專利名稱：一種生物合成γ－氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物合成γ-氨基丁酸的方法。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(簡稱GABA)是一種具有重要生理活性的非蛋白質(zhì)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)。大量文獻報道，GABA具有降血壓和膽固醇、降低神經(jīng)元活性，防止神經(jīng)細胞過熱，不僅具有安神和抗除抑郁作用，而且還能增強腦功能和長期記憶、增加生長激素分泌、防止肥胖、健肝利腎、改善更年期綜合癥等功能。隨著對GABA生理活性的不斷深入研究，最新研究發(fā)現(xiàn)的γ-氨基丁酸的生理功能越來越多。GABA也越來越多地受到了更多的關(guān)注，GABA在生物體內(nèi)雖然廣泛存在，但無論動、植物中，含量卻都很低，分離很困難，需要對其進行合成制備。對于它的合成制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成方法。與化學(xué)合成方法相比，生物法合成GABA是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶作為催化劑，以L-谷氨酸鈉(L-MSG)為底物，將L-谷氨酸鈉(L-MSG)α-脫羧，產(chǎn)生γ-氨基丁酸和CO2，主要優(yōu)點在于合成條件溫和，不需要昂貴的原材料，環(huán)境污染小，能耗小。采用生物法合成GABA的關(guān)鍵之一就是篩選出具有高谷氨酸脫羧酶活力的優(yōu)良菌株。有文獻報道，GABA的生物合成通常采用大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株，但是用大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株存在食品安全衛(wèi)生方面的隱患，本實驗室篩選到一株具有高效生物合成GABA能力的乳酸菌株。本文報道了一種生物合成GABA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物合成γ-氨基丁酸的方法。
保藏編號為CGMCC NO.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～30小時后，以0.5％～5％的接種量接種于GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃～35℃下靜置培養(yǎng)48h～120h，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體離心分離收集；離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25～2g濕菌體，懸浮于15～50mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5mM～60mM，反應(yīng)1～10小時，反應(yīng)液離心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
保藏編號為CGMCC NO.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，在發(fā)酵時產(chǎn)乳酸，顯微鏡觀察成對或成鏈狀出現(xiàn)，不運動，無孢子，菌落小，表面光滑；屬于革蘭氏陽性菌株，兼性厭氧。
本發(fā)明采用短乳桿菌作為菌種，菌體生長達到穩(wěn)定期，收集菌體，采用全細胞催化，以L-谷氨酸鈉(L-MSG)為底物，以檸檬酸—磷酸氫二鈉為緩沖體系，無其它碳氮源等其它培養(yǎng)基成分，利用乳酸菌體內(nèi)含有高活性谷氨酸脫羧酶，將L-谷氨酸鈉(L-MSG)α-脫羧，產(chǎn)生γ-氨基丁酸，GABA產(chǎn)量達到1～6g/L。本方法的優(yōu)點在于生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、方法簡單、易于操作，周期短、生產(chǎn)效率高，并且產(chǎn)品純度較高，減輕了后續(xù)分離純化工藝。
具體實施例方式
A.菌株本實驗室篩選。
B.培養(yǎng)基1000mL瓊脂斜面保藏培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸鈉2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg，瓊脂15g，pH6.8。
1000mL GYP種子培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸鈉2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg，pH6.6-7.0。
1000mL GYP發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸鈉2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg，一水合L-谷氨酸鈉10g，pH6.6-7.0。
1000mL MRS種子培養(yǎng)基牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，K2HPO42g，檸檬酸銨2g，葡萄糖20g，吐溫-80 1mL，醋酸鈉5g，無機鹽溶液5mL(MgSO4·7H2O，11.5％；MnSO4·2H2O，2.4％)，pH6.6。
1000mL MRS發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，K2HPO42g，檸檬酸銨2g，葡萄糖20g，吐溫-80 1mL，醋酸鈉5g，無機鹽溶液5mL(MgSO4·7H2O，11.5％；MnSO4·2H2O，2.4％)，一水合L-谷氨酸鈉10g，pH6.6。
C.制備工藝此菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～30小時后，以0.5％～5％的接種量接種GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃下靜置培養(yǎng)48h～120h，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25～2g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5mM-100mM，反應(yīng)1～10小時，反應(yīng)液離心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
該菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～30小時后，以0.5％～5％的接種量接種GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃下靜置培養(yǎng)48h～120h，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25～2g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5mM-100mM，反應(yīng)1～10小時，反應(yīng)液離心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
實施例1此菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為24小時，將種子培養(yǎng)液以1％的接種量接種于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加1％的一水合L-谷氨酸鈉，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為200mL/500mL，靜置培養(yǎng)60小時，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.5g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為10mM，反應(yīng)1小時，反應(yīng)液離心經(jīng)高效液相色譜分析得，γ-氨基丁酸含量約1g/L。
實施例2此菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為24小時，將種子培養(yǎng)液以1％的接種量接種于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加1％的一水合L-谷氨酸鈉，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為200mL/500mL，靜置培養(yǎng)60小時，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.5g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為20mM，反應(yīng)2小時，反應(yīng)液離心經(jīng)高效液相色譜分析得，γ-氨基丁酸含量約2g/L。
實施例3此菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為24小時，將種子培養(yǎng)液以1％的接種量接種于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加1％的一水合L-谷氨酸鈉，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為200mL/500mL，靜置培養(yǎng)60小時，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.5g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為40mM，反應(yīng)3小時，反應(yīng)液離心經(jīng)高效液相色譜分析得，γ-氨基丁酸含量約4g/L。
實施例4此菌株經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為24小時，將種子培養(yǎng)液以1％的接種量接種于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加1％的一水合L-谷氨酸鈉，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為200mL/500mL，靜置培養(yǎng)60小時，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體通過離心(8000r/min，5min)收集。離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.5g濕菌體，懸浮于25mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為60mM，反應(yīng)5小時，反應(yīng)液離心經(jīng)高效液相色譜分析得，γ-氨基丁酸含量約6g/L。
權(quán)利要求
1.一種生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，保藏編號為CGMCCNO.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～30小時后，以0.5％～5％的接種量接種于GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃～35℃下靜置培養(yǎng)48h～120h，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體離心分離收集；離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25～2g濕菌體，懸浮于15～50mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系中，L-谷氨酸鈉含量為5mM～60mM，反應(yīng)1～10小時，反應(yīng)液離心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述保藏編號為CGMCC NO.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，在發(fā)酵時產(chǎn)乳酸，顯微鏡觀察成對或成鏈狀出現(xiàn)，不運動，無孢子，菌落小，表面光滑；屬于革蘭氏陽性菌株，兼性厭氧。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物合成γ－氨基丁酸的方法，其特征在于，保藏編號為CGMCC NO.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，經(jīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于GYP種子培養(yǎng)基或MRS種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～30小時后，以0.5％～5％的接種量接種于GYP或MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃～35℃下靜置培養(yǎng)48h～120h，即得含菌體的發(fā)酵液，菌體離心分離收集；離心后的菌體再以滅過菌的去離子水洗滌，取0.25～2g濕菌體，懸浮于15～50mL的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖體系中，L－谷氨酸鈉含量為5mM～60mM，反應(yīng)1～10小時，反應(yīng)液離心即得含γ－氨基丁酸的溶液。本發(fā)明生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、方法簡單、易于操作，生產(chǎn)效率高，并且產(chǎn)品純度較高，減輕了后續(xù)分離純化工藝。
文檔編號C12P13/00GK1683544SQ20051004918
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者梅樂和, 黃 俊, 武鴻 申請人:浙江大學(xué)