專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白和其制備方法，具體涉及重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)hCNTF)突變體及其制備方法，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及用乳糖誘導(dǎo)hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中高效可溶表達(dá)、并從中加以分離純化的方法，以及通過(guò)該方法制備的hCNTF突變體。
背景技術(shù)：
睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)最初是從雞的睫狀體中提取出來(lái)的，可維持雞副交感神經(jīng)節(jié)的存活，并因此而得名。CNTF基因最早于1989年得以克隆和表達(dá)。天然CNTF是一個(gè)由200個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，無(wú)分子內(nèi)二硫鍵，無(wú)分泌信號(hào)，無(wú)糖基化位點(diǎn)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和IL-6、LIF等有相似的螺旋框架結(jié)構(gòu)。CNTF具有多種功能，能促使多種神經(jīng)細(xì)胞的存活，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)能夠維持體內(nèi)和離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活及突起生長(zhǎng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，CNTF還具有肌肉營(yíng)養(yǎng)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和神經(jīng)損傷修復(fù)中具有非常重要的作用，可用于制備治療哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷、外周神經(jīng)損傷、周?chē)窠?jīng)疾病等的藥物。
對(duì)于重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)來(lái)說(shuō)，lac啟動(dòng)子是常用的啟動(dòng)子，IPTG對(duì)該啟動(dòng)子具有高的誘導(dǎo)性，但因其高成本和潛在的毒性，使其在大規(guī)模生產(chǎn)上的應(yīng)用受到極大的限制。乳糖代替IPTG用作誘導(dǎo)劑不僅能夠消除上述限制，而且可以達(dá)到接近IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平。目前，人們通常在向培養(yǎng)液中添加乳糖作為誘導(dǎo)劑后，以乳糖作為目標(biāo)蛋白表達(dá)階段的主要碳源。由于乳糖在細(xì)菌體內(nèi)的作用機(jī)制和特點(diǎn)，誘導(dǎo)后在較高細(xì)胞密度情況下以乳糖作為基因工程菌的主要碳源最終導(dǎo)致菌體終濃度不高和菌體收獲量偏低。
目前，本領(lǐng)域中大腸桿菌表達(dá)CNTF多以包涵體形式，當(dāng)外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物往往在細(xì)胞內(nèi)聚集在一起，形成大小0.5～1μm的折光小體，即包涵體。例如，馬紅雨等(馬紅雨，朱美才，蔡慶，占志，CNTF工程菌培養(yǎng)及產(chǎn)物純化.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2001年，Vol.14，No.3)利用工程菌DH5α/pBV220CNTF進(jìn)行了CNTF的表達(dá)研究，其為包涵體形式的表達(dá)。杭州九源基因工程有限公司的中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)No.02136033.2中通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)hCNTF的基因進(jìn)行修飾改造，獲得突變型hCNTF基因的cDNA，人工合成該cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)全自動(dòng)發(fā)酵罐高密度表達(dá)得到hCNTF的包涵體表達(dá)。另外US6602687中公開(kāi)的重組hCNTF在大腸桿菌中也是以包涵體形式表達(dá)。
雖然包涵體表達(dá)一般表達(dá)量較高，但包涵體形成后，包涵體內(nèi)大部分成分，這些蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但沒(méi)有經(jīng)過(guò)正確折疊形成天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，因而缺乏生物學(xué)活性，需要增加變性、復(fù)性步驟恢復(fù)其天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)的復(fù)性問(wèn)題目前仍是生物工程中的一個(gè)難點(diǎn)，復(fù)性工作量大，復(fù)性率低，成本高。如US6602687中實(shí)施例所述，按照估算的表達(dá)水平和濕菌體總濃度計(jì)算，每克濕菌體理論上可得到15～45mgCNTF，但是經(jīng)過(guò)包涵體變性復(fù)性以及純化后，最終純品收獲量?jī)H為每克濕菌體6mgCNTF。
李鴻均等(李鴻鈞，馬雁冰，蘇婷等.人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子克隆、表達(dá)、純化及其生物活性.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2002年Vol.15，No.3)研究重組表達(dá)質(zhì)粒PBV220-CNTF在大腸桿菌BL21中獲得了非融合的穩(wěn)定高效表達(dá)，通過(guò)薄層掃描分析，目的蛋白約占菌體總蛋白的45％，在超聲上清與沉淀中均有表達(dá)的hCNTF，約60％以可溶形式存在，并對(duì)可溶上清進(jìn)行了簡(jiǎn)單的一步陽(yáng)離子交換層析純化，這是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中唯一提到重組人CNTF以可溶形式表達(dá)的報(bào)道。目前尚沒(méi)有以可溶上清為原料、以大量制備高純度和高活性重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為目的的純化方法。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)以低成本、高產(chǎn)率為目的制備重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的方法，所述的制備包括重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)、分離和純化。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可溶性表達(dá)高活性重組hCNTF的方法。其中所述的可溶性和高活性是通過(guò)下述突變實(shí)現(xiàn)的hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的谷氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個(gè)氨基酸；或這些突變的組合。C末端氨基酸優(yōu)選去除13或15個(gè)。所述的突變組合優(yōu)選第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個(gè)氨基酸的組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供高活性重組hCNTF的誘導(dǎo)表達(dá)方法。其中所述的誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)加入乳糖誘導(dǎo)后再加入葡萄糖作為主要碳源實(shí)現(xiàn)的。其中加入乳糖的終濃度為1.5-2.5％，優(yōu)選為2％，誘導(dǎo)約1～4小時(shí)，優(yōu)選2～2.5小時(shí)后再緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，并控制培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制培養(yǎng)液中溶解氧值為10％～15％。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供高活性重組hCNTF的分離純化方法，其包括20％～45％硫酸銨分級(jí)鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過(guò)濾純化，獲得的純度大于98％。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備可溶性hCNTF的方法包括下列步驟(a)將hCNTF突變體基因序列克隆入表達(dá)載體以得到重組載體，并導(dǎo)入大腸桿菌中，生成含有重組載體的基因工程菌；(b)培養(yǎng)基因工程菌至OD600＝12～14時(shí)，加入乳糖，誘導(dǎo)hCNTF突變體在基因工程菌中可溶性表達(dá)；(c)誘導(dǎo)后，向培養(yǎng)液中緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，并控制培養(yǎng)液中溶解氧值為10％～15％，繼續(xù)培養(yǎng)；(d)待基因工程菌的OD600＝20-30時(shí)，收獲菌體，并將菌體破碎得到破菌液；(e)純化破菌液，得到純化產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的大腸桿菌是大腸桿菌BL21(DE3)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的hCNTF突變體中涉及的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的谷氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個(gè)氨基酸；或這些突變的組合。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，C末端氨基酸優(yōu)選去除13或15個(gè)。
在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的突變組合優(yōu)選第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個(gè)氨基酸的組合。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的菌體破碎使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行，條件為800bar，2個(gè)循環(huán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(d)中基因工程菌的OD600＝25。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(e)中對(duì)破菌液依次進(jìn)行20％～45％硫酸銨分級(jí)鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過(guò)濾純化，得到純化產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的疏水層析填料是Butyl Sepharose 4 FastFlow或Phenyl Sepharose 4 Fast Flow，在層析過(guò)程中使用含有硫酸銨的緩沖液平衡層析柱，上樣后，先用含硫酸銨的緩沖液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的緩沖液洗脫活性峰。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述的平衡緩沖液含有的硫酸銨濃度范圍是0.5～1mol/L；洗雜峰緩沖液含有的硫酸銨濃度范圍是0.2～0.3mol/L；緩沖液是Tris-HCl，濃度范圍是10～50mmol/L，pH值是7.0～9.0。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的陰離子交換層析填料是Q SepharoseFast Flow或DEAE Sepharose Fast Flow，層析過(guò)程中使用含有鹽的緩沖液平衡層析柱，上樣后，先用含鹽的緩沖液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩沖液洗脫活性峰。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，濃度為20～50mmol/L，pH值是7.5～8.5。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖液中含有的鹽為氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是O.13～0.2mol/L。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明hCNTF突變體的制備方法在陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析步驟之間還包括通過(guò)硫酸銨沉淀濃縮活性蛋白溶液的步驟。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述凝膠過(guò)濾層析的填料是Superdex 75prep grade或Sephacryl S-200 High Resolution，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫，濃度是5～50mmol/L，pH值是7.0～8.5。
此外，本發(fā)明還涉及根據(jù)上述的方法制備的具有生物活性的hCNTF突變體。


圖1所示為搖瓶培養(yǎng)條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；1號(hào)至7號(hào)樣品依次為未誘導(dǎo)破菌液上清，誘導(dǎo)1小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)2小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)3小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)4小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)4小時(shí)后破菌液沉淀，誘導(dǎo)4小時(shí)后的全菌液，每條泳道均為等量發(fā)酵原液處理后得到的樣品。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶從大到小依次為116kD、66kD、45kD、34kD、25kD、18kD、14kD。如無(wú)特殊說(shuō)明，以下附圖的SDS-PAGE電泳均使用同樣的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2所示為搖瓶培養(yǎng)條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以乳糖誘導(dǎo)表達(dá)；1號(hào)至8號(hào)樣品依次為未誘導(dǎo)破菌液上清，誘導(dǎo)1小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)2小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)3小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)4小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)5小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)6小時(shí)后破菌液上清，誘導(dǎo)6小時(shí)后的全菌液，每條泳道均為等量發(fā)酵原液處理后得到的樣品。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3所示為發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。1號(hào)至9號(hào)樣品依次為誘導(dǎo)后1～9小時(shí)取樣的破菌液上清圖4所示為純化過(guò)程所得主要組分的SDS-PAGE(13.5％)電泳分析結(jié)果，考馬斯亮藍(lán)染色，樣品順序?yàn)?破菌液上清；2經(jīng)20％硫酸銨沉淀的破菌液上清，3經(jīng)20％-45％硫酸銨沉淀的破菌液上清；4經(jīng)20％-45％硫酸銨沉淀的破菌液上清；5Butyl疏水層析目標(biāo)峰；6Q陰離子交換層析目標(biāo)峰；7Superdex 75凝膠過(guò)濾層析目標(biāo)峰；M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。1～7電泳泳道上樣量分別為30μg、30μg、8μg、40μg、20μg、17μg、15μg。
圖5所示為最終純品SDS-PAGE電泳圖片及純度分析結(jié)果。SDS-PAGE電泳中的1、2號(hào)泳道上樣量分別為10μg，15μg，M為與圖4相同的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。其后的圖表是根據(jù)電泳圖片，由UVP公司提供的LabwarksTMAnalysis Software軟件分析電泳泳道中目標(biāo)蛋白含量得到的結(jié)果。
圖6為根據(jù)實(shí)施例6的生物活性測(cè)定方法所得到的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，除非特別指明，否則本說(shuō)明書(shū)所用的任何技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，如金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版，科學(xué)出版社，北京，1992；汪家政等，蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)，科學(xué)出版社，北京，2001；朱厚礎(chǔ)等譯，蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版杜，北京，1999；和李育陽(yáng)主編，基因表達(dá)技術(shù)，科學(xué)出版社，北京，2000所述的方法進(jìn)行的；或按照安瑪西亞公司所建議的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，首先對(duì)天然存在的hCNTF氨基酸序列進(jìn)行突變，以獲得更穩(wěn)定、活性更高、能夠以可溶性方式表達(dá)的hCNTF突變體。所述的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的谷氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個(gè)氨基酸；或這些突變的組合。
其中，第17位的半胱氨酸被所列的氨基酸取代后，可以避免分子間的二硫鍵，歸于實(shí)驗(yàn)結(jié)果為有更好的穩(wěn)定性，在生理的pH、溫度下更利于活性作用的發(fā)揮，對(duì)制備藥劑是有意義的。
hCNTF第63位的谷氨酸所列的氨基酸取代后，突變體蛋白會(huì)更強(qiáng)烈地在體外刺激神經(jīng)細(xì)胞的存活與分化，在體外表現(xiàn)為活性檢測(cè)指標(biāo)更好，而在體內(nèi)表現(xiàn)為動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的提高。
hCNTF第64位的組氨酸所列的氨基酸取代后，突變體蛋白體內(nèi)的生物活性有了顯著提高。
hCNTF的C末端的一端氨基酸去除后，優(yōu)選去除13和15個(gè)氨基酸后，突變體蛋白在生理狀態(tài)下有更好溶解度和穩(wěn)定性。
在上述的突變中，優(yōu)選將涉及第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個(gè)氨基酸的突變組合，同時(shí)具備上述三種突變的hCNTF突變體，稱(chēng)為hCNTF-TS，這種組合在一定程度上可以集合其各突變體的優(yōu)點(diǎn)，能夠在穩(wěn)定性、生物活性較天然氨基酸序列的hCNTF分子有顯著的提高。
在本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“突變體或hCNTF突變體”除非特別指出，即指含有上述突變位點(diǎn)或其組合的hCNTF分子，其均是以天然的hCNTF氨基酸序列(GenBank號(hào)GI25952136)為突變對(duì)象。獲得上述突變體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
將外源基因序列插入合適的表達(dá)載體并導(dǎo)入大腸桿菌的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的，例如參見(jiàn)金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版，科學(xué)出版社，北京，1992。得到含有重組載體的菌株后，在37℃下用LB等培養(yǎng)對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到一定密度后(如，OD＝0.6時(shí))，可以向培養(yǎng)基中添加一定濃度(如1mmol/L)IPTG或(如2％)乳糖，細(xì)菌在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下，可以大量表達(dá)hCNTF及突變體蛋白，我們獲得這些細(xì)菌樣品，就可以對(duì)hCNTF及突變體蛋白進(jìn)行提純和研究。
在本發(fā)明的說(shuō)明與實(shí)施方案中，關(guān)于蛋白純度和含量的估算，如無(wú)特殊說(shuō)明，均是以SDS-PAGE電泳圖片為分析對(duì)象，使用電泳圖片分析軟件計(jì)算得來(lái)的，該類(lèi)軟件是公眾可以得到或購(gòu)買(mǎi)的(如UVP公司提供的LabworksTM分析軟件)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用乳糖，優(yōu)選使用2％的乳糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組hCNTF的可溶性表達(dá)。由于乳糖誘導(dǎo)的關(guān)鍵是誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度要足夠低[7]，因此在誘導(dǎo)期間，乳糖既作為重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑，又作為主要碳源。但是，考慮到乳糖作為碳源會(huì)限制菌體的終濃度和菌體收獲量，使菌體終濃度和菌體收獲量偏低，另外，作為碳源，乳糖的價(jià)格較為昂貴，生物利用率又較低，從而造成生產(chǎn)成本提高。因此，本發(fā)明在誘導(dǎo)一段時(shí)間之后，優(yōu)選在誘導(dǎo)約2～2.5小時(shí)后緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，并控制培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制培養(yǎng)液中溶解氧值為10％～15％，使盡可能多的目標(biāo)蛋白以可溶形式表達(dá)。
結(jié)果，乳糖誘導(dǎo)一段時(shí)間后添加葡萄糖和其他氮源不但可以大幅提高菌體收獲量，而且絲毫不影響目標(biāo)蛋白的可溶表達(dá)。目標(biāo)蛋白90％以上形成可溶表達(dá)，可溶表達(dá)量(可溶性的目的蛋白在所有可溶性菌體蛋白中占的比例)達(dá)到20％左右。
在發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明采用半合成培養(yǎng)基，誘導(dǎo)前通過(guò)流加碳源(如葡萄糖)和氮源補(bǔ)充液(如胰蛋白胨、酵母提取物和酪蛋白水解物)，在菌體濃度達(dá)到OD600＝12～14時(shí)，加入終濃度為2％的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，停止流加碳源補(bǔ)充液，繼續(xù)流加氮源補(bǔ)充液。誘導(dǎo)后間隔2～2.5小時(shí)，恢復(fù)流加碳源補(bǔ)充液。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中控制pH值6.6～7.0，誘導(dǎo)前溶解氧值30％～50％，溫度37℃，誘導(dǎo)后溶解氧值5％～20％，誘導(dǎo)后開(kāi)始流加碳源補(bǔ)充液后控制溫度20～30℃。更優(yōu)選地，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中控制pH值6.8，誘導(dǎo)前溶解氧值40％，誘導(dǎo)后溶解氧值10％～15％，誘導(dǎo)后開(kāi)始流加碳源補(bǔ)充液后控制溫度25～28℃。通過(guò)適時(shí)調(diào)整流加補(bǔ)充液的流加速度，控制細(xì)菌比生長(zhǎng)速率(比生長(zhǎng)速率的定義參見(jiàn)張?jiān)d編著，生物反應(yīng)器工程，P37，華東理工大學(xué)出版社，2001年)在誘導(dǎo)前為0.2～0.3h-1，誘導(dǎo)后為0.05～0.15h-1。誘導(dǎo)后6小時(shí)收獲菌體，細(xì)菌密度可達(dá)OD600＝25左右，濕菌體產(chǎn)量50g/L，90％以上的目標(biāo)蛋白形成可溶性表達(dá)，可溶表達(dá)量為20％左右(圖2)。
將發(fā)酵收獲的菌體破碎得到破菌液，然后對(duì)破菌液依次進(jìn)行硫酸銨分級(jí)鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過(guò)濾純化，得到純度高并具有生物活性的重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
將發(fā)酵收獲的濕菌體按1∶10的比例，用PBS或者Tris-HCl緩沖液重懸菌體，經(jīng)過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)破菌，高壓均質(zhì)機(jī)破菌條件優(yōu)選在800bar的壓力下，破菌2個(gè)循環(huán)。
對(duì)破菌液進(jìn)行的硫酸銨分級(jí)鹽析以除去菌體碎片及大部分雜蛋白，硫酸銨分級(jí)鹽析優(yōu)選20％～45％分級(jí)沉淀。
疏水層析填料為Butyl Sepharose 4 Fast Flow，還可以是Phenyl Sepharose 4 FastFlow，使用的含有0.5～1mol/L硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，緩沖液的pH值是7.0～9.0，然后用平衡緩沖液溶解硫酸銨分級(jí)沉淀樣品，樣品上疏水層析柱后，先用含0.2～0.3mol/L硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl，pH7.0～9.0的緩沖液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl，pH7.0～9.0的緩沖液洗脫活性峰。
陰離子交換層析填料是Q Sepharose Fast Flow，還可以是DEAE Sepharose FastFlow，在陰離子交換層析中使用的平衡緩沖液是Tris-HCl緩沖液，濃度為20～50mmol/L，緩沖液的pH值是7.5～8.5，經(jīng)過(guò)疏水層析的活性峰電導(dǎo)率較低，直接上陰離子交換層析柱，上樣后，先用含鹽的緩沖液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩沖液洗脫活性峰，緩沖液選用Tris-HCl緩沖液，濃度為20～50mmol/L，緩沖液的pH值是7.5～8.5，緩沖液含有的鹽可以是氯化鈉，也可以是硫酸鈉、硫酸銨，優(yōu)選氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是0.13～0.2mol/L。
在陰離子交換層析后使用硫酸銨沉淀方法濃縮活性峰，上用濃度為5～50mmol/L、pH值7.5～8.5的磷酸鹽緩沖液平衡了的凝膠過(guò)濾層析柱，凝膠過(guò)濾層析填料是Superdex 75 prep grade，還可以是Sephacryl S-200 High Resolution，使用濃度為5～50mmol/L、pH值7.0～8.5的磷酸鹽緩沖液洗脫得到目標(biāo)蛋白CNTF。
實(shí)施例下面將結(jié)合附圖，通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。但應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍具有任何限制。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍僅由附加的權(quán)利要求書(shū)加以限制。
實(shí)施例1獲得表達(dá)hCNTF突變體的基因工程菌我們通過(guò)RT-PCR反應(yīng)從人血細(xì)胞克隆到天然CNTF基因序列，并經(jīng)過(guò)突變得到下列hCNTF突變體序列SEQ ID NO.1catatggctt tcacagagca ttcaccgctg acccctcacc gtcgggacctcgcaagccgc tctatctggc tagcaaggaa gattcgttca gacctgactgctcttacgga atcctatgtg aagcatcagg gcctgaacaa gaacatcaacctggactctg cggatgggat gccagtggca agcactgatc gttggagtgagctgaccgag gcagagcgac tccaagagaa ccttcaagct tatcgtaccttccatgtttt gttggccagg ctcttagaag accagcaggt gcattttaccccaaccgaag gtgacttcca tcaagctata catacccttc ttctccaagtcgctgccttt gcataccaga tagaggagtt aatgatactc ctggaatacaagatcccccg caatgaggct gatgggatgc ctattaatgt tggagatggtggtctctttg agaagaagct gtggggccta aaggtgctgc aggagctttcacagtggaca gtaaggtcca tccatgacct tcgtttcatt tcttctcatcagactgggta ataaggatcc其中下劃線(xiàn)部分catatg和ggatcc依次為NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)，陰影部分atg和taataa依次為基因表達(dá)的起始密碼子和終止密碼子。該突變體序列為前述突變方法的優(yōu)選組合，即與天然hCNTF基因相比，為第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸并去除C末端15個(gè)氨基酸的突變組合(hCNTF-TS)，利用該序列上的NdeI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)克隆入pET32a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒的NdeI(691)和BamHI(198)位點(diǎn)(參見(jiàn)Novagen公司質(zhì)粒圖譜)，獲得重組表達(dá)載體質(zhì)粒，將該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，得到能夠表達(dá)hCNTF突變體的工程菌，表達(dá)的突變體與天然hCNTF比較，第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸，C末端去除15個(gè)氨基酸。該工程菌已經(jīng)于2005年3月22日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢大學(xué)，郵編430072)進(jìn)行了生物保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOM205025。
實(shí)施例2IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)重組hCNTF突變體取甘油管凍存的重組基因工程菌BL21(DE3)，按0.2％的接種量接入新鮮LB抗性培養(yǎng)基中(含Amp 100μg/ml)，過(guò)夜培養(yǎng)。將活化的種液按1％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有200ml LB培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，280rpm，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6左右時(shí)，以終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，結(jié)果90％以上的目標(biāo)蛋白形成可溶性表達(dá)，可溶表達(dá)量為20～25％。(圖1)。
實(shí)施例3乳糖誘導(dǎo)重組hCNTF突變體在搖瓶條件下的高效可溶表達(dá)取甘油管凍存的基因工程菌BL21(DE3)，按0.2％的接種量接入新鮮LB抗性培養(yǎng)基中(含Amp 100μg/ml)，過(guò)夜培養(yǎng)。將活化的種液按1％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有200mlLB培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，280rpm，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6左右時(shí)，加入終濃度為2％的乳糖溶液，220rpm，25℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，3000g離心力，10分鐘離心收獲菌體。秤取濕菌體重量，以50mmol/L的Tris-HCl緩沖液按1∶20的比例重懸菌體。超聲波破菌后，破菌液以20,000g離心力，10分鐘離心，取出上清，沉淀以等體積的緩沖液重懸，分別將破菌液上清，沉淀和收獲的菌體并行進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果90％以上的目標(biāo)蛋白形成可溶性表達(dá)，可溶表達(dá)量為20％左右。圖2為誘導(dǎo)后各時(shí)期的重組hCNTF突變體的表達(dá)。
實(shí)施例4乳糖誘導(dǎo)重組hCNTF突變體在發(fā)酵罐放大培養(yǎng)條件下的高效可溶表達(dá)取甘油管凍存的基因工程菌BL21(DE3)，劃線(xiàn)接種LB抗性斜面，37℃培養(yǎng)12～18小時(shí)后取出置4℃保存。將一支斜面菌種轉(zhuǎn)入裝有400ml種子培養(yǎng)液的三角瓶中，280rpm，37℃培養(yǎng)至OD600＝1.5左右。種子培養(yǎng)液為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。
14L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，裝入7L發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為T(mén)ryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，酪蛋白水解物2g/L，Na2HPO4·12H2O14g/L，KH2PO44g/L，(NH4)2HPO42g/L。其中胰蛋白胨和酵母提取物為OXOID產(chǎn)品，酪蛋白水解物為國(guó)產(chǎn)生化試劑，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｅ囵B(yǎng)基以121℃，25分鐘實(shí)罐滅菌。滅菌完畢待培養(yǎng)基冷卻后，接入400ml培養(yǎng)好的種子液，控制pH6.8，溶氧值40％，溫度37℃，溶氧值由攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量級(jí)聯(lián)。3.5小時(shí)后，向發(fā)酵罐內(nèi)同時(shí)流加碳源補(bǔ)充液和氮源補(bǔ)充液，通過(guò)適時(shí)調(diào)整碳源補(bǔ)充液和氮源補(bǔ)充液的流加速度，使細(xì)菌比生長(zhǎng)速率控制在0.2hr-1左右。其中碳源補(bǔ)充液組成為葡萄糖200g/L，MgSO4·7H2O10g/L；氮源補(bǔ)充液組成為胰蛋白胨40g/L，酵母提取物20g/L，酪蛋白水解物10g/L，MgSO4·7H2O 10g/L。
培養(yǎng)至OD600＝12～14時(shí)，向發(fā)酵罐內(nèi)一次性加入30％的乳糖溶液，使其終濃度為2％，此時(shí)暫停碳源補(bǔ)充液的流加，調(diào)整溶氧值為20％。2～2.5小時(shí)后，恢復(fù)流加碳源補(bǔ)充液，控制細(xì)菌比生長(zhǎng)速率0.05～0.15hr-1，調(diào)整培養(yǎng)溫度25～28℃，溶氧值1O～15％。繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后放罐，細(xì)菌終濃度達(dá)到OD600＝25左右，濕菌體產(chǎn)量50g/L。將濕菌體按1∶10的比例，以50mmol/L的Tris-HCl緩沖液重懸菌體，以高壓均質(zhì)機(jī)在800bar的壓力下，破菌2個(gè)循環(huán)。取破菌液小樣，20000g離心力，10分鐘離心，取出上清液，沉淀以等體積的緩沖液重懸，分別將破菌液上清，沉淀和收獲的菌體一并行SDS-PAGE。結(jié)果90％以上的目標(biāo)蛋白形成可溶性表達(dá)，可溶表達(dá)量為20％左右。圖3為誘導(dǎo)后各時(shí)期的重組hCNTF突變體的表達(dá)。
實(shí)施例5重組hCNTF突變體的分離和純化將發(fā)酵收獲的濕菌體按1∶10的比例，以50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液重懸菌體，以高壓均質(zhì)機(jī)在800bar的壓力下，破菌2個(gè)循環(huán)。先將破菌液加硫酸銨至20％飽和度，10,000g離心40min，取出上清，向20％上清中繼續(xù)加入硫酸銨至45％飽和度，hCNTF沉淀析出，10,000g離心25min，棄上清，回收沉淀。用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液重懸沉淀，離心或經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，以流速10ml/min上用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液平衡好了的XK50/30 Sepharose Butyl 4Fast Flow柱，先用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液洗流穿至280nm吸收曲線(xiàn)接近平穩(wěn)，再用含0.2mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液洗脫約1.5個(gè)柱床體積，出現(xiàn)一個(gè)雜峰，然后用20mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液洗脫，收集洗脫峰，此即目標(biāo)峰，用適量的去離子水或1mol/L的NaCl調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至0.35～0.4ms/cm，以流速10ml/min上用50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液平衡好了的XK26/20 Sepharose Q Fast Flow柱，先用含0.04mol/L NaCl的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液洗脫約1.5個(gè)柱床體積，出現(xiàn)一個(gè)雜峰，再用含0.14mol/L NaCl的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩沖液洗脫，收集洗脫峰，此即目標(biāo)峰，冰浴磁力攪拌加入固體硫酸銨至60％飽和度，離心收集沉淀。用少量20mmol/L的PB pH8.0緩沖液重懸，以流速2ml/min上經(jīng)20mmol/L的PB pH8.0緩沖液平衡好了的XK26/100 Superdex 75柱，用20mmol/L的PB pH8.0緩沖液洗脫，收集活性峰，此即hCNTF突變體純品，經(jīng)SDS-Page電泳分析，純度大于98％，其濃度用lowry定蛋白法檢測(cè)為2.7mg/ml。
實(shí)施例6重組CNTF突變體的活性檢測(cè)本實(shí)施例中重組CNTF突變體活性檢測(cè)的方法參見(jiàn)本申請(qǐng)人在與本申請(qǐng)的同一天提交的、題目為“定量測(cè)定睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)因子的方法”的專(zhuān)利申請(qǐng)，其通過(guò)引用并入本文。
簡(jiǎn)言之，用含100IU/ml的青霉素、100μg/ml鏈霉素和4mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋上述實(shí)施例5中獲得的重組hCNTF突變體蛋白樣品，最高濃度為3000倍稀釋?zhuān)韵率褂?000倍稀釋、27000倍稀釋等作3倍梯度稀釋?zhuān)?0個(gè)稀釋樣品。如上述專(zhuān)利申請(qǐng)中的方法獲取雞胚背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。用含2％血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋神經(jīng)細(xì)胞液至50000個(gè)細(xì)胞/ml，加入到鼠尾膠原包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100微升。待神經(jīng)細(xì)胞貼壁2小時(shí)后吸棄含血清的培養(yǎng)基，每孔加入含不同濃度CNTF的高糖DMEM培養(yǎng)基100微升，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)孔，另外取3孔加入不含樣品的同樣配制的高糖DMEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，放置于溫度37℃、二氧化碳濃度5％、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。依次吸盡各孔中培養(yǎng)液，棄去。每孔各加入200微升PBS緩沖液(0.058mol/L Na2HPO4，0.017mol/LNaH2PO4，0.068mol/L NaCl，pH7.4)，靜置1分鐘后依次吸盡各孔中PBS，棄去。往各孔中依次加入100微升1mg/ml pNPP底物液(稱(chēng)取一定量的pNPP，按比例加入包含0.1mol/L乙酸鈉pH6.0，0.2％Triton X-100，1mmol/L EDTA的緩沖液將其完全溶解。臨用前配制，1小時(shí)內(nèi)使用)，放37℃。待4小時(shí)后，每孔各加入10微升1mol/LNaOH，混合均勻。室溫放置10分鐘后，于BIO-TEK酶標(biāo)儀405nm處讀取吸光度值，如下表所示。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)作如圖6所示的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)，確定樣品的半數(shù)有效劑量ED50，并確定活性為1.63×107單位/ml，比活性為6.05×106單位/mg。

綜上所述，由上述發(fā)酵和分離純化工藝獲得的重組CNTF突變體蛋白能夠促進(jìn)體外原代培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活，并具有明顯的量效關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種制備hCNTF突變體的方法，包括下列步驟(a)將hCNTF突變體基因序列克隆入表達(dá)載體以得到重組載體，并導(dǎo)入大腸桿菌中，生成含有重組載體的基因工程菌；(b)培養(yǎng)基因工程菌至OD600＝12～14時(shí)，加入乳糖，誘導(dǎo)hCNTF突變體在基因工程菌中可溶性表達(dá)；(c)誘導(dǎo)后，向培養(yǎng)液中緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，并控制培養(yǎng)液中溶解氧值為10％～15％，繼續(xù)培養(yǎng)；(d)待基因工程菌的OD600＝20-30時(shí)，收獲菌體，并將菌體破碎得到破菌液；(e)純化破菌液，得到純化產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的hCNTF突變體中涉及的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的谷氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個(gè)氨基酸；或這些突變的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的C末端氨基酸去除13或15個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述的突變組合為第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的谷氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個(gè)氨基酸的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的誘導(dǎo)過(guò)程進(jìn)行1～6小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中加入乳糖的終濃度為1.5-2.5％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)中控制培養(yǎng)溫度為25～28℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)中基因工程菌的OD600＝25。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)中對(duì)破菌液依次進(jìn)行20％～45％硫酸銨分級(jí)鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過(guò)濾純化，得到純化產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的疏水層析填料是Butyl Sepharose 4 Fast Flow或Phenyl Sepharose 4 Fast Flow，在層析過(guò)程中使用含有硫酸銨的緩沖液平衡層析柱，上樣后，先用含硫酸銨的緩沖液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的緩沖液洗脫活性峰。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的平衡緩沖液含有的硫酸銨濃度范圍是0.5～1mol/L；洗雜峰緩沖液含有的硫酸銨濃度范圍是0.2～0.3mol/L；緩沖液是Tris-HCl，濃度范圍是10～50mmol/L，pH值是7.0～9.0。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的陰離子交換層析填料是Q Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose Fast Flow，層析過(guò)程中使用含有鹽的緩沖液平衡層析柱，上樣后，先用含鹽的緩沖液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩沖液洗脫活性峰。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，使用的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，濃度為20～50mmol/L，pH值是7.5～8.5。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，緩沖液中所含的鹽為氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩沖液中含有的氯化鈉濃度是0.13～0.2mol/L。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其在陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析步驟之間還包括通過(guò)硫酸銨沉淀濃縮活性蛋白溶液的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，所述凝膠過(guò)濾層析的填料是Superdex 75 prep grade或Sephacryl S-200 High Resolution，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫，濃度是5～50mmol/L，pH值是7.0～8.5。
17.根據(jù)權(quán)利要求1～16中任意一項(xiàng)所述的方法制備的純度大于98％，并具有生物活性的hCNTF突變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蛋白和其制備方法，具體涉及重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(簡(jiǎn)稱(chēng)hCNTF)突變體及其制備方法，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及用乳糖誘導(dǎo)hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中高效可溶表達(dá)、并從中加以分離純化的方法，以及通過(guò)該方法制備的hCNTF突變體。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1687413SQ20051006619
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者朱俊銘, 雷繼軍, 李清雄, 王革非, 余永恒, 張曉林, 張光勛, 文力 申請(qǐng)人:梁亮勝