專利名稱：一種預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法
(一)、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用分子標(biāo)記檢測(cè)雞跖骨性狀的方法。
(二)、背景技術(shù)背景技術(shù) 家禽育種工作在過去的幾十年中依賴于表型的選擇已經(jīng)取得了令人矚目的成績(jī)，肉雞的生長(zhǎng)速度和肉產(chǎn)量得以明顯提高。肉雞業(yè)在世界范圍內(nèi)，尤其在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家具有良好的發(fā)展前景。然而，伴隨著肉雞的快速生長(zhǎng)，其生理性不適癥及相關(guān)疾病明顯增加，如腿部疾病，腹水綜合癥，猝死癥，雞體免疫功能下降等，這些問題給肉雞生產(chǎn)者造成的經(jīng)濟(jì)損失是顯而易見的。因此，通過增強(qiáng)骨的強(qiáng)壯性、保持骨骼的恰當(dāng)比例來解決雞的腿部疾病已成為當(dāng)前快大型肉雞生產(chǎn)的一個(gè)重要目標(biāo)。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGF-beta)超家族成員，該家族中的各個(gè)成員對(duì)機(jī)體的各器官、組織的生長(zhǎng)和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。1965年，Urist首次將0.6M鹽酸制備的脫鈣骨基質(zhì)植入鼠骨肌內(nèi)，成功誘導(dǎo)異位骨形成，從而提出了骨誘導(dǎo)理論。1971年，Urist將這類誘導(dǎo)成骨物質(zhì)定義為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了15種BMPs，而且數(shù)目仍在增加。
BMP-2是目前研究最廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMPs之一。1988年，人們首次分離純化出天然BMP-2，這是一種分子量約為30KDs的堿性降解糖蛋白質(zhì)，其降解產(chǎn)物的分子量分別為30、18、16KDs。其中30KDs的分子以二聚體形式存在，是天然BMP-2的主要形式。有研究認(rèn)為，BMP-2主要對(duì)未分化間充質(zhì)細(xì)胞和骨系細(xì)胞起到募集和分化作用。在骨形成早期，BMP-2不僅可使未分化間充質(zhì)細(xì)胞向骨形成中心募集，并分化為骨系細(xì)胞，而且可使成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞及骨髓的基細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化為骨系細(xì)胞。對(duì)于成骨細(xì)胞，BMP-2可使之維持其特有細(xì)胞表型，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞標(biāo)志物的增高，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化。在骨形成后期，BMP-2還作為一種破骨細(xì)胞分化因子與其它支持破骨細(xì)胞分化因子直接或間接刺激破骨細(xì)胞分化，參與骨的重建。
人的在體及離體實(shí)驗(yàn)均表明BMP-2具有誘導(dǎo)異位新骨形成的作用。BMP-2不僅可刺激骨組織來源的細(xì)胞株向成骨細(xì)胞系方向分化，還可以改變非骨組織來源的細(xì)胞株的分化方向，使其向成骨細(xì)胞系方向分化。此外，BMP-2在骨細(xì)胞分化過程中，具有增加其它BMPs基因表達(dá)的作用，在骨改建和塑形時(shí)期，BMP-2和其它BMPs一樣，通過自分泌或旁分泌的方式刺激定向性和非定向性骨祖細(xì)胞的分化和新骨形成。
雞的BMP-2基因CDS全長(zhǎng)1179bp，與雞的基因組比對(duì)結(jié)果顯示該基因位于雞的14號(hào)染色體上。H.Zhou等對(duì)雞BMP-2基因的1000bp進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，但未發(fā)現(xiàn)多態(tài)。
(三)、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學(xué)技術(shù)，即采用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測(cè)雞跖骨長(zhǎng)度，從而預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、根據(jù)雞BMP-2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’2、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3、使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出BMP-2基因內(nèi)含子II中的12bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；4、當(dāng)雞BMP-2基因內(nèi)含子II缺失12bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為162bp，將其命名為EE基因型；當(dāng)雞BMP-2基因內(nèi)含子II含有12bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174bp，將其命名為FF基因型；該位點(diǎn)雜合的個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶162bp和174bp，將其命名為EF基因型。
本發(fā)明還可以包括1、其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測(cè)堿基的插入/缺失而分類的基因型。
2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是內(nèi)含子。
3、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是由BMP2F2和BMP2R2表示的引物擴(kuò)增的內(nèi)含子及部分外顯子區(qū)。
4、其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自雞BMP-2基因如下序列中第98位至第109位的12個(gè)堿基的插入/缺失。
1 AGTCTTTCAG GTCTTGTTTG TCGCATGCCA GCAGCACGTATCTGAGGGGT TTGGTTGCTT61 GTCTCAGTTC CTAACTITIT TTTCTCTCTC CCTCTGCTCCCTGCCCCCTT CCCTGCCCCC121 TTCCCTCCTG TTTAATCAAA TTAGAAGTTT TGGAAGAACTGCCAGAAACA AGTG5、其中雞跖骨性狀是雞的跖骨長(zhǎng)。
6、其中聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為12％或14％。
實(shí)驗(yàn)證明具有FF基因型雞只的4、6、8、10周齡跖骨長(zhǎng)均顯著高于具有EE基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)，具有FF基因型雞只的12周齡跖骨長(zhǎng)顯著高于具有EF基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)。
本發(fā)明巧妙地采用PCR擴(kuò)增和凝膠分離的方法檢測(cè)雞BMP-2基因內(nèi)含子中的12bp插入/缺失的變異位點(diǎn)。由于EE基因型和FF基因型的BMP-2基因片段長(zhǎng)度僅差12個(gè)堿基，使用瓊脂糖凝膠電泳很難將兩種基因型分離，因此本發(fā)明采用12％或14％的聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離兩種基因型。
本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)雞的跖骨長(zhǎng)進(jìn)行選擇時(shí)，將使4、6、8、10和12周齡的跖骨長(zhǎng)分別取得15.5％、10.8％、4.5％、10.4％和2.0％的遺傳進(jìn)展。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對(duì)跖骨長(zhǎng)進(jìn)行選擇，不僅為雞育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法，同時(shí)為雞的跖骨性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，可以加速雞的育種進(jìn)程。


附圖是BMP-2基因12bp插入/缺失多態(tài)位點(diǎn)分析。
(五)、具體實(shí)施方案下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和性狀測(cè)定東北農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的以高脂肉雞和白耳雞為親本雜交產(chǎn)生的F2資源群體(NEAUF2)，本研究選取5個(gè)家系，共計(jì)447只雞。
F2代群體于4周齡開始至12周每隔2周測(cè)量其跖骨長(zhǎng)、跖骨圍；12周齡時(shí)翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱量活重之后屠宰，然后稱量脛骨重、股骨重和跖爪重，測(cè)量脛骨長(zhǎng)、股骨長(zhǎng)等性狀。。
2.藥品和酶三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris飽和酚，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要儀器PTC-200PCR儀(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR儀、UVP多功能成像系統(tǒng)、Ultrospec 1000紫外分光光度計(jì)、BECKMAN冷凍離心機(jī)、Milli-Q超純水儀、DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳槽。
二、實(shí)驗(yàn)方法1.緩沖液與常用試劑的配制1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
TE緩沖液10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高壓滅菌。
20×SET緩沖液3MNaCl，1M Tris Cl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。
5×TBE緩沖液54g Tris堿，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE緩沖液242g Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5M EDTA186.1g EDTA溶于800ml雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
3M NaAc(pH5.2)408.1g NaAe 3H2O溶于800ml雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至7.0，定容至1000ml。
200ml銀染液NH3·H2O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO33.6ml，加去離子水至200ml。
200ml顯色液1％檸檬酸鈉1ml；甲醛100ul；加去離子水至200ml。
禽血裂解液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的設(shè)計(jì)與合成以下引物由上海博亞生物公司合成BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊。
(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCl至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻10min。□(3)12,000rpm，室溫離心10min。取上清，加等體積氯仿混勻10min?！?4)12,000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA?！?5)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次?！?6)7,500rpm，室溫離心5min，棄上清。
(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二(1)將20μl全血加入裝有700μl 1×SET的1.5ml離心管中，輕輕混勻。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200μg/μl和10％的SDS至終濃度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個(gè)離心管中，棄去有機(jī)相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23∶1)，來回顛倒混合10min，12,000rpm，離心10min，移出水相到另一個(gè)離心管。
(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒，沉淀DNA。
(8)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4.PCR反應(yīng)(1)以雞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ul反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10×PCR reaction buffer2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM) 0.5μl引物2(10μM) 0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去離子水 18.25μl基因組DNA(50ng/μl)1.0μl(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
94℃變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5～10μl)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
5.非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳以濃度為14％、體積為25ml，厚度為0.1cm的膠為例。
(1)清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8％瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。
(2)在100ml燒杯內(nèi)加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10％過硫酸銨0.175ml，TEMED8μl，去離子水5.617ml，混勻后迅速灌膠。
(3)當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時(shí)停止灌膠，插入梳子，室溫聚和半小時(shí)，多余的丙烯酰胺4℃保存。隨時(shí)觀察凝膠聚合情況，并補(bǔ)加丙烯酰胺。
(4)凝膠聚合好后，向電泳槽加入1×TBE，用注射器沖洗加樣孔。
(5)預(yù)電泳10min，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。
(6)取2μl PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加2μl上樣Buffer混勻，用微量注射器點(diǎn)樣。
(7)120伏，電泳8-10h。
6.硝酸銀染色方法(1)電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70％乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。
(2)雙蒸水洗膠2遍，每次2min，去除殘留乙醇。
(3)用200ml染色液染色30min。
(4)雙蒸水洗膠3遍，每次2min。
(5)用200ml顯色液顯色，約10-30min，當(dāng)DNA帶的強(qiáng)度合適時(shí)，倒掉顯色液。
(6)去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。
7.統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)NEAUF2資源群體的特點(diǎn)，構(gòu)建統(tǒng)計(jì)模型如下Y＝μ+G+S+H+F+D(F)+G*S+G*H+S*H+G*S*H+BW+e①Y＝μ+a+G+S+H+BW+e□Y為性狀觀察值，μ為群體均值，a為剩余多基因效應(yīng)，G為基因型固定效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，H為孵化批次固定效應(yīng)，F(xiàn)為家系隨機(jī)效應(yīng)，D(F)為母雞與家系嵌套的隨機(jī)效應(yīng)，G*S為基因型與性別的互作效應(yīng)，G*H為基因型與孵化批次的互作效應(yīng)，S*H為性別與孵化批次的互作效應(yīng)，G*S*H為基因型、性別、孵化批次的互作效應(yīng)，BW為周齡體重，e為剩余值。對(duì)于模型①使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP4(SAS Institute Inc.，Cary，NC)檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。對(duì)于模型②使用統(tǒng)計(jì)軟件MTDFREML估計(jì)基因型對(duì)性狀的遺傳和表型貢獻(xiàn)率。
實(shí)施例、雞BMP2基因的多態(tài)性與NEAUF2資源群體周齡跖骨長(zhǎng)的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(BMP2F2和BMP2R2)對(duì)NEAUF2資源群體447個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。在NEAUF2資源群體中共檢測(cè)到3種基因型，對(duì)于PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為162bp的個(gè)體，將其命名為EE基因型；對(duì)于PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174bp的個(gè)體，將其命名為FF基因型；對(duì)于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶(162bp和174bp)的個(gè)體，將其命名為EF基因型(附圖)。
對(duì)BMP2基因12bp插入/缺失的變異位點(diǎn)的3種基因型與NEAUF2資源群體447個(gè)個(gè)體的周齡跖骨長(zhǎng)進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對(duì)F2資源群體的周齡跖骨長(zhǎng)有顯著影響(P＜0.05)(表1)。
表1 NEAUF2資源群體周齡跖骨長(zhǎng)的最小二乘分析結(jié)果(P值)性狀P值4周齡跖骨長(zhǎng)0.00276周齡跖骨長(zhǎng)0.02058周齡跖骨長(zhǎng)0.042110周齡跖骨長(zhǎng) 0.014412周齡跖骨長(zhǎng) 0.0866對(duì)3種基因型間NEAUF2資源群體周齡跖骨長(zhǎng)的最小二乘均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明具有FF基因型雞只的4、6、8、10周齡跖骨長(zhǎng)均顯著高于具有EE基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)，具有FF基因型雞只的12周齡跖骨長(zhǎng)顯著高于具有EF基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)。(表2)；表2 BMP2基因不同基因型對(duì)NEAUF2資源群體雞只周齡跖骨長(zhǎng)的影響性狀 EE EF FF4周跖骨長(zhǎng)最小二乘均值(厘米)5.654±0.039b5.736±0.031a5.778±0.034a6周跖骨長(zhǎng)最小二乘均值(厘米)7.014±0.045b7.051±0.035b7.127±0.039a8周跖骨長(zhǎng)最小二乘均值(厘米)8.204±0.054b8.320±0.041a8.311±0.046a10周跖骨長(zhǎng)最小二乘均值(厘米) 9.189±0.053b9.299±0.037a9.358±0.044a12周跖骨長(zhǎng)最小二乘均值(厘米) 9.809±0.057ab9.820±0.039b9.913±0.046a均值比較時(shí)同一行無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)表3列出基因型對(duì)NEAUF2資源群體雞只跖骨長(zhǎng)的遺傳貢獻(xiàn)率和表型貢獻(xiàn)率。BMP-2基因的變異位點(diǎn)對(duì)NEAUF2群體各周齡跖骨長(zhǎng)的遺傳貢獻(xiàn)率都較大，尤其是對(duì)4周齡跖骨長(zhǎng)的遺傳貢獻(xiàn)率達(dá)到15.5％。因此推測(cè)用該基因?qū)︴殴情L(zhǎng)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，會(huì)獲得較大的遺傳進(jìn)展。
表3 BMP-2基因?qū)EAUF2群體雞跖骨長(zhǎng)的遺傳和表型貢獻(xiàn)率性狀遺傳貢獻(xiàn)率(％)表型貢獻(xiàn)率(％)4周齡跖骨長(zhǎng)15.5 2.96周齡跖骨長(zhǎng)10.8 1.98周齡跖骨長(zhǎng)4.51.610周齡跖骨長(zhǎng) 10.4 2.112周齡跖骨長(zhǎng) 2.00.9
權(quán)利要求
1.一種預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是(1)、根據(jù)雞BMP-2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’；(2)、利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)、使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出BMP-2基因內(nèi)含子中的12bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；(4)、多態(tài)性分析當(dāng)雞BMP-2基因內(nèi)含子缺失12bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為162bp，將其命名為EE基因型；當(dāng)雞BMP-2基因內(nèi)含子含有12bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174bp，將其命名為FF基因型；該位點(diǎn)雜合的個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶162bp和174bp，將其命名為EF基因型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測(cè)堿基的插入/缺失而分類的基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的部位是內(nèi)含子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的部位是由BMP2F2和BMP2R2表示的引物擴(kuò)增的內(nèi)含子及部分外顯子區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自雞BMP-2基因如下序列中第98位至第109位的12個(gè)堿基的插入/缺失。1 AGTCTTTCAG GTCTTGTTTG TCGCATGCCA GCAGCACGTATCTGAGGGGT TTGGTTGCTT61GTCTCAGTTC CTAACTTTTT TTTCTCTCTC CCTCTGCTCCCTGCCCCCTT CCCTGCCCCC121 TTCCCTCCTG TTTAATCAAA TTAGAAGTTT TGGAAGAACTGCCAGAAACA AGTG
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中雞跖骨性狀是雞的跖骨長(zhǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為12％或14％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法，其特征是其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為12％或14％。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種預(yù)示和鑒定雞跖骨性狀的分子標(biāo)記方法。根據(jù)雞BMP－2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物BMP2F2和BMP2R2；利用該引物對(duì)雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出BMP－2基因內(nèi)含子中的12bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；分別對(duì)雞BMP2基因內(nèi)含子缺失12bp、含有12bp插入及該位點(diǎn)雜合時(shí)進(jìn)行命名。結(jié)果表明具有FF基因型雞只的4、6、8、10周齡跖骨長(zhǎng)均顯著高于具有EE基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)，具有FF基因型雞只的12周齡跖骨長(zhǎng)顯著高于具有EF基因型雞只的跖骨長(zhǎng)(P＜0.05)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對(duì)雞跖骨性狀進(jìn)行選擇，不僅為雞育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法，同時(shí)為雞的跖骨性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，可以加速雞的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1721551SQ20051001012
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者李輝, 冷麗 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)