專利名稱：高抗病毒活性重組雞γ－干擾素(rChIFN－γ)的制取方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種廣譜高效抗病毒基因工程產(chǎn)品的制取方法。
背景技術(shù)：
雞γ-干擾素(ChIFN-γ)是由活化的T細胞和NK細胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激后產(chǎn)生的一種細胞因子，分子量為17～20KD。IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤細胞生長、分化的生物學活性等，在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。ChIFN-γ基因由Digby和Lowenthal于1995年首次克隆，隨后國內(nèi)外學者先后用大腸桿菌、COS細胞、桿狀病毒、雞痘病毒、禽腺病毒以及植物煙草花葉病毒表達ChIFN-γ，對其生物學活性進行了大量研究。本實驗室也成功克隆出了ChIFN-γ基因，并在大腸桿菌和COS細胞上進行了表達和初步應用，發(fā)現(xiàn)原核表達的rChIFN-γ沒有抗病毒活性，COS細胞瞬時表達的rChIFN-γ活性較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種能高效地表達高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)的制取方法及其應用。
本發(fā)明由以下步驟制得a、將ChIFN-γ基因從真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I雙酶切后克隆到轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC1中，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFASTBAC1-ChIFN-γ；b、取DH10Bac感受態(tài)細胞，加入1ng pFASTBAC1-ChIFN-γ，轉(zhuǎn)座后，用SOC培養(yǎng)基10倍梯度稀釋培養(yǎng)物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培養(yǎng)24～48小時，挑取白色菌落，Luria平板進行四次篩選純化，陽性質(zhì)粒命名為Bacmid-ChIFN-γ，提取陽性質(zhì)粒DNA用于下一步轉(zhuǎn)染；c、取上述重組DNA質(zhì)粒(Bacmid-ChIFN-γ)轉(zhuǎn)染Sf9細胞。
為了獲得更多的高抗病毒活性rChIFN-γ，可以取雞γ-干擾素重組桿狀病毒感染量為MOI＝1，感染96h。
另外，在步驟a中，用EcoR I和Not I雙酶切真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，與同樣酶切的pFASTBAC1回收產(chǎn)物4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，篩選出pFASTBAC1-ChIFN-γ。
在步驟b中，Luria平板為含氨芐青霉素板或卡那霉素板或慶大霉素板或四環(huán)素板或IPTG板或X-gal抗生素板。
本發(fā)明還在于將高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)用于抑制MDV GA對CEF的致病變作用；用于抑制NDV F48E8在細胞上的增殖；用于抗AIV(H5N1)病毒對細胞的致病作用。


圖1為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-ChIFN-γ雙酶切電泳鑒定圖譜。
圖2為轉(zhuǎn)染SF9細胞5天前后的對比IFA圖譜。
圖3為重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)活性測定匯總表圖。
具體實施例1.方法1.1桿狀病毒重組雞γ-干擾素轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC1-ChIFN-γ的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I(購自寶生物大連公司)雙酶切真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，與同樣酶切的pFASTBAC1回收產(chǎn)物4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，篩選出的重組質(zhì)粒命名為pFASTBAC1-ChIFN-γ。
1.2重組桿狀病毒表達質(zhì)粒Bacmid-ChIFN-γ的構(gòu)建和鑒定取DH10Bac感受態(tài)細胞，加入1ng pFASTBAC1-ChIFN-γ，轉(zhuǎn)座后，用SOC培養(yǎng)基10倍梯度稀釋培養(yǎng)物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培養(yǎng)24~48小時，挑取白色菌落，Luria平板(含氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、IPTG和X-gal抗生素板)進行四次篩選純化，陽性質(zhì)粒命名為Bacmid-ChIFN-γ，提取陽性質(zhì)粒DNA用于下一步轉(zhuǎn)染。
1.3 Sf9細胞的轉(zhuǎn)染及間接免疫熒光(IFA)檢測將重組質(zhì)粒Bacmid-ChIFN-γ用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按GIBCO BRL公司說明書中的轉(zhuǎn)染程序轉(zhuǎn)染Sf9細胞，27℃培養(yǎng)5h后換用含血清的Grace’s培養(yǎng)液。同時轉(zhuǎn)染野生病毒DH10Bac(購自GIBCO公司)，作為陰性對照。3d后觀察細胞病變，收集轉(zhuǎn)染后72h的細胞上清，500g離心5min，收集上清4℃避光保存，即為P1代。轉(zhuǎn)染5d后，細胞用-20℃預冷的丙酮-乙醇(3∶2)固定5min，PBS洗3次，室溫吹干，加入1∶100稀釋的鼠抗雞干擾素-γ高免血清，37℃孵育30min，PBS洗3次，加入1∶150稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察記錄，同時設(shè)野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染Sf9細胞、Sf9正常細胞作為陰性對照。
1.4重組桿狀病毒的擴增和表達條件的優(yōu)化將病毒分別以不同的MOI(每個細胞的病毒感染量)感染Sf9細胞并于感染后不同時間收集表達產(chǎn)物上清。用10倍梯度稀釋重組干擾素(每孔100μl)致敏次代雞胚成纖維細胞24h，然后加入100TCID50(100μl)的VSV，24h～48h后觀察細胞半數(shù)保護情況，按照劉長暖等的方法測定雞干擾素-γ的活性，用Reed-Muench法進行計算，最終確定重組病毒的最佳感染量和最佳蛋白表達時間。以每ml干擾素樣品的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)值定義為1個干擾素單位(U)。
1.5重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)抗病毒活性測定按照步驟1.4測定的結(jié)果將表達產(chǎn)物進行系列稀釋，每孔加100μl，將單層雞胚成纖維細胞分別致敏24h和48h后，然后再分別接種1、10和100×TCID50的NDV F48E8株，10～104TCID50禽流感病毒(H5N1)，24h后觀察半數(shù)細胞保護情況；用同樣方法致敏單層雞胚成纖維細胞后接種不同空斑數(shù)的MDV GA株，待病毒吸附5h后，加入1％瓊脂和維持液混合液覆蓋，5天后觀察空斑增殖抑制情況。設(shè)野生型病毒感染的細胞培養(yǎng)上清和正常細胞培養(yǎng)上清作為病毒致病的陽性對照。結(jié)果用SPSS軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。
2結(jié)果2.1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定 將ChIFN-γ基因從真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I雙酶切后克隆到轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC1中，經(jīng)過DNA純化和雙酶切鑒定，證明獲得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFASTBAC1-ChIFN-γ正確(如圖1所示)。經(jīng)測序分析，進一步證明基因序列正確無誤。
2.2 rChIFN-γ在Sf9細胞上表達取上述重組DNA質(zhì)粒(Bacmid-ChIFN-γ)轉(zhuǎn)染Sf9細胞，五天后按上述方法進行IFA，結(jié)果表明，熒光顯微鏡下可以見到Sf9胞漿內(nèi)和胞膜上都有亮綠色的熒光，而野生病毒轉(zhuǎn)染的Sf9細胞、正常Sf9細胞沒有可見熒光。這一結(jié)果證明rChIFN-γ在Sf9細胞中得到良好表達(如圖2所示)。
2.3 Sf9細胞上清中含有高效價的rChIFN-γ活性取不同的MOI分別感染Sf9細胞，于感染后不同時間收集細胞上清，按10倍梯度稀釋，致敏次代CEF，24h后，加入100TCID50的VSV，再間隔24h后觀察細胞保護情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rChIFN-γ的表達是隨時間和MOI的變化而變化的，當MOI＝1時，rChIFN-γ表達量呈明顯穩(wěn)定的上升趨勢，且活性也相對最高，96h達到表達高峰，MOI＝2時也是如此，但表達量略低于MOI＝1，而MOI＝4，6，8，10，rChIFN-γ表達在感染后72h達到了高峰，由于細胞裂解較多，所以采樣時rChIFN-γ活性不是很高，從感染后96h～144h，細胞全部裂解，所以在96h收集破碎細胞和細胞上清測定蛋白活性。連續(xù)四次實驗結(jié)果表明干擾素感染量為MOI＝1為最佳感染量，感染后96h為最佳收獲時間，測得的干擾素的活性高達1.58×106U/0.1ml。將四次的測定結(jié)果取平均值后進行繪圖，如圖3所示。表達的干擾素對溫度比較敏感，在4℃避光可保存3個月，活性仍能保持在1×106U/0.1ml，37℃放置1天活性就會下降到1×105U/0.1ml，58℃處理1h活性就下降到1×104U/0.1ml，放液氮和-20℃凍融一次后的活性下降到1×105U/0.1ml，但能保持該活性半年不變。表達的干擾素對pH也比較敏感，研究發(fā)現(xiàn)干擾素在pH＝5～7，4℃處理1h時，活性為1×106U/0.1ml左右，但pH小于5，大于7時干擾素活性下降到1×103～1×104U/0.1ml。
3應用3.1高抗病毒活性重組雞 γ-干擾素(rChIFN-γ)能抑制MDV GA對CEF的致病變作用，但對NDV F48E8僅能抑制其在細胞上的增殖用不同量的高抗病毒活性rChIFN-γ分別致敏CEF 24h和48h，接種不同劑量TCID50的F48E8毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24h內(nèi)重組干擾素對細胞幾乎沒有保護作用，細胞均表現(xiàn)出病變。用血凝實驗測定細胞上清中的病毒血凝價，從感染后第3天開始，連續(xù)5天，直到陽性感染細胞全部死亡，然后將各稀釋度第5天的血凝價平均值列表，如表1，從表1中也可以看出，對照組和試驗組的細胞都有血凝價，經(jīng)統(tǒng)計學分析組與組之間差異不顯著。當用GA(1.6×104PFU/ml)稀釋到一定的空斑數(shù)后，感染致敏過24h的CEF，吸附5h后加瓊脂覆蓋維持5天，臺盼藍(0.3％)染色計數(shù)空斑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高抗病毒活性rChIFN-γ致敏過的CEF病毒形成的空斑數(shù)明顯少于對照組(正常上清)，結(jié)果如表2，從表2中結(jié)果可以看出高抗病毒活性rChIFN-γ對MDV GA的空斑抑制作用與干擾素的用量呈正相關(guān)，經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析干擾素加入組與組之間差異顯著。
表1 rChIFN-γ干擾素抑制NDV的血凝測定結(jié)果

HA結(jié)果記為2n，表格中的結(jié)果為n值表2 rChIFN-γ對馬立克氏病病毒的空斑抑制作用

3.2高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)有顯著的抗AIV(H5N1)病毒對細胞的致病作用按上述方法致敏并感染AIV病毒，然后用血凝實驗測定細胞上清中的血凝價，從感染后24h開始，連續(xù)10天測得的血凝價平均列表，如表3，從表3中可以看出rChIFN-γ對AIV H5N1有明顯抑制作用，且rChIFN-γ的量為100U以上時，對104TCID50 AIV病毒都能表現(xiàn)出很好的抑制效果。
表3 rChIFN-γ抗104TCID50 AIV的抑制結(jié)果 HA結(jié)果記為2n，表格中的結(jié)果為n值3.3結(jié)論以本發(fā)明所述方法對表達條件的優(yōu)化使感染后昆蟲細胞上清中的高抗病毒活性rChIFN-γ活性就達到1~1.58×106-7U/ml[每ml干擾素樣品的最高稀釋度仍能使細胞50％免受病毒的攻擊的稀釋度的倒數(shù)值定義為1個干擾素單位]，且昆蟲細胞上清易于收獲。
本發(fā)明用桿狀病毒表達的高抗病毒活性rChIFN-γ進行抗病毒初步研究發(fā)現(xiàn)其具有很強的抗病毒能力，但對不同病毒的抗病毒能力差異顯著，對NDV(F48E8株)有一定的抑制作用；rChIFN-γ對禽流感的抑制作用最為明顯，對不同接種量的病毒都有明顯的抑制作用；對MDV(GA株)的空斑抑制作用也非常明顯。
權(quán)利要求
1.一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)的制取方法，其特征在于由以下步驟制得a、將ChIFN-γ基因從真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I雙酶切后克隆到轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC1中，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFASTBAC1-ChIFN-γ；b、取DH10Bac感受態(tài)細胞，加入lng pFASTBAC1-ChIFN-γ，轉(zhuǎn)座后，用SOC培養(yǎng)基10倍梯度稀釋培養(yǎng)物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培養(yǎng)24～48小時，挑取白色菌落，Luria平板進行四次篩選純化，陽性質(zhì)粒命名為Bacmid-ChIFN-γ，提取陽性質(zhì)粒DNA用于下一步轉(zhuǎn)染；c、取上述重組DNA質(zhì)粒(Bacmid-ChIFN-γ)轉(zhuǎn)染Sf9細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)的制取方法，其特征在于在步驟c中，取雞γ-干擾素重組桿狀病毒感染量為MOI＝1，感染96h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)的制取方法，其特征在于在步驟a中，用EcoR I和Not I雙酶切真核質(zhì)粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，與同樣酶切的pFASTBAC1回收產(chǎn)物4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，篩選出pFASTBAC1-ChIFN-γ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)的制取方法，其特征在于在步驟b中，Luria平板為含氨芐青霉素板或卡那霉素板或慶大霉素板或四環(huán)素板或IPTG板或X-gal抗生素板。
5.一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)用于抑制雞馬立克病毒(MDV GA)對雞胚成纖維細胞(CEF)的致病變作用。
6.一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)用于抑制雞新城疫病毒(NDV F48E8)在細胞上的增殖。
7.一種高抗病毒活性重組雞γ-干擾素(rChIFN-γ)用于抗禽流感病毒(AIV H5N1)對細胞的致病作用。
全文摘要
高抗病毒活性重組雞γ－干擾素的制取方法及用途，涉及一種廣譜高效抗病毒基因工程產(chǎn)品的制取方法。將ChIFN－γ基因從真核質(zhì)粒中經(jīng)雙酶切后克隆到轉(zhuǎn)移載體中，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFASTBAC1－ChIFN－γ；取DH10Bac感受態(tài)細胞，加入1ng pFASTBAC1－ChIFN－γ，轉(zhuǎn)座后，用SOC培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，涂布Luria平板，培養(yǎng)后，挑取白色菌落，Luria平板進行純化，陽性質(zhì)粒命名為Bacmid－ChIFN－γ，提取陽性質(zhì)粒DNA；取上述重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞，制得高抗病毒活性重組雞γ－干擾素。本發(fā)明還在于將該干擾素用于抑制MDV GA對CEF的致病變作用、抑制NDV F48E8在細胞上的增殖、抗AIV(H5N1)病毒對細胞的致病作用。
文檔編號C12N15/09GK1657616SQ200510038289
公開日2005年8月24日 申請日期2005年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日
發(fā)明者秦愛建, 許金俊, 孔桂美, 劉岳龍, 金文杰 申請人:揚州大學