專利名稱：：抗病毒病的嫁接植株和生產(chǎn)相同植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包括轉(zhuǎn)基因抗病砧木和嫁接幼芽的抗病毒病植抹和生產(chǎn)相同植抹的方法，其中轉(zhuǎn)基因抗病砧木將抗病性傳給幼芽。
背景技術(shù)：
：植物致病病毒導(dǎo)致全球農(nóng)業(yè)鮮產(chǎn)品的重大損失。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)踐，包括大地區(qū)種植單一植物和常年對(duì)鮮產(chǎn)品的需求導(dǎo)致的溫室面積的增大，使病毒傳播和總損失增加的問(wèn)題加重了。過(guò)去人們成功的運(yùn)用傳統(tǒng)育種程序生產(chǎn)了抗病毒感染的植抹。然而，這些育種程序都依賴于抗病的自然資源，這些資源并非總能得到。比如，全世界每年葫聲科植物都因小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)而受嚴(yán)重?fù)p害。這種病毒通過(guò)葉蟲(chóng)牙蟲(chóng)從一棵植物傳到另一棵，殺蟲(chóng)劑不能有效地阻止這種病毒的傳播。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗病資源有限。Powell-Abel等(Powell-Abel等，1986.Science232:738-743)首次說(shuō)明轉(zhuǎn)化并表達(dá)煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白(CP)基因的植株對(duì)TMV有抗性。其后，指示用15種分類群中至少25種病毒獲得了病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性，包括苜?；ㄈ~病毒，煙草脆裂病毒、馬鈴薯病毒X、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒及用馬鈴薯病毒X和馬鈴薯病毒Y兩種病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)化的植抹。通常，CP-介導(dǎo)的抗性與RNA-介導(dǎo)的抗性相比，對(duì)較大范圍的病毒菌抹有效，但一般效果要差些，即，病毒RNA片段的在前者中的表達(dá)不能翻譯為具抗性的蛋白。舉例說(shuō)來(lái)，美國(guó)專利No.6,649,813揭示病毒誘導(dǎo)的抗性會(huì)從植抹的一代傳到下一代，這種轉(zhuǎn)基因植株包含取自病毒基因組的復(fù)制酶部分的通讀部分的編碼序列，對(duì)病毒造成的隨后的病害有抗性。特別的描述了來(lái)自煙草花葉病毒(TMV)的54kDa編碼序列的作用。復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性局限于具有高度序列同源性的菌抹，不受這種具挑戰(zhàn)性的病毒的滴度的影響，和轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平不相關(guān)。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)是一種序列特異保護(hù)才幾制，能同時(shí)靶向細(xì)胞和病毒的mRNA，作為使基因表達(dá)失活的工具被廣泛運(yùn)用。已知PTGS在植物中發(fā)生，然而一個(gè)接近的相關(guān)的現(xiàn)象，RNA干擾(RNAi),已知它在大范圍的其他的有機(jī)體中發(fā)生(Baulcombe,D.2000.Science,290:1108-1109)。已有結(jié)果指示RNA干擾發(fā)生在，例如線蟲(chóng)、粗糙脈孢菌、黑腹果蠅和哺乳動(dòng)物中。此外，轉(zhuǎn)基因和病毒^C揭示在植物中誘導(dǎo)基因沉默，現(xiàn)在人們相信PTGS是一種抵抗病毒積累的天然防御機(jī)制(HamiltonA.andBaulcombe，D.1999.Science286:950-952;Matzke等，2001.Curr.Opin.Genet.Dev.11:221-227)。對(duì)于許多的植物RNA病毒來(lái)說(shuō)，病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)被很好的證實(shí)了。這個(gè)過(guò)程開(kāi)始于雙鏈的RNA(dsRNA)分子。dsRNA分子可能由病毒RNA復(fù)制中間產(chǎn)物或者異常的轉(zhuǎn)基因編碼的RNA通過(guò)RNA-依賴的RNA聚合酶活性變成dsRNA。一種屬于核糖核酸酶III家族的酶將dsRNA裂解成通常大小范圍在21到26個(gè)核苷酸的短的干擾RNA(siRNA)。人們相信siRNA接著通過(guò)形成一個(gè)多成分的破壞同源mRNA的多成分核酸酶復(fù)合體RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)促進(jìn)mRNA的降解。自從發(fā)現(xiàn)了siRNA，基于這一機(jī)制的方法被用于使特殊靶基因沉默，作為一個(gè)研究工具去揭示基因的功能和用于阻止不希望要的基因的表達(dá)。WO99/61631運(yùn)用有義和反義RNA的基因片段揭露了改變植物靶基因表達(dá)的方法。這些有義和反義的RNA片段能夠配對(duì)并形成RNA雙鏈分子，因此改變基因的表達(dá)。WO99/53050揭示了在真核細(xì)胞中，特別是在植物細(xì)胞中減少感興趣的核酸的表型表達(dá)的方法和手段，其通過(guò)引入編碼導(dǎo)向靶核酸的有義和反義RNA分子的融合基因，能夠通過(guò)區(qū)域與有義和反義核酸序列間的堿基配對(duì)或者通過(guò)引入RNA分子本身形成雙鏈RNA區(qū)域。WO00/68374涉及運(yùn)用有義和反義RNA基因片段改變病毒基因在細(xì)胞中的表達(dá)的方法。這些有義和反義RNA片段能夠配對(duì)并形成雙鏈RNA分子，因此改變基因的表達(dá)。該發(fā)明還涉及運(yùn)用該發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞、植物或者動(dòng)物，其優(yōu)選地^l氏抗或者耐受病毒。WO2004/009779揭示包含前體RNA的構(gòu)建體是為了RNA前體的表達(dá)的組成。這種前體RNA構(gòu)建體包括一個(gè)在植物細(xì)胞中表達(dá)的驅(qū)動(dòng)一種具微小RNA的前體RNA的表達(dá)的啟動(dòng)子。這種微小RNA是一部分靶基因或者核苷酸序列的互補(bǔ)或者部分的互補(bǔ)，具調(diào)節(jié)靶序列或基因的表達(dá)的功能。如此，這種RNA前體構(gòu)建體可被設(shè)計(jì)去調(diào)節(jié)感興趣的基因的任何核苷酸序列的表達(dá)，任一內(nèi)源植物基因或者可選擇的一種轉(zhuǎn)基因。嫁接是一種農(nóng)民和園丁們使用的將砧木和幼芽的想得到的品質(zhì)結(jié)合的古老的技術(shù)。在過(guò)去，嫁接主要用于多年生的植物，特別是草本植物和樹(shù)木。現(xiàn)在，這一4支術(shù)也用于一年生植物，并且由砧木和幼芽組成的嫁接的植物苗的百分率不斷地增加。Smirnov等(Smirnov等，1997.PlantPhysiol.114:1113-1121)運(yùn)用嫁接技術(shù)將野生型煙草植抹和表達(dá)美洲商陸抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草植抹嫁接。他們證明了抗病毒蛋白在嫁接植株的轉(zhuǎn)基因砧木中的表達(dá)誘導(dǎo)野生型幼芽對(duì)病毒感染的抗性。然而，抗性是依賴于美洲商陸抗病毒蛋白的酶活性。至今，生產(chǎn)抗病菌感染的植抹的企圖主要集中在使用轉(zhuǎn)化方法來(lái)合并抗性相關(guān)性狀到植物基因組。然而，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植抹獲得的農(nóng)產(chǎn)品在許多國(guó)家不受歡迎。二者擇一地，嫁接技術(shù)被運(yùn)用。雖然已表明有抗某種疾病的砧木的運(yùn)用，這些嫁接幼芽易因病菌的傳播而感病。這樣，存在一個(gè)公認(rèn)的需要，而且高度有利的是具有對(duì)病菌，特別是對(duì)病毒的抗性的植抹，其中農(nóng)產(chǎn)品由植株未受遺傳修飾的部分生產(chǎn)。發(fā)明概要本發(fā)明提供包括轉(zhuǎn)基因抗病毒砧木和易感病幼芽的嫁接植林，其中整個(gè)植抹對(duì)病毒病有抗性。本發(fā)明的植抹可為多年生或一年生。本發(fā)明還提供生產(chǎn)嫁接抗病植株的組成和方法。病毒抗性的特性依賴于用于生產(chǎn)這種特別的植株的組成的特殊的特征。根據(jù)某些方面，本發(fā)明提供受保護(hù)不受土傳病毒侵害的嫁接植抹。根據(jù)其他方面，本發(fā)明的植株抗由病毒導(dǎo)致的葉的感染。本發(fā)明的植抹可以通過(guò)各種嫁接類型產(chǎn)生；當(dāng)幼芽生產(chǎn)想得到的農(nóng)產(chǎn)品的時(shí)候，代表性地應(yīng)用嫁接的方法。有利地，因?yàn)檎枘局皇侵材ǖ霓D(zhuǎn)基因的部分，由本發(fā)明的植林生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品沒(méi)有被遺傳修飾。不希望受任何特別的理論或者機(jī)制的約束，本發(fā)明的植抹對(duì)病毒病的抗性可能歸功于給予轉(zhuǎn)基因砧木的RNA-介導(dǎo)的抗病毒性，這種砧木將抗性授予嫁接的易感病幼芽。這樣，根據(jù)一方面，本發(fā)明提供一種植株，其包括抗病毒病的而不同于表達(dá)抗病毒蛋白的手段的轉(zhuǎn)基因砧木和對(duì)病毒病易感的幼芽，其中嫁接植抹抗所述的病毒病。根據(jù)各種實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過(guò)轉(zhuǎn)基因砧木授予給嫁接幼芽的病毒抗性，這種砧木表達(dá)選自編碼病毒蛋白或者其部分和siRNA的序列的一種核酸序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這樣，根據(jù)某些實(shí)施方案，抗病毒的轉(zhuǎn)基因砧木包含核酸序列，其至少90%相同于病毒基因組的至少一個(gè)片段。根據(jù)另外的實(shí)施方案，抗病毒感染的轉(zhuǎn)基因砧木包含DNA構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA。就如在這里用到的，術(shù)語(yǔ)"片段"指的是從由病毒基因組編碼區(qū)、非編碼區(qū)、其部分和其組合物組成的組中4兆選出的核酸序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，具有與至少一個(gè)病毒基因組片段至少90%相同性的核酸序列編碼一種蛋白或者其部分。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，核酸序列編碼一種蛋白，其從由外殼蛋白、重復(fù)蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白或者其部分組成的組中選出。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木含核酸序列，其為病毒基因組復(fù)制酶部分的片段。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木含核酸序列，其編碼一個(gè)推定的為黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的復(fù)制蛋白的54kDa的蛋白質(zhì)。根據(jù)一個(gè)現(xiàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木包括具有在序列IDNO:l中提出的序列的核酸序列。還根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體包括(a)可操作地連接的至少一種植物的可表達(dá)啟動(dòng)子；(b)編碼形成至少一個(gè)雙《連RNA的RNA序列的核酸序列，其中雙鏈RNA分子包含具有與病毒基因組的靶片段的有義核苷酸序列至少90%序列相同性的至少20個(gè)鄰近的核苷酸的第一核苷酸序列；具有與所述的病毒基因組的所述革巴片段的有義核香酸序列的互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近的核苷酸的第二核苷酸序列；并且視需要(c)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生耙向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體包括(a)可操作地連接的至少一種植物的可表達(dá)啟動(dòng)子；(b)編碼形成莖環(huán)形式的至少一個(gè)RNA雙鏈的RNA序列的核酸序列，其中雙鏈RNA分子包括具有與病毒基因組的靶片段的有義核苷酸序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核苷酸的第一核苷酸序列；具有與所述病毒基因組的所述靶片段的有義核苦酸序列互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核苷酸的第二核苷酸序列；間隔序列；并且視需要，(c)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。應(yīng)了解的是本發(fā)明的實(shí)施不受任何特殊的DNA構(gòu)建體的限制，倘若構(gòu)建體被設(shè)計(jì)以引導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)siRNA的發(fā)生，其中siRNA靶向到病毒基因組的至少一個(gè)片段。根據(jù)某些實(shí)施方案，構(gòu)建體包括編碼形成至少一個(gè)雙鏈RNA分子的RNA序列的核酸序列，其中雙鏈RNA分子介導(dǎo)病毒靶序列的裂解。DNA構(gòu)建體可能凈皮-沒(méi)計(jì)以各種方式形成雙《連RNA分子。而且應(yīng)了解，雖然本發(fā)明用產(chǎn)生siRNA的構(gòu)建體來(lái)實(shí)施，而且以產(chǎn)生植物細(xì)胞中siRNA的技術(shù)的任何已知的方法也被包含在本發(fā)明的范圍。已揭示以前已經(jīng)有將siRNA作為一種手段來(lái)裂解植物細(xì)胞中病毒基因組的片段的運(yùn)用。也已表明當(dāng)染色體基因(無(wú)論內(nèi)源還是異源基因)在砧木中沉默時(shí)，沉默的砧木轉(zhuǎn)移沉默到表達(dá)相應(yīng)染色體基因的靶幼芽上。然而，本發(fā)明令人驚訝地揭示轉(zhuǎn)化具產(chǎn)生靶向致病病毒的至少一個(gè)片段的siRNA的構(gòu)建體的砧木，將抗性授予嫁接幼芽，其對(duì)病毒造成的感染敏感。根據(jù)一些實(shí)施方案，第一和第二核苦酸序列可操作地連接到相同的啟動(dòng)子。在其他的實(shí)施方案中，第一和第二核苷酸序列各自可操作地連接到單獨(dú)的啟動(dòng)子，其中這些單獨(dú)的啟動(dòng)子可能相同或者不同。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一核苷酸序列包括與病毒基因組的至少一個(gè)片段的有義核苦酸序列至少95%，優(yōu)選地100%地相同的至少20個(gè)鄰近核苷酸的序列。根據(jù)另外的實(shí)施方案，第二核苷酸序列包括與病毒基因組至少一個(gè)片段的有義核香酸序列的互補(bǔ)序列至少95%,優(yōu)選地100%地相同的至少20個(gè)鄰近核香酸的序列。沒(méi)有對(duì)可運(yùn)用的第一和第二核苷酸序列長(zhǎng)度的上限，因而本發(fā)明的構(gòu)建體可包括不同長(zhǎng)度的核苦酸序列，包括從大約20個(gè)核苷酸到靶RNA的全長(zhǎng)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，第一和第二核苦的長(zhǎng)度為大約1,000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二核苦酸的長(zhǎng)度為約22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，第一核苦酸序列包括具有與序列IDNO:2中闡明的核苷酸序列或其片段90%,優(yōu)選地95%,更優(yōu)選100%地相同的核苷S吏序列。根據(jù)另一個(gè)現(xiàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案，第二核苷酸序列包括具有與序列IDNO:2中闡明的核苷酸序列或其片段的互補(bǔ)序列90%,優(yōu)選地95%,更優(yōu)選100%地相同的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，抑制性RNA分子的結(jié)構(gòu)包括相對(duì)于第一和第二核苷酸序列更多的結(jié)構(gòu)間隔序列，這樣雙鏈RNA以莖環(huán)RNA的形式存在(發(fā)夾RNA，hpRNA)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，間隔序列的長(zhǎng)度是第一和第二核苷酸長(zhǎng)度的1/5到1/10。根據(jù)某些實(shí)施方案，間隔序列包括源于增強(qiáng)siRNA產(chǎn)量的基因內(nèi)含子的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，間隔序列包括包含來(lái)自蓖麻子過(guò)氧化氫酶基因的內(nèi)含子的核苦酸序列，具有序列IDNO:3中闡明的序列。視需要，編碼siRNA的構(gòu)建體可包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是NOS終止子。根據(jù)某些實(shí)施方案，將抗性授予嫁接幼芽的核苦酸序列，更進(jìn)一步地包括植物細(xì)胞中核酸序列表達(dá)的調(diào)控因子。表達(dá)控制因子選自包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子、剪切信號(hào)和終止序列的組。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。根據(jù)一個(gè)現(xiàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案，組成型啟動(dòng)子是草莓鑲脈病毒的啟動(dòng)子。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。根據(jù)其他的實(shí)施方案，用具有與病毒基因組至少片段90%相同性的核酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因砧木對(duì)由土傳病害導(dǎo)致的病害有抗性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，包含這樣的轉(zhuǎn)基因砧木的轉(zhuǎn)基因植株被保護(hù)而不受選自包含線蟲(chóng)傳播的病毒、真菌傳播的病毒、通過(guò)根部傷口傳播的病毒和通過(guò)不明載體傳播的病毒的組的一種土傳病害的侵害。根據(jù)一種實(shí)施方案，線蟲(chóng)傳播的病毒選自但不限于線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒(nepoviruse):南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒、辣椒環(huán)斑病毒。根據(jù)另一種方案，真菌傳播病毒選自一組病毒，包括但不限于黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)根部傷口傳播的病毒選自一組由煙草花葉屬病毒組成但不限于其的病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒。仍根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)不明途徑傳播的病毒選自一組病毒，其包括^(旦不局限于豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，嫁接植抹受保護(hù)而不被由一種煙草花葉病毒屬的土傳病毒引起的一種病害的侵害。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，嫁接植林被保護(hù)而不被煙草花葉病毒屬病毒CFMMV引起的病害的侵害。還根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，嫁接植抹選自葫聲科。本發(fā)明首次表明利用嫁接技術(shù)將對(duì)土傳病毒病菌抗性傳給易感的植株是可能的。將易感病幼芽嫁接到抗病砧木，其中抗病砧木包括具有與土傳病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%相同性的核酸序列，將易感病的幼芽變?yōu)槭鼙Ｗo(hù)而不被土傳病菌侵害。根據(jù)其它的實(shí)施方案，包括包含被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因的抗病毒砧木和幼芽的嫁接植株，可為植物的任何一個(gè)種。此外，可生產(chǎn)出對(duì)任何挑選出的病毒的表現(xiàn)抗性的植林，其中對(duì)多種植物病毒的抗性也能得到。根據(jù)某些實(shí)施方案，植抹對(duì)從所述在此描述的組中挑選的土傳病毒具抗性。根據(jù)其它的實(shí)施方案，植株對(duì)一種通過(guò)侵害植株地上部分的載體傳播的病毒有抗性。根據(jù)一種實(shí)施方案，侵害植抹地上部分的病毒屬于一個(gè)病毒科，其選自以下組花椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸孤病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、豇豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番茄叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，病毒選自一組病毒，包括煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃脈病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、蕪苓黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。根據(jù)某些實(shí)施方案，包括包含被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生siRNA的DNA構(gòu)建體的砧木的嫁接植抹對(duì)來(lái)自馬鈴薯Y病毒科的植物病毒有抗性。在下面的描述中，使用靶向包括外殼蛋白基因和3'端非編碼區(qū)的小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)基因組的3'端的siRNA將抗病毒性授予轉(zhuǎn)基因煙草(Mco"朋a/)CT^mm'"朋)砧木，進(jìn)而授予煙草幼芽，一皮描述為根據(jù)本發(fā)明的更廣泛的技術(shù)的一個(gè)特殊的例子。本發(fā)明中轉(zhuǎn)化給砧木的核酸序列優(yōu)選地進(jìn)一步包括可選4奪的標(biāo)記，因而只有轉(zhuǎn)基因植株可以萌芽和生長(zhǎng)。此外或者另一選擇為，報(bào)告基因可以被整合到構(gòu)建體中以便能夠挑選表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植抹。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，選擇標(biāo)記是包括植株體內(nèi)抗生素抗性的基因。近來(lái)制定的與大田的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)相關(guān)的規(guī)定排除包括含誘導(dǎo)抗生素抗性的基因的轉(zhuǎn)基因植物的使用。這樣，轉(zhuǎn)基因植物的挑選可通過(guò)共轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明被設(shè)計(jì)以授予病毒抗性的第一構(gòu)建體和包括報(bào)告基因的第二構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行。授予病毒抗性的構(gòu)建體的成功的轉(zhuǎn)化于是通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法，僅在表達(dá)報(bào)告基因和因此指示其為成功的轉(zhuǎn)化的植株中，被證實(shí)，比如通過(guò)PCR。如本領(lǐng)域中已知的，本發(fā)明的核酸序列可能被整合到用于轉(zhuǎn)化植物的植物轉(zhuǎn)化載體中。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種方法用于產(chǎn)生抗病毒感染的植物，包括以下步驟(a)提供抗病毒感染的轉(zhuǎn)基因砧木而非通過(guò)抗病毒蛋白的表達(dá)手段；(b)提供對(duì)所述病毒感染敏感的幼芽；并(c)將幼芽嫁接到砧木上以便獲得對(duì)抗所述病毒侵染的嫁接植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，砧木用具有與病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%同樣性的核酸序列轉(zhuǎn)化，以便產(chǎn)生抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，砧木用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，其被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA,以產(chǎn)生抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，病毒基因組受影響的片段對(duì)病毒侵染植物和/或復(fù)制是必需的，所以其裂解阻止病毒侵染和/或復(fù)制，因此產(chǎn)生了抗性植物。用多聚核苷酸或者DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植抹可通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的不同方法產(chǎn)生抗性砧木。常用的方法的例子(但不受限于)有土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法、花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移(例如微注射)和胚性愈傷組織電穿孔法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，抗性植株可通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。包括本發(fā)明的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植株，可運(yùn)用所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的分子遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法挑選。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植林根據(jù)它們對(duì)抗生素的抗性來(lái)^L選。根據(jù)某些實(shí)施方案，作為可選擇標(biāo)記的抗生素是包括巴龍霉素和卡那霉素的氨基糖甙類抗生素。根據(jù)另一實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植抹的挑選根據(jù)它們對(duì)病毒感染的抗性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植林的挑選根據(jù)它們對(duì)土傳病毒的抗性，土傳病毒選自一組病毒包括(但不限于)線蟲(chóng)傳播病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。根據(jù)另一實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植物的挑選根據(jù)它們對(duì)病毒的抗性，病毒通過(guò)感染植物的地上部分的載體傳送，選自一個(gè)科，所述科包括以下組椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸孤病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、5工豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番茄叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科；煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃脈病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、蕪茶黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的嫁接植株。植抹包括幼芽，其原本對(duì)病毒感染敏感，嫁接到轉(zhuǎn)基因的抗病毒的砧木后對(duì)病毒感染有抗性。嫁接的植林將對(duì)砧木有抗性的同一病毒種有抗性。砧木包括根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定地整合到其基因組的核酸序列，其中DNA構(gòu)建體的特性決定了其對(duì)哪一病毒種有抗性。本發(fā)明的這些或者另外的特征在下面的圖、描述和權(quán)利要求中有更詳細(xì)的解釋。附圖概述圖1顯示CFMMV基因組結(jié)構(gòu)和54kDaDNA構(gòu)建體的示意圖。A.CFMMV基因組的結(jié)構(gòu)。核苦酸數(shù)指假定基因的位置。編碼假定的54kDa(RNA-I1)、運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)和外殼蛋白(CP)基因的三個(gè)亞基因組RNA都被標(biāo)記了。B.用于植物轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的組成，在左邊(LB)和右邊(RB)T-DNA邊界之間的部分。CFMMV的54kDa基因與ZYMV的在截短的SVBV(SV)啟動(dòng)子和NOS多聚A終止子(T)之間的5，端非編碼區(qū)(NCR)融合。選擇的NPTII基因在全長(zhǎng)SVBV啟動(dòng)子的控制下插入。圖2顯示產(chǎn)生siRNA的DNA構(gòu)建體的示意圖，pCddCP-ZY在左邊(LB)和右邊(RB)T-DNA邊界之間。包括病毒的ZYMV基因外殼蛋白(CP)和3'端非編碼區(qū)(NOR)的多聚核苷酸的反向重復(fù)在每一端融合內(nèi)含子，在SVBV(SV)啟動(dòng)子和NOS多聚A終止子(Ter)之間。選擇的NPTII基因和GUS基因在35S啟動(dòng)子控制下插入。圖3顯示了144抗性植林和對(duì)照植株對(duì)感染不同的侵染葫蘆的煙草花葉病毒屬病毒的反應(yīng)；CFMMV(CF)、CGMMV(CG)、KGMMV(KG)和ZGMMV(ZG)感染的反應(yīng)，根據(jù)病毒粒體的積累(a)和RT-PCR(b)來(lái)評(píng)定。圖4顯示了RT-PCR產(chǎn)物，指示被CFMMV侵染。抹系144和未轉(zhuǎn)化的"Ilan"植林(未接種(H)或者用CFMMV(inocul.)接種后三個(gè)星期)的總RNA作為PT-PCR(a)和(b)的模板和PCR(c)作為陰性對(duì)照分析。(a)54kDa基因的引物。(b)CP基因的引物。MW:分子量為100bp階梯。圖5顯示黃瓜植株接種CFMMV后的反應(yīng)。A和C:轉(zhuǎn)基因的株系144。B和D:未轉(zhuǎn)化的品種'Ilan，。葉子和果實(shí)分別在接種后三和七個(gè)星期后表現(xiàn)出病癥。(144)和未轉(zhuǎn)化的植抹('Ilan，)的第二和第三片真葉的總RNA,未接種或者是接種18dpi的CFMMV(CF)或ZYMV(ZY)。用變性瓊脂糖凝膠電泳和Northern點(diǎn)雜交分析了RNA。RNA上樣量為或每孔3嗎(從未轉(zhuǎn)化的用CFMMV感染了的'Ilan，植抹)，或30嗎(其它孔)。運(yùn)用32P標(biāo)記的與54kDa的編碼序列互補(bǔ)的RNA探針來(lái)探測(cè)病毒RNA和轉(zhuǎn)基因。在平板附近指示了CFMMVRNA和亞基因組RNA-II的電泳位置。標(biāo)記了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(54kDa的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)。Ilan+CF孑L(用CFMMV侵染的未轉(zhuǎn)化植株)被暴露了4小時(shí)，而其它孔暴露了3天。底板用溴化乙錠染色轉(zhuǎn)膜前的膠而確定18SRNA水平。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗病毒的4家接植物，其包括砧木和幼芽。以DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植抹，授予對(duì)一種植物病毒的抗性而不是通過(guò)抗病毒蛋白的表達(dá)，作為砧木來(lái)源，而對(duì)病毒病易感染的植株作為幼芽來(lái)源。通過(guò)將幼芽嫁接到砧木，整個(gè)植林被保護(hù)而不被病毒侵染。在詳細(xì)解釋至少一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案之前，應(yīng)了解本發(fā)明的應(yīng)用不限于在下面的描述中闡明的或者在制圖中解釋的構(gòu)建的細(xì)節(jié)和成分的排列。本發(fā)明可以有其它的實(shí)施方案，可按不同方法操作或者實(shí)行。而且，應(yīng)了解在此的措辭和術(shù)語(yǔ)是為了達(dá)到描述的目的而不應(yīng)該認(rèn)為是限制。定義在這里用到的術(shù)語(yǔ)"植物"是其最廣義的意思。它包括(但不限于)任何一種木本植物，草本的，多年生或一年生的植物。它還指多個(gè)植物細(xì)胞，其大量的分化成一個(gè)結(jié)構(gòu)，處于植林生長(zhǎng)的任何階段。這些結(jié)構(gòu)包括(但不限于)根、莖、芽、葉、花、花瓣、果實(shí)等。在此用到的術(shù)語(yǔ)"嫁接植抹"指包括砧木和幼芽的植林，其中，幼芽通過(guò)所屬領(lǐng)域已知的任何方法被嫁接到砧木上。在此用到的術(shù)語(yǔ)"砧木，，指用于嫁接的包括植物的根部的樹(shù)干。術(shù)語(yǔ)"幼芽"指從植林分離的被設(shè)計(jì)或準(zhǔn)備以在嫁接中與樹(shù)干接合的活體部分，通常單獨(dú)地或者最具優(yōu)勢(shì)地提供給嫁接林地上部分。在此用到的術(shù)語(yǔ)"病毒，，指一種植物病毒，即一種可以侵染植物細(xì)胞和在植物細(xì)胞中繁殖的病毒。典型地病毒是致病的，所以實(shí)質(zhì)性的病毒侵染導(dǎo)致農(nóng)作物的產(chǎn)量減少。在此用到的術(shù)語(yǔ)"土傳，，病毒指通過(guò)土壤載體傳播的病毒，土i裏載體包括線蟲(chóng)、真菌或者不明土壤載體，和殘留在植物殘?bào)w中的病毒，且通過(guò)根部傷口在土壤中傳播。術(shù)語(yǔ)"抗性植抹，，和"抗病毒病的植抹"指植株與非抗(易感病)植抹相比具有增強(qiáng)的對(duì)病毒的耐受性。增強(qiáng)的耐受性通過(guò)用供試病毒故意侵染植抹而檢查到。根據(jù)每種病毒的特殊的癥狀等級(jí)，與易感病植抹相比表現(xiàn)出較輕的癥狀程度的植林被定義為抗此病毒的植林。植抹可或者抗侵染(抗性于是指免疫能力)或者經(jīng)歷一個(gè)侵染的初步階段而恢復(fù)(抗性于是指恢復(fù)能力)?？剐钥蔀橐环€(wěn)定的性狀，其可被遺傳到后代群體?；蛘撸灰藿又材òㄕ枘竞陀籽烤痛嬖诳剐?。在后者的情況中，抗病毒病的植株也可指植抹被保護(hù)而不受病毒病侵害。術(shù)語(yǔ)"基因"指核酸(例如DNA或者RNA)序列，其包括產(chǎn)生RNA或多聚肽必需的編碼序列。多聚肽可被全長(zhǎng)的編碼序列或者其部分所編碼。術(shù)語(yǔ)"其部分"，當(dāng)其用于指一基因，指此基因的片段。片段的大小范圍可從幾個(gè)核苷酸到整個(gè)基因序列減去一個(gè)核苷酸。這樣，"包括至少一個(gè)基因的一部分的核酸序列"可包括基因的片段或者整個(gè)基因。術(shù)語(yǔ)"基因"也包含結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和包括位于靠近編碼區(qū)的具每端約lkb距離的5，和3，端的序列，所以基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)5'端和出現(xiàn)在mRNA上的序列指5'端非翻譯的序列。位于編碼區(qū)3，端或下游和出現(xiàn)在mRNA上的序列指3，端非翻譯序列。在此用到的術(shù)語(yǔ)"內(nèi)含子"指非編碼區(qū)，其打斷了基因的編碼區(qū)。內(nèi)含子被移出或者從核或初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中"剪除"，這樣就不在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中了。在此用到的術(shù)語(yǔ)"核酸，，指RNA或者DNA，其為線性或分枝的，單鏈或者雙鏈或者為其雜合體。此術(shù)語(yǔ)也包含RNA/DNA雜合體。在此用到的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)因子"、"啟動(dòng)子"、或"啟動(dòng)序列"指DNA序列，其位于DNA聚合體的編碼蛋白的區(qū)域的5'末端(即先行(prec.edes))。已知大多數(shù)啟動(dòng)子的位置實(shí)際上在轉(zhuǎn)錄區(qū)域之前。啟動(dòng)子的作用像一個(gè)開(kāi)關(guān)，激活基因的表達(dá)。如果基因被激活，其被稱為轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄包括由基因合成mRNA。因此，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也提供基因轉(zhuǎn)錄為mRNA開(kāi)始的位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"外源基因"或"融合基因"指編碼一個(gè)因子的基因，其不處于它的自然的環(huán)境中(即被人為的改變了)。例如，從一個(gè)物種導(dǎo)入到另一物種的基因的外源基因。外源基因也包括通過(guò)某些方法(如突變、加入了多個(gè)拷貝、與非自身的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列連接等)改變了的有機(jī)體的自身基因。外源基因可能包括植物基因序列，其包括植物基因的cDNA形式；cDNA序列可能正(以產(chǎn)生mRNA)或反向(以產(chǎn)生與mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)地表達(dá)。因?yàn)橥庠椿虻男蛄械湫偷嘏c包括調(diào)節(jié)因子例如啟動(dòng)子的核苷酸序列有關(guān)，其通常在自然下未發(fā)現(xiàn)與外源基因編碼的蛋白的基因有關(guān)或者與染色體的植物基因序列有關(guān)，或者與在自然狀態(tài)下沒(méi)有的染色體部分有關(guān)(例如，在通常不表達(dá)的位點(diǎn)表達(dá)的基因)，外源植物基因和內(nèi)源植物基因可相區(qū)別。一特殊的植物物種的植物內(nèi)源基因是一個(gè)在此物種中自然能找到，或者其通過(guò)常規(guī)的雜交可被導(dǎo)入此物種的基因。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"用于指植抹或者果實(shí)或者種子(即"轉(zhuǎn)基因植抹"或"轉(zhuǎn)基因果實(shí)"或"轉(zhuǎn)基因種子")指在其一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中包含至少一個(gè)外源基因的植林或者果實(shí)或者種子。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因植物材料"泛指植林、植物結(jié)構(gòu)、植物組織、植物種子或者植物細(xì)胞，在其至少一個(gè)細(xì)胞中至少包括一個(gè)外源基因。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化抹"或者"轉(zhuǎn)化細(xì)胞，，包括初轉(zhuǎn)化細(xì)胞和由不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)量的細(xì)胞而來(lái)的培養(yǎng)物。由于有意的或者無(wú)意的突變，不可能所有的后代在DNA含量上都精確的相同。從初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選出的具有相同功能性的突變后代包括在轉(zhuǎn)化體的定義中。本發(fā)明揭示了一個(gè)利用嫁接技術(shù)來(lái)生產(chǎn)抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因植物的體系，其中砧木是植抹唯一的遺傳修飾了的部分。這樣，因轉(zhuǎn)化方法可以用于授予對(duì)病毒侵染的抗性，本發(fā)明的植抹優(yōu)于迄今已知的抗性植抹，而且由此植抹生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品未被遺傳修飾。幼芽嫁接到砧木是一個(gè)普通的園藝實(shí)踐，其被用于繁殖木本植物多年。一旦嫁接了，砧木的水分和營(yíng)養(yǎng)被運(yùn)輸?shù)接籽恳灾С钟籽康纳L(zhǎng)。如今，嫁接廣泛用于多種植物物種以改善嫁接后的植林的園藝性狀。用于大田作物的嫁接苗包括砧木和幼芽，其比例在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)踐中不斷的增加。例如，在希臘、意大利和西班牙，約60%的黃瓜和西瓜苗是嫁接苗。為了滿足對(duì)嫁接苗日益增長(zhǎng)的需要，多種方法得以發(fā)展以得到高的嫁接產(chǎn)量。在所有實(shí)施的方法中，幼苗和砧木的互補(bǔ)端被連在一起以形成一個(gè)嫁接聯(lián)合體。作為植抹正常的愈合過(guò)程的一部分，愈傷組織在嫁接聯(lián)合體上形成，并作為幼芽和砧木之間水分和營(yíng)養(yǎng)的管道。根據(jù)一方面，本發(fā)明提供包括抗病毒的轉(zhuǎn)基因砧木(不是通過(guò)表達(dá)抗病毒蛋白)和對(duì)病毒病敏感的幼芽的植株，其中嫁接植林對(duì)所述病毒病有抗性?？共《静〉霓D(zhuǎn)基因植抹可用多種方法來(lái)生產(chǎn)，其可作為砧木。本發(fā)明特別地涉及轉(zhuǎn)基因砧木，其表達(dá)與把病毒基因組片段同源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。不希望受特定的機(jī)制束縛，抗性可與RNA沉默有關(guān)。RNA沉默的命名，在植物中為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)、真菌中為基因壓制和動(dòng)物中為RNA干涉，指在相關(guān)RNA存在的情況下特殊的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平藉以減少的現(xiàn)象。沉默的基因可是有機(jī)體內(nèi)源的或者外源的，整合到染色體而存在或者短暫的存在，例如未整合到基因組的轉(zhuǎn)染載體或者病毒?；虻谋磉_(dá)或完整或部分,皮抑制。PTGS也可^L認(rèn)為完全地或部分地阻止目標(biāo)RNA的功負(fù)b。根據(jù)某些實(shí)施方案，抗病毒侵染轉(zhuǎn)基因砧木包括一核酸序列，其具有與病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%的相同性。已顯示導(dǎo)入一轉(zhuǎn)基因組成型地表達(dá)病毒基因組的一部分，導(dǎo)致植物對(duì)病毒侵染的抗性(Marathe等,2000.PlantMol.BioL43:295-306)。本發(fā)明現(xiàn)在顯示將易感病幼芽嫁接到如上面描述的那樣轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因砧木，導(dǎo)致砧木將抗病毒性授予幼芽。特別地，本發(fā)明顯示這樣的嫁接植林被保護(hù)而不辟皮土傳病毒導(dǎo)致的疾病4曼害。作為一個(gè)非限制性的例子，本發(fā)明揭示通過(guò)嫁接到轉(zhuǎn)基因有抗性的黃瓜砧木，一易感病黃瓜品種受保護(hù)而不被土傳黃瓜果實(shí)花葉煙草花葉病毒屬病毒(CFMMV)侵害。CFMMV是一種新l艮道的侵染葫，的煙草花葉病毒屬病毒，其在以色列(Antig腿等,2001.Phytopathology91:565-571)從生長(zhǎng)于溫室的黃瓜(CucumissativusL.)上分離。黃瓜品種對(duì)四種截然不同的屬于兩個(gè)亞組的煙草花葉病毒屬病毒敏感。CFMMV在生物上、序列相似性上與Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)、小西葫蘆綠斑駁花葉病毒(ZGMMV)緊密相關(guān)，但是與黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-W)相比表現(xiàn)出更弱的血清親和力和更低的外殼蛋白(CP)同源性。CFMMVRNA基因組包括6，562個(gè)核苦酸(基因庫(kù)編號(hào)no.AF321057，序列IDNO:4)，具三個(gè)亞基因組RNA，編碼四個(gè)開(kāi)放閱讀框(圖1)。CFMMV的5'近端區(qū)域編碼對(duì)復(fù)制必需的兩個(gè)共起始(co-initiated)蛋白132-kDa和189-kDa的蛋白。189-kDa的蛋白通過(guò)滲漏UAG終止密碼子的通讀產(chǎn)生，其在132-kDa蛋白的3，端的3629位置處(Antigus等，2001，同上)。在煙草花葉病毒(TMV)—個(gè)名為Il-RNA的亞基因組RNA從短的復(fù)制酶基因(132-kDa)開(kāi)始，并編碼復(fù)制酶框架的通讀部分，產(chǎn)生假定的54kDa的蛋白，其還未在被煙草花葉病毒屬病毒侵染的植物上發(fā)現(xiàn)(Zaitlin，M.1999.PhilTransRSocLondB354:587-591)。在商業(yè)溫室環(huán)境，CFMMV的癥狀首次在處于一個(gè)相當(dāng)高級(jí)的生長(zhǎng)階段的果實(shí)和頂端的葉子上發(fā)現(xiàn)。葉子的癥狀包括花葉嚴(yán)重、沿脈變色和黃斑駁。在很多情形下，發(fā)育完全的植抹表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎蔦癥狀，以致植抹病死。病毒在溫室迅速的蔓延可能導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)作物嚴(yán)重的損失。此病毒通過(guò)接種源機(jī)械接觸植物器官而易于傳播。此病毒可在植物殘?bào)w或者受侵染的溫室土壤中殘留很長(zhǎng)時(shí)間。由于缺乏有效的天然的黃瓜抗性資源，使得不可能通過(guò)傳統(tǒng)的育種程序來(lái)使抗性基因滲入到商業(yè)品種。這樣，根據(jù)一實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木包括一核酸序列，其編碼一假定的為黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的復(fù)制蛋白的一部分的54kDa的蛋白。根據(jù)一現(xiàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木包括一核酸序列，其具序列IDNO:1中闡明的序列。就如下面的在此例證的，用CFMMV假定的非結(jié)構(gòu)的54-kDa的基因轉(zhuǎn)化的單性結(jié)實(shí)的黃瓜表現(xiàn)出對(duì)CFMMV侵染的高水平的抗性(免疫力)，而且通過(guò)生物的或者分子的方法不能在接種的植株上發(fā)現(xiàn)病毒蹤跡。檢測(cè)了許多有關(guān)抗性反應(yīng)的參數(shù)。在重復(fù)試驗(yàn)中，盡管被組成型強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)基因株系的54-kDa位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累水平一直低(圖6)。不希望受特殊的機(jī)制的束綽，抗性可與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特殊的降解有關(guān)，如以前報(bào)道的為對(duì)植物病毒的沉默介導(dǎo)的抗性。有意思的是，用CFMMV或者ZYMV接種轉(zhuǎn)基因植物不能影響此54-kDa的編碼序列的RNA表達(dá)水平(圖6)。相反，在許多研究中，在抗性機(jī)制中意味著沉默時(shí)，用同源病毒接種轉(zhuǎn)基因抗性植林減少了病毒RNA的水平(Savenkov,E.I.和Valkonen,J.P.2002.JGenVirol83:2325-2335)。用已知存在沉默抑制基因的病毒提前侵染，不能削弱轉(zhuǎn)基因植物對(duì)具挑戰(zhàn)性的CFMMV的侵染的抗性。這一觀察與轉(zhuǎn)基因的W.6eW/w附^mfl(煙草)對(duì)馬鈴薯A病毒或李痘病毒的沉默介導(dǎo)的抗性的報(bào)告不一樣，其中轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)用馬鈴薯Y病毒分別提前侵染而克服了抗性。本發(fā)明揭示易感病黃瓜通過(guò)嫁接到轉(zhuǎn)基因的抗性砧木上受保護(hù)而不被CFMMV土壤接種侵害。這樣，本發(fā)明首次證明，通過(guò)嫁接到表達(dá)與病毒基因組一片段同源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因砧木，易感病幼芽可被保護(hù)而不被土傳病毒侵害。在此揭示的轉(zhuǎn)基因砧木介導(dǎo)的保護(hù)具重要的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值，使非基因修飾的(非-GMO)農(nóng)產(chǎn)品可生長(zhǎng)并被充分的保護(hù)不被土傳病菌侵害。根據(jù)另一實(shí)施方案，抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木包括一DNA構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生耙向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA。轉(zhuǎn)錄后基因沉默這一現(xiàn)象可被兩類轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)引發(fā)。第一種類型相當(dāng)于高度轉(zhuǎn)錄單基因，如上述的。第二種有效地引發(fā)PTGS的轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的類型是那些含兩個(gè)轉(zhuǎn)基因重復(fù)的位點(diǎn)，其排列成通過(guò)通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA的反向重復(fù)(IR)。雙鏈RNA(dsRNA)在許多有機(jī)體(包括植物)中對(duì)抑制特殊基因表達(dá)非常有效。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)，例如，已在許多植物RNA病毒中被證實(shí)(Vance和Vaucheret,2001.Science292:2277-2280)。雙鏈RNA(dsRNA)分子發(fā)動(dòng)這個(gè)過(guò)程。dsRNA分子可能由病毒RNA或者異常的轉(zhuǎn)基因編碼的RNA的復(fù)制中間產(chǎn)物產(chǎn)生，其通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶活性作用變成dsRNA(Dalmay等.2000.Cell101:543-553;Waterhouse等.2001.Nature411:834-842)。這樣的dsRNA分子已被合成到植物細(xì)胞，且顯示在抑制或者阻止病毒基因表達(dá)方面有用(見(jiàn)，例如，美國(guó)申請(qǐng)No.20020169298)。在植物細(xì)胞中，dsRNA被一核糖核酸酶III家族的酶剪切成短干擾RNA(siRNA),其大小范圍一般在21到26個(gè)核苷酸。人們相信siRNA然后通過(guò)形成多成分的核酸酶復(fù)合物RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)促進(jìn)RNA降解，其破壞同源mRNA(Elbashir等.2001.EMBOJ20:6877-6888;Zanore等.2000.Cell101:25-33)。近來(lái)，已顯示這樣的大小范圍在21到26個(gè)核苷酸的siRNA是RNAi通路的中間產(chǎn)物，其抑制動(dòng)物和哺乳系統(tǒng)中的基因表達(dá)同樣有效。siRNA的運(yùn)用于是已成為一個(gè)下調(diào)基因表達(dá)的有力工具。轉(zhuǎn)錄后基因沉默以一種非常典型的與病毒傳播相像的方式系統(tǒng)地在單個(gè)植抹中傳播。這導(dǎo)致系統(tǒng)沉默信號(hào)的假說(shuō)，其在組織中產(chǎn)生并發(fā)動(dòng)沉默，然后轉(zhuǎn)移到植物遠(yuǎn)端部分，在那里其可以序列特異的方式發(fā)動(dòng)沉默。沉默的這一序列特異性暗示信號(hào)是核酸，但是信號(hào)實(shí)體未知(Kalantidis,K.2004.PloSBiology2:1059-1061)。沉默主要以從碳源到碳庫(kù)的方向傳播，即如葉子這樣的運(yùn)輸出光合作用糖類產(chǎn)物的組織到如根這樣的運(yùn)輸入這些產(chǎn)物的組織，而且其可能需要幾周的時(shí)間直到其在整個(gè)植抹中建立。沉默信號(hào)的存在已在嫁接植抹中被顯示，從而沉默從沉默了的砧木轉(zhuǎn)移到了靶幼芽。然而，這樣的信號(hào)轉(zhuǎn)移依賴于幼芽的相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。而且，被證實(shí)染色體的相應(yīng)的基因，無(wú)論是內(nèi)源基因或者幼芽的穩(wěn)定、完整的外源基因，其過(guò)表達(dá)是由從砧木到幼芽的信號(hào)轉(zhuǎn)移來(lái)介導(dǎo)的引發(fā)RNA降解的一個(gè)必需的首要事件。本發(fā)明證實(shí)轉(zhuǎn)基因砧木，其表達(dá)靶向使病毒基因組序列沉默的dsRNA,通過(guò)嫁接將抗病毒性授予易感病幼芽。幼芽被授予病毒抗性暗示從砧木轉(zhuǎn)移到幼芽的信號(hào)有效地剪切病毒基因組序列。這樣，本發(fā)明首次表明從砧木轉(zhuǎn)移到幼芽的信號(hào)以一種序列特異的方式干預(yù)植物基因組中不表達(dá)的核酸序列的功能性表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明轉(zhuǎn)移了的信號(hào)是RNA。Smirnov等(如前)揭示了轉(zhuǎn)基因植物中的美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)誘導(dǎo)嫁接植物的病毒抗性。作者們進(jìn)一步證實(shí)幼芽獲得的抗性不依賴于水楊酸的積累和發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白的合成。然而，這些結(jié)果與本發(fā)明描述的現(xiàn)象非常不同，因?yàn)楫a(chǎn)生使幼芽抗病毒侵染的信號(hào)需要PAP酶活性。另外，與授予給本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的序列特異抗性不同，PAP活性授予非特異的病毒抗性。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明揭示通過(guò)嫁接到轉(zhuǎn)基因抗性煙草砧木，易感病煙草幼芽(6e,"/^m/a憩)受保護(hù)而抗小西葫聲黃花葉病毒(ZYMV)，其中，抗性砧木包括被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向ZYMV基因組的片段的siRNA的DNA構(gòu)建體，其包括為一外殼蛋白編碼的基因和病毒基因組3，非翻譯區(qū)。這一實(shí)施方案為一非限定例，展示本發(fā)明在此上文描述的更廣的范圍。本發(fā)明的組成和方法可能被使用到授予抗性給任何對(duì)病毒侵染敏感的植物。非限制性的例子包括葫,科植物、大豆、小麥、燕麥、高粱、棉花、番茄、馬鈴薯、煙草、辣椒、水稻、玉米、大麥、蕓莒和擬南芥。才艮據(jù)一實(shí)施方案，嫁接的抗病毒的植物屬葫蘆科。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因的抗病毒植物選自一組植物包括西瓜、甜瓜、西葫,、南瓜、小西葫蘆和黃瓜。病毒特異性可能通過(guò)轉(zhuǎn)化到植物中的核酸序列的類型和設(shè)計(jì)來(lái)決定。核酸序列可編碼一靶向以使病毒基因組一個(gè)或者更多的相應(yīng)片段沉默的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而且多于一個(gè)核酸序列可被轉(zhuǎn)化到植物中。根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明提供一植抹包括一轉(zhuǎn)基因砧木，其包括一具有與土傳病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%相同性的核酸序列以致抗由土傳病毒引起的疾病，和對(duì)疾病易感病的幼芽，其中4家接的植抹受保護(hù)而不被由所述的土傳病毒導(dǎo)致的所述疾病侵害。根據(jù)一實(shí)施方案，植物抗由土傳病毒導(dǎo)致的疾病，病毒選自以下組包括(但不受限于)線蟲(chóng)傳播的病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣祐又環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘嚴(yán)褪綠條紋病毒。根據(jù)一實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木包括一核酸序列，其編碼為黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的復(fù)制蛋白的一部分的假定54kDa蛋白。根據(jù)一現(xiàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因砧木包括一核酸序列，其具有在序列IDNO:l中闡明的序列。根據(jù)另外的實(shí)施方案，本發(fā)明提供一植株，其包括一包括被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向一病毒基因組至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因砧木以致抗由病毒導(dǎo)致的疾病，和一易感所述病毒導(dǎo)致的疾病的幼芽，其中4家接的植抹抗所述病毒的所述侵染。依賴于病毒基因組的耙片段，植物可被設(shè)計(jì)以抗任何病毒。根據(jù)某些實(shí)施方案，如在此上文描述的，植抹抗由可感染植林的地上部分的載體傳^番的病毒，也抗土傳病毒。根據(jù)一實(shí)施方案，被^:計(jì)以產(chǎn)生靶向一病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體包括(a)可操作地連接的至少一種植物的可表達(dá)啟動(dòng)子；(b)核酸序列，其編碼形成至少一個(gè)RNA雙鏈的RNA序列，其中雙鏈RNA分子包括具有與病毒基因組的耙片段的有義核苷酸序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核芬酸的第一核苷酸序列；具有與所述病毒基因組的所述靶片段的有義核苦酸序列互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核苷酸的第二核苷酸序列；間隔序列；并且視需要，(c)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。根據(jù)一些實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明DNA構(gòu)建體被設(shè)計(jì)以表達(dá)莖環(huán)RNA,其除包括第一(有義)和第二(反義)核苦酸序列外還包括位于第一和第二核苷酸序列的DNA編碼區(qū)之間的間隔多聚核苷酸序列。間隔多聚核苷酸序列的長(zhǎng)度可根據(jù)莖環(huán)RNA特殊的結(jié)構(gòu)變化。典型地，間隔序列的長(zhǎng)度與第一和第二核苷酸長(zhǎng)度的比率為1:5到1:10。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體包括(a)可操作地連接的至少一種植物的可表達(dá)啟動(dòng)子；(b)編碼形成至少一個(gè)莖環(huán)形式的RNA雙纟連的RNA序列的核酸序列，其中雙鏈RNA分子包括具有與病毒基因組的靶片4殳的有義核苷酸序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核苷酸的第一核苷酸序列；具有與所述病毒基因組的所述靶片段的有義核苦酸序列互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近核苷酸的第二核苷酸序列；間隔序列；并且視需要，(c)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。根據(jù)一實(shí)施方案，間隔序列包括來(lái)自基因內(nèi)含子的核苷酸序列，已知其在此項(xiàng)技術(shù)中增加siRNA的產(chǎn)量。根據(jù)一實(shí)施方案，間隔序列包括包含來(lái)自蓖麻過(guò)氧化氫酶基因的內(nèi)含子的核苦酸序列，其具有在序列IDNO:3中闡明的序列。在此用到的術(shù)語(yǔ)"DNA構(gòu)建體"和"核酸序列"指多聚核苷酸分子，其包括至少一個(gè)在宿主細(xì)胞或者有機(jī)體表達(dá)的多聚核苷酸。典型地，這種表達(dá)在某些順式作用調(diào)節(jié)元件控制下，包括組成型的、可誘導(dǎo)的或者組織特異的啟動(dòng)子、以及增強(qiáng)元件。在本領(lǐng)域中普遍的，這樣的多聚核苷酸序列#皮述為"可操作的連接到"調(diào)節(jié)元件。典型地轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞的核酸序列也包括源于真核的或者細(xì)菌的可選捧的標(biāo)記，用于包括此核酸序列的真核細(xì)胞的選4奪。在本領(lǐng)域中已為我們充分地熟知的這些序列可包括(但不限于)，各種授予抗生素抗性的基因和各種報(bào)告基因。視情況，此核酸序列可進(jìn)一步包括克隆位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的原核起源、一個(gè)或多個(gè)翻譯開(kāi)始位點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)多聚腺苷信號(hào)和相似的。在此用到的術(shù)語(yǔ)"核酸序列的表達(dá)，，，或"多聚核苷酸的表達(dá)"指一個(gè)過(guò)程，其中與合適的調(diào)節(jié)區(qū)，特別是啟動(dòng)子區(qū)，可操作地連接的DNA區(qū)被轉(zhuǎn)錄成具生理活性的RNA,即，其能與另一核酸相互作用或其可被翻譯成多肽或蛋白。應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，為了獲得病毒基因或其部分的沉默，蛋白的翻譯不是必要的。術(shù)語(yǔ)"基因的表達(dá)"指通過(guò)此基因的"轉(zhuǎn)錄"(即通過(guò)RNA多聚酶的酶作用)到RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、或snRNA)和通過(guò)mRNA的"翻譯，，到蛋白質(zhì)的傳遞基因中的遺傳信息的過(guò)程?；虻谋磉_(dá)可在此過(guò)程的許多階段被調(diào)節(jié)。"上調(diào)"或"激活"指增加基因表達(dá)產(chǎn)物(即RNA或蛋白質(zhì))產(chǎn)量的調(diào)節(jié)，"下調(diào)，，或"抑制"指減少產(chǎn)量的調(diào)節(jié)。參與上調(diào)或下調(diào)的分子(例如轉(zhuǎn)錄因子)通常被分別稱為"激活子"和"抑制子"。本發(fā)明的為病毒基因組的一個(gè)部分的核苷酸序列可為全長(zhǎng)基因、其部分、非編碼區(qū)或其部分或其組合。當(dāng)在此用到的術(shù)語(yǔ)"同源性"用于與核酸序列有關(guān)時(shí)，指至少兩個(gè)核苷酸序列間的相似性或相同性的程度?？赡苡胁糠值耐葱曰蛘咄耆耐葱?即相同性)。"序列相同性"指兩個(gè)或者更多的核苷酸序列間的關(guān)聯(lián)度的測(cè)量，以對(duì)于總的對(duì)照長(zhǎng)度的百分率表示。相同性的計(jì)算考慮那些相同的、在其各自的序列中處于相同相對(duì)位置的核苷酸殘基。一個(gè)間隙，即在一列中的一個(gè)位置，殘基在一個(gè)序列中此處出現(xiàn)但在另一個(gè)中不出現(xiàn)，被認(rèn)為是具不同殘基的位置。同源性用如基于GappedBLAST的搜索(Altsclml等.1997NucleicAcidsRes.25:3389-3402)和"BESTFIT"測(cè)定.在此用到的"核苷酸序列的互補(bǔ)序列，，是指能與核普酸序列形成雙鏈DNA分子的核苦酸序列，而且其根據(jù)夏格夫法則(AT;GC)通過(guò)它們的互補(bǔ)核苷酸代替此核苷酸和從5，到3'方向閱讀，即按核苷酸序列的相反方向，能由此核苷酸序列得到。在此用到的RNA分子的核苷酸序列可通過(guò)與序列列表中的DNA核苷酸的相關(guān)性來(lái)鑒別。然而，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)根據(jù)其內(nèi)容了解RNA或者DNA是否為想要的。而且，除了在RNA分子中T-堿基被尿嘧啶(U)所代換了，核苷酸序列是相同的。應(yīng)理解的是，與病毒基因組的片段同源的核酸序列總長(zhǎng)越長(zhǎng)，對(duì)與病毒基因組的片段的序列相同的序列的需要就越不嚴(yán)格?？偟暮怂嵝蛄锌删哂信c病毒基因組的相應(yīng)片段至少約90%的序列相同性，也可具有更高的約95%或100%的序列相同性。沖艮據(jù)某些實(shí)施方案，其中砧木包括DNA構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA,DNA構(gòu)建體的第二(反義)核苷酸序列的長(zhǎng)度很大程度上決定于第一(有義)核香酸序列的長(zhǎng)度，而且，可能與后者序列的長(zhǎng)度相關(guān)。然而，可以用在長(zhǎng)度上約10%不同的反義序列。相似地，反義區(qū)域的核苦酸序列在很大程度上決定于有義區(qū)域的核苷酸序列，而且可能具有與有義區(qū)域的互補(bǔ)序列大約90%的序列相同性，也可具有更高的約95%或100。/。的序列相同性。被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生siRNA的DNA構(gòu)建體的第一和第二核苷酸序列可為任何長(zhǎng)度，其提供包括至少20個(gè)鄰近核苷酸的序列。這樣，第一和第二核苷酸可包括靶序列的一部分或者此耙序列的全長(zhǎng)。才艮據(jù)一些實(shí)施方案，核苷酸序列的長(zhǎng)度為從20個(gè)核香酸到1,200個(gè)核普酸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的siRNA,其目的是使ZYMV基因組的包括病毒外殼蛋白的編碼區(qū)域的片段沉默。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，第一核苷酸序列包括核苷酸序列，其具有與在序列IDNO:2中闡明的核苷酸序列或者其片段90%、優(yōu)選地95%，更優(yōu)選地100%的相同性。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，第二核香酸序列包括一核苷酸序列，其具有與在序列IDNO:2中闡明的核香酸序列或其片段的互補(bǔ)序列90%、優(yōu)選地95%,更優(yōu)選地100%的相同性。根據(jù)一些實(shí)施方案，第一和第二核苷S臾序列可操作地連接到同一啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄了的鏈，其至少部分互補(bǔ)，可形成dsRNA。才艮據(jù)其他的實(shí)施方案，第一和第二核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄成兩個(gè)單獨(dú)的鏈。當(dāng)dsRNA這樣產(chǎn)生后，應(yīng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列^L兩個(gè)啟動(dòng)子^v側(cè)面相連，一個(gè)控制第一核苦酸序列的轉(zhuǎn)錄，另一個(gè)控制第二互補(bǔ)的核香酸序列的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)啟動(dòng)子可相同或者不同。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二核苦S吏序列可操作地連接到同一啟動(dòng)子。將受想要運(yùn)用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的植物物種、可用性和所要求的作用方式的指示。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，優(yōu)選的啟動(dòng)子是組成型的啟動(dòng)子，或普通的或組織特異的。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"組成型的"用于指啟動(dòng)子時(shí)，其意思為在沒(méi)有刺激物(例如熱激、化學(xué)藥品、光等)存在的條件下啟動(dòng)子可指導(dǎo)可操作地連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。典型地，組成型啟動(dòng)子可指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在實(shí)質(zhì)上地任何細(xì)胞和組織的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子經(jīng)常被用于組成型基因在植物中的表達(dá)，其包括CaMV35S啟動(dòng)子、增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、玄參花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子、甘露堿合酶(mas)啟動(dòng)子、胭脂堿合酶(nos)啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子。優(yōu)選地運(yùn)用本發(fā)明的發(fā)明人和合作者從草莓鑲脈病毒(SVBV)分離出來(lái)的組成型啟動(dòng)子(Wang等，2001.VirusGenes20:11-17)。抑制特殊基因的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)的潛在作用導(dǎo)致各種新方法的發(fā)展以獲得細(xì)胞中活性siRNA。例如，美國(guó)申請(qǐng)No.20040262249揭示了siRNA的直接誘導(dǎo)以在植物細(xì)胞中沉默靶基因，特別是病毒基因。本發(fā)明的教導(dǎo)可通過(guò)任何本領(lǐng)域中已知的方法實(shí)踐以在植物細(xì)胞中產(chǎn)生siRNA,或者直接誘導(dǎo)siRNA到植物細(xì)胞中。與在此上面描述的核酸序列雜交，特別是與(i)具有選自序歹'JIDNO:1和序列IDNO:2的核苦酸序列的核酸或(ii)選自序歹'jIDNO:1和序列IDNO:2的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段雜交的核酸序列也包括在本發(fā)明的范圍。成功的雜交很大程度上依賴于雜交條件。在此用到的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格的條件"或"嚴(yán)格性"指雜交的條件，決定于核酸、鹽和溫度。在本領(lǐng)域中這些條件都已為我們所熟知，而且可能被改變以便鑒別或者檢測(cè)相同的或相關(guān)的多聚核苷S吏序列。許多等效的條件包括或高或低的嚴(yán)格性，其依賴于像長(zhǎng)度和序列(DNA、RNA和堿基組成)的特性、目標(biāo)序列(DNA、RNA和堿基組成)的特性、環(huán)境(在溶液中或固定在固體基質(zhì))、鹽和其他成分(例如曱酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)的濃度和反應(yīng)(在低于探針融化溫度的從約5。C到約25。C的范圍)的溫度等因素。一個(gè)或者多個(gè)因素可被改變以產(chǎn)生或高或低的嚴(yán)格性的條件。雜交和洗脫條件已被熟知而且在Sambrook等Molecularcloning:Alaboratorymanual,SecondEdition,ColdSpringHarbor,NY.1989,尤其是chapter11中有例證。根據(jù)一實(shí)施方案，雜交在適中的嚴(yán)格性(在65。C、L0-2.0XSSC)下進(jìn)行。為了含有本發(fā)明的構(gòu)建體的植物細(xì)胞的選擇，典型地被設(shè)計(jì)的以將核香酸序列轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中的構(gòu)建體也包括可選擇標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)"可選擇標(biāo)記"指基因，其編碼一種具有一種使細(xì)胞具有一種抗生素或者藥物抗性的活性的酶，在細(xì)胞中選擇性標(biāo)記被表達(dá)，或者指使一種可被檢測(cè)到的性狀(例如發(fā)光或熒光)表達(dá)的基因。典型地，二綬予抗生素抗性和在本領(lǐng)域中已為我們所熟知的基因用作選#^生標(biāo)記。然而，即使最終產(chǎn)物不含有此外來(lái)遺傳物質(zhì)，大田中授予抗生素抗性的遺傳修飾了的植物，特別是農(nóng)作物，在西方國(guó)家不允許大批生長(zhǎng)。體的轉(zhuǎn)化植抹。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，共轉(zhuǎn)移的實(shí)施是用根據(jù)本發(fā)明的授予病毒基因沉默的DNA構(gòu)建體和包括至少一個(gè)選擇性標(biāo)記的DNA構(gòu)建體。共轉(zhuǎn)移的方法在本領(lǐng)域中已為我們所知，而且部分基于高百分率的轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有兩個(gè)DNA構(gòu)建體的發(fā)現(xiàn)。表達(dá)選擇性標(biāo)記的植物被檢查到授予病毒基因沉默的DNA構(gòu)建體的存在，例如通過(guò)PCR反應(yīng)。被選擇的植物長(zhǎng)到成熟并自花授粉。在產(chǎn)生的后代中，兩個(gè)DNA構(gòu)建體各自分離，允許選擇包括想要的DNA構(gòu)建體的植株?？蛇x擇地，使病毒基因裂解的核酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。可用于本發(fā)明的構(gòu)建體的多種終止子被所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些終止子可來(lái)自啟動(dòng)子序列的相同的基因或者來(lái)自不同的基因。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是NOS終止子。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)抗病毒侵染的嫁接植抹的方法，其包括以下步驟(a)提供抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木而不是通過(guò)表達(dá)抗病毒蛋白的方法；(b)提供對(duì)所述病毒易感的幼芽；(c)將幼芽嫁接到砧木上以獲得抗所述病毒侵染的嫁接植林。嫁接包括將兩個(gè)獨(dú)立的植抹部分結(jié)合成一抹植物。這樣的結(jié)合可通過(guò)各種方法實(shí)施，包括(但不限于)枝接和舌接、合接、劈接、側(cè)接、鞍接和芽接(需要更多的細(xì)節(jié)見(jiàn)GarnerRJ,,TheGrafter'sHandbook,5thEDedition(March1993)CassellAcademic:ISBN:0304342742)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，用具有與病毒基因組的至少一個(gè)片段至少90%的相同性的核苷酸序列轉(zhuǎn)化砧木以產(chǎn)生抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木。根據(jù)另一實(shí)施方案，砧木用被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生耙向病毒基因組的至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生抗病毒侵染的轉(zhuǎn)基因砧木。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，此病毒基因組受影響的部分對(duì)病毒侵染植物和/或復(fù)制是必需的，因此它的裂解阻止了病毒侵染和/或復(fù)制，這樣產(chǎn)生了抗性植物。根據(jù)本發(fā)明用核酸序列轉(zhuǎn)化砧木以使砧木抗病毒侵染的方法在本領(lǐng)域中已為我們所知。在此用到的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)化中"描述一個(gè)過(guò)程，外來(lái)的DNA如DNA構(gòu)建體通過(guò)其進(jìn)入和改變受體細(xì)胞，使其成為轉(zhuǎn)化了的、遺傳修飾了的或者轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可能是穩(wěn)定的，其中核酸序列被整合到植物基因組，而且同樣地表現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳性狀；或者是瞬時(shí)的，其中核苷酸序列在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)但是未被整合到基因組，而且同樣地表現(xiàn)出瞬時(shí)的性狀。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的核酸序列被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞。將外來(lái)的基因?qū)雴巫尤~或雙子葉植物有多種方法(Potrykus,I.1991.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42，205-225;Shimamoto，K.等1989.Nature(1989)338，274-276)。穩(wěn)定整合外源DNA到植物基因組DNA的基本方法包括兩種方式土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移土壤桿菌介導(dǎo)的系統(tǒng)包括包含整合到植物基因組DNA中的固定DNA片段的質(zhì)粒載體的運(yùn)用。接種植物組織的方法根據(jù)植物物種和土壤桿菌運(yùn)輸系統(tǒng)而改變。一個(gè)廣泛地運(yùn)用的方法是葉盤(pán)法，其可用任何組織的外植體實(shí)施，外植體提供一個(gè)好的開(kāi)始整個(gè)植林分化的來(lái)源(Horsch，R.B.等.簡(jiǎn).PlantMolecularBiologyManualA5,l-9，KluwerAcademicPublishers,Dordrecht)。|蕭助的方法4吏用土^裏一干菌運(yùn)輸系統(tǒng)結(jié)合真空滲透。土壤桿菌系統(tǒng)在創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因雙子葉植物時(shí)特別有用。直接DNA獲取。有各種直接DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的方法。在電穿孔法中，原生質(zhì)體暫時(shí)地暴露在強(qiáng)電場(chǎng)中，打開(kāi)了小孔允許DNA進(jìn)入。在微注射中，用微量移液器DNA被機(jī)械地直接地注射到細(xì)胞中。在微粒轟擊法中，DNA被吸收到微彈，例如硫酸鎂晶體或鴒粒，微彈被物理地加速到細(xì)胞或者植物組織中。轉(zhuǎn)化穩(wěn)定后，接著進(jìn)行植物的繁殖。最普遍的植物繁殖的方法是通過(guò)種子。然而，既然種子由植物根據(jù)孟德?tīng)栆?guī)則控制的遺傳變異產(chǎn)生，通過(guò)種子繁殖的再生的缺點(diǎn)是由于雜合性，作物缺乏一致性。換句話說(shuō)，每粒種子遺傳上是不同的，每粒會(huì)長(zhǎng)有其自身特殊的性狀。于是，優(yōu)選的是影響再生使得再生植林與轉(zhuǎn)基因親本植抹具有相同的性狀和特征。優(yōu)選的再生轉(zhuǎn)化植抹的方法是微繁殖，其提供一個(gè)迅速的、連續(xù)的繁殖轉(zhuǎn)化植抹的方法。微繁殖是從一個(gè)選擇出來(lái)的親本植抹或者品種中的單個(gè)組織樣本生長(zhǎng)第二代植物的方法。此方法允許具有優(yōu)選組織和表達(dá)融合蛋白的植抹的批量繁殖。這些新生產(chǎn)出來(lái)的才直抹與源植抹遺傳上一致且具有所有的源植抹的特征。微繁殖允許在短的時(shí)間內(nèi)批量生產(chǎn)具質(zhì)量的植物材料，并且提供在保留源轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植抹的特征的情況下快速的繁殖選擇出來(lái)的品種。此植物克隆方法的優(yōu)點(diǎn)包括植物繁殖的速度和生產(chǎn)出的植物的質(zhì)量和一致性。微繁殖是一個(gè)多階段的過(guò)程，其需要在兩個(gè)階段間更換培養(yǎng)基或者生長(zhǎng)環(huán)境。微繁殖的過(guò)程包括四個(gè)基本的階段第一階段，原始組織的培養(yǎng)；第二階段，組織培養(yǎng)物的增殖；第三階段，分化和植抹形成；第四紀(jì)段，溫室培養(yǎng)和鍛煉。在第一階段期間，建立組織培養(yǎng)并保證無(wú)菌。在第二階—險(xiǎn)期間，原始組織培養(yǎng)物增殖直到足夠的組織樣品產(chǎn)生出來(lái)以滿足生產(chǎn)目標(biāo)。在第三階段期間，新生長(zhǎng)的組織樣品被分開(kāi)，種植成單獨(dú)的小苗。在第四階段，轉(zhuǎn)化了的小苗轉(zhuǎn)移到溫室接受鍛煉，在溫室植物對(duì)光的忍耐力逐漸升高以至于它們可以在自然環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員希望核酸序列的各種成分和在本發(fā)明中描述的轉(zhuǎn)化載體可操作地連接，這樣可以引起所述核酸或核酸片段的表達(dá)?？刹僮鞯剡B接構(gòu)建體和本發(fā)明的載體的成分的技術(shù)已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些技術(shù)包括運(yùn)用接頭，例如人工接頭，例如包括一個(gè)或多個(gè)限制性酶位點(diǎn)。就如在此下面的范例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因砧木表達(dá)外源的RNA分子，特別是同源于靶病毒的基因組的至少一個(gè)片段的RNA序列。表達(dá)可通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法監(jiān)控，例如通過(guò)分離轉(zhuǎn)基因植物葉片的RNA和通過(guò)使用特殊的引物用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測(cè)試病毒RNA的存在。本發(fā)明也涉及一個(gè)植物細(xì)胞或者其它部分，其根據(jù)本發(fā)明用核酸序列轉(zhuǎn)化作為砧木。而且，本發(fā)明也包含由此轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)出的種子，其中種子也包括轉(zhuǎn)化到植物中的核酸序列。通過(guò)常規(guī)的育種程序，轉(zhuǎn)基因抗性植物可為了砧木的大批量生產(chǎn)被繁殖。而且，育種可用于引導(dǎo)DNA構(gòu)建體到其他各種相同的或者相關(guān)的植物物種，或者到雜交植物中。從轉(zhuǎn)基因植物獲得的種子包含作為一個(gè)穩(wěn)定的基因組插入的核酸序列，這樣，本發(fā)明也包含在此描述的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代，其由轉(zhuǎn)基因植物的種子長(zhǎng)成。任何一種上面描述到的轉(zhuǎn)基因植物可作為砧木，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，幼芽被嫁接到其上。用本發(fā)明的核酸序列轉(zhuǎn)化以提供轉(zhuǎn)基因抗性砧木的植株，其挑選的實(shí)施是用已為所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的分子遺傳學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，核酸序列也包括一個(gè)核酸序列，其編碼授予抗生素抗性的產(chǎn)物，而且這樣轉(zhuǎn)基因植物根據(jù)它們對(duì)抗生素的抗性來(lái)選擇。根據(jù)某些實(shí)施方案，作為選擇性標(biāo)記的此抗生素屬于由巴雷霉素和卡那霉素組成的氨基糖苷組。根據(jù)其他的實(shí)施方案，核酸序列還包括一個(gè)編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的報(bào)告基因，而且這樣產(chǎn)物在其中被;險(xiǎn)測(cè)到的轉(zhuǎn)基因植物被挑選出來(lái)。根據(jù)某些實(shí)施方案，報(bào)告基因選自GUS、GFP和類似物組成的組。根據(jù)另一實(shí)施方案，根據(jù)其對(duì)病毒侵染的抗性，轉(zhuǎn)化以提供抗性砧木的植抹被挑選出來(lái)。被選擇以挑戰(zhàn)植物的病毒在其基因組中包括此轉(zhuǎn)化到植物中的核酸序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植林根據(jù)其對(duì)一種土傳病毒的抗性被挑選出來(lái)，病毒選自此組病毒包括(但不受限于)，線蟲(chóng)傳播病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪根據(jù)另一實(shí)施方案，根據(jù)其對(duì)由感染植抹地上部分的載體傳播的病毒的抗性挑選轉(zhuǎn)基因植物，病毒選自一個(gè)科，所述科包括(但不受限于)花椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸孤病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、豇豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番^叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科；煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃脈病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、蕪苓黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗病毒嫁接植株。本來(lái)易感病毒病的幼芽被嫁接到一轉(zhuǎn)基因的抗性砧木，包括此幼芽的植抹抗病毒病。此砧木包括根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定地整合到其基因組的核酸序列。核酸序列或者是高度地被轉(zhuǎn)錄的單個(gè)轉(zhuǎn)基因，或者是如在此上面描述的產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)基因，其性質(zhì)決定授予嫁接植抹的抗性特征。根據(jù)某些實(shí)施方案，砧木授予保護(hù)而不被土傳病毒導(dǎo)致的疾病的侵害。根據(jù)其他實(shí)施方案，砧木授予對(duì)一種由侵染植抹的地上部分的載體傳播的病毒導(dǎo)致的疾病的抗性。接下來(lái)的在此下面的非限制性的實(shí)施例描述抗性植抹，根據(jù)本發(fā)明其包括砧木和幼芽。除非在實(shí)施例中另外陳述，所有園藝方法和重組DNA與RNA技術(shù)一樣，沖艮據(jù)已為所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)的步驟實(shí)施。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建雙元載體戶C4MSTM)a利用前述Antignus等的全長(zhǎng)克隆技術(shù)，將位于3629位點(diǎn)(圖1A)的帶有AUG上游22個(gè)核苷酸的假定為54-kDa的編碼序列克隆到pCambia2301雙元載體中(注冊(cè)號(hào)AF234316;Hajdukiewicz等，1994.PlantMolBiol25:989-994)。54kDa編碼序列的5，端與ZYMV的非編碼區(qū)(NCR)融合，3，端(T)與NOS多聚A終止子融合(圖IB)。所克隆基因與NPTII標(biāo)記基因分別克隆于截短的草莓鑲脈病毒(SVBV)啟動(dòng)子(下文稱為SV)和全長(zhǎng)的SVBV啟動(dòng)子下游(Wang等，2000.VirusGenes20:11-17,圖IB)。此DNA構(gòu)建體克隆于T-DNA左端(LB)和右端(RB)之間(圖IB)。與ZYMV5，NCR相接的SV啟動(dòng)子是利用SV的正向引物(序列IDN0:5:5'CGCTAGCTATCACTGAAAAGACAGC3，)和帶有Ncol酶切位點(diǎn)(標(biāo)有下劃線)的反向引物(序列IDNO:6:5，GGCCATGGTTATGTCTGAAGTAAACG3')以ASVBVpr-ZYMV-FLC克隆(Wang等，見(jiàn)上文)為模板PCR擴(kuò)增的。將PCR片段(470bp)克隆到pGEM-T載體(Promega,Madison,WI，USA)中，定名為pASVBV-NCRzy。54-kDa編碼序列是利用以下引物從pUC3，-3.3kbPCR擴(kuò)增的5，CGG￡￡AISSCATCGAAGGCGGGTTTTTGGACG3，(54-kDa正向，攜帶的Ncol酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)記，序列IDNO:7)，5，GAGGTGACCTAGACACTAGGCTTAATGAATAG3，(54-kDa反向，攜帶的BstEII酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)記，序列IDNO:8)。由PCR擴(kuò)增的推測(cè)的54-kDa片段(1461bp)經(jīng)NcoI/BstEII酶切后克隆到經(jīng)NcoI/BstEII酶切的pASVBV-NCRzy中。將得到的克隆pASVBV-NCR54-kDa用EcoRI/BstEII雙切，將得到的插入片段克隆到經(jīng)EcoRI/BstEH雙切的雙元載體pCAMBIA2301中。經(jīng)以下流程，將pCAM35S-SV54-kDa中的35S啟動(dòng)子(位于NPTII基因上游)替換為完整的SVBV啟動(dòng)子之前已將SVBV啟動(dòng)子克隆到pGEM-T中，定名為SVBVpr(Wang等，見(jiàn)上文)，>^人該克隆的EcoRI/Bglll位點(diǎn)將SVBV啟動(dòng)子雙切下來(lái)，然后克隆到雙元載體的相同位置并定名為pCAMSV54-kDa。將構(gòu)建的最終載體(圖IB)導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌林中，用于目的植林的轉(zhuǎn)化。用于產(chǎn)生siRNA的DNA構(gòu)建體pCddCP-ZY的構(gòu)建利用PCR方法，將包括編碼病毒外殼蛋白的完整基因和3'非編碼區(qū)(NCR)(序列IDNO:2，注冊(cè)No.M35095)在內(nèi)的ZYMV基因組3'端擴(kuò)增出來(lái)，所用引物為含BamHI和Kpnl酶切位點(diǎn)的正向引物(5，ATGGATCCCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGC3，序列IDNO:10)和含Narl和Pstl酶切位點(diǎn)的反向引物(5'ATGGCGCCGGTACCAGGCTTGCAAACGGAGTC3，序列IDNO:ll)。該片段是從一種ZYMV的以色列種中分離的，與注冊(cè)號(hào)為NC一0033224(序列IDN0:9)的ZYMV基因組核酸序列的8538到9588位點(diǎn)同源。首先，將一個(gè)過(guò)氧化氬酶內(nèi)含子克隆到KSBluescript載體的多克隆位點(diǎn)?？寺〉倪^(guò)氧化氬酶內(nèi)含子5'端含BamHI和Pstl酶切位點(diǎn)，3'端含Narl和KpnI酶切位點(diǎn)。將ZYMV基因組3，端的PCR產(chǎn)物(1050bp)用Kpnl和Narl雙切，將酶切后的片段克隆到KS質(zhì)粒中過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子的下游(3'端)。然后將PCR產(chǎn)物用BamHI和PstI雙切，將酶切產(chǎn)物克隆到KS質(zhì)粒中過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子的5，端。這將在KS質(zhì)粒中產(chǎn)生一個(gè)由過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子分隔的ZYMV基因組3'端的反向重復(fù)序列。將此克隆定名為pKSddCP-ZY。來(lái)自一個(gè)pCambia雙元栽體2301的35SCaMV啟動(dòng)子被SVBV啟動(dòng)子取代。前面描述的構(gòu)建體pKSddCP-ZY,被BamHI和Kpnl剪切，而且克隆到合適的位點(diǎn)BamHI和Kpnl(SVBV啟動(dòng)子的下游和NOS終止子的上游)。將此新克隆命名為pCddCP-ZY(圖2)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌培養(yǎng)物在含有合適的選擇性的抗生素和100|iM乙酰丁香酮的LB培養(yǎng)基中于28t:生長(zhǎng)一夜，然后在相同的環(huán)境下在沒(méi)有抗生素的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)4h。細(xì)菌沉降下來(lái)并在包含3%蔗糖最終密度為0.5OD的液體MS培養(yǎng)基中重新懸浮(Murashige，T.和Skoog,F.1962.PhysiologyPlantarum15:473-497)。轉(zhuǎn)化的方法如前面描述的(Tabei等,1998PlantCellreport17:159-164)，作了一些修改。黃瓜的轉(zhuǎn)化'Ilan，品種(ZeraimGederaCo.,以色列)去皮的黃瓜種子通過(guò)在70%乙醇中溫育lmin,然后在2%的次氯酸鹽溶液中溫育20min表面滅菌。粗洗后，這些種子在包括3%的蔗糖和0.8%的Oxiod瓊脂的MS培養(yǎng)基中于25。C在黑暗中溫育l-2d。種胚#皮切除了，而且單個(gè)的子葉在具200pM的乙酰丁香酮的再生培養(yǎng)基中(MS培養(yǎng)基、3%蔗糖、2mg/1芐基腺嘌呤(BAP)、lmg/1脫落酸(ABA)、0.8%Oxoid瓊脂)于25。C在黑暗中溫20058育1-2天。子葉在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡5min,在濾紙上吸干后轉(zhuǎn)到相同的平板上在黑暗中共培養(yǎng)2天。接著外值體被轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充了500mg/l的Cefatoxim和100mg/l的卡那霉素的再生培養(yǎng)基)并在一個(gè)16/8-h的光周期下溫育亞培養(yǎng)兩周。再生的芽被剪切并轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基(MS、3%的蔗糖、lmg/l的赤霉酸、0.1mg/l的BAP、O.lmg/1的ABA、0.8%的Oxoid瓊脂、500mg/lCefatoxim和100mg/l的卡那霉素)。芽的生根的誘導(dǎo)是在MS、3%的蔗糖、0.5mg/l的p引咮丁酸、0.8%的Oxoid瓊脂、500mg/lCefatoxim和100mg/l的卡那霉素中。在轉(zhuǎn)移到溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)前，生根的小苗移植到Jiffy7泥炭球中鍛煉。煙草的轉(zhuǎn)化來(lái)自無(wú)菌植抹的葉子外植體在補(bǔ)充了200|iM的乙酰丁香酮的再生培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基、3%的蔗糖、lmg/l的節(jié)基腺噤呤(BAP)、O.lmg/1的萘乙酸(NAA)、0.8%的Oxoid瓊脂)中于25。C在黑暗中溫育1-2天。外植體在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡5min,在濾紙上吸千后轉(zhuǎn)到相同的平板上在黑暗中共培養(yǎng)兩天。外植體接著被轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充了500mg/l的Cefatoxim和100mg/l的卡那霉素的再生培養(yǎng)基)并在一個(gè)16/8-h的光周期下溫育亞培養(yǎng)兩周。再生的芽被剪切并轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS、3%的蔗糖、0.8%的Oxoid瓊脂、500mg/lCefatoxim和250mg/l的卡那霉素)。在轉(zhuǎn)移到溫室中繼續(xù)生長(zhǎng)前，生根的小苗移植到Jiffy7泥炭球中鍛煉。R!苗的分離(segregation)分析單獨(dú)的轉(zhuǎn)化植抹的后代被篩選以分離DNA構(gòu)建體，如下R!種子被表面滅菌并在100mg/l的卡那霉素存在的條件下于如上面描述的條件下發(fā)育。轉(zhuǎn)基因種子(具NPTII基因)顯示出正常的根的生長(zhǎng)，然而非轉(zhuǎn)基因后代植株容易被檢測(cè)到根據(jù)其的萎縮的未分支的根。記錄了抗卡那霉素/易受卡那霉素影響的比率，而且轉(zhuǎn)基因苗被用于更進(jìn)一步的試驗(yàn)中?？剐苑磻?yīng)的評(píng)估在溫室環(huán)境下篩選了抗卡那霉素的具病毒抗性的R,苗。對(duì)CFMMV的抗性用純化的CFMMV以lmg/ml在50mM的磷酸緩沖液(pH7.4),或者用病毒RNA以400略/ml在50mM的磷酸緩沖液(pH8.0)機(jī)械地接種抗卡那霉素的黃瓜植抹。對(duì)于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因后代，通過(guò)接種初始篩選了多于10的小苗。接種苗在溫室條件下放置數(shù)周。通過(guò)肉眼觀察癥狀，并且通過(guò)DAS-ELISA用濃度稀釋到1:1000的一種特殊的抗血清檢查CFMMV的存在(Antigmis等.如前)測(cè)定了小苗對(duì)接種的反應(yīng)。進(jìn)一步的抗性分析在接種后三個(gè)星期通過(guò)機(jī)械的回接煙草(N.benthamiana)和曼陀羅(Datumstramonium)來(lái)實(shí)施。對(duì)ZYMV的抗性抗卡那霉素的表達(dá)GUS的煙草植株被機(jī)械地接種是用稀釋到1:5的比率的來(lái)自用ZYMV和一種煙草花葉病毒屬病毒(暫時(shí)地鑒別是黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV))共侵染的煙草植抹的汁液，CGMMV被作為使得ZYMV系統(tǒng)傳播的工具。對(duì)于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因后代，通過(guò)接種多于IO個(gè)小苗被初始篩選出來(lái)。接種的小苗在溫室條件下放置數(shù)周。用一種稀釋到1:2,000的特殊的ZYMV-CP抗血清通過(guò)ELISA測(cè)定了它們對(duì)接種的反應(yīng)。在子葉階段的黃瓜苗被用來(lái)嫁接。使用頂接的方法，在子葉節(jié)下的莖處斜切后，未轉(zhuǎn)化的幼芽^皮嫁接并安置到轉(zhuǎn)基因或者未轉(zhuǎn)化的砧木苗的上端，砧木以保留一個(gè)子葉的方式也在子葉節(jié)處斜切(這樣嫁接苗保留三個(gè)子葉)。三周大的煙草幼苗通過(guò)對(duì)砧木莖的斜切和安置上一個(gè)類似地斜切的幼芽而頂接。幼芽/砧木的結(jié)合用小的塑料別針而固定在原處。在第一周嫁接植株維持在高的濕度。植抹的接種黃瓜幼苗用作維持CFMMV、KGMMV、ZGMMV、CGMMV和黃瓜脈黃病毒(CVYV)培養(yǎng)物的植抹源。南瓜植抹用作ZYMV和CMV-Fny的接種源。在蒸餾水中研磨源植林的幼葉準(zhǔn)備接種體。用金剛砂噴灑后，機(jī)械地接種子葉(萌芽后3天)。通過(guò)把已試植林從聚苯乙烯盤(pán)移植到含有病毒侵染了的珍珠巖基質(zhì)的塑料罐(直徑10cm)中而接種根。在0.01M的pH為7的磷酸緩沖液以1:100的比率研磨病毒侵染了的黃瓜葉準(zhǔn)備粗接種體。在四片真葉階段，通過(guò)在病毒侵染的植株的莖上斜切而嫁接接種。剪掉了將要被接種的植抹的頂端部分并在插入受侵染的砧木的斜切部分之前將植林莖的下面部分修剪成楔形。幼芽和砧木連接的位置用封口膜帶綁住以4吏它們更好的融合。在第一周嫁接植株放置在塑料袋中以維持高的濕度。病毒如文中描述的從受侵染的檔j朱中部分地純化(ChapmanS.N.1998.inPlantVirologyProtocols.G.D.Foster和S.C.Taylor,Eds.HumanaPress,NewJersey:123-129)。部分純化的病毒粒子1:1與2XSDS-PAGE上樣緩沖液混合并煮沸5分鐘。(Sambrook等1989.Molecularcloning-ALABORATORYMANUAL,SecondEdition)。煮沸的材料(10^1)在12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上用SDS-PAGE分離。提取和分離RNA、Northern點(diǎn)雜交和RT-PCR病毒RNA的轉(zhuǎn)錄通過(guò)Northern點(diǎn)雜交和RT-PCR分析從萌芽后三個(gè)星期的幼苗中提取的總RNA來(lái)測(cè)定。將嫩葉組織(300mg)在液氮中研碎成細(xì)粉且根據(jù)廠家的說(shuō)明用TRI-REAGENT試劑盒提取RNA(MolecularResearchCenter,Inc.,Cincinnati,OH,USA)。用GeneQuant(PharmaciaBiotech)測(cè)定了RNA的濃度，來(lái)自不同來(lái)源的量相當(dāng)?shù)腞NA在膠上點(diǎn)樣。每個(gè)樣品約30嗎在含有曱醛的變性1.5%瓊脂糖凝膠上跑膠。在膠上分離的RNA接著與Hybond-NX膜(Amersham,NJ,美國(guó))雜交并暴露在80W的UV燈(VilberLourmatBLX-254,法國(guó))下兩分鐘而固定。與Rapid-hyb緩沖液(AmericanPharmacia)的預(yù)雜交進(jìn)行了兩小時(shí)。通過(guò)與32P標(biāo)記的CFMMV(核苷酸3824-4693)的54kDa的基因的cDNA探針雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)化植抹中的CFMMVRNA,CFMMV具一個(gè)隨機(jī)引物的32P標(biāo)記的DNA探針(隨機(jī)引物DNA標(biāo)記混合試劑盒；以色列BeiHaEmek生物公司)。用RT-PCR檢測(cè)接種植林中的CFMMVRNA的操作是用2-5嗎的總RNA在一個(gè)試管中以單步法，根據(jù)Arazi等(200UBiotechnol87:67-82)用54kDa的基因的特殊引物(有義5'GCTACGGAGCGTCCGCGG3',序列IDNO:12和反義5，CGCGGTCGACTGTATGTCAT3',序列IDNO:13)進(jìn)行。RT-PCR循環(huán)如下46。C30分鐘；94。C2分鐘，接著是在94。C、58。C和72。C下循環(huán)35次，每次30秒，且最后的循環(huán)是在72°C5分鐘。用于化驗(yàn)各種煙草花葉病毒屬病毒(圖3)的傳染性的RT-PCR的操作為兩步，用下列病毒的CP基因組的特殊的引物CGMMV(5，TCTGACCAGACTACCGAAAA3',序歹寸IDN0:14和5'ATGGCTTACAATCCGATCAC3，，序列IDNO:15);KGMMV(5,GAGAGGATCCATGTTTCTAAGTCAGGTCCT3，,序列IDNO:16和5'GAGAGAATTCTCACTTTGAGGAAGTAGCGCT3'，序列IDNO:17);ZGMMV(5，TCTATCGTTAACGCAGC3，，序歹'JIDNO:18和5，ATGTCTTACTCTACTTCTGG3，，序列IDNO:19);和CFMMV(5，CAAGACGAGGTAGACGAAC3，，序歹'JIDNO:20和5'ATGCCTACTCTACCAGCG3，，序列IDNO:21)。RT-PCR的操作是在i-cyler(Bio-Rad)中用RT-PCRAmpTaq試劑盒(PerkinElmer),且循環(huán)步驟是在37°Clhr和在94°C中l(wèi)min,退火40s溫度在53°C(KGMMV)、52。C(ZGMMV、CGMMV)或44。C(CFMMV),在72。Clmin循環(huán)30個(gè)周期，最后在72。C10min。DNA提取和PCR分析用CTAB方法(Chen,D.H.和Ronald,P.C.1999.PlantMolBiolReporter17:53-57)從幼葉(萌芽后3周)中提取總的基因組DNA。DNA溶液(l^il)在25|il的PCR反應(yīng)混合液中稀釋，其包括根據(jù)CFMMV54kDa的基因(注冊(cè)號(hào)AF321057，序列IDNO:4)的序列而得的引物。用兩套引物檢測(cè)此54kDa的基因:第一套引物位于3824和4693(序歹'JIDNO:12和序列IDNO:13,圖4)和第二套引物位于3785和4479(5，GAAAAAGGAGTTTTTGATCCCGCT3'，序歹'JIDNO:22和5'ACTGATATGCGTCTTCTTATGCCC3，，序列IDNO:23;圖3)。PCR條件為在94。C下2min循環(huán)一次，在94、58和72。C每個(gè)溫度下30秒循環(huán)35次，最后在72。C下5分鐘。實(shí)施例1:抗性黃瓜株系的鑒別和鑒定在用pCAMSV54kDa的構(gòu)建體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化后，單個(gè)R0轉(zhuǎn)化抹生長(zhǎng)至成熟，并自交得到Ri種子。植物基因組中CFMMV54kDa基因的存在用PCR分析證實(shí)，對(duì)表1所示的所有的抗卡那霉素的Rj朱系。在篩選了抗性株系后，14個(gè)R^朱系中的8個(gè)表現(xiàn)出完全的抗性反應(yīng)(表1)。剩余的抹系中的一些是完全易感的；其他的具部分抗性的特征。沒(méi)有試圖去估計(jì)接種的子葉中CFMMVRNA的積累。然而，在八個(gè)抗性復(fù)制酶株系的上部葉片中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒的積累，就如大多數(shù)的抹系用ELISA和回接的方法分析顯示的。相同地，當(dāng)植林生長(zhǎng)在更高的溫度下(30-35。C)抗性反應(yīng)保持不變。表1:篩選抗CFMMV的包含54kDa基因的轉(zhuǎn)基因黃瓜抹系抹系a<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>a每一編號(hào)的株系代表單個(gè)R。轉(zhuǎn)基因植株的后代。'Ilan，是親本未轉(zhuǎn)化品種。b通過(guò)機(jī)械地用純化的lmg/l的病毒接種，估計(jì)了抗卡那霉素的R!幼苗對(duì)CFMMV的抗性。顯示總的接種苗中易感幼苗的數(shù)目(侵染了的/接種了的)。完全抗性抹系用黑體字顯示。c通過(guò)回接到煙草(A^eW/wm&打a)分析了未顯示癥狀的幼苗中CFMMV的積累情況。記錄了接種三個(gè)星期后在煙草(A^e"A"脂'"朋)上系統(tǒng)的癥狀(+)或缺乏癥狀(-)。n丄未檢測(cè)實(shí)施例2:在同源144抹系中抗性的鑒定進(jìn)行的對(duì)R44林系的抗性特征的進(jìn)一步的研究(表1)表明因單個(gè)iV尸77/內(nèi)含子可表現(xiàn)出假定的分離。因?yàn)檫z傳一致性，R44抹系的十個(gè)不同R!植抹的種子如在此上面描述的那樣在具卡那霉素的條件下萌發(fā)，一個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)未分離的R2純合基因系(這樣命名為144抹系)被發(fā)現(xiàn)了，并用于進(jìn)一步的研究。144植林表現(xiàn)出正常的表型和正常的果實(shí)生長(zhǎng)，不能與源品種'Ilan，區(qū)分開(kāi)來(lái)。親本林系'Ilan，對(duì)接種CFMMV高度敏感(表1)且在接種14天后具有明顯的花葉癥狀，接著是葉子變形、植林萎蔫和具黃斑的畸形果(圖5)。相比之下，144植林對(duì)用植林提取物(表2,圖5)和純化的RNA機(jī)械接種具完全的抗性(數(shù)據(jù)未顯示)。在溫室中土壤介導(dǎo)的CFMMV的接種是病毒流行開(kāi)始的觸發(fā)因子(Antignus,未發(fā)表)。于是，檢查了在故意用CFMMV接種病土中種植的I44幼苗的反應(yīng)。而且，也用最多的侵略性的接種方法挑戰(zhàn)了144抹系，即，嫁接到一侵染了的易感砧木(品種'Ilan，)頂端。144植抹保持著沒(méi)有癥狀，并且不論用何接種方法，無(wú)論用ELISA或者通過(guò)回接到易感宿主(煙草(iV.^",/w/m'朋a)和黃瓜)的方法都不能檢測(cè)到病毒的積累。表2:144林系對(duì)機(jī)械的、土壤或者嫁接接種CFMMV的反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>"家接接種是通過(guò)嫁接144或者'Ilan，幼芽到受感染的'Ilan，砧木頂端。b在144和未轉(zhuǎn)化的'Ilan，植株感染率是在接種4周后計(jì)數(shù)，為總的接種植株中表現(xiàn)癥狀的植抹的數(shù)目。c回接是通過(guò)用來(lái)自接種4周后的接種植林的提取汁液機(jī)械地接種煙草來(lái)實(shí)施。n.t三未檢測(cè)實(shí)施例3:144抗性抹系的分子鑒定在144抹系的基因組中病毒核酸序列的存在通過(guò)PCR(圖4C)和Southern點(diǎn)雜交(數(shù)據(jù)未顯示)來(lái)證實(shí)。接種或未接種的144植抹中，54kDa的編碼序列的轉(zhuǎn)錄通過(guò)RT-PCR來(lái)檢測(cè)(圖4A)。相反地，來(lái)自144植株的總RNA制品的PCR反應(yīng)是陰性(圖4C),說(shuō)明圖4A中RT-PCR擴(kuò)增的帶不是因?yàn)樵赗NA準(zhǔn)備時(shí)污染了DNA片段。RT-PCR分析方法被用來(lái)評(píng)定CFMMV接種了的144抹系中無(wú)癥狀是否是由于缺乏病毒的積累。用CFMMV外殼蛋白(CP)的特殊的引物在I44抹系中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增帶，與在接種了的'Ilan，植林中存在確定的CP帶形成對(duì)比(圖4B)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了在144植林中不能檢測(cè)到病毒積累跡象的觀察。實(shí)施例4:篩選對(duì)其他煙草花葉病毒屬病毒的抗性以前已顯示復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性表現(xiàn)出高的序列特異性。這樣，檢查了144抹系對(duì)各種侵染葫,的煙草花葉病毒屬病毒的侵染的反應(yīng)。抹系144和未轉(zhuǎn)化'Ilan，品種用三種另外的煙草花葉病毒屬病毒接種KGMMV、ZGMMV和CGMMV。未轉(zhuǎn)化的品種'Ilan，，用KGMMV和ZGMMV接種的，在接種8天后(dpi),并且用CFMMV和CGMMV的在其后2天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀(表3)。觀察到在株系144中癥狀的出現(xiàn)很明顯的推遲了用CGMMV和ZGMMV接種的癥狀在14dpi可見(jiàn)，用KGMMV接種的在20dpi可見(jiàn)。此外，在用CGMMV感染的144植株上觀察到在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中(30dpi)癥狀顯著地變輕，與未轉(zhuǎn)化植;眛上表現(xiàn)的嚴(yán)重的癥狀形成對(duì)比(表3)。通過(guò)SDS-PAGE^r測(cè)純化的病毒體和RT-PCR測(cè)定病毒RNA(圖3)確定了144對(duì)煙草花葉病毒屬病毒的侵染的反應(yīng)。ZGMMV、CGMMV和KGMMV病毒體的積累在144和對(duì)照'Ilan，植抹中清楚地4全測(cè)到；然而，CFMMV病毒體^f又在后者中檢測(cè)到(圖3A)。此外，雖然和在未轉(zhuǎn)化對(duì)照植抹中一樣，在I44植抹中用RT-PCR檢測(cè)到了CGMMV、KGMMV和ZGMMV的病毒RNA,但是CFMMVRNA僅在對(duì)照'Ilan，植株中發(fā)現(xiàn)(圖3B)。表3.144植抹對(duì)用各種葫,煙草花葉病毒屬病毒感染的反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a黃瓜植抹在子葉階段被接種，在接種后30天(30dpi)的時(shí)期癥狀的嚴(yán)重性(花葉擴(kuò)散和萎蔫)被計(jì)為1+到5+。(-)無(wú)癥狀。數(shù)據(jù)是每一處理IO林苗的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的綜合。實(shí)施例5:病毒接種了的植林中轉(zhuǎn)化了的核酸序列的轉(zhuǎn)錄株系144對(duì)CFMMV侵染顯示的特異性和顯著的抗性可能預(yù)示著RNA介導(dǎo)的抗性機(jī)制的流行，可能與RNA沉默有關(guān)。為了檢測(cè)這一假說(shuō)，在用CFMMV接種前或后從抹系144和'Ilan，植抹中提取了總的RNA。用一個(gè)標(biāo)記了的54kDa的探針通過(guò)Northern點(diǎn)雜交分析了相同量的總的RNA樣品。探針與CFMMV基因組RNA(上面的條帶)雜交，假定的亞基因組RNAII具此54-kDa基因，并具此54-kDa的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。就和所期待的一樣，144植抹中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比在受侵染的對(duì)照植株中檢測(cè)到的I1亞基因組RNA短(圖6)。此54-kDa的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物僅在株系144植株中發(fā)現(xiàn)，且預(yù)先用CFMMV或ZYMV接種144植株，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累水平未大致地受影響(圖6)。已顯示，通過(guò)在用此病毒挑戰(zhàn)植林之前接種馬鈴薯Y病毒屬病毒或者改變溫度條件(Szittya等.2003.EMBOJ22:663-640),沉默介導(dǎo)的病毒抗性可被抑制(Savenkov,E.I.和Valkonen,J.P.2002.JGenVirol83:2325-2335)。在用下面的馬鈴薯Y病毒屬病毒預(yù)接種后，評(píng)價(jià)了抹系144的植株對(duì)CFMMV的抗性ZYMV、小西葫聲斑花葉病毒(ZFMV)和黃瓜脈黃化病毒(CVYV,番薯屬病毒屬，馬鈴薯Y病毒科)、或者用黃瓜花葉病毒(CMV)(表4)。144植抹表現(xiàn)出了單獨(dú)的馬鈴薯Y病毒屬病毒或CMV感染的典型的癥狀，但是在連續(xù)的感染中保留了對(duì)CFMMV的抗性，這通過(guò)ELISA和回接曼陀羅證實(shí)。此外，在接種了的植抹生長(zhǎng)在生長(zhǎng)室不同的溫度下(20、28或35。C),抹系144對(duì)CFMMV侵染的抗性未受影響。表4:144在用其他病毒接種后對(duì)CFMMV的抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例6:通過(guò)I44砧木保護(hù)易感病幼芽煙草花葉病毒屬病毒顆粒在土壤中存活很長(zhǎng)時(shí)間，且CFMMV通過(guò)處于病土的根侵染是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。既然林系144顯示出對(duì)土壤接種CFMMV的抗性(表2),我們檢測(cè)了用作保護(hù)未轉(zhuǎn)化的幼芽的砧木的此才朱系的適應(yīng)性。對(duì)照Ilan植株嫁接到抹系144或者Ilan砧木，并種在CFMMV侵染的土壤中。大多數(shù)(12/16)嫁接到未轉(zhuǎn)化的Ilan砧木的植株表現(xiàn)出明顯的CFMMV癥狀，且用ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性。然而，嫁接到I44上的幼芽沒(méi)有一抹(0/16)在整個(gè)試驗(yàn)期間(5周)為受感染了的，這可通過(guò)肉眼可見(jiàn)的癥狀、ELISA檢測(cè)和回接到煙草來(lái)評(píng)定。在平行試驗(yàn)中，嫁接到I44砧木上的'Ilan，幼芽對(duì)用CFMMV直接機(jī)械的接種敏感。實(shí)施例7:抗性煙草砧木保護(hù)易感病幼芽如在此前面所描述的那樣，煙草葉盤(pán)被具pCddCP-ZY構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了。在再生基質(zhì)上挑選后，單個(gè)的假定轉(zhuǎn)化體通過(guò)GUS鑒別。證實(shí)的轉(zhuǎn)化體自交產(chǎn)生R！代。篩選了來(lái)自單獨(dú)的轉(zhuǎn)化植林的后代以分離DNA構(gòu)建體，如下Ri種子表面滅菌且在250mg/l卡那霉素的存在下萌發(fā)。轉(zhuǎn)基因種子(具NPTII基因)表現(xiàn)了正常的根的生長(zhǎng)，然而根據(jù)其萎縮的和未分支的根，非轉(zhuǎn)基因后代植抹很容易被發(fā)現(xiàn)。記錄了抗/感卡那霉素的比率，且轉(zhuǎn)基因幼苗被用于接種試驗(yàn)。抗卡那霉素表達(dá)GUS的煙草幼苗用來(lái)自煙草植抹(用ZYMV和一種暫時(shí)地被認(rèn)為是黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的煙草花葉病毒共感染，CGMMV作為幫助ZYMV系統(tǒng)傳播的工具)的稀釋到1:5的比率的汁液機(jī)械地接種。對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因后代，多于IO抹的幼苗由接種被初始篩選出來(lái)。接種的幼苗在溫室條件下放置數(shù)周。用準(zhǔn)備成1:2,000的特定ZYMV外殼蛋白的抗血清的稀釋液通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)接種的反應(yīng)。在下面的嫁接試驗(yàn)中，選出來(lái)的轉(zhuǎn)基因株系用作砧木。通過(guò)在砧木莖上斜切和安上一個(gè)相似地斜切了的幼芽，3周大的煙草幼苗^皮頂接。用小的塑料帶包扎幼芽/砧木接合處以固定在原處。在第一周嫁接的植株保持在高濕度。對(duì)幼芽機(jī)械的接種用稀釋到1:5比率的汁液(如在此上面描述的那樣，來(lái)自用ZYMV和一種煙草花葉病毒屬病毒共侵染的煙草植林)在嫁接后3到4周進(jìn)行。接種的嫁接植林在溫室環(huán)境下放置數(shù)周。用一種準(zhǔn)備成1:2,000的特殊的ZYMV-CP抗血清的稀釋液通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)接種的反應(yīng)。在某些試驗(yàn)中，在接種了的幼芽中ZYMV的存在通過(guò)回接種到易感南瓜植抹上測(cè)定。這些結(jié)果總結(jié)在下面的表5中。表5:通過(guò)轉(zhuǎn)基因砧木授予幼芽的對(duì)ZYMV的抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>未嫁接的對(duì)照煙草或者嫁接到非轉(zhuǎn)基因砧木的幼芽分別表現(xiàn)出89%和70%的高的感病率。嫁接到轉(zhuǎn)基因林系的幼芽的反應(yīng)可被分成兩組嫁接到砧木株系Z89、Z99和Z102的那些植抹被完全保護(hù)而不受ZYMV的系統(tǒng)侵染；嫁接到砧木抹系Z97、Z100和Z101的那些植株很少顯示疾病的癥狀。在少數(shù)受保護(hù)的砧木中，接種的幼芽中不含ZYMV是通過(guò)回接到南瓜植抹而i正實(shí)。前述的對(duì)特定實(shí)施方案的描述將充分地揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)以至于其他人能通過(guò)應(yīng)用現(xiàn)有的知識(shí)，在無(wú)不適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)和不偏離普通概念的條件下為了各種應(yīng)用易于去修改和/或改變這些特殊的實(shí)施方案，并且，因而這樣的改變或者修改應(yīng)該而且意為包括在所公開(kāi)的實(shí)施方案的同等物的意思和范圍中。應(yīng)理解在此用到的措辭和術(shù)語(yǔ)是為了描述的目的而不是為了限制。這些得到各種^Hf的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的方法、材料和步驟可采用許多可選擇的形式而不偏離本發(fā)明。權(quán)利要求1.一種包括不同于通過(guò)表達(dá)抗病毒蛋白方法抗一種病毒病的轉(zhuǎn)基因砧木和易感所述病毒病的幼芽的植株，其中所嫁接的植株對(duì)所述病毒病有抗性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植抹，其中所述抗一種病毒病的轉(zhuǎn)基因砧木包括具有與所述病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%相同性的核酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植株，其中所述抗一種病毒病的轉(zhuǎn)基因砧木包括被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生輩巴向所述病毒基因組至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植抹，其中所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段編碼病毒蛋白或其部分。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植抹，其中所述病毒蛋白選自病毒外殼蛋白、病毒復(fù)制蛋白、病毒運(yùn)動(dòng)蛋白或其部分組成的組。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植抹，其中所述病毒蛋白是病毒復(fù)制蛋白或其部分。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植株，其中所述轉(zhuǎn)基因砧木對(duì)由土傳病毒導(dǎo)致的疾病有抗性。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的植林，其被保護(hù)而不受由土傳病毒導(dǎo)致的一種疾病的侵害，所述土傳病毒選自以下組線蟲(chóng)傳播的病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植抹，其中所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段編碼黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)復(fù)制蛋白的一片段的假定的54kDa的蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植抹，其中編碼假定的54kDa的蛋白的所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段具有在序列IDNO:l中闡明的序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的植株，其被保護(hù)而不被由屬于煙草花葉病毒屬的土傳病毒導(dǎo)致的疾病的侵害。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的植抹，其被保護(hù)而不被CFMMV導(dǎo)致的疾病侵害。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植林，其屬于葫蘆科。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的植抹，其是黃瓜植株。15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植林，其中所述DNA構(gòu)建體包括編碼形成至少一個(gè)雙鏈RNA分子的RNA序列的核酸序列，其中所述雙鏈RNA分子介導(dǎo)所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段的裂解。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植抹，其中所述DNA構(gòu)建體包括a.可^t喿作地連接的至少一種植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b.編碼形成至少一種雙《連RNA的RNA序列的核酸序列，其中所述雙鏈RNA分子包含具有與所述病毒基因組的靶片段的有義核苷酸序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近的核苷酸的第一核苷酸序列；具有與所述病毒基因組的所述靶片段的有義核苷酸序列的互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近的核苷酸的第二核苦酸序列；并且視需要c.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植抹，其中所述第一和第二核苷酸序列被18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的植林，其中所述間隔序列包括內(nèi)含子序列。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植抹，其中所述間隔序列包括蓖麻過(guò)氧化氫酶基因的內(nèi)含子，其具有在序列IDNO:3中所述的序列。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植抹，其中包括所述第一和第二核苷酸序列的所述DNA構(gòu)建體可操作地連接到同一啟動(dòng)子。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植林，其對(duì)選自土傳病毒和通過(guò)影響植林地上部分的載體傳播的病毒組成的組的一種病毒有抗性。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的植林，其中所述土傳病毒選自以下組線蟲(chóng)傳播的病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的植抹，其中所述通過(guò)影響植抹地上部分的載體傳播的病毒屬于一個(gè)科，所述科選自以下組花椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸孤病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、虹豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番茄叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科；煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃脈病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、蕪茶黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植抹，其中所迷病毒基因組的所述至少一個(gè)片段包括小西葫,黃花葉病毒(ZYMV)基因組的3，端。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的植株，其中所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段包括序列IDNO:2中闡明的核酸序列。26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植林，其中所述第一核苷酸序列包括具有與序列IDNO:2中闡明的所述核苷酸序列和其片段至少90%相同性的核酸序列。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的植抹，其中所述第二核苷酸序列包括具有與序列IDNO:2中闡明的所述核苷酸序列和其片段的互補(bǔ)序列至少90%相同性的核酸序列。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的植林，其對(duì)來(lái)自馬鈴薯Y病毒科的病毒造成的疾病有抗性。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的植林，其對(duì)ZYMV有抗性。30.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植抹，其中所述核酸序列還包括至少一個(gè)表達(dá)控制序列，其選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子、剪切信號(hào)和終止序列組成的組。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的植抹，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。32.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植抹，其中所述核酸序列還包括可選擇標(biāo)記。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的植林，其中所述可選擇標(biāo)記選自編碼授予產(chǎn)物抗生素抗性的多核苷酸序列和編碼可檢測(cè)產(chǎn)物的報(bào)告基因。34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的植株，其中所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)為NOS終止子。35.—種生產(chǎn)抗一種病毒病植株的方法，其包括a.提供抗所述病毒病的轉(zhuǎn)基因砧木而不是通過(guò)表達(dá)抗病毒蛋白的方法；b.提供易感所述病毒的幼芽；而且c.將所述幼芽嫁接到所述砧木；以獲得抗所述病毒病的嫁接植抹。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述砧木用與所述病毒基因組至少一個(gè)片段至少90%相同性的核酸序列轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生抗所述病毒病的轉(zhuǎn)基因植抹。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述砧木用被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生靶向所述病毒基因組所述至少一個(gè)片段的siRNA的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段編碼病毒蛋白或者其部分。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述病毒蛋白選自病毒外殼蛋白、病毒復(fù)制蛋白、病毒運(yùn)動(dòng)蛋白或其部分組成的組。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述病毒蛋白是病毒復(fù)制蛋白或其部分。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因砧木對(duì)由土傳病毒導(dǎo)致的疾病有抗性。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述植抹被保護(hù)而不受由土傳病毒導(dǎo)致的疾病的侵害，所述土傳病毒選自以下組線蟲(chóng)傳播病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)4艮部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因砧木包括編碼為黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的復(fù)制蛋白的一部分的假定的54kDa的蛋白的核酸序列。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因砧木包括具有在序列IDNO:1中闡明的序列的編碼假定的54kDa的蛋白的核酸序列。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述植抹被保護(hù)而不受由所述煙草花葉病毒屬的土傳病毒導(dǎo)致的疾病的侵害。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述植抹被保護(hù)而不被由CFMMV導(dǎo)致的疾病的侵害。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述植株屬于葫，科。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述植抹為黃瓜植林。49.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述DNA構(gòu)建體包括編碼形成至少一個(gè)雙鏈RNA分子的RNA序列的核酸序列，其中所述雙鏈RNA分子介導(dǎo)所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段的裂解。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述DNA構(gòu)建體包括a.可操作地連接的至少一個(gè)植物的可表達(dá)啟動(dòng)子；b.編碼形成至少一個(gè)雙鏈RNA的RNA序列的核酸序列，其中所述雙鏈RNA分子包含具有與所述病毒基因組的耙片段的有義核苷酸序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近的核苦酸的第一核苷酸序列；具有與所述病毒基因組的所述靶片段的有義核苦酸序列的互補(bǔ)序列至少90%相同性的至少20個(gè)鄰近的核苷酸的第二核苷酸序列；并且視需要c.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述第一和第二核苷酸序列被間隔序列分開(kāi)。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述間隔序列包括內(nèi)含子序列。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述間隔序列包括蓖麻過(guò)氧化氫酶基因的內(nèi)含子，其具有在序列IDNO:3中闡述的序列。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述DNA構(gòu)建體包括可操作地連接到同一啟動(dòng)子的所述第一和第二核苷酸序列。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述植抹對(duì)選自土傳病毒和由影響植株地上部分的載體傳播的病毒的一種病毒有抗性。56.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述土傳病毒選自以下組線蟲(chóng)傳播病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣椒黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣材義輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述由影響植株地上部分的載體傳播的病毒屬于一個(gè)科，所述科選自以下組花椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸^瓜病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、豇豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番茄叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科；煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃^K病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、完茶黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。58.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段包括小西葫聲黃花葉病毒(ZYMV)基因組的3，端。59.才艮據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述病毒基因組的所述至少一個(gè)片段包括在序列IDNO:2中闡明的核酸序列。60.才艮據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括具有與在序列IDNO:2中闡明的核苷酸序列和其部分至少90%相同性的核酸序列。61.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述第二核苷酸序列包括具有與在序列IDNO:2中闡明的核苷酸序列和其部分的互補(bǔ)序列至少90%相同性的核酸序列。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述植抹對(duì)由來(lái)自馬鈴薯Y病毒科的病毒導(dǎo)致的疾病有抗性。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述植林抗ZYMV。64.由權(quán)利要求35-63任何一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的嫁接植抹。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的植抹，其對(duì)選自土傳病毒和由影響植株地上部分的載體傳播的病毒組成的組的病毒有抗性。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的植抹，其抗一種土傳病毒，所述土傳病毒選自以下組線蟲(chóng)傳播病毒線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒南芥菜花葉病毒、葡萄扇葉病毒、番茄黑環(huán)斑病毒、樹(shù)莓環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒；煙草脆裂病毒屬病毒豌豆早褐病毒、煙草脆裂病毒和辣椒環(huán)斑病毒；真菌傳播的病毒黃瓜葉斑病毒、黃瓜壞死病毒、甜瓜壞死斑病毒、紅三葉草壞死花葉病毒、南瓜壞死病毒、煙草壞死衛(wèi)星病毒、萵苣巨脈病毒、辣祐又黃脈病毒、甜菜壞死黃脈病毒、甜菜土傳病毒、燕麥金色條紋病毒、花生叢簇病毒、馬鈴薯帚頂病毒、水稻條紋壞死病毒、土傳小麥花葉病毒、大麥和性花葉病毒、大麥黃花葉病毒、燕麥花葉病毒、水稻壞死花葉病毒、小麥梭條斑花葉病毒和小麥黃花葉病毒；通過(guò)根部傷口傳播的病毒煙草花葉病毒屬病毒煙草花葉病毒、番茄花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒、Kyuri綠斑駁花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、紅辣椒輕斑駁病毒、辣椒輕斑駁病毒、長(zhǎng)葉車前花葉病毒和煙草輕綠花葉病毒；通過(guò)不明途徑傳播的病毒豆瓣菜黃斑病毒、蠶豆壞死萎蔫病毒、桃縱簇病毒和甘蔗褪綠條紋病毒。67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的植抹，其抗來(lái)自一個(gè)科的由影響植林地上部分的載體傳播的病毒，所述科選自以下組花椰菜花葉病毒科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、呼腸孤病毒科、Tartitiviridae、雀麥花葉病毒科、豇豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、番茄叢矮病毒科、伴生病毒科、Clostroviridae和黃癥病毒科；煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、馬鈴薯X病毒組、香石竹潛病毒屬、蔥X病毒屬、線形病毒屬、凹陷病毒屬、發(fā)狀病毒屬、葡萄病毒屬、真菌傳桿狀病毒組、花生叢簇病毒屬、馬鈴薯帚頂病毒屬、甜菜壞死黃脈病毒屬、大麥條紋花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組、玉米雷亞朵非納病毒屬、茺茶黃花葉病毒組、懸鉤子病毒屬、Ourmivirus和幽影病毒屬。全文摘要本發(fā)明涉及一種嫁接植株，其包括對(duì)一種病毒病有抗性的轉(zhuǎn)基因砧木和易感病的幼芽，其中轉(zhuǎn)基因的抗病毒砧木將抗病毒性傳給幼芽，因此整株嫁接植株對(duì)該病毒病有抗性。本發(fā)明還涉及抗病毒嫁接植株的生產(chǎn)方法和由其生產(chǎn)出的植株。文檔編號(hào)C12N15/40GK101321455SQ200580012779公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2005年2月23日優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日發(fā)明者亞倫·杰爾瑟,維克多·保羅·蓋博,耶赫茲克爾·安提格納斯,艾米特·蓋爾-昂,達(dá)利爾·沃爾夫申請(qǐng)人:以色列國(guó)農(nóng)業(yè)部