專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1－n及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中可用于同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1-n及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)特異性地誘發(fā)與其同源序列的mRNA分子被降解，導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)被抑制的現(xiàn)象，是一種特殊的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)現(xiàn)象。shRNA是指在構(gòu)建表達(dá)短RNA片段時(shí)的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。自1998年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在機(jī)理研究及應(yīng)用開(kāi)發(fā)方面均取得了令人鼓舞的成果。它的具體過(guò)程是由外源或轉(zhuǎn)基因、病毒感染等方式引入的dsRNA，在細(xì)胞內(nèi)被RNA酶Dicer以ATP依賴(lài)的方式，切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的3’-端有2個(gè)核苷酸突出的雙鏈RNA，即小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)。siRNA同核酸酶等蛋白結(jié)合而形成RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RNAs inducedsilencing complex，RISC)。RISC在ATP的作用下將雙鏈siRNA打開(kāi)成單鏈，與靶基因表達(dá)的mRNA的互補(bǔ)位置特異性結(jié)合，誘發(fā)mRNA降解，使靶基因的mRNA的數(shù)量減少，從而在RNA水平上抑制靶基因表達(dá)。
目前RNA干擾的應(yīng)用主要集中于抗病毒、抗腫瘤和對(duì)基因功能的研究等方面。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由于干擾素效應(yīng)的存在，只能采用小于29bp的雙鏈RNA。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獲得siRNA的方法主要有化學(xué)合成siRNA法、體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA法、shRNA表達(dá)載體法、用RNaseIII(Dicer)切割長(zhǎng)的dsRNA的方法、PCR表達(dá)盒法(由PCR得到的siRNA轉(zhuǎn)錄模板，為DNA片段，僅含啟動(dòng)子、siRNA模板和終止位點(diǎn))等五種。
在抗病毒、抗腫瘤的研究中，化學(xué)合成法以其方便快捷的優(yōu)點(diǎn)而進(jìn)展迅速，但它相對(duì)高昂的成本限制了它的進(jìn)一步推廣。而shRNA表達(dá)載體法則成本低廉，也能有效地在體內(nèi)、體外實(shí)現(xiàn)RNA干擾，近來(lái)的發(fā)展也十分迅速。
shRNA表達(dá)載體法的基本思路如下細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶III可以識(shí)別特定啟動(dòng)子從而起始轉(zhuǎn)錄，當(dāng)遇到連續(xù)的4～6個(gè)T時(shí)，轉(zhuǎn)錄就會(huì)終止?？茖W(xué)家們由此設(shè)計(jì)了能表達(dá)特定短RNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄就可得到短RNA。這種RNA兩端的21個(gè)左右的核苷酸反向互補(bǔ)，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。這種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA(short hairpin RNA，shRNA)會(huì)很快被剪切成為siRNA，從而起到RNA干擾的作用。這種方法操作簡(jiǎn)便，成本低，與化學(xué)合成siRNA相比，DNA質(zhì)粒在體內(nèi)更穩(wěn)定，對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效率高，便于進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的基因功能研究，因而日漸成為熱門(mén)研究課題。
shRNA表達(dá)載體法分為病毒載體法和非病毒載體法兩種。盡管相對(duì)于非病毒載體而言，病毒載體用量少，轉(zhuǎn)染效率高，但它的安全性一直倍受關(guān)注。非病毒載體相對(duì)安全，它的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率低，載體用量大等。
Alan J Bridge等發(fā)現(xiàn)，足夠量的shRNA表達(dá)載體也可以促發(fā)干擾素效應(yīng)，并且普通的質(zhì)粒如Bluscript轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，只要達(dá)到一定的用量，也可以引起細(xì)胞的干擾素效應(yīng)，尤其是在體外實(shí)驗(yàn)中。這一現(xiàn)象限制了轉(zhuǎn)染時(shí)載體的用量，在某些試驗(yàn)尤其是需要同時(shí)抑制兩個(gè)或多個(gè)基因時(shí)往往受到很大的限制。
本發(fā)明的目的，是要提供一種可用于同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1-n，具體地講，是為了克服非病毒載體已知的上述缺陷，使一個(gè)載體上能同時(shí)存在多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位，提高shRNA干擾效果，在產(chǎn)生有效的特異RNA干擾的同時(shí)，盡量降低載體的用量，以減少轉(zhuǎn)染過(guò)程產(chǎn)生的非特異性作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可用于同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1-n(n表示shRNA轉(zhuǎn)錄單位的個(gè)數(shù)，n＝1，2，…，n)。所說(shuō)載體pCSH1-n，其組成包括多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位、質(zhì)?；拘蛄屑岸嗫寺∥稽c(diǎn)的表達(dá)載體(圖1)。本發(fā)明利用目前普遍使用的、也是分子量最小的shRNA表達(dá)載體之一pSilencer H1 3.0載體的H1啟動(dòng)子，將H1啟動(dòng)子用合適的酶切位點(diǎn)串聯(lián)起來(lái)，并在H1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄單位的前后各連接一個(gè)多克隆位點(diǎn)，然后將連接產(chǎn)物連接到含有質(zhì)?；拘蛄腥鏿UC19上，命名為pCSH1-n。構(gòu)建完成后的載體pCSH1-n包含有基本質(zhì)粒序列、兩個(gè)或多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位及兩組多克隆位點(diǎn)。兩組多克隆位點(diǎn)分別位于shRNA轉(zhuǎn)錄單位的前后，利用轉(zhuǎn)錄單位前后合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)如同尾酶酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)的一個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行的組合即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)在一個(gè)載體上。該多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位可以設(shè)計(jì)成針對(duì)一個(gè)靶基因的同一位點(diǎn)，也可以設(shè)計(jì)成針對(duì)一個(gè)靶基因的不同位點(diǎn)，還可以設(shè)計(jì)成針對(duì)不同靶基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶基因有效而且特異的抑制。因此，本發(fā)明所說(shuō)載體可用于制備研究基因功能的siRNA試劑或用于siRNA抗腫瘤藥物的研究與開(kāi)發(fā)。本發(fā)明shRNA表達(dá)載體pCSH1-n的構(gòu)建步驟如下1、設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)組合為了利用同尾酶的特性，實(shí)現(xiàn)將多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)在一個(gè)載體上的目的，需要在shRNA轉(zhuǎn)錄單位兩側(cè)選擇一對(duì)同尾酶和設(shè)計(jì)兩組多克隆位點(diǎn)，使這兩組多克隆位點(diǎn)與shRNA表達(dá)轉(zhuǎn)錄單位、基本的質(zhì)粒序列有序組合，構(gòu)建成質(zhì)粒載體。
2、合成兩對(duì)引物根據(jù)以上設(shè)計(jì)思路，需人工合成兩對(duì)引物，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)一個(gè)多克隆位點(diǎn)。
3、引物進(jìn)行退火成為雙鏈DNA這兩對(duì)引物退火形成雙鏈后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、將各個(gè)片斷進(jìn)行連接用基因工程的手段將載體基本質(zhì)粒序列如pUC19和利用轉(zhuǎn)錄單位如pSilencer H1 3.0(購(gòu)自Ambion公司)中的H1啟動(dòng)子前后合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)如同尾酶酶切位點(diǎn)，加上含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的引物連接起來(lái)。利用轉(zhuǎn)錄單位前后合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)如同尾酶酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)的一個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行的組合可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)。然后測(cè)序驗(yàn)證插入片斷的正誤，構(gòu)建形成pCSH1-n表達(dá)載體。本發(fā)明所述的載體pCSH1-n由基本質(zhì)粒序列、兩個(gè)或多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位和兩組多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成，可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)載體上同時(shí)表達(dá)多種shRNA。
5、pCSH1-n載體同時(shí)表達(dá)多種shRNA在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行RNAi效應(yīng)檢測(cè)載體pCSH1-1構(gòu)建完成后，合成了兩個(gè)腫瘤相關(guān)基因如N-Ras和c-Myc的shRNA模板，分別構(gòu)建含單一N-Ras或c-Myc shRNA的pCSH1-1載體，即pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc。然后利用本發(fā)明的思路，或?qū)hN2和shMyc串聯(lián)成兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的pCSH1-shNM載體，或?qū)蓚€(gè)shN2轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)，構(gòu)成pCSH1-2shN2表達(dá)載體，進(jìn)行RNAi效應(yīng)檢測(cè)。結(jié)果表明，本發(fā)明所說(shuō)載體可以同時(shí)表達(dá)兩種或多種shRNA。串聯(lián)后的載體pCSH1-2shN2對(duì)細(xì)胞的干擾效應(yīng)呈現(xiàn)增強(qiáng)。表明本載體應(yīng)用于串聯(lián)相同的shRNA轉(zhuǎn)錄單位可增強(qiáng)RNA干擾的效果。
發(fā)明效果本發(fā)明以質(zhì)粒表達(dá)干擾RNA為技術(shù)平臺(tái)，提供了一種新的可以在一個(gè)載體上表達(dá)多種干擾RNA的載體pCSH1-n及其構(gòu)建方法，經(jīng)siRNA體外生長(zhǎng)抑制作用檢測(cè)、mRNA和蛋白水平沉默效果檢測(cè)等表明，所構(gòu)建的載體能實(shí)現(xiàn)兩個(gè)不同靶點(diǎn)的抑制效果明顯，應(yīng)用于串聯(lián)相同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄單位可增強(qiáng)RNA干擾的效果。與單shRNA表達(dá)載體如pSilencer H1 3.0相比，本發(fā)明載體降低了質(zhì)粒的使用量，降低了載體導(dǎo)入細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生的非特異毒性。因此，載體pCSH1-n在以RNA干擾為基礎(chǔ)的腫瘤基因治療中有著較好的應(yīng)用前景。


圖1.pCSH1-n質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，其中n表示shRNA轉(zhuǎn)錄單位的個(gè)數(shù)，n＝1，2，…，n。
圖2.兩個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的流程圖，其中Sal I、Xho I和Pst I三個(gè)酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置維持不變。
圖3.pCSH1-1質(zhì)粒構(gòu)建流程圖，其中Sal I、Xho I和Pst I三個(gè)酶切位點(diǎn)是進(jìn)行shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的關(guān)鍵酶。
圖4.pCSH1-shN2降低靶mRNA水平，其中MarkerDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；psiMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；psiN2轉(zhuǎn)染pCSH1-shN2組。
圖5.pCSH1-shN2降低靶蛋白水平，其中Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；psiMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；psiN2轉(zhuǎn)染pCSH1-shN2組。
圖6.pCSH1-shMyc降低靶mRNA水平，
其中MarkerDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；psiMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；psiMyc轉(zhuǎn)染pCSH1-shMyc組。
圖7.pCSH1-shMyc降低靶蛋白水平，其中Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；psiMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；psiMyc轉(zhuǎn)染pCSH1-shMyc組。
圖8.pCSH1-2shN2、pCSH1-shN2對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，其中Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；shMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；2shMock轉(zhuǎn)染pCSH1-2shMock組；shN2轉(zhuǎn)染pCSH1-shN2組；2shN2轉(zhuǎn)染pCSH1-2shN2組。
圖9.pCSH1-shN2、pCSH1-shMyc和pCSH1-shNM降低靶蛋白水平，其中Control未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組；psiMock轉(zhuǎn)染pCSH1-shMock組；psiN2轉(zhuǎn)染pCSH1-shN2組；psiMyc轉(zhuǎn)染pCSH1-shMyc組；psiNM轉(zhuǎn)染pCSH1-shNM組。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明說(shuō)明書(shū)實(shí)施例中在強(qiáng)調(diào)所構(gòu)建的發(fā)卡式短干擾RNA結(jié)構(gòu)時(shí)使用shRNA來(lái)表示，在強(qiáng)調(diào)短干擾RNA的效應(yīng)時(shí)用siRNA來(lái)表示。
以下所舉實(shí)施例是為幫助進(jìn)一步理解本發(fā)明，而不具有任何限制作用。
實(shí)施例1能同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1-n的構(gòu)建要在一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)，需要利用原始載體的shRNA轉(zhuǎn)錄單位中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，即在保證轉(zhuǎn)錄單位完整的情況下，利用合適的酶切位點(diǎn)，以使串聯(lián)成為可能。本發(fā)明利用內(nèi)切酶中同尾酶能產(chǎn)生相同的粘末端可進(jìn)行連接但連接后不再被切開(kāi)的原理，來(lái)實(shí)現(xiàn)串聯(lián)的目標(biāo)，但不限于所選用的內(nèi)切酶包括同尾酶。Sal I和Xho I是一對(duì)同尾酶，Sal I識(shí)別的位點(diǎn)是GTCGAC，Xho I識(shí)別的位點(diǎn)是CTCGAG，二者的酶切產(chǎn)物均含相同的粘末端TCGA，可以用連接酶進(jìn)行連接，連接完成后序列為GTCGAG，這一對(duì)同尾酶均不能被識(shí)別。根據(jù)這一特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一個(gè)方案，在轉(zhuǎn)錄單位之前加入Sal I位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄單位之后加入Xho I位點(diǎn)和Pst I位點(diǎn)。將改造好的載體用SalI+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切回收大片斷，將兩個(gè)回收的片斷連接即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)，而這三個(gè)酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置維持不變，可以繼續(xù)用來(lái)串聯(lián)別的shRNA轉(zhuǎn)錄單位(圖2)。
本發(fā)明所說(shuō)的載體pCSH1-n由基本質(zhì)粒序列、n個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位和兩個(gè)多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成，可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)載體上同時(shí)表達(dá)多種shRNA。
一、多克隆位點(diǎn)的設(shè)計(jì)與合成兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，按照同尾酶的特性進(jìn)行多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的思路設(shè)計(jì)，委托賽百盛公司合成，退火后凍存，分別命名為KSEE和HXEP，合成的引物序列分別為KSEEa5′-AATTGGTACCGTCGACGATATCG-3′KSEEas3′-CCATGGCAGCTGCTATAGCTTAA-5′HXEPa5′-AGCTTCTCGAGATATCTGC-3′HXEPas3′-AGAGCTCTATAGACGTCGA-5′KSEEa和KSEEas可以退火形成雙鏈，雙鏈上含有Kpn I、Sal I、EcoR V、EcoR I四個(gè)酶切位點(diǎn)；HXEPa和HXEPas可以形成雙鏈，雙鏈上含有Hind III、Xho I、EcoR V、Pst I四個(gè)酶切位點(diǎn)。
二、引物進(jìn)行退火成為雙鏈DNA引物加無(wú)RNase水溶解至1μg/μL。將成對(duì)的引物各2μL加入46μLDNA退火緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，1mM EDTA pH8.0)至總體積50μL，95℃ 5分鐘、37℃ 1小時(shí)孵育，使引物退火成為雙鏈DNA，分別命名為KSEE和HXEP，KSEE上含有Kpn I、Sal I、EcoR V、EcoR I四個(gè)酶切位點(diǎn)，HXEP上含有Hind III、Xho I、EcoR V、Pst I四個(gè)酶切位點(diǎn)。其中Sal I和Xho I是一對(duì)同尾酶。引物退火后的DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 三、將各個(gè)片斷進(jìn)行連接用基因工程的手段將載體pUC19、KSEE、pSilencer H1 3.0(購(gòu)自Ambion公司)的H1啟動(dòng)子和HXEP連接起來(lái)(圖3)，命名為pCSH1-1。
四、本發(fā)明shRNA表達(dá)載體pCSH1-1的檢測(cè)構(gòu)建好的載體委托寶生物公司測(cè)序，引物為M13±，雙向測(cè)序結(jié)果均正確，證明改造完成。
五、本發(fā)明shRNA表達(dá)載體pCSH1-n的構(gòu)建(n＞1時(shí))如果需要構(gòu)建含一個(gè)以上shRNA轉(zhuǎn)錄單位的pCSH1-n載體，則按照實(shí)施例6的方法完成構(gòu)建。
實(shí)施例2應(yīng)用pCSH1-n實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤相關(guān)基因N-Ras的RNA干擾為了驗(yàn)證pCSH1-n是否可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)單個(gè)基因的RNA干擾，需要設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的siRNA靶序列，聯(lián)入pCSH1-1并在RNA水平和蛋白水平檢測(cè)靶基因的變化。同時(shí)設(shè)計(jì)不針對(duì)任何特定基因的siRNA序列，即mock序列，聯(lián)入pCSH1-1載體來(lái)作為陰性對(duì)照。
一、siRNA靶序列的選擇N-Ras是Ras蛋白家族中的一種，在許多腫瘤中發(fā)生突變，且突變后會(huì)導(dǎo)致Raf-MAPK途徑的組成型激活。在腫瘤細(xì)胞中抑制突變的N-Ras的表達(dá)，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，是腫瘤治療中的一個(gè)熱門(mén)靶點(diǎn)。
shRNA靶序列的選擇，目前主要是遵循較為公認(rèn)的Tushl原則并參考其它一些標(biāo)準(zhǔn)。選定靶序列后進(jìn)行Blast檢索，使該靶序列與其它基因不具有較高的同源性。
確定靶序列后需要按照現(xiàn)有規(guī)則合成靶序列的shRNA模板DNA(見(jiàn)Thijn R.Brummelkamp等，Science 296，550-553<2002>)。shRNA模板DNA包括正義、反義兩條互補(bǔ)的短DNA單鏈，其基本單位為BamH I位點(diǎn)、靶序列正義鏈、9bp的環(huán)序列、靶序列反義鏈、6個(gè)T、HindIII位點(diǎn)，總長(zhǎng)約60bp。
N-Ras-siRNA的靶mRNA序列及寡DNA引物序列如下mRNA Target(N19)5’-GUGUGAUUUGCCAACAAGG-3’(SEQ ID No1)引物序列為Sense5′-GATCCGTGTGATTTGCCAACAAGGTTCAAGAGACCTTGTTGGCAAATCA
CACTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No2)Antisense5′-AGCTTTTCCAAAAAAGTGTGATTTGCCAACAAGGTCTCTTGAACCTTGTTGGCAAATCACACG-3′(SEQ ID No3)實(shí)驗(yàn)中采用的mock-siRNA序列為mRNA Target(N19)5’-GGAUAGUACGAGAUUACAC-3’引物序列為Sense5′-GATCCCGGATAGTACGAGATTACACTTCAAGAGAGTGTAATCTCGTACTATCCTTTTTTGGAAA-3′Antisense5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGATAGTACGAGATTACACTCTCTTGAAGTGTAATCTCGTACTATCCGG-3′引物中劃線(xiàn)部分為相應(yīng)靶mRNA序列的DNA序列或其互補(bǔ)序列，轉(zhuǎn)錄成RNA后會(huì)在此處形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的雙鏈部分。引物送到賽百盛公司合成。
二、以N-Ras為靶點(diǎn)的干擾序列表達(dá)質(zhì)粒pCSH1-shN2的構(gòu)建引物加無(wú)RNase水溶解至1μg/μL。將成對(duì)的引物各2μL加入46μL DNA退火緩沖液，95℃，5分鐘，37℃，1小時(shí)孵育，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锿嘶鸷笮纬傻碾p鏈RNA的5’端有BamH I酶切位點(diǎn)的粘末端，3’端有Hind III酶切位點(diǎn)的粘術(shù)端，可以直接用于連接。
將質(zhì)粒pCSH1-1用內(nèi)切酶BamH I和Hind III雙酶切，回收大片斷，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 將回收的質(zhì)粒大片斷和引物退火后形成的短雙鏈DNA連接，篩選，測(cè)序鑒定。以N-Ras為靶點(diǎn)的干擾序列表達(dá)質(zhì)粒命名為pCSH1-shN2，對(duì)照干擾序列表達(dá)質(zhì)粒命名為pCSH1-shMock，對(duì)照干擾序列經(jīng)Blast分析不針對(duì)任何基因的mRNA。
三、干擾序列表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染本發(fā)明使用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體(Life Technologies，產(chǎn)品貨號(hào)11668-027)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)進(jìn)行沉默效果測(cè)定。
四、RT-PCR檢測(cè)干擾序列表達(dá)質(zhì)粒的基因沉默效果細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用TRIzol(Ivitrogen，產(chǎn)品貨號(hào)15596-026)提取總RNA，并用紫外分光光度計(jì)(BECKMAN DU800)測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量。采用RT-PCR試劑盒(Invitrogen，Cat.No.10928-34)對(duì)mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀照相并分析結(jié)果。結(jié)果表明，pCSH1-shN2能夠有效降低N-Ras基因mRNA的水平，而pCSH1-shMock對(duì)N-Ras基因mRNA的水平?jīng)]有影響(圖4)。
五、Western Blotting檢測(cè)干擾序列表達(dá)質(zhì)粒對(duì)靶蛋白水平的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，10％的SDS-PAGE，伯樂(lè)小型垂直電泳槽(Bio-RadMini-PROTEAN 3)凝膠電泳分離各蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀(Amersham Biosciences，Hoefer TE 70)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)完的膜浸于含5％(w/v)脫脂奶粉TBS(10mM Tris HCl，pH 7.5，150mM NaCl)溶液中室溫振搖封閉過(guò)夜，TBS室溫潤(rùn)洗5次，每次5分鐘，裝入雜交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀釋第一抗體，室溫振搖孵育3小時(shí)，TBS室溫潤(rùn)洗5次，每次5分鐘。裝入新的雜交袋內(nèi)，用二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗)室溫孵育3小時(shí)，TBS室溫潤(rùn)洗5次，每次5分鐘。膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Santa Cruz Biotechnology sc-2048)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕獲圖像。抗體的稀釋比例如下，小鼠單克隆N-RAS抗體(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-31)1/150稀釋?zhuān)∈髥慰寺CNA抗體(Oncogene Product，NA-03)1/500稀釋?zhuān)备^(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體(ZB-2305)1/3000稀釋。結(jié)果表明pCSH1-shN2能抑制HepG2細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)，而經(jīng)pCSH1-shMock對(duì)N-RAS蛋白水平?jīng)]有影響(圖5)。同時(shí)以PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白作為上樣對(duì)照。
實(shí)施例3應(yīng)用pCSH1-n實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤相關(guān)基因c-Myc的RNA干擾為了驗(yàn)證pCSH1-n是否可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)基因的同時(shí)干擾，本發(fā)明又設(shè)計(jì)了針對(duì)腫瘤相關(guān)基因c-Myc的siRNA模板。c-Myc是Myc蛋白家族中的一種，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡。c-myc與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-Myc有助于癌細(xì)胞的發(fā)展，在惡性腫瘤的病態(tài)發(fā)展中扮演著關(guān)鍵性的角色。c-Myc目前是腫瘤治療的一個(gè)重要靶標(biāo)。
確定靶序列后需要按照同實(shí)施例2的方法合成靶序列的shRNA模板DNA。
c-Myc-siRNA的靶mRNA序列及寡DNA序列如下mRNA Target(N19)5’-GGAAGAAAUUCGAGCUGCU-3’(SEQ ID No4)引物序列為Sense5′-GATCCCGGAAGAAATTCGAGCTGCTTTCAAGAGAAGCAGCTCGAATTTCTTCCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No5)Antisense5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGAAGAAATTCGAGCTGCTTCTCTTGAAAGCAGCTCGAATTTCTTCCGG-3′(SEQ ID No6)引物中劃線(xiàn)部分為相應(yīng)靶mRNA序列的DNA序列或其互補(bǔ)序列，轉(zhuǎn)錄成RNA后會(huì)在此處形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的雙鏈部分。引物送到賽百盛公司合成。實(shí)驗(yàn)中采用的mock-siRNA序列同實(shí)施例2。
按照同實(shí)施例2的方法完成以c-Myc為靶點(diǎn)的干擾序列表達(dá)質(zhì)粒pCSH1-shMyc的構(gòu)建后，把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行RT-PCR和WesternBlotting檢測(cè)，結(jié)果表明，pCSH1-shN2能夠有效降低c-Myc基因mRNA的水平，而pCSH1-shMock對(duì)c-Myc基因mRNA的水平?jīng)]有影響(圖6)。Western Blotting檢測(cè)中小鼠單克隆c-Myc抗體(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-31)1/150稀釋?zhuān)琾CSH1-shMyc能抑制HepG2細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)，而經(jīng)pCSH1-shMock對(duì)c-Myc蛋白水平?jīng)]有影響(圖7)。同時(shí)以actin(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-1616)作為上樣對(duì)照。
實(shí)施例4應(yīng)用pCSH1-n實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤相關(guān)基因N-Ras同一位點(diǎn)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)為了驗(yàn)證pCSH1-n對(duì)同一shRNA轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行串聯(lián)是否有意義，本發(fā)明構(gòu)建了針對(duì)腫瘤相關(guān)基因N-Ras同一位點(diǎn)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-2shN2，并用生長(zhǎng)曲線(xiàn)法檢驗(yàn)它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
一、pCSH1-2shN2的構(gòu)建將pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含兩個(gè)相同的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-2shN2。同時(shí)構(gòu)建Mock的兩個(gè)相同的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-2shMock。
二、pCSH1-2shN2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將pCSH1-shN2、pCSH1-2shN2、pCSH1-shMock和pCSH1-2shMock轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，將細(xì)胞以每孔3000個(gè)細(xì)胞鋪到24孔板中，連續(xù)計(jì)數(shù)6天。相同質(zhì)量的pCSH1-2shN2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制明顯強(qiáng)于pCSH1-shN2，而相同質(zhì)量的pCSH1-2shMock對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制略微強(qiáng)于pCSH1-shMock(圖8)。說(shuō)明pCSH1-n針對(duì)同一位點(diǎn)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)可以增加RNA干擾效果或在保證相同的干擾效果的同時(shí)降低質(zhì)粒的使用量。
實(shí)施例5應(yīng)用pCSH1-n實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤相關(guān)基因N-Ras和c-Myc不同靶基因的shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)為了驗(yàn)證pCSH1-n是否可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)不同靶基因的shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)，本發(fā)明構(gòu)建了將針對(duì)腫瘤相關(guān)基因N-Ras和c-Myc不同靶基因的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-shNM，并且在RNA水平和蛋白水平同時(shí)檢測(cè)這兩個(gè)基因的變化，看它們是否會(huì)同時(shí)降低。
一、pCSH1-shNM的構(gòu)建將pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-shMyc回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含兩個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-shNM。
二、pCSH1-shNM的效果檢測(cè)將pCSH1-shMock、pCSH1-shN2、和pCSH1-shNM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48小時(shí)后，Western Blotting檢測(cè)質(zhì)粒對(duì)靶蛋白水平的影響，pCSH1-shNM既能有效抑制N-Ras又能有效抑制c-Myc的蛋白表達(dá)水平(圖9)。說(shuō)明pCSH1-n可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)基因同時(shí)干擾，兩個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位之間沒(méi)有明顯抑制作用。
實(shí)施例6應(yīng)用pCSH1-n實(shí)現(xiàn)多個(gè)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)為了驗(yàn)證pCSH1-n是否可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)，我們構(gòu)建了含3個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，4個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，5個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，6個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體。這些串聯(lián)在-個(gè)載體內(nèi)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位可以相同也可以不同。
一、pCSH1-3shN2的構(gòu)建將pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-2shN2回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含3個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-3shN2。
二、pCSH1-4shN2的構(gòu)建將pCSH1-2shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-2shN2回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含4個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-4shN2。
三、pCSH1-5shN2的構(gòu)建將pCSH1-2shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-3shN2回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含5個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-5shN2。
四、pCSH1-6shN2的構(gòu)建將pCSH1-3shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片斷，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-3shN2回收大片斷，兩個(gè)回收的片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選，就可以得到含6個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，命名為pCSH1-6shN2。
權(quán)利要求
1.一種可同時(shí)表達(dá)多種shRNA的質(zhì)粒載體pCSH1-n，其特征是所說(shuō)載體pCSH1-n由基本質(zhì)粒序列、多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位和兩組多克隆位點(diǎn)組成。多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位可以用于多次表達(dá)一個(gè)靶基因，或表達(dá)一個(gè)靶基因的多個(gè)不同位點(diǎn)，還可以表達(dá)不同靶基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶基因有效而且特異的抑制。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)多種shRNA的質(zhì)粒載體pCSH1-n，其特征是shRNA表達(dá)載體中可被串聯(lián)構(gòu)建入兩段針對(duì)腫瘤基因治療靶點(diǎn)N-Ras和/或c-Myc的RNA干擾序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的載體pCSH1-n，其特征是腫瘤基因治療靶點(diǎn)N-Ras的RNA干擾序列為5′-GATCC TTCAAGAGA TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No2)5′-AGCTTTTCCAAAAAA TCTCTTGAA G-3′(SEQ ID No3)其中N-Ras-siRNA的靶mRNA序列為
5’-GUGUGAUUUGCCAACAAGG-3’(SEQ ID No 1)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的載體pCSH1-n，其特征是腫瘤基因治療靶點(diǎn)c-Myc的干擾序列為5′-GATCCC TTCAAGAGA TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No5)5′-AGCTTTTCCAAAAAA TCTCTTGAA GG-3′(SEQ ID No6)其中c-Myc-siRNA的靶mRNA序列為5’-GGAAGAAAUUCGAGCUGCU-3’(SEQ ID No4)。
5.一種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述載體pCSH1-n的方法，其特征是在shRNA轉(zhuǎn)錄單位兩側(cè)選擇一對(duì)同尾酶酶切位點(diǎn)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)合成及退火獲得含有兩組多克隆位點(diǎn)的序列，使含兩組多克隆位點(diǎn)序列與shRNA轉(zhuǎn)錄單位、基本的質(zhì)粒序列有序組合；利用轉(zhuǎn)錄單位前后的同尾酶酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)的一個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位組合，即可構(gòu)建表達(dá)多個(gè)shRNA質(zhì)粒載體pCSH1-n。
6.如權(quán)利要求1所述shRNA表達(dá)載體pCSH1-n在制備腫瘤基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1－n，可在一個(gè)載體上同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的干擾，所說(shuō)載體pCSH1包含有基本質(zhì)粒序列、shRNA轉(zhuǎn)錄單位和兩組多克隆位點(diǎn)，插入針對(duì)靶基因的shRNA模板后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞或動(dòng)物就可以特異并有效地抑制兩個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)，因而可將本發(fā)明方便地用于基因功能的研究和用于抗腫瘤藥物的研究與開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1710079SQ20051006653
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者邵榮光, 何紅偉, 劉鐵剛, 張敏, 李保衛(wèi), 邊春景, 劉霞, 封云 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所