專利名稱：一種對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近10年來隨著微生態(tài)學(xué)在我國(guó)的飛速發(fā)展，以微生態(tài)制劑為主的新的一類藥品、保健食品已經(jīng)或正在形成產(chǎn)業(yè)，成為人們防治疾病、維護(hù)健康的重要生物制劑。它既有見效快的近期效果，如預(yù)防和治療急慢性腹瀉、便秘，改善胃腸功能等。還有顯著的遠(yuǎn)期效果，如通過降低人體內(nèi)毒素水平、改善營(yíng)養(yǎng)狀況、促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)、提高人體免疫力等而起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用，輔助改善肝病癥狀；對(duì)于用化學(xué)、放射、免疫抑制劑治療中的不良反應(yīng)導(dǎo)致菌群失調(diào)的癥狀如食欲降低、乏力、白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降等，微生態(tài)制劑可以改善前述癥狀，提高抗病能力。此外，腸道正常菌群直接參與食物的消化吸收，其代謝產(chǎn)物中有多種維生素和酶，可以作為老、幼、病人的營(yíng)養(yǎng)保健食品。因此微生態(tài)制劑的最大特點(diǎn)是“有病治病，未病防病，無病保健”。我國(guó)微生態(tài)學(xué)奠基人魏曦教授曾經(jīng)預(yù)言“抗生素之后的時(shí)代將是生態(tài)制劑的時(shí)代”。21世紀(jì)，微生態(tài)產(chǎn)業(yè)將形成創(chuàng)造巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益的產(chǎn)業(yè)。
本發(fā)明所保護(hù)的微生態(tài)制劑包括雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳桿菌(Lactobacillus)等。常用于腸道微生態(tài)制劑中的雙歧桿菌是較難長(zhǎng)期貯藏的G+、無芽孢、不運(yùn)動(dòng)的專一性厭氧菌，對(duì)生存條件要求極為苛刻，外界環(huán)境的少許變化就易引起該菌的死亡。加之在其生命活動(dòng)過程中還會(huì)產(chǎn)生一些危及自身正常生長(zhǎng)繁殖的乳酸、乙酸等代謝產(chǎn)物，故不但在液體條件下難以貯藏，即使在干燥狀態(tài)下也不易長(zhǎng)期貯藏。因此，如何提高菌體的存活率、保證微生態(tài)制劑的貨架壽命，是目前困擾活菌制劑行業(yè)的技術(shù)難題之一。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的微生態(tài)產(chǎn)品菌體存活率低，且均需在低溫下長(zhǎng)期存放，使流通成本增加，推廣應(yīng)用受到限制。利用透明質(zhì)酸和海藻糖的雙重和協(xié)同保護(hù)作用，可使微生物存活率提高，存活期延長(zhǎng)，且可以在常溫長(zhǎng)期存放。也可以在微生態(tài)制劑中加入雙歧因子，如異麥芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚乳酮糖、低聚異麥芽酮糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚甘露糖、異構(gòu)化乳糖、低聚龍膽糖、棉子糖、水蘇糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、酪蛋白水解產(chǎn)物、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、茶多酚、人參皂苷等，促進(jìn)雙歧桿菌增殖。
1透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和主要作用透明質(zhì)酸是由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖為雙糖單位組成的直鏈黏多糖。在水溶液中，透明質(zhì)酸分子相互作用形成具有一定剛性的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以將微生物鑲嵌在網(wǎng)眼中起到保護(hù)作用；較高濃度下透明質(zhì)酸玻璃化，處于玻璃態(tài)的物質(zhì)的分子很不活躍，透明質(zhì)酸在微生物外部形成玻璃態(tài)，從而起到保護(hù)作用。
透明質(zhì)酸為生物體正常組成成分，無毒副作用。
2海藻糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和主要作用海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的雙糖。海藻糖有三種異構(gòu)體，即α，α-型、α，β-型和β，β-型。海藻糖存在二水晶體、非晶體和無水晶體三種形態(tài)。海藻糖性質(zhì)非常穩(wěn)定。
海藻糖廣泛存在于自然界，如低等蕨類植物、藻類、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲及無脊椎動(dòng)物中。是一種對(duì)于環(huán)境變化形成的應(yīng)激狀態(tài)具有高抗性的物質(zhì)，是生物體內(nèi)的一種典型的應(yīng)激代謝物。在各種惡劣環(huán)境下，海藻糖表現(xiàn)出對(duì)物種的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等良好的保護(hù)作用。最新研究表明，外源性的海藻糖具有良好的非特異性保護(hù)作用。
海藻糖無毒無害，對(duì)人體無不良反應(yīng)。
海藻糖的生物保護(hù)機(jī)制“水替代”假說生物分子周圍包著一層水膜，當(dāng)干燥、冷凍等條件下失去水膜時(shí)，海藻糖分子能在失水部位與生物分子以氫鍵連接，以代替失去的結(jié)構(gòu)水膜，而不致使生物分子喪失活性。
“玻璃態(tài)”假說當(dāng)生物成分干燥時(shí)，海藻糖緊密地包住相鄰的分子，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相類似的糖玻璃體，其擴(kuò)散系數(shù)很低，分子運(yùn)動(dòng)和分子變性非常微弱，能夠使生物分子維持一定的空間結(jié)構(gòu)。
“優(yōu)先排阻”假說海藻糖優(yōu)先與蛋白質(zhì)表面的水分子結(jié)合，結(jié)果蛋白質(zhì)的溶劑化層半徑減小，分子結(jié)構(gòu)更緊密，構(gòu)象更穩(wěn)定，有利于抵御外界極端環(huán)境的影響。
由上可以看出，生物體脫水過程中，海藻糖對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)等起到獨(dú)特的保護(hù)作用，提高微生物的存活率。
3透明質(zhì)酸和海藻糖組合作為微生態(tài)制劑的保護(hù)劑的優(yōu)勢(shì)由于透明質(zhì)酸為大分子化合物，不能進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部，但可形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將微生物鑲嵌在網(wǎng)眼中。海藻糖為小分子化合物，能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。我們將透明質(zhì)酸和海藻糖組合使用，這樣在微生物細(xì)胞內(nèi)外均存在保護(hù)劑，保護(hù)作用優(yōu)于單一保護(hù)劑及常規(guī)保護(hù)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)。
本發(fā)明對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合為透明質(zhì)酸和海藻糖，兩者濃度分別為0.01％～1.5％、0.1％～50％。
本發(fā)明透明質(zhì)酸是指任何來源的透明質(zhì)酸，包括由動(dòng)物組織提取分離而得、微生物發(fā)酵而得及基因工程制備而得等。
本發(fā)明透明質(zhì)酸包括透明質(zhì)酸及其鹽類如透明質(zhì)酸鈉(又稱玻璃酸鈉)、透明質(zhì)酸鋅(又稱玻璃酸鋅)等。
本發(fā)明透明質(zhì)酸是指任何相對(duì)分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸。
本發(fā)明海藻糖是指任何來源的海藻糖，包括由植物、動(dòng)物組織提取分離而得，微生物發(fā)酵而得及基因工程制備而得等。
本發(fā)明海藻糖是指任何存在形式的海藻糖，包括α，α-型、α，β-型和β，β-型，二水晶體、非晶體和無水晶體。
本發(fā)明所保護(hù)的微生態(tài)制劑包括雙歧桿菌和乳桿菌。
本發(fā)明所保護(hù)的雙歧桿菌包括兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B.infants)、長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)和短雙歧桿菌(B.breve)中的一種或幾種。乳桿菌包括嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、干酪乳桿菌(L.casei)、格氏乳桿菌(L.gasseri))和羅伊乳桿菌(L.reuteri)中的一種或幾種。
本發(fā)明所保護(hù)的微生態(tài)制劑也可以加入雙歧因子，促進(jìn)雙歧桿菌增殖。雙歧因子包括異麥芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚乳酮糖、低聚異麥芽酮糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚甘露糖、異構(gòu)化乳糖、低聚龍膽糖、棉子糖、水蘇糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、酪蛋白水解產(chǎn)物、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、茶多酚、人參皂苷等。
本發(fā)明所保護(hù)的微生態(tài)制劑具有維持腸道微生態(tài)平衡，治療因菌群失調(diào)引起的便秘、腹瀉等腸道疾病；增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；降低血膽固醇和甘油三酯；預(yù)防、抑制腫瘤發(fā)生；抗衰老等作用。
本發(fā)明在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)配方為以100mL保護(hù)劑溶液計(jì)，其中透明質(zhì)酸0.01～1.5g，海藻糖0.1～50g，其余為去離子水。
本發(fā)明在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)制備方法是按本發(fā)明對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合配方及用量，將一定量透明質(zhì)酸、海藻糖置于少量去離子水中攪拌溶解后，加去離子水至一定體積定容，得到含透明質(zhì)酸和海藻糖的溶液，將該溶液用微孔濾膜過濾除菌，即為本發(fā)明保護(hù)劑。
本發(fā)明在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合的應(yīng)用方法是雙歧桿菌、乳桿菌菌種活化，分別于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)和CO2培養(yǎng)16～18h，使菌體濃度均達(dá)到1×1011cfu/mL以上，將上述菌液于4℃分別以4000r·min-1離心20min收集菌體，用冷的無菌去離子水洗滌兩次，再次離心收集，兩種菌體以1∶1比例混合，懸浮于保護(hù)劑溶液中，保護(hù)劑的加量使菌體濃度大約在1×1011cfu/mL?？梢约尤腚p歧因子，雙歧因子事先經(jīng)過除菌處理。將混合菌液進(jìn)行干燥處理。干燥方法包括冷凍干燥、真空干燥和噴霧干燥。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例1取透明質(zhì)酸0.01g、海藻糖1g，用去離子水溶解混勻，定容至10ml，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得本發(fā)明保護(hù)劑。取上述保護(hù)劑0.5mL，稱取離心后的濕菌體0.1mg，懸浮于保護(hù)劑中。再根據(jù)需要添加一定量經(jīng)事先除菌的雙歧因子，得混合菌液。
將混合菌液分裝于無菌具塞玻璃瓶?jī)?nèi)，先預(yù)凍至約-35℃，再放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥約25h，得凍干菌粉。要求產(chǎn)物中殘余水分達(dá)2％～3％。
本發(fā)明實(shí)施例2取透明質(zhì)酸0.01g、海藻糖1g，用去離子水溶解混勻，定容至10ml，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得本發(fā)明保護(hù)劑。取上述保護(hù)劑0.5mL，稱取離心后的濕菌體0.1mg，懸浮于保護(hù)劑中。再根據(jù)需要添加一定量經(jīng)事先除菌的雙歧因子，得混合菌液。
將混合菌液分裝于無菌具塞玻璃瓶?jī)?nèi)，置真空干燥機(jī)中于真空度20～30Pa、品溫30℃下真空干燥約48h，得干燥菌粉。要求產(chǎn)物中殘余水分達(dá)2％～3％。
本發(fā)明實(shí)施例3取透明質(zhì)酸0.01g、海藻糖1g，用去離子水溶解混勻，定容至10ml，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得本發(fā)明保護(hù)劑。取上述保護(hù)劑0.5mL，稱取離心后的濕菌體0.1mg，懸浮于保護(hù)劑中。再根據(jù)需要添加一定量經(jīng)事先除菌的雙歧因子，得混合菌液。
將混合菌液分裝于無菌具塞玻璃瓶?jī)?nèi)，置離心式噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度為120℃，出口溫度為80℃，得干燥菌粉。要求產(chǎn)物中殘余水分達(dá)2％～3％。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)本實(shí)驗(yàn)以不加保護(hù)劑的菌液經(jīng)同樣方式凍干后為陰性對(duì)照，以10％蔗糖、10％乳糖、0.1％透明質(zhì)酸和10％海藻糖分別為保護(hù)劑的凍干菌粉組為陽性對(duì)照，考察了本發(fā)明實(shí)施例中保護(hù)劑對(duì)凍干微生態(tài)制劑的保護(hù)效果，考察指標(biāo)為菌體存活率和菌體產(chǎn)酸力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1～表3所示。
表1 本發(fā)明實(shí)施例中保護(hù)劑對(duì)凍干菌體存活率的影響

表2本發(fā)明實(shí)施例中保護(hù)劑對(duì)凍干菌體產(chǎn)酸力的影響

表3本發(fā)明實(shí)施例中保護(hù)劑對(duì)凍干菌體貯藏穩(wěn)定性的影響

以上結(jié)果表明，透明質(zhì)酸和海藻糖組合應(yīng)用于微生態(tài)制劑的保護(hù)劑，可顯著提高凍干過程微生物的存活率、活力和貯藏穩(wěn)定性，單獨(dú)使用透明質(zhì)酸和海藻糖均具有保護(hù)作用，但效果不如本發(fā)明實(shí)施例中兩者組合使用。本發(fā)明保護(hù)劑比常規(guī)保護(hù)劑(如蔗糖、乳糖)的保護(hù)效果明顯提高。
權(quán)利要求
1.一種在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)，其特征在于保護(hù)劑中含有透明質(zhì)酸和海藻糖。
2.一種如權(quán)利要求書1中所述的在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，其特征在于透明質(zhì)酸的濃度為0.01％～1.5％，海藻糖的濃度為0.1％～50％，其余為去離子水。
3.一種如權(quán)利要求書1中所述的微生態(tài)制劑包含雙歧桿菌和乳桿菌。
4.一種如權(quán)利要求書3所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述的雙歧桿菌為兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和短雙歧桿菌中的一種或幾種；乳桿菌包括嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、格氏乳桿菌和羅伊乳桿菌中的一種或幾種。
5.一種如權(quán)利要求書1和2中任一所述的在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，其特征在于透明質(zhì)酸包括透明質(zhì)酸及其鹽如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鋅。
6.一種如權(quán)利要求書1、2和5中任一所述的在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，其特征在于透明質(zhì)酸是指任何相對(duì)分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸。
7.一種如權(quán)利要求書1、2、5和6中任一所述的在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，其特征在于海藻糖是指任何構(gòu)型、任何形態(tài)的海藻糖，包括α，α-型、α，β-型和β，β-型，及二水晶體、非晶體和無水晶體。
8.一種如權(quán)利要求書3和6中任一所述的微生態(tài)制劑，其特征在于可以加入雙歧因子，包括異麥芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚乳酮糖、低聚異麥芽酮糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚甘露糖、異構(gòu)化乳糖、低聚龍膽糖、棉子糖、水蘇糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、酪蛋白水解產(chǎn)物、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、茶多酚、人參皂苷。
9.一種如權(quán)利要求書1和2中任一所述的在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，其制備方法是按本發(fā)明在干燥和貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合配方及用量，將一定量透明質(zhì)酸、海藻糖置于少量去離子水中攪拌溶解后，加去離子水至一定體積定容，得到含透明質(zhì)酸和海藻糖的溶液，即為本發(fā)明保護(hù)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。微生態(tài)制劑正成為維護(hù)健康的重要生物制劑。本發(fā)明所述微生態(tài)制劑包括雙歧桿菌和乳桿菌等。由于雙歧桿菌對(duì)生存條件要求極為苛刻，在液體及干燥狀態(tài)下都難于貯藏。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的微生態(tài)產(chǎn)品菌體存活率低，且需低溫存放，流通成本較高，推廣應(yīng)用受到限制。本發(fā)明提供了一種在干燥及貯藏過程中對(duì)微生態(tài)制劑有保護(hù)作用的糖類組合(保護(hù)劑)，即利用透明質(zhì)酸和海藻糖的雙重和協(xié)同保護(hù)作用使微生物存活率提高，存活期延長(zhǎng)，且可以在常溫長(zhǎng)期存放。本試驗(yàn)證明此糖類組合應(yīng)用于微生態(tài)制劑，可顯著提高凍干過程微生物的存活率、貯藏穩(wěn)定性和活力，且保護(hù)效果較單一保護(hù)劑及常規(guī)保護(hù)劑明顯提高。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1739804SQ20051010557
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者籍保平, 張玉華, 凌沛學(xué), 張桂芝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 山東省生物藥物研究院