專利名稱：通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體。
背景技術(shù)：
生物活性肽是具有高生物活性的短肽(通常僅有幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸殘基)分子，在生命科學(xué)研究中具有重要地位，也是近年來發(fā)現(xiàn)具有預(yù)防、診斷和治療作用和良好應(yīng)用前景的生物藥品。目前可以使用化學(xué)合成方法獲得生物活性肽，但現(xiàn)有這些技術(shù)存在的問題是生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低很難做到工業(yè)化生產(chǎn)水平，因此價(jià)格昂貴，病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重。使用基因工程表達(dá)技術(shù)在體內(nèi)或體外表達(dá)生物活性肽，就可避免化學(xué)合成方法的缺點(diǎn)。但生物活性肽和蛋白質(zhì)不同，前者是由cDNA片段編碼的，后者是由一個(gè)完整基因編碼。目前的表達(dá)載體都是為蛋白質(zhì)而構(gòu)建的，在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)的基因，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和加工糖化，最后形成表達(dá)蛋白。但表達(dá)的編碼生物活性肽的cDNA片段時(shí)，在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)翻譯后無法運(yùn)輸和加工，被細(xì)胞內(nèi)肽酶分解，不能獲得表達(dá)的生物活性肽?，F(xiàn)有的表達(dá)載體是為了表達(dá)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)，如使用融合表載體表達(dá)的生物活性肽時(shí)，在表達(dá)產(chǎn)物的氨基端或羧基端添加了生物活性肽之外的非必需的氨基酸殘基序列，改變了生物活性肽的性質(zhì)和功能。目前的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)載體，使用了短鏈(僅有20-30氨基酸殘基)信號(hào)肽可以促進(jìn)翻譯后的運(yùn)輸，將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外，但使用其來表達(dá)短肽時(shí)，由于表達(dá)產(chǎn)物的肽鏈過短，極易被細(xì)胞漿的內(nèi)肽酶降解。而且這些蛋白質(zhì)分泌表達(dá)載體，為了方便將編碼的蛋白質(zhì)編碼的cDNA插入到載體中，在信號(hào)肽酶識(shí)別點(diǎn)的下游加裝了多克隆位點(diǎn)。在使用該載體表達(dá)生物活性肽時(shí)必然的在氨基端添加了無關(guān)的附加氨基酸序列影響生物活性肽的結(jié)構(gòu)和功能。為了按著序列要求精確的表達(dá)生物活性肽和避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞被內(nèi)肽酶降解，本專利設(shè)計(jì)了人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物活性肽表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要提供一種通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種表達(dá)生物活性肽的載體，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子家族基因的長鏈信號(hào)肽/引導(dǎo)肽及其在信號(hào)肽酶識(shí)別序列設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)和骨架質(zhì)粒。
一種神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)信號(hào)肽/引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽表達(dá)載體結(jié)構(gòu)為 一種神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT4)信號(hào)肽/引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽表達(dá)載體結(jié)構(gòu)為 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利選用了神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)和神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT4)的信號(hào)肽/引導(dǎo)肽制備表達(dá)生物活性肽的專用載體。其發(fā)明點(diǎn)是1、使用長鏈信號(hào)肽/引導(dǎo)肽(大于90氨基酸殘基)來表達(dá)生物活性肽避免表達(dá)產(chǎn)物(前肽大于100氨基酸殘基)在細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)肽酶降解。
2、使用兼并密碼子原理，突變信號(hào)肽酶識(shí)別點(diǎn)的編碼序列，使其成為克隆生物活性肽cDNA的限制性內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)和連接點(diǎn)。
3、信號(hào)肽酶識(shí)別點(diǎn)編碼子突變后，短肽cDNA插入到信號(hào)肽酶識(shí)別點(diǎn)的上游，而且不改變信號(hào)肽/引導(dǎo)肽的氨基酸序列。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，表達(dá)的前肽在準(zhǔn)確位置將信號(hào)肽/引導(dǎo)肽和生物活性肽切開，確保了表達(dá)肽序列的正確性(沒有氨基端附加序列)。
具體理論論述如下NT3的信號(hào)肽/引導(dǎo)肽序列同NT4是類似的，NT3的內(nèi)肽酶識(shí)別序列為SRRK而NT4為SRRG，內(nèi)肽酶在SRR的羧基端切下成熟蛋白質(zhì)。但編碼NT3的SRR cDNA是TCA CGG CGT，編碼NT4的SRR cDNA是AGC CGG CGT.因此NT4的內(nèi)肽酶識(shí)別點(diǎn)自身具有Nae I內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)GCC GGC，雖然編碼相同但NT3沒有內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)。為了方便的將肽的cDNA克隆到NT3的信號(hào)肽和引導(dǎo)肽cDNA的3`端，我們使用PCR方法突變了NT3的內(nèi)肽酶識(shí)別點(diǎn)編碼序列，使之成為AGC CGGCGT.，編碼的SRR氨基酸序列不變。構(gòu)建了以NT3信號(hào)肽/引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)肽表達(dá)載體。
本載體為真核細(xì)胞表達(dá)載體，它適用于表達(dá)各種生物活性肽。使用本載體可直接轉(zhuǎn)染人類或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使用puromycini篩選陽性轉(zhuǎn)化克隆，分析表達(dá)生物活性肽的生物學(xué)作用。當(dāng)然以本載體為中間載體，將本載體表達(dá)盒亞克隆到其它表達(dá)載體，進(jìn)行藥物、疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)。


圖1～圖7顯示了質(zhì)粒pNT3peptide的完整序列；圖8～圖14顯示了pNT4peptide質(zhì)粒的完整序列。
其中，pNT3peptide質(zhì)粒的功能組件1.PCMV IE促進(jìn)子 232-8202.NT3信號(hào)肽/引導(dǎo)肽 936-13423.PpSP64質(zhì)粒Nae I至BamH I短片段 1348-1657
4.合成內(nèi)含子(IVS) 1689-19845.腦心肌炎病毒的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) 2014-25996.嘌呤霉素抗藥基因 2618-32147.牛生長激素poly-A信號(hào) 3334-36118.氨基芐青霉素抗藥基因 5729-48599.PBR322的復(fù)制子 4051-4715其中，pNT4peptide質(zhì)粒的功能組件1.PCMV IE促進(jìn)子 232-8202.NT4信號(hào)肽/引導(dǎo)肽 936-11763.PpSP64質(zhì)粒Nae I至BamH I短片段 1180-14894.合成內(nèi)含子(IVS) 1523-17185.腦心肌炎病毒的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) 1778-22336.嘌呤霉素抗藥基因 2452-30487.牛生長激素poly-A信號(hào) 3168-34458.氨基芐青霉素抗藥基因 5565-46939.PBR322的復(fù)制子 3885-4549
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)信號(hào)肽和引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽的載體結(jié)構(gòu)為 上面所示為表達(dá)重組前肽的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pNT3peptide的結(jié)構(gòu)示意圖。使用pIRESpuro作骨架質(zhì)粒，在MCS的EcoR I和BamH I點(diǎn)間插入了突變了信號(hào)肽酶識(shí)別點(diǎn)的NT3信號(hào)肽和pSP64質(zhì)粒的序列。
實(shí)施例2一種神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT4)信號(hào)肽/引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽的載體結(jié)構(gòu)為 上面所示表達(dá)重組前肽的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pNT4peptide的結(jié)構(gòu)示意圖。使用pIRESpuro作骨架質(zhì)粒，在MCS的EcoR I和BamH I點(diǎn)間插入了NT4信號(hào)肽和pSP64質(zhì)粒的序列。
本專利載體的使用方法1、質(zhì)粒的增殖本專利介紹的質(zhì)粒適宜轉(zhuǎn)染DH5α受體菌，在LB培養(yǎng)基中增殖，使用氨基芐青霉素作篩選抗菌素。
2、生物活性肽編碼cDNA片段的插入A.按肽序列推測(cè)的編碼核酸，在5`端加入限制性內(nèi)切酶的識(shí)別點(diǎn)序列GGCGT，3`端加入TGA終止密碼子和BamH I黏性末端。使用N來表示肽編碼的核酸，下面是5個(gè)氨基酸殘基肽的合成的雙鏈cDNA結(jié)構(gòu)GG CGT NNN NNN NNN NNN NNN TGA GCC GCA NNN NNN NNN NNN NNN ACT CCT AGB.使用Nae I和BamH I雙酶消化，回收載體片段，常規(guī)T4連接酶連接插入的生物活性肽cDNA片段，轉(zhuǎn)化受體菌，建立重組克隆。
3、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染本質(zhì)?？梢允褂梦锢砗突瘜W(xué)方法轉(zhuǎn)染人類和其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使用嘌呤霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化克隆，常規(guī)生化學(xué)和免疫學(xué)方法分析生物活性肽的表達(dá)和其生物學(xué)效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體，包括神經(jīng)營養(yǎng)家族基因的長鏈信號(hào)肽/引導(dǎo)肽及其在信號(hào)肽酶識(shí)別序列中的限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)和骨架質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述的通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體，其特征在于它是一種以神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)信號(hào)肽和引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽表達(dá)載體，結(jié)構(gòu)為
3.如權(quán)利要求1所述的通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體，其特征在于它是一種以神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT4)信號(hào)肽和引導(dǎo)肽為基礎(chǔ)的活性肽表達(dá)載體，結(jié)構(gòu)為
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過重組前肽來實(shí)現(xiàn)表達(dá)生物活性肽基因治療的質(zhì)粒載體。為了按著序列要求精確的表達(dá)生物活性肽和避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞被內(nèi)肽酶降解，本發(fā)明設(shè)計(jì)了人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物活性肽表達(dá)載體。為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種表達(dá)生物活性肽的載體，包括神經(jīng)營養(yǎng)家族基因的長鏈信號(hào)肽/引導(dǎo)肽及在信號(hào)肽酶識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)和骨架質(zhì)粒。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1919344SQ200510043140
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者楊廣孝 申請(qǐng)人:楊廣孝