專利名稱：同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速、靈敏、特異對(duì)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草叢頂病是近年來(lái)在世界范圍內(nèi)一些主要種煙區(qū)頻繁爆發(fā)的一種毀滅性煙草病害，病害由煙草叢頂病毒(TBTV)和煙草扭脈病毒(TVDV)復(fù)合侵染引起。煙草叢頂病的癥狀表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)淡褐色壞死斑，隨后的新生葉片逐漸變小變圓并褪綠或黃化，植株矮縮。煙草叢頂病毒單獨(dú)侵染煙草后引起的癥狀與煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒復(fù)合侵染引起的癥狀基本一致，而煙草扭脈病毒單獨(dú)侵染煙株后一般無(wú)明顯癥狀。因此，通過(guò)癥狀觀察很難區(qū)分發(fā)病煙株是由煙草叢頂病毒單獨(dú)侵染引起還是由煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒復(fù)合侵染引起。
通常檢測(cè)病毒的方法有指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。但目前還沒(méi)有煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的指示植物報(bào)道，無(wú)法用此方法進(jìn)行病毒檢測(cè)。煙草叢頂病毒不形成普通的病毒粒體，在電鏡下無(wú)法看到病毒粒體，而煙草扭脈病毒為球形粒體，且在植株體內(nèi)含量很少，很難在電鏡下觀察到。煙草叢頂病毒不編碼外殼蛋白，無(wú)法制備血清，雖然煙草扭脈病毒可編碼外殼蛋白，但目前還沒(méi)有關(guān)于煙草扭脈病毒血清制備的報(bào)道，所以不能利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)這兩個(gè)病。目前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)煙草叢頂病的方法是，利用總核酸提取檢測(cè)與煙草叢頂病相關(guān)的小分子RNA。該方法只能間接檢測(cè)植株體內(nèi)是否存在煙草叢頂病毒，而不能檢測(cè)煙草扭脈病毒。RT-PCR的方法被廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性和靈敏度較高的特點(diǎn)。但是普通RT-PCR的方法每次只能檢測(cè)一個(gè)病毒，對(duì)于兩個(gè)病毒復(fù)合侵染的情況則要針對(duì)各個(gè)病毒單獨(dú)檢測(cè)，既浪費(fèi)時(shí)間，又加大了檢測(cè)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種同步、快速、靈敏、特異地檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法。
本發(fā)明的具體步驟是1、引物設(shè)計(jì)(1)根據(jù)已報(bào)道的煙草叢頂病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AF402620)設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草叢頂病毒部分復(fù)制酶基因的特異性引物對(duì)TB2R/TB2F，引物序列如下TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)根據(jù)已報(bào)道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AJ575129)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增煙草扭脈病毒外殼蛋白基因的特異性引物對(duì)TVCPF/TVCPR，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′(3)引物對(duì)擴(kuò)增目的核酸帶的大小如下

2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?、RT-PCR擴(kuò)增
(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA取提取的總RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴(kuò)增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl23μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產(chǎn)物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H2O 33μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、53-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-40次循環(huán)，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測(cè)取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％-3％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時(shí)后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在僅感染煙草叢頂病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條550bp的核酸帶，在僅感染煙草扭脈病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條620bp的核酸帶，而復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株中可以同時(shí)擴(kuò)增到550bp和620bp的核酸帶。
其中所述的退火溫度53-60℃，也可以是53-54℃或57-59℃；所述的循環(huán)數(shù)30-40次，也可以是31-34次；所述的瓊脂糖凝膠濃度1％-3％，也可以是1.6％-1.9％。
本發(fā)明的有益效果是根據(jù)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性引物TB2F/TB2R(檢測(cè)煙草叢頂病毒)、TVCPF/TVCPR(檢測(cè)煙草扭脈病毒)，因此可以方便、特異、靈敏的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒?？朔藷煵輩岔敳《竞蜔煵菖っ}病毒不能用指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)以及總核酸提取法和傳統(tǒng)RT-PCR方法一次只能檢測(cè)一種病毒等缺點(diǎn)，只用相當(dāng)于一次普通RT-PCR的時(shí)間和試劑，就可以同步檢測(cè)出煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒。
說(shuō)明書(shū)附圖

圖1是煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)例一以已知的復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株和分別感染煙草叢頂病毒、煙草扭脈病毒的煙株為檢測(cè)對(duì)象，并以健康材料為陰性對(duì)照。
1、引物設(shè)計(jì)(1)根據(jù)已報(bào)道的煙草叢頂病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AF402620)設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草叢頂病毒部分復(fù)制酶基因的特異性引物對(duì)TB2R/TB2F，引物序列如下TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)根據(jù)已報(bào)道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AJ575129)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增煙草扭脈病毒外殼蛋白基因的特異性引物對(duì)TVCPF/TVCPR，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′(3)引物對(duì)擴(kuò)增目的核酸帶的大小如下

2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?、RT-PCR擴(kuò)增
(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA取提取的總RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴(kuò)增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl23μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產(chǎn)物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H2O 33μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、53℃退火1min、72℃延伸2min，共30次循環(huán)，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測(cè)取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時(shí)后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；5、結(jié)果分析在僅感染煙草叢頂病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條550bp的核酸帶，在僅感染煙草扭脈病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條620bp的核酸帶，而復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株中可以同時(shí)擴(kuò)增到550bp和620bp的核酸帶；而健康植株擴(kuò)增不到任何核酸條帶。
實(shí)例二以已知的復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株和分別感染煙草叢頂病毒、煙草扭脈病毒的煙株為檢測(cè)對(duì)象，并以健康材料為陰性對(duì)照。
1、引物設(shè)計(jì)(1)根據(jù)已報(bào)道的煙草叢頂病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AF402620)設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草叢頂病毒部分復(fù)制酶基因的特異性引物對(duì)TB2R/TB2F，引物序列如下TB2R 5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)根據(jù)已報(bào)道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AJ575129)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增煙草扭脈病毒外殼蛋白基因的特異性引物對(duì)TVCPF/TVCPR，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCA ATTGC-3′
(3)引物對(duì)擴(kuò)增目的核酸帶的大小如下

2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?、RT-PCR擴(kuò)增(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA取提取的總RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transeriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴(kuò)增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl23μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產(chǎn)物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H2O 33μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、60℃退火1min、72℃延伸2min，共40次循環(huán)，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測(cè)取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)3％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時(shí)后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；
5、結(jié)果分析在僅感染煙草叢頂病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條550bp的核酸帶，在僅感染煙草扭脈病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條620bp的核酸帶，而復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株中可以同時(shí)擴(kuò)增到550bp和620bp的核酸帶；而健康植株擴(kuò)增不到任何核酸條帶。
實(shí)例三以已知的復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株和分別感染煙草叢頂病毒、煙草扭脈病毒的煙株為檢測(cè)對(duì)象，并以健康材料為陰性對(duì)照。
1、引物設(shè)計(jì)(1)根據(jù)已報(bào)道的煙草叢頂病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AF402620)設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草叢頂病毒部分復(fù)制酶基因的特異性引物對(duì)TB2R/TB2F，引物序列如下TB2R 5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)根據(jù)已報(bào)道的煙草扭脈病毒的核苷酸序列(基因登錄號(hào)為AJ575129)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增煙草扭脈病毒外殼蛋白基因的特異性引物對(duì)TVCPF/TVCPR，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′(3)引物對(duì)擴(kuò)增目的核酸帶的大小如下

2、總RNA提取(1)稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL離心管中；(2)在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；(3)12,000rpm離心10min；(4)上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；
(5)12,000rpm離心10min；(6)棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?、RT-PCR擴(kuò)增(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA取提取的總RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；(2)PCR擴(kuò)增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl23μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA產(chǎn)物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H2O 33μL；輕彈管壁混勻稍離心后94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min，共35次循環(huán)，最后72℃延伸10min；4、電泳檢測(cè)取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時(shí)后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；5、結(jié)果分析在僅感染煙草叢頂病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條550bp的核酸帶，在僅感染煙草扭脈病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條620bp的核酸帶，而復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株中可以同時(shí)擴(kuò)增到550bp和620bp的核酸帶；而健康植株擴(kuò)增不到任何核酸條帶。
權(quán)利要求
1.同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，包括以下步驟(1)引物設(shè)計(jì)①設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草叢頂病毒部分復(fù)制酶基因的特異性引物對(duì)TB2R/TB2F，引物序列如下TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′②設(shè)計(jì)擴(kuò)增煙草扭脈病毒外殼蛋白基因的特異性引物對(duì)TVCPF/TVCPR，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′③引物對(duì)擴(kuò)增目的核酸帶的大小如下
(2)總RNA提取①稱取煙草葉片50mg，放入研缽中，加入1mL Trizol試劑研磨。研磨液倒入1.5mL離心管中；②在裝有研磨液的離心管中加入400μL氯仿，混勻后靜置5min；③12,000rpm離心10min；④上清液移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置5min；⑤12,000rpm離心10min；⑥棄上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗滌，干燥10min；⑦沉淀用40μL DEPC處理水懸浮，-20℃保存?zhèn)溆茫?3)RT-PCR擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄合成cDNA取提取的總RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H2O，充分混勻后70℃溫浴10min，迅速冰浴5min；加入以下試劑
輕彈管壁混勻，稍離心后室溫10min，42℃保溫60min；②PCR擴(kuò)增加入以下試劑
輕彈管壁混勻稍離心后94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、53-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-40次循環(huán)，最后72℃延伸10min；(4)電泳檢測(cè)取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％-3％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和120V的電壓下電泳1小時(shí)后，在0.5μg/mL的溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀察；在僅感染煙草叢頂病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條550bp的核酸帶，在僅感染煙草扭脈病毒的煙株中可以擴(kuò)增到一條620bp的核酸帶，而復(fù)合感染煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的煙株中可以同時(shí)擴(kuò)增到550bp和620bp的核酸帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增中的退火溫度為53-54℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增中的退火溫度為57-59℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增中的循環(huán)數(shù)為31-34次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，其特征在于電泳檢測(cè)時(shí)所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.6％-1.9％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。根據(jù)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒核苷酸序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物TB2F/TB2R(檢測(cè)煙草叢頂病毒)及TVCPF/TVCPR(檢測(cè)煙草扭脈病毒)。提取植株組織的總RNA后，采用雙重RT－PCR的方法，同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒。該發(fā)明能有效克服指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)以及總核酸提取法和傳統(tǒng)RT－PCR方法的缺點(diǎn)，只用相當(dāng)于一次普通RT－PCR的時(shí)間和試劑，就可以方便、特異、靈敏的同步檢測(cè)煙草叢頂病毒和煙草扭脈病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1793859SQ20051004872
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者李凡, 王鈺麗, 陳海如, 蔡紅, 孫健, 吳建宇, 吳德喜, 秦西云, 楊根華, 程建勇, 馬琨玲, 錢(qián)寧剛, 蘭平秀, 楊金廣 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)