專利名稱：激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物誘變技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用激光誘變手段選育達(dá)托霉素高產(chǎn)突變株技術(shù)。
背景技術(shù)：
病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性是我國(guó)乃至全球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，尋找能有效抑制抗藥菌的抗生素是解決這一問(wèn)題的根本途徑。萬(wàn)古霉素，曾被人們公認(rèn)為是抗革蘭氏陽(yáng)性菌的最后一道防線，然而，目前我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的抗該藥耐藥菌。開(kāi)發(fā)新型高效的新一代抗生素迫在眉睫。
“玫瑰孢鏈霉菌”(拉丁文名稱為“Streptomyces roseosporus”)是一種鏈霉菌屬放線菌，其發(fā)酵產(chǎn)物可提取達(dá)托霉素(英文名“daptomycin”)，一種由一個(gè)十碳烷側(cè)鏈與一個(gè)由13個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)狀β-氨基酸肽鏈N-末端的色氨酸連接而成的酸性脂肽類抗生素。
達(dá)托霉素由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，在臨床上與萬(wàn)古霉素相比表現(xiàn)出廣譜、藥效快、給藥小、副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，是目前世界公認(rèn)的萬(wàn)古霉素等現(xiàn)用一線抗生素的最佳替代品。因此，達(dá)托霉素具有廣闊的市場(chǎng)前景和巨大的經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)加快該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化研究。
達(dá)托霉素2003年在美國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，2004年年銷(xiāo)售額已超過(guò)8000萬(wàn)美元。盡管?chē)?guó)內(nèi)已有制備達(dá)托霉素的菌種，但該菌為未經(jīng)有效的正誘變的普通菌株，制備達(dá)托霉素能力弱，效能低。
激光誘變技術(shù)在微生物誘變育種中的應(yīng)用較為廣泛，其作用于微生物細(xì)胞產(chǎn)生光、熱、壓力、點(diǎn)、電磁場(chǎng)、弱磁場(chǎng)作用等，改變了微生物細(xì)胞中DNA和RNA遺傳密碼的次序，引起變異。滕利榮等用He-Ne激光誘變處理透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌——獸疫鏈球菌，得到的正突變株透明質(zhì)酸產(chǎn)量比原始菌株提高4.5倍。韓建榮等采用激光對(duì)青霉PT95菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行了誘變處理，選育到一株類胡蘿卜素提高28.3％的突變菌株。而把激光應(yīng)用在生產(chǎn)達(dá)托霉素菌種的選育方面，則未見(jiàn)相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法，依此方法可以有效地提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于包括以下過(guò)程將該模式菌為玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成104～106個(gè)孢子/ml的孢子懸液，將0.1～0.3ml孢子懸液分裝于無(wú)菌石英槽內(nèi)，采用波長(zhǎng)為632.8nm的He-Ne激光在照射功率5～30mW下，對(duì)該孢子輻照5～150min，然后把經(jīng)輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋10～10000倍后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中28～30℃培養(yǎng)7～10d，選取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶，于28～30℃，180～220rpm搖床中培養(yǎng)90～120h，從而獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定的純菌玫瑰孢鏈霉菌。
上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖0.6～1.0g，糊精2～4g，干酪素0.5～1.0g，花生餅粉0.4～0.6g，L-天冬素0.08～0.12g，K2SO40.4～0.6g，溶解在1L蒸餾水中，初始pH 7.5。
本發(fā)明采用的He-Ne激光照射的方式進(jìn)行對(duì)制備達(dá)托霉素的菌種進(jìn)行激光誘變的誘變方法，激光誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法好，在微生物制藥菌種選育中有較大的推廣價(jià)值。本發(fā)明通過(guò)利用He-Ne激光輻照進(jìn)行誘變，可選育出高產(chǎn)抗生素達(dá)托霉素鏈霉菌突變株。突變株正變率5～30％。發(fā)酵單位比原始菌株提高0.5～3.5倍。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照5min，輻照功率10mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率8～9％。發(fā)酵單位比原始菌株提高1.3～1.4倍。
實(shí)施例2在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照25min，輻照功率30mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率18～19％。發(fā)酵單位比原始菌株提高2.3～2.4倍。
實(shí)施例3在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照30min，輻照功率25mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率25～26％。發(fā)酵單位比原始菌株提高3.0～3.3倍。
實(shí)施例4在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照37.5min，輻照功率20mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率23～24％。發(fā)酵單位比原始菌株提高2.7～2.8倍。
實(shí)施例5在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照50min，輻照功率15mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率18～19％。發(fā)酵單位比原始菌株提高1.7～1.8倍。
實(shí)施例6在室溫下，取玫瑰孢鏈霉菌斜面用無(wú)菌水制成104～105個(gè)孢子/ml的孢子懸液，吸取0.2ml置于總體積3.5ml(10×10×35mm)無(wú)菌石英槽內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm，照射距離20cm，激光束直徑10mm)輻照150min，輻照功率5mW。吸取輻照處理后的懸液0.1ml稀釋100～1000倍后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)10d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基(組成為葡萄糖0.75g/L，糊精3g/L，干酪素1g/L，花生餅粉0.5g/L，L-天冬素0.1g/L，K2SO40.5g/L，pH 7.5)的250ml搖瓶中，于30℃，200rpm搖床中培養(yǎng)110h，HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中達(dá)托霉素產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)達(dá)托霉素的遺傳穩(wěn)定突變株。突變株正變率8～9％。發(fā)酵單位比原始菌株提高0.8～0.9倍。
權(quán)利要求
1.一種激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于包括以下過(guò)程將該模式菌為玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成104～106個(gè)孢子/ml的孢子懸液，將0.1～0.3ml孢子懸液分裝于無(wú)菌石英槽內(nèi)，采用波長(zhǎng)為632.8nm的He-Ne激光在照射功率5～30mW下，對(duì)該孢子輻照5～150min，然后把經(jīng)輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋10～10000倍后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中28～30℃培養(yǎng)7～10d，選取生長(zhǎng)良好的單菌株接種于盛有30ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶，于28～30℃，180～220rpm搖床中培養(yǎng)90～120h，從而獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定的純菌玫瑰孢鏈霉菌。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖0.6～1.0g，糊精2～4g，干酪素0.5～1.0g，花生餅粉0.4～0.6g，L-天冬素0.08～0.12g，K2SO40.4～0.6g，溶解在1L蒸餾水中，初始pH7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種激光誘變玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的方法，屬于菌種的誘變選育技術(shù)。該方法包括以下過(guò)程在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液，將懸液分裝于無(wú)菌石英槽內(nèi)，采用He－Ne激光輻照一定時(shí)間，然后把經(jīng)激光輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，從中獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定的純玫瑰孢鏈霉菌，選取純菌株轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后選取遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用的激光誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法好，依此方法誘變得到的玫瑰孢鏈霉菌，同原始菌株相比，發(fā)酵單位提高0.5～3.3倍。
文檔編號(hào)C12R1/465GK1793356SQ20051001584
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者聞建平, 盧文玉, 范晶華, 馮偉, 財(cái)音青格樂(lè) 申請(qǐng)人:天津大學(xué)