專利名稱：胡蘿卜黑腐病的pcr檢測及鑒定優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡蘿卜黑腐病的PCR檢測及鑒定優(yōu)化方法，屬于農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是優(yōu)質(zhì)胡蘿卜原料的生產(chǎn)大國。黑龍江、吉林、青海、陜西、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、寧夏等省區(qū)是我國優(yōu)質(zhì)胡蘿卜原料的主要產(chǎn)區(qū)，資源優(yōu)勢和技術(shù)優(yōu)勢的結(jié)合，將使我國可能成為國際上最大胡蘿卜優(yōu)質(zhì)工業(yè)原料和胡蘿卜功能食品的加工、出口國。近年來各地胡蘿卜種植面積迅速擴(kuò)大，由于生產(chǎn)管理不善等因素，胡蘿卜病害逐漸加重。
由真菌Alternaria radicina和A.dauci是胡蘿卜上最重要的種傳、土傳真菌，在全世界胡蘿卜產(chǎn)區(qū)都能發(fā)現(xiàn)，在大田和儲藏期均可發(fā)病，引起葉片黑斑病和根部黑腐病。黑腐病主要特征是在胡蘿卜的葉柄，冠部和根部有壞死斑，在儲藏期發(fā)病嚴(yán)重，在潮濕的條件下很容易從一個(gè)胡蘿卜傳到另一個(gè)胡蘿卜上。Alternaria的分生孢子可以在顯微鏡下檢測，但是由于Alternaria radicina的分生孢子在大小和形態(tài)上與Alternaria dauci很相似。Alternaria dauci分生孢子單個(gè)著生，2個(gè)成串的很少見，5-11個(gè)橫隔，1個(gè)或幾個(gè)豎隔或縱隔。Alternaria radicina分生孢子單個(gè)著生，少數(shù)2個(gè)或3個(gè)成串，卵圓形，橢圓的，孢子兩端圓形，1-10個(gè)橫隔，幾個(gè)豎隔或縱隔，但從形態(tài)上很難準(zhǔn)確鑒定。雖然已有冰凍封閉法和選擇性培養(yǎng)基法，但需7-14天才能判定結(jié)果，由于形態(tài)太相似，易導(dǎo)致鑒定有誤，況且，一旦病菌量太少就有可能無法鑒定。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是PCR技術(shù)，為鑒定提供了了準(zhǔn)確而又快速的方法。國外開展了這項(xiàng)研究，分別設(shè)計(jì)了特異性引物ARF25-AAT CAG CGTCAG TAA ACA AAC G-3，ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3鑒定出現(xiàn)頻率較高的Alternaria radicina和易與該種混淆的Alternaria dauci的特異引物對ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3，ADR15-CGC AAG GGG AGA CAAAAA-3。已有的PCR程序無預(yù)變性，導(dǎo)致擴(kuò)增后經(jīng)常檢測不到產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服已有技術(shù)中的不足，提供一種操作簡單、結(jié)果可靠、效率高的植物病害的快速診斷鑒定方法。
用于檢測胡蘿卜黑腐病菌的PCR方法，其步驟是1胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7天。
2胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進(jìn)行(1)供試菌株在PDA液體培養(yǎng)基上25℃，100rpm生長5-7天，菌絲用滅菌的漏斗和濾紙過濾，放在50℃烘箱中烘24小時(shí)。
(2)用無菌刀片刮下菌絲放入滅菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。
(3)粉末轉(zhuǎn)入離心管中，加入750μLDNA提取液(100mM Tris pH8.0，100mMEDTA 250mM Nacl)100μL 10％的SDS，75μL的5mM Nacl，65μL10％CTAB充分混合后放入65℃水浴鍋中30分鐘。
(4)取出離心管于12000rpm離心10分鐘吸取上清液。加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)充分混勻后12000rpm離心10分鐘，吸上清液，重復(fù)抽提1-2次。
(5)加入2倍體積的冰無水乙醇，置于4℃冰箱中沉淀，12000rpm離心(6)10分鐘收集DNA沉淀。
(7)用70％乙醇洗滌一次；加入100-200μLTE溶液溶解，-20℃保存。3用于檢測胡蘿卜黑腐病特異性引物引物ARF25-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR35-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡蘿卜黑腐病特異性擴(kuò)增出343bp的產(chǎn)物。
4PCR反應(yīng)擴(kuò)增的體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個(gè)dNTP200um，每個(gè)引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應(yīng)體積。
5PCR反應(yīng)擴(kuò)增反程序94℃預(yù)變性4min，PCR反應(yīng)條件按每循環(huán)94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min。擴(kuò)增共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。
6PCR產(chǎn)物鑒定取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統(tǒng)上觀察成像。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來判定結(jié)果。
本發(fā)明的有益效果對胡蘿卜黑腐病的早期快速診斷和病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本方案中加入了94℃預(yù)變性4min，使擴(kuò)增的靈敏度提高。預(yù)變性在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要。經(jīng)多次試驗(yàn)，我們在已有的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序中增加了94℃預(yù)變性4min，使擴(kuò)增效率大幅度提高，彌補(bǔ)了原技術(shù)的不足。


附圖是引物ARF2/ARR3對胡蘿卜病樣分離菌株進(jìn)行的優(yōu)化和未優(yōu)化PCR擴(kuò)增結(jié)果。
其中1、2、3泳道為胡蘿卜黑腐病菌用未優(yōu)化PCR程序擴(kuò)增結(jié)果，4、5泳道為胡蘿卜黑腐病菌用優(yōu)化PCR程序擴(kuò)增結(jié)果，6泳道為50bp DNALadder.7泳道為鐮刀菌菌株(Fusarium solani)。8泳道為陰性對照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1引物ARF2/ARR3對胡蘿卜病樣分離出的兩種菌株(一種是鐮刀菌屬的菌株，一種是胡蘿卜黑腐病菌株)采用本優(yōu)化程序進(jìn)行的PCR擴(kuò)增結(jié)果具體步驟如下1)胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7天。
2)胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進(jìn)行3)用于檢測胡蘿卜黑腐病特異性引物引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。引物ARF2/ARR3在胡蘿卜黑腐病特異性擴(kuò)增出343bp的產(chǎn)物。
4)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個(gè)dNTP200um，每個(gè)引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應(yīng)體積。
5)PCR反應(yīng)擴(kuò)增反程序94℃預(yù)變性4min，PCR反應(yīng)條件按每循環(huán)94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min。擴(kuò)增共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。
6)PCR產(chǎn)物鑒定取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統(tǒng)上觀察成像。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來判定結(jié)果。
實(shí)施結(jié)果利用引物ARF2/ARR3以胡蘿卜病樣分離出的兩種菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，胡蘿卜黑腐病菌株擴(kuò)增出產(chǎn)物為343bp的條帶，而鐮刀菌菌株沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物。說明鐮刀菌不是引起胡蘿卜黑腐病的病原菌。
2引物ARF2/ARR3對胡蘿卜黑腐病菌采用非優(yōu)化程序的PCR擴(kuò)增結(jié)果方法同實(shí)例優(yōu)化程序的PCR擴(kuò)增，不同的是PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序中沒有94℃，4min的預(yù)變性。
實(shí)施結(jié)果同時(shí)利用引物ARF2/ARR3以胡蘿卜黑腐病菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有三分之一樣品有擴(kuò)增結(jié)果，三分之二樣品無擴(kuò)增結(jié)果。而且條帶的亮度與PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序中有94℃，4min的預(yù)變性條帶的亮度相比，擴(kuò)增效果不如后者好。
實(shí)施例二利用Alternaria dauci的特異性引物ADF2/ADR1以胡蘿卜黑腐病菌菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行優(yōu)化與非優(yōu)化程序PCR擴(kuò)增方法同實(shí)例1，只是采用用Alternaria dauci的特異性引物ADF25-GCA ATC AGC GTC AGT AAC AAC A-3ADR15-CGC AAG GGG AGA CAA AAA-3引物稀釋至10um，分裝，-20℃保存。(由北京三博遠(yuǎn)志有限公司合成)實(shí)施結(jié)果利用Alternaria dauci的特異性引物ADF2/ADR1以胡蘿卜黑腐病菌菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行優(yōu)化與非優(yōu)化PCR擴(kuò)增，均沒有擴(kuò)增出條帶。說明我國胡蘿卜黑腐病是由真菌Alternaria radicina引起的。
權(quán)利要求
1.一種胡蘿卜黑腐病的PCR檢測及鑒定優(yōu)化方法，包括以下步驟1)胡蘿卜黑腐病菌菌株分離胡蘿卜病樣取病健交界處1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分鐘，再用滅菌水漂洗三次，每次3分鐘，涼干，在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7天；2)胡蘿卜黑腐病病菌基因組DNA提取采用CTAB法進(jìn)行；3)胡蘿卜黑腐病病菌的PCR檢測中使用的特異性引物ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-34)PCR的反應(yīng)體系10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每個(gè)dNTP200um，每個(gè)引物1.5um，1.5單位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反應(yīng)體積；5)PCR的擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性4min，PCR反應(yīng)條件按每循環(huán)94℃變性2min，70℃40sec退火，72℃1min，擴(kuò)增共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min；6)取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于3％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，脫色，置于UPV紫外成像系統(tǒng)上觀察，根據(jù)343bp擴(kuò)增產(chǎn)物的有無來判定結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明用于檢測及鑒定胡蘿卜黑腐病菌的PCR方法，適用于檢測胡蘿卜黑腐病和早期診斷，準(zhǔn)確鑒定引起該病的病原(Alternaria radicina)。屬于農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域。該方法根據(jù)胡蘿卜黑腐病菌的特異性引物檢測胡蘿卜黑腐病菌，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為343bp。同時(shí)，本方法對PCR的擴(kuò)增程序進(jìn)行了優(yōu)化，增加了94℃預(yù)變性4min，提高了檢測的靈敏性。是對胡蘿卜黑腐病菌特異性引物檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。
文檔編號C12Q1/68GK1824799SQ200510048769
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者黃瓊, 趙瑩瑩, 王云月, 孫躍先, 焦玉霞 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)