專利名稱：深圳5號非洲菊的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非洲菊(Gerbera hybrida)深圳5號(S5)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，即通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。
背景技術(shù)：
非洲菊別名扶郎花，為世界六大切花之一，也是重要的盆栽花卉。它的園藝品種多，觀賞價值高。育種工作者一直都在致力于獲得各種花色、花型、花香、以及瓶插壽命長，具有抗性、耐熱、耐冷的新品種。傳統(tǒng)育種技術(shù)存在雜交育種時間長、雜交難以引入親緣性較遠(yuǎn)種的優(yōu)良性狀，引入某一或某些優(yōu)良性狀時往往伴隨一些不良的性狀引入等缺點。利用基因工程技術(shù)將有望實現(xiàn)對非洲菊花色、花形、抗性、花期、瓶插壽命、花香等性狀進行改良。
目前為止，國外對非洲菊轉(zhuǎn)基因進行了初步的研究工作，但也僅限于一兩個實驗室的報道，且轉(zhuǎn)化效率很低。例如，Elomaa等(1993)以紅色品種Terra Regina試管苗的葉柄為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌將外源基因?qū)胪庵搀w，然后進行卡那霉素(Kan)選擇，最后每100個外植體獲得0.1-2個轉(zhuǎn)基因苗(Biotechnology，1993，11508-511)。國內(nèi)的非洲菊轉(zhuǎn)基因研究還只是處于摸索轉(zhuǎn)化條件的階段，尚未能獲得轉(zhuǎn)基因植株[葉華等，2003，云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，25(增刊)128-130；劉慧，2004，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文]。深圳5號(S5)舌狀花為桔黃色，內(nèi)輪盤狀花為黑色，花色鮮艷，很受人們喜愛。目前該品種植株再生頻率很低。另外各種病毒、微生物和害蟲的侵害以及本身的耐熱性、耐冷性不高，使非洲菊的品質(zhì)提高以及廣泛應(yīng)用于市場受到很大限制。
(三)發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種深圳5號非洲菊的轉(zhuǎn)基因方法，該方法具有穩(wěn)定性好、再生和轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點。將含有嵌合的CaMV35S.HPT基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)和一個嵌合的CaMV35S.GUS基因轉(zhuǎn)化深圳5號非洲菊單芽，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為生產(chǎn)上轉(zhuǎn)化其它目的基因、獲得轉(zhuǎn)基因非洲菊新品系(種)提供技術(shù)。
本發(fā)明的方法包括如下步驟步驟一，質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌按照常規(guī)的中間載體質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法(可參照王關(guān)林和方宏筠2002年編著的《植物基因工程原理與技術(shù)》，北京科學(xué)出版社)，將pCAMBIA1301(CAMBIA公司，澳大利亞)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中；涂板培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用配方為YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基A，在28±1℃條件恒溫培養(yǎng)46～50h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養(yǎng)獲得的含pCAMBIA1301質(zhì)粒的LBA4404單菌落，接種至培養(yǎng)基B即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的液體培養(yǎng)基中，28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養(yǎng)24～36h；加入體積百分比濃度為80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最終甘油濃度為20％；將甘油菌液混合液，即LBA4404種子液分裝至eppendof管中，置于-70～-80℃條件下保存?zhèn)溆?；步驟三，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化包括如下步驟(1)活化農(nóng)桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5～8μl接種于10～15ml步驟二的培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件培養(yǎng)23～25h；取1ml的菌液轉(zhuǎn)接到40～50ml新鮮培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)10～14h；將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用植物誘導(dǎo)培養(yǎng)基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養(yǎng)基懸浮沉淀；在分光光度計上測定所得菌液的OD600值，OD600值為0.4～0.5時為活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最終濃度為20～30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養(yǎng)將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養(yǎng)1～2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方為MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.2～5.5的共培養(yǎng)基中，24±1℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3～4d；(3)除菌培養(yǎng)將分步驟(2)培養(yǎng)后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗，吸去表面水分；轉(zhuǎn)入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的除菌培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)3～4d，培養(yǎng)條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養(yǎng)后的單芽轉(zhuǎn)入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7～10d轉(zhuǎn)瓶一次，轉(zhuǎn)瓶3～4次后，單芽基部誘導(dǎo)出不定芽；(5)擬轉(zhuǎn)基因植株的復(fù)壯和增殖培養(yǎng)將分步驟(4)誘導(dǎo)出的不定芽切下，轉(zhuǎn)入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽復(fù)壯和增殖培養(yǎng)基上，進行復(fù)壯和增殖10～15d；再將不定芽轉(zhuǎn)入與分步驟(4)相同的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30～40d；最后將生活力強的擬轉(zhuǎn)基因不定芽轉(zhuǎn)至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20～30d可獲得具有根的完整的擬轉(zhuǎn)基因植株，用于分子鑒定。
在本辦法步驟一中，中間載體質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法一般包括根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備、質(zhì)DNA轉(zhuǎn)化和檢測等步驟；恒溫培養(yǎng)一般是在恒溫培養(yǎng)箱中進行的。步驟二和步驟三之(2)中，振蕩培養(yǎng)一般是在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行的。在步驟三之(2)中，組培苗的獲得方法屬于現(xiàn)有技術(shù)，一般包括花托外植體的消毒、接種、培養(yǎng)、幼苗增殖和繼代培養(yǎng)等步驟而獲得健壯幼苗的單芽。在步驟三之(3)中，單芽外植體一般用30～50mL含頭孢拉定的無菌水沖洗2～3次，然后用吸水紙吸去表面水分。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點和效果1、通過轉(zhuǎn)基因，經(jīng)GUS穩(wěn)定性表達(dá)檢測和PCR、Southern雜交檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因苗誘導(dǎo)頻率最高可達(dá)到7.43％。
2、轉(zhuǎn)基因方法中采用無菌組培苗的單芽為外植體，這樣實驗材料的獲得就有了保證，而不受季節(jié)和外界環(huán)境條件變化的影響。
3、采用單芽直接誘導(dǎo)出不定芽(單芽增殖)這一基因轉(zhuǎn)化途徑可在較短時間(從單芽外植體接種于共培養(yǎng)基到獲得抗性芽約30～45d)獲得擬轉(zhuǎn)基因不定芽，再經(jīng)過20～30d可獲得完整的擬轉(zhuǎn)基因組培苗。
4、本轉(zhuǎn)基因方法中不定芽再生途徑在非洲菊各品種中的研究已很成熟，因此可實現(xiàn)非洲菊其它品種轉(zhuǎn)基因體系的建立和后續(xù)基因工程的研究。
(四)具體的實施方式下面結(jié)合實施例1-3對本發(fā)明進行進一步的說明。
實施例1步驟一，質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌按照常規(guī)的中間載體質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法，將pCAMBIA1301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中；涂板培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用配方為YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基A，在28±1℃條件恒溫培養(yǎng)46h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養(yǎng)獲得的含pCAMBIA1301質(zhì)粒的LBA4404單菌落，接種至培養(yǎng)基B即YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L鏈霉素的液體培養(yǎng)基中，28±1℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h；將已經(jīng)配好的體積百分比濃度為80％的甘油與培養(yǎng)好的菌液混合，使甘油菌液混合液中的最終甘油濃度達(dá)到20％。將甘油菌液混合液分裝至1.5ml的eppendof管中，置于-70℃條件下保存?zhèn)溆茫徊襟E三，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
(1)活化農(nóng)桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5μl接種于10ml步驟二的培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件培養(yǎng)23h；取1ml的菌液轉(zhuǎn)接到40ml新鮮培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)10h；將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入10ml eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用10ml植物誘導(dǎo)培養(yǎng)基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養(yǎng)基懸浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度計上測菌液的OD600值，結(jié)果OD600值為0.4，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最終濃度達(dá)到20mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養(yǎng)將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、220r/min條件下振蕩培養(yǎng)1h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10min后置于配方為MS+BA 2mg/L+IAA 0.2mg/L+乙酰丁香酮20mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.5的共培養(yǎng)基中，24±1℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3d；(3)除菌培養(yǎng)將分步驟(2)培養(yǎng)后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗3次，用吸水紙吸去表面水分；轉(zhuǎn)入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+頭孢拉定400mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6的除菌培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)3d，培養(yǎng)條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養(yǎng)后的單芽轉(zhuǎn)入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+頭孢拉定300mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7d轉(zhuǎn)瓶一次，轉(zhuǎn)瓶3次后，單芽基部誘導(dǎo)出不定芽；(5)擬轉(zhuǎn)基因植株的復(fù)壯和增殖培養(yǎng)將分步驟(4)誘導(dǎo)出的不定芽切下，轉(zhuǎn)入MS+BA 0.5mg/L+IAA 0.3mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.8的不定芽復(fù)壯和增殖培養(yǎng)基上，進行復(fù)壯和增殖10d；再將不定芽轉(zhuǎn)入與分步驟(4)相同的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30d；最后將生活力強的擬轉(zhuǎn)基因不定芽轉(zhuǎn)至MS+IAA 0.3mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20d可獲得具有根的完整的擬轉(zhuǎn)基因植株，用于分子鑒定。
檢測結(jié)果單芽外植體中GUS瞬時表達(dá)率為20％，抗性不定芽發(fā)生頻率達(dá)20％，最終能獲得轉(zhuǎn)基因不定芽頻率達(dá)7.43％。
實施例2其它同實施例1，不同的是步驟一培養(yǎng)基A為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為50h；步驟二培養(yǎng)基B為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件28±1℃、220r/min，培養(yǎng)時間36h；LBA4404種子液分裝至1.5ml eppendof管中，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?br> 步驟三(1)活化農(nóng)桿菌取步驟二所得LBA4404種子液8μl接種于15ml步驟二的培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件培養(yǎng)25h；取1ml的菌液轉(zhuǎn)接到50ml新鮮培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)14h；將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入10mleppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用10ml植物誘導(dǎo)培養(yǎng)基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養(yǎng)基懸浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度計上測菌液的OD600值，結(jié)果OD600值為0.5，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最終濃度達(dá)到30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養(yǎng)將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡15min后置于配方為MS+BA 3mg/L+IAA 0.5mg/L+乙酰丁香酮30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.2的共培養(yǎng)基中，24±1℃、黑暗條件下共培養(yǎng)4d；(3)除菌培養(yǎng)將分步驟(2)培養(yǎng)后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗3次，用吸水紙吸去表面水分；轉(zhuǎn)入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+頭孢拉定500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.8的除菌培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)4d，培養(yǎng)條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養(yǎng)后的單芽轉(zhuǎn)入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+頭孢拉定400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.8的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每10d轉(zhuǎn)瓶一次，轉(zhuǎn)瓶4次后，單芽基部誘導(dǎo)出不定芽；
(5)擬轉(zhuǎn)基因植株的復(fù)壯和增殖培養(yǎng)將分步驟(4)誘導(dǎo)出的不定芽切下，轉(zhuǎn)入MS+BA 0.8mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.8的不定芽復(fù)壯和增殖培養(yǎng)基上，進行復(fù)壯和增殖15d；再將不定芽轉(zhuǎn)入與分步驟(4)相同的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)40d；最后將生活力強的擬轉(zhuǎn)基因不定芽轉(zhuǎn)至MS+IAA 0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30d可獲得具有根的完整的擬轉(zhuǎn)基因植株，用于分子鑒定。
檢測結(jié)果單芽外植體中GUS瞬時表達(dá)率為18％，抗性不定芽發(fā)生頻率達(dá)18％，最終能獲得轉(zhuǎn)基因不定芽頻率達(dá)6.86％。
實施例3其它同實施例1，不同的是步驟1培養(yǎng)基A為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基；步驟2培養(yǎng)基B為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間36h；步驟3(1)完成后，OD600值為0.5；(2)中備用菌液振蕩培養(yǎng)時間為2h；(3)外植體在除菌培養(yǎng)基pH為5.8條件下除菌培養(yǎng)3d；(4)中培養(yǎng)基pH為5.8；(5)中不定芽復(fù)壯和增殖培養(yǎng)基pH值為5.6；在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為30d。
檢測結(jié)果單芽外植體中GUS瞬時表達(dá)率為20.3％，抗性不定芽發(fā)生頻率達(dá)20.3％，最終能獲得轉(zhuǎn)基因不定芽頻率達(dá)7.35％。
權(quán)利要求
1.一種深圳5號非洲菊的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于包括如下步驟步驟一，質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌按照常規(guī)的中間載體質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法，將pCAMBIA1301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中；涂板培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用配方為YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基A，在28±1℃條件恒溫培養(yǎng)46～50h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養(yǎng)獲得的含pCAMBIA1301質(zhì)粒的LBA4404單菌落，接種至培養(yǎng)基B即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的液體培養(yǎng)基中，28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養(yǎng)24～36h；加入體積百分比濃度為80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最終甘油濃度為20％；將甘油菌液混合液，即LBA4404種子液分裝至eppendof管中，置于-70～-80℃條件下保存?zhèn)溆?；步驟三，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化包括如下步驟(1)活化農(nóng)桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5～8μl接種于10～15ml步驟二的培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件培養(yǎng)23～25h；取1ml的菌液轉(zhuǎn)接到40～50ml新鮮培養(yǎng)基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)10～14h；將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用植物誘導(dǎo)培養(yǎng)基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養(yǎng)基懸浮沉淀；在分光光度計上測定所得菌液的OD600值，OD600值為0.4～0.5時為活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最終濃度為20～30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養(yǎng)將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養(yǎng)1～2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方為MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH 5.2～5.5的共培養(yǎng)基中，24±1℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3～4d；(3)除菌培養(yǎng)將分步驟(2)培養(yǎng)后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗，吸去表面水分；轉(zhuǎn)入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的除菌培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)3～4d，培養(yǎng)條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養(yǎng)后的單芽轉(zhuǎn)入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7～10d轉(zhuǎn)瓶一次，轉(zhuǎn)瓶3～4次后，單芽基部誘導(dǎo)出不定芽；(5)擬轉(zhuǎn)基因植株的復(fù)壯和增殖培養(yǎng)將分步驟(4)誘導(dǎo)出的不定芽切下，轉(zhuǎn)入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽復(fù)壯和增殖培養(yǎng)基上，進行復(fù)壯和增殖10～15d；再將不定芽轉(zhuǎn)入與分步驟(4)相同的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30～40d；最后將生活力強的擬轉(zhuǎn)基因不定芽轉(zhuǎn)至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20～30d可獲得具有根的完整的擬轉(zhuǎn)基因植株。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟一中，恒溫培養(yǎng)是在恒溫培養(yǎng)箱中進行的；步驟二和步驟三之(2)中，振蕩培養(yǎng)是在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行的；在步驟三之(3)中，單芽外植體用30～50mL含頭孢拉定的無菌水沖洗2～3次，然后用吸水紙吸去表面水分。
全文摘要
一種深圳5號非洲菊的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于包括質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌、LBA4404種子液的制備和保存、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化三大步驟，其中，步驟三——農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化包括活化農(nóng)桿菌、外植體與菌液共培養(yǎng)、除菌培養(yǎng)、抗生素篩選、擬轉(zhuǎn)基因植株的復(fù)壯和增殖培養(yǎng)五個分步驟。本方法將含有嵌合的CaMV35S.HPT基因和一個嵌合的CaMV35S.GUS基因轉(zhuǎn)化深圳5號非洲菊單芽，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為生產(chǎn)上轉(zhuǎn)化其它目的基因、獲得轉(zhuǎn)基因非洲菊新品系(種)提供技術(shù)。本方法具有穩(wěn)定性好、再生和轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點。
文檔編號C12N5/04GK1769461SQ20051003740
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者王小菁, 張妙彬 申請人:華南師范大學(xué)