專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抑制土壤中真菌孢子萌發(fā)的化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制土壤中真菌孢子萌發(fā)的化合物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
土傳類(lèi)病害是造成農(nóng)作物損失的重要原因之一。目前防治的主要方法仍為輪作、培育抗病品種及化學(xué)農(nóng)藥防治等。長(zhǎng)期以來(lái)，化學(xué)農(nóng)藥在防治土傳病害，保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面做出了突出貢獻(xiàn)。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，廣泛和長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)使真菌病害產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)平衡，對(duì)環(huán)境造成污染。目前環(huán)境問(wèn)題已成為全球共同關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)，亦是我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展面臨的主要問(wèn)題之一。因此有必要尋找新的途徑來(lái)控制植物病害，同時(shí)又能盡量減少對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成負(fù)面影響。與化學(xué)防治形成對(duì)照，生物防治基于生態(tài)平衡的原理，可有效避免或減輕3R(抗性，殘留，害蟲(chóng)再爆發(fā))問(wèn)題，越來(lái)越引起人們的重視。
100年前，人們注意到土壤中的微生物或其代謝產(chǎn)物對(duì)土傳類(lèi)病原真菌具有抑制作用。抑制機(jī)理主要是使菌絲異常膨大；溶解和完全降解菌絲的尖端；通過(guò)掠奪營(yíng)養(yǎng)，抑制芽管的生長(zhǎng)或寄生等。此外，1953年Dobs和Hinson發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的自然土壤能夠抑制真菌孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為土壤抑菌作用(Fungistasis)。土壤抑菌作用對(duì)于控制土傳類(lèi)病害來(lái)說(shuō)是有益菌，但對(duì)于防治土傳病害的生防菌來(lái)說(shuō)，則是有害的。因?yàn)椋咦邮钦婢姆敝丑w，生防真菌只有通過(guò)孢子擴(kuò)散和生存，在土壤中快速萌發(fā)定殖，才能產(chǎn)生良好的防效。一般來(lái)說(shuō)，植物病原真菌對(duì)土壤抑真菌作用有較強(qiáng)的敏感性。主要是通過(guò)在不利的條件下休眠不萌發(fā)，從而達(dá)到自我保護(hù)。因此，可以利用這種敏感性來(lái)防治土傳類(lèi)植物病害。即有目的增加土壤抑菌作用，通過(guò)限制病原真菌孢子繁殖而達(dá)到控制病害的目的。但對(duì)病害生防真菌而言，則是通過(guò)減少土壤抑菌作用而增強(qiáng)防效。最近的研究表明，土壤的微生物菌群是影響土壤抑真菌作用的重要因素。由這些微生物產(chǎn)生的非揮發(fā)性抗真菌化合物起了決定的作用，因此研究和開(kāi)發(fā)具有土壤抑菌作用的化合物對(duì)于土傳類(lèi)病害控制具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從具有強(qiáng)土壤抑菌作用的土壤中，分離出強(qiáng)抑制性細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中，篩選出對(duì)病原真菌的孢子具有強(qiáng)抑制作用的化合物，用于開(kāi)發(fā)土傳類(lèi)病害生防菌劑及生防菌劑增效劑。
本發(fā)明采用的生產(chǎn)菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis C2，該菌株于2005年2月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.1318。
本發(fā)明采用常規(guī)技術(shù)制備，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的1、從枯草芽孢桿菌C2中提取活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)選用從強(qiáng)抑真菌孢子萌發(fā)的土壤中分離篩選獲得的枯草芽孢桿菌C2菌株，采用常規(guī)方法用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基為牛肉膏3克、蛋白胨5克、7波美度的麥芽汁500ml、pH 7.5，在37℃下發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)，將發(fā)酵液低壓濃縮后，用甲醇提取。經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析，甲醇洗脫，得到本發(fā)明的化合物，該活性化合物命名為伊枯草菌素A(Iturin A)，結(jié)構(gòu)鑒定為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜顯示該化合物在1043，1057，1071處有[M+H]+峰。UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
2、活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)對(duì)植物病原真菌孢子的藥效試驗(yàn)(1)試驗(yàn)用藥劑將化合物伊枯草菌素A用無(wú)菌蒸餾水分別配成濃度為15，10，8，5μg ml-1六個(gè)濃度。
將未接種的發(fā)酵液低壓濃縮后，分別用正丁醇和乙酸乙酯萃取，濃縮后部位在硅膠G上用氯仿和甲醇(增加甲醇的比例)洗脫，所得餾分做活性，將活性部位合并。然后用SephadexLH-20分離，用甲醇做洗脫劑。洗脫液濃縮后用無(wú)菌蒸餾水分別配成濃度為15，10，8，5μg ml-1六個(gè)濃度作為對(duì)照。
(2)制備試驗(yàn)用病原真菌和生防真菌a.腐皮鏈孢(Fusarium solani f.sp.radicicola)，三七根腐病原菌將腐皮鏈孢接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天。用無(wú)菌蒸餾水將孢子洗下后用離心機(jī)將蒸餾水除去，凍于4℃冰箱備用。
b.灰霉病菌(Botrytis cinerea)，灰霉病原菌將灰霉菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天。用無(wú)菌蒸餾水將孢子洗下后用離心機(jī)將蒸餾水除去，凍于4℃冰箱備用。
c.哈慈木霉(Trichodermaa harzianum)，真菌病害生防菌將哈慈木霉接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天。用無(wú)菌蒸餾水將孢子洗下后用離心機(jī)將蒸餾水除去，凍于4℃冰箱備用。
(3)試驗(yàn)方法將本發(fā)明的活性化合物用馬鈴薯液體培養(yǎng)基配成濃度為15，10，8，5μg ml-1四個(gè)供試藥液，將藥液500μl放于1.5ml離心管中，加入病原孢子使孢子濃度為104，放置于28℃下培養(yǎng)，分別于16小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率。
鑒定孢子萌發(fā)的方法為當(dāng)孢子芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑2倍的認(rèn)為萌發(fā)。

以對(duì)照藥劑作對(duì)照，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次平均值計(jì)算出平均萌發(fā)率。
(4).試驗(yàn)結(jié)果表1抑制腐皮鏈孢(Fusarium solani f.sp.Radicicola)孢子萌發(fā)的作用

表2 抑制灰霉病菌Botrytis cinerea孢子萌發(fā)的作用

表3抑制哈慈木霉Trichodermaha harzianum孢子萌發(fā)的作用

結(jié)果表明本發(fā)明的活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)對(duì)兩種病原真菌孢子的萌發(fā)有較好的抑制作用，在濃度為10μg ml-1時(shí)就能完全抑制住孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。而對(duì)于生防真菌，在濃度為8μg ml-1時(shí)就能完全抑制住孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。
本發(fā)明的活性化合物伊枯草菌素A可作為制備抑制土壤病原真菌孢子萌發(fā)的生物農(nóng)藥制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有的殺真菌藥相比，具有高效、低毒及低殘留等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例(方法為常規(guī)方法)，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一從具有強(qiáng)土壤抑菌作用的土壤中，分離出強(qiáng)抑制性細(xì)菌，從中篩選獲得的枯草芽孢桿菌C2菌株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基為牛肉膏3克、蛋白胨5克、7波美度的麥芽汁500ml、pH7.5，于37℃下發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)后，將發(fā)酵液低壓濃縮，用甲醇提取。經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析，甲醇洗脫，得到本發(fā)明的化合物，該活性化合物命名為伊枯草菌素A(Iturin A)。
結(jié)構(gòu)鑒定為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜顯示該化合物在1043，1057，1071處有[M+H]+峰。UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
實(shí)施例二將本發(fā)明的活性化合物伊枯草菌素A用馬鈴薯液體培養(yǎng)基配成濃度為15，10，8，5μg ml-1四個(gè)供試藥液，將藥液500μl放于1.5ml離心管中，加入病原孢子使孢子濃度為104，放置于28℃下培養(yǎng)，分別于16小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率。
結(jié)果表明(表1-3)本發(fā)明化合物伊枯草菌素A(Iturin A)對(duì)兩種病原真菌孢子的萌發(fā)有較好的抑制作用，在濃度為10μg ml-1時(shí)就能完全抑制住孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。而對(duì)于生防真菌，在濃度為8μg ml-1時(shí)就能完全抑制住孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。本發(fā)明的活性化合物伊枯草菌素A具有高效、低毒及低殘留等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種抑制土壤中真菌孢子萌發(fā)的化合物，由生產(chǎn)菌株經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)、低壓濃縮、甲醇提取、反復(fù)凝膠柱層析及甲醇洗脫后得到，其特征在于a.生產(chǎn)菌株為從強(qiáng)抑真菌孢子萌發(fā)的土壤中分離篩選獲得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)C2，該菌株于2005年2月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.1318；b.該活性化合物命名為伊枯草菌素A(Iturin A)，結(jié)構(gòu)鑒定為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜顯示該化合物在1043，1057，1071處有[M+H]+峰，UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
2.權(quán)利要求1所說(shuō)的化合物伊枯草菌素A，能夠抑制三七根腐病的病原菌腐皮鏈孢、灰霉病菌和哈慈木霉生防菌孢子萌發(fā)，可應(yīng)用于植病生防和生防劑菌增效。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制土壤中真菌孢子萌發(fā)的化合物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的活性化合物伊枯草菌素A(IturinA)，選用從強(qiáng)抑真菌孢子萌發(fā)的土壤中分離篩選獲得的枯草芽孢桿菌C2菌株，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)、低壓濃縮、甲醇提取、反復(fù)凝膠柱層析，甲醇洗脫后得到?？莶菅挎邨U菌C2菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO.1318?；衔镆量莶菥谹(IturinA)的結(jié)構(gòu)鑒定為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜顯示該化合物在1043，1057，1071處有[M+H]
文檔編號(hào)C12N1/20GK1683519SQ20051001069
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者李蕾, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)