專利名稱：具有提高的果糖發(fā)酵能力的酵母菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有提高的碳水化合物發(fā)酵能力的酵母菌株，具體而言，涉及用編碼改進(jìn)的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因轉(zhuǎn)化的菌株，更具體地，用突變的HXT3基因轉(zhuǎn)化的菌株。
在葡萄酒的乙醇發(fā)酵期間，己糖(例如葡萄糖和果糖)通過微生物的活動(dòng)被轉(zhuǎn)化為乙醇，具體而言，通過Saccharomyces屬酵母菌株。S.cerevisiae是葡萄酒制造中優(yōu)選的酵母，選出的S.cerevisiae菌株被用作為接種葡萄汁及進(jìn)行乙醇發(fā)酵的啟動(dòng)者。葡萄汁含有等量的葡萄糖和果糖，其中典型地，總己糖的水平在160至300g/L的范圍內(nèi)。S.cerevisiae是親葡萄糖(glucophilic)酵母，相對(duì)于生長底物中存在的其它任何碳源而言更優(yōu)選葡萄糖。結(jié)果，在乙醇發(fā)酵期間，葡萄汁的果糖/葡萄糖比率逐步增加。目前已通過實(shí)踐證實(shí)，發(fā)酵之后，瓶裝的葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的果糖總是比葡萄糖的量要大。發(fā)酵期間，果糖和葡萄糖的比率強(qiáng)烈不平衡可能是發(fā)酵停滯的主要原因。
在分子水平上，已對(duì)酵母的發(fā)酵能力進(jìn)行了相當(dāng)廣泛的研究。通過酵母的活動(dòng)進(jìn)行的糖代謝早期步驟之一是運(yùn)送糖穿過質(zhì)膜。編碼用于不同的糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特定基因在酵母中表達(dá)。在Saccharomyces中，己糖(例如葡萄糖和果糖)的攝取受到特定的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于單糖促進(jìn)因子(facilitator)的超家族(Reifenberger，E.，F(xiàn)reidel，K.andCiriacy，M.(1995)16(1)，157-167)。至今，已經(jīng)鑒定出了超過16種編碼此類基因的基因，特別是所謂的HXT基因(其代表己糖轉(zhuǎn)運(yùn)”hexosetransport”)。單個(gè)HXT基因和同源體的表達(dá)取決于環(huán)境因素，例如酵母細(xì)胞所感受到的己糖濃度。已經(jīng)有人提出，己糖的攝取由兩種動(dòng)力學(xué)上不同的系統(tǒng)催化(Bisson，L.F.，Coons，D.M.，Kruckeberg，A.L.and Lewis D.A.(1993)Crit Rev Biochem Mol Biol 28，295-308；Lagunas，R.(1993)FEMSMicrobiol Rev 104，229-242)。
一種系統(tǒng)具有對(duì)己糖的高親和度。這種高親和度的組分在生長于相對(duì)高的己糖濃度(例如，2％葡萄糖)的細(xì)胞中是不存在的。在這些條件下，酵母細(xì)胞表達(dá)低親和度的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。構(gòu)建缺乏多種HXT基因的突變體酵母菌株使得可以鑒定出酵母中的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Reifenberger，E.，Boles，E.and Ciriacy，M.(1997)，Eur.J.Biochem.245324-333)。在缺乏HXT1至HXT7基因的酵母菌株中，在含有高和低葡萄糖濃度(0.1％至5％)的培養(yǎng)基中的生長，葡萄糖攝取和葡萄糖消耗都低于檢測(cè)水平。在用僅表達(dá)HXT1至HXT7中的一種基因的突變體酵母菌株進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)中顯示HXT1p和HXT3p是低親和度的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(km≈50-100mM己糖)，HXT4p較低，而HXT2p、HXT6p和HXT7p是高親和度的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(km≈1-4mM己糖)，與這些突變體的培養(yǎng)條件(0.1％或5％葡萄糖)無關(guān)(Reifenberger，E.，F(xiàn)reidel，K.and Ciriacy，M.(1995)Yeast 11，S457)。相對(duì)果糖而言，所有己糖載體都對(duì)葡萄糖展示出較強(qiáng)的親和度。對(duì)于低親和度的載體HXT1(對(duì)葡萄糖而言，km≈110mM，而對(duì)果糖來說則＞300mM)和HXT3(對(duì)葡萄糖而言，km≈65mM，而對(duì)果糖來說是125mM)而言更是如此。
已分析出了葡萄酒發(fā)酵期間HXT載體的作用(Luyten，K.，Riou，C.andBlondin，B.(2002)Yeast 19，1-15 and Riou，C.Luyten，K.de Chazal，E.andBlondin，B.(2001)Yeast 18，S293)。其顯示，在釀制葡萄酒的發(fā)酵條件下，若干種載體(HXT1、HXT3、HXT6、HXT7)參與己糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
遵循消費(fèi)者的要求和國際上制作葡萄酒的實(shí)踐，大比例的天然品質(zhì)葡萄酒被發(fā)酵至干。這意味著葡萄酒中殘余的己糖的量通常小于1g/L。果糖是發(fā)酵終點(diǎn)存在的主要的糖，因?yàn)楣潜绕咸烟歉y于發(fā)酵，因此發(fā)酵在結(jié)尾時(shí)通常進(jìn)行緩慢。取決于酵母的活性，這可能導(dǎo)致緩慢的或停滯的發(fā)酵。人們預(yù)計(jì)，具有強(qiáng)的發(fā)酵果糖的能力的酵母能更為迅速地達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。
已從自然界中分離出了能更好地發(fā)酵果糖的酵母菌株，此類所謂的親果糖酵母已被成功用于進(jìn)一步降低葡萄汁中的糖含量。它們還已被成功用于停滯的發(fā)酵中，以通過用新的酵母細(xì)胞接種來去除殘余的糖。法國的Institut National de Recherche Agronomique已分離出了被稱為Fermichamp的親果糖酵母菌株67J INRA Narbonne，其可從DSM Food Specialties商業(yè)獲得。
除了發(fā)酵葡萄進(jìn)行葡萄酒制作之外，還有其它工業(yè)過程中，其中發(fā)酵速率和/或效率可被提高，以增加產(chǎn)生的乙醇的量。此類過程的例子是通過發(fā)酵從淀粉中獲得的葡萄糖以及發(fā)酵從含木聚糖的化合物中獲得的木糖來生產(chǎn)燃料乙醇。
人們需要具有提高的碳水化合物利用能力的酵母菌株。
令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，在HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之中存在更好地利用碳水化合物的能力。本發(fā)明涉及經(jīng)過分離的HXT3基因，其編碼具有提高的轉(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物的能力的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其功能性片段。碳水化合物可以例如是己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖)和戊糖(木糖、核糖、阿拉伯糖)。優(yōu)選地，獲得了利用選自由果糖、葡萄糖或木糖構(gòu)成的組的至少一種碳水化合物的提高的能力，更優(yōu)選地，是由果糖和木糖構(gòu)成的組。在制作葡萄酒的情況中，如上文所述，果糖利用的提高是優(yōu)選的。額外的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵速率也可被根據(jù)本發(fā)明的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高。
可以通過用突變的或野生型HXT3基因轉(zhuǎn)化過的酵母發(fā)酵期間，比較兩種碳水化物(包括希望被分析的一種)的比率來測(cè)量某種類型的碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的提高。野生型HXT3基因優(yōu)選具有根據(jù)SEQ ID NO25的核酸序列，其與來自Saccharomyces cerevisiae基因組數(shù)據(jù)庫(Stanford)的已知S288C HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相同。
用于測(cè)量的用HXT3基因轉(zhuǎn)化的酵母可以是任何希望的酵母菌株，只要能在同一物種中轉(zhuǎn)化兩種基因。合適的酵母菌株例如是Saccharomycescerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus、S.paradoxus。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能選出針對(duì)目標(biāo)應(yīng)用的酵母菌株。優(yōu)選地，采用Saccharomycescerevisae用于測(cè)量。
當(dāng)分離出的HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有增加的轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力時(shí)，優(yōu)選通過比較發(fā)酵期間的葡萄糖/果糖比(在與實(shí)施例4所述相同的條件下)來測(cè)量它相對(duì)于野生型己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而言提高的轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力。
本發(fā)明還涉及新的核酸序列，其編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有從SEQ ID NO26衍生的氨基酸序列，并且在選自由Leu 207、Met208、Ile 209、Thr 210、Leu 211、Gly 212所構(gòu)成的組的位置上具有至少一種突變。優(yōu)選地，所述突變選自由Leu 207、Met 208、Ile 209、Thr 210、Leu 211所構(gòu)成的組，更優(yōu)選地，選自由Met 208、Ile 209、Thr 210所構(gòu)成的組，最優(yōu)選地，突變?cè)贗le 209處發(fā)生。
此外還可以存在其它突變。優(yōu)選的作用于改進(jìn)表型的其它突變是在由野生型HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的第324、388、389、392、414、415、449、471位構(gòu)成的組的至少一處上或附近發(fā)生的突變。當(dāng)HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是根據(jù)SEQ ID NO26的序列時(shí)，該組更具體地由Met 324、Leu 388、Tyr 389、Ile 392、Glu 414、Gly 415、Ile 449、Leu 471構(gòu)成。
優(yōu)選地，下述的任何突變可以單獨(dú)或組合形式額外存在Met 324Ile、Leu 388 Met、Tyr 389 Trp、Ile 392 Val、Glu 414 Gln、Gly 415 Asn、Ile 449 Val、Leu 471 Ile。
上下文中，術(shù)語“突變的”或“突變”或“多種突變”表示，編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的核苷酸序列不同于該物種的野生型HXT3序列?；蛘撸g(shù)語“突變的”或“突變”或“多種突變”可以指編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的核苷酸序列較之編碼內(nèi)源HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因序列的變化。此外，用于本文中的術(shù)語“突變的”或“突變”或“多種突變”指，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列較之天然的或內(nèi)源的或野生型氨基酸序列的改變。
突變可以是保守的或非保守的突變。
術(shù)語“保守取代”用來指野生型氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，它們包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。
術(shù)語“非保守取代”用來表示野生型氨基酸殘基被具有不同側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。
令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，即便是Ile 209 Val的保守突變也可對(duì)親果糖表型做出貢獻(xiàn)，其中，前三個(gè)字符代表野生型HXT3蛋白質(zhì)的氨基酸，中間三個(gè)數(shù)字代表蛋白質(zhì)中突變的位置(從Met起始，其氨基酸編號(hào)為001)，后三個(gè)字符代表根據(jù)本發(fā)明的突變的HXT3蛋白的氨基酸。
上面鑒定出了HXT3基因中的大量特定突變，它們可單獨(dú)或組合以利于提高酵母的碳水化合物利用能力。上面鑒定出了HXT3基因中的大量特定突變，它們可單獨(dú)或組合以利于提高酵母的果糖利用能力。此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種突變的HXT3基因可以轉(zhuǎn)移到非親果糖菌株中，由此提高該非親果糖菌株在發(fā)酵期間利用果糖的能力。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)過分離的HXT3基因，其中包含一種或多種突變，所述突變能提高基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力。本發(fā)明還涉及本文中鑒定的由此獲得的特定基因和基因產(chǎn)物，以及包含外源突變HXT3基因的酵母菌株。
在上下文中，術(shù)語“外源”指，在一種生物的基因組中天然不存在，但是通過重組事件、突變事件或其它事件(例如，通過天然選擇或通過育種)由酵母獲得的基因。
在考慮到本發(fā)明公開的主題的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以找到作用相當(dāng)?shù)窃谕蛔兊拇_切數(shù)量和位置上有所不同的等同物。然后可按照實(shí)施例所述對(duì)這些突變體利用果糖的能力加以試驗(yàn)，可以容易地選出具有優(yōu)點(diǎn)的重組體。
或者，可用本領(lǐng)域已知的若干種突變方法向任何給定的酵母菌株的HXT3基因中引入突變，以使得該菌株更為親果糖。合適的酵母菌株的例子是Saccharomyces cerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus、S.paradoxus。酵母的其它屬也可被根據(jù)本發(fā)明的HXT3基因所轉(zhuǎn)化，以增加其碳水化合物發(fā)酵能力，例如，Candida。
此外，技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)，與上述位置鄰近的突變可能產(chǎn)生有用的重組。因此，上文提到的任何突變體HXT3基因都包括在本發(fā)明中。
令人驚奇地，HXT3基因在果糖發(fā)酵中有著重要的作用。
根據(jù)本發(fā)明的突變?cè)试S對(duì)大量的HXT3載體加以改造，以提高在任何給定的酵母菌株中利用果糖的能力。
本發(fā)明還涉及獲得具有親果糖性質(zhì)的酵母細(xì)胞的方法，其中，包含編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的酵母細(xì)胞被改造，使得HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有提高的轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力，所述方法包括如下步驟a)突變HXT3基因b)選擇出具有提高的親果糖性質(zhì)的酵母細(xì)胞。
對(duì)編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因進(jìn)行改造可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的突變或重組技術(shù)來進(jìn)行。它們的組合也是可行的，例如，首先轉(zhuǎn)化基因，然后進(jìn)行誘變或在轉(zhuǎn)化的部分進(jìn)行點(diǎn)突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何進(jìn)行此類突變。誘變被描述于例如WO04/070022中，其可以類似的方式進(jìn)行于Saccharomyces。編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因可以是天然的或重組的。
在任何給定的酵母菌株或在Fermichamp自身中，突變的HXT3基因還可以是過量表達(dá)的。較之“標(biāo)準(zhǔn)”基因的過量表達(dá)，該基因的過量表達(dá)能誘發(fā)更高的發(fā)酵速率。這表明，突變的蛋白質(zhì)在過量表達(dá)時(shí)更有效率。這使得可以通過轉(zhuǎn)移突變的HXT3基因來提高其它酵母對(duì)果糖的利用，如在實(shí)施例中所述。這可以引起經(jīng)濟(jì)方面的很高的興趣，因?yàn)閷?duì)果糖的利用是發(fā)酵終點(diǎn)處發(fā)酵速率的限制性因素。
此外，還發(fā)現(xiàn)，HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)時(shí)，發(fā)酵-糖酵解通量被提高。由兩種基因的過量表達(dá)誘發(fā)的發(fā)酵能力的區(qū)別因此不僅僅局限于對(duì)果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其對(duì)于其它碳水化合物的發(fā)酵來說也是重要的。這可以在很多希望有高發(fā)酵速率的領(lǐng)域找到應(yīng)用，例如乙醇生產(chǎn)和烘焙。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的酵母用于發(fā)酵碳水化合物的用途，更優(yōu)選地，用于發(fā)酵果糖和葡萄糖。本發(fā)明還涉及由根據(jù)本發(fā)明的菌株產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇、葡萄酒、啤酒、清酒、伏特加、金酒(ginever)、龍舌蘭酒。
實(shí)施例實(shí)施例1 菌株和培養(yǎng)條件用于本研究的S.cerevisiae菌株列于表1中。
表1.Saccharomyces cerevisiae菌株
菌株V5從Champagne葡萄酒菌株8130獲得。通過使8130菌株形成孢子隨后分離出抗5-氟乳清酸的ura3突變體來獲得該菌株。
V5 HXT1-7Δ該菌株缺失了HXT3-6-7(缺失范圍位于染色體IV上的1 164 600至1 154 055)(位置根據(jù)Saccharomyces cerevisiae基因組數(shù)據(jù)庫，Stanford)和HXT5-1-4(缺失范圍位于染色體VIII上的296 399至287 180)基因簇。該菌株還缺失HXT2(缺失位于染色體XIII上的288125至289 658位)，導(dǎo)致HXT1至7基因的完全缺失。該菌株不能在葡萄糖或果糖上生長。
于28℃在含有2％葡萄糖或2％麥芽糖的YPD培養(yǎng)基(除了用p4H7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的酵母菌株)上對(duì)酵母菌株進(jìn)行培養(yǎng)(V5 HXT1-7Δ)。為評(píng)估不同整合突變體菌株的生長表型，將它們培養(yǎng)于人造培養(yǎng)基上(0.67％無氨基酸的Yeast Nitrogen Base、25mg/l尿嘧啶(uracile)、5％葡萄糖)。用含有HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的p4H7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的酵母菌株被培養(yǎng)于人造培養(yǎng)基上(如上所述，但不含尿嘧啶)。在人造葡萄汁(MS300)(其中含有100g/l葡萄糖、100g/l果糖和額外的115mg/l甲硫氨酸和25mg/l尿嘧啶(不用于經(jīng)過轉(zhuǎn)化的酵母菌株))上進(jìn)行類似分批釀制葡萄酒的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。該培養(yǎng)基含有大約430mg/l可吸收的氮。將預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞以106細(xì)胞/ml的密度接種到工作體積為1.11、裝備有發(fā)酵鎖的發(fā)酵罐中。發(fā)酵在28℃持續(xù)攪拌(500rpm)下進(jìn)行。上述條件使得發(fā)酵動(dòng)力學(xué)類似于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)葡萄酒的條件。
實(shí)施例2 將HXT3整合進(jìn)V5 HXT1-7Δ菌株通過基因組整合，從V5或Fermichamp獲得的HXT3基因被重新引入到V5 HXT1-7缺失菌株中，引入位點(diǎn)位于它們各自的基因簇的原始位置。使用引物HXT3P1和I2HXT3，通過PCR擴(kuò)增出HXT3基因。在酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，這些PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被用于基因組整合，這允許HXT3基因的單個(gè)拷貝整合到其自身的啟動(dòng)子之后。針對(duì)HXT3，使用C1HXT3ORF和C2HXT3p.引物通過PCR來驗(yàn)證整合的正確性。
所有引物列于表2中。
表2.用于在V5 HXT1-7中整合HXT3的引物
下劃線與HXT7終止子同源；大寫字母與HXT3同源；雙下劃線與p4H7啟動(dòng)子同源；斜體與p4H7終止子同源；加粗與HXT7啟動(dòng)子同源。
實(shí)施例3 構(gòu)建含有HXT3 ORF的p4H7多拷貝質(zhì)粒使用引物HXT3p426和HXT3t426，從V5或Fermichamp菌株的基因組DNA通過PCR擴(kuò)增出HXT3基因。通過在Sacharomyces cerevisiae中進(jìn)行體內(nèi)重組，在Hamacher et al.，2002.Microbiology，vol 148，2783-2788中所述的質(zhì)粒p4H7中克隆HXT3基因。p4H7質(zhì)粒具有截短的HXT7啟動(dòng)子和CYC1終止子。首先用BamH1和EcoR1對(duì)p4H7質(zhì)粒進(jìn)行線性化。引物HXT3p426的5’末端與用BamH1和EcoR1線性化的p4H7質(zhì)粒的BamH1末端(HXT7啟動(dòng)子)同源。引物HXT3t426的5’末端與與用BamH1和EcoR1線性化的p4H7質(zhì)粒的EcoR1末端(終止子側(cè))同源。按照?qǐng)D2所述，將關(guān)于HXT3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和用BamH1和EcoR1線性化的p4H7質(zhì)粒用于酵母。針對(duì)在最小限度培養(yǎng)基(含有葡萄糖作為唯一碳源)上的生長能力對(duì)轉(zhuǎn)化子加以選擇。得到的重組質(zhì)粒具有HXT3 ORF，其位于截短的、不受調(diào)節(jié)的HXT7啟動(dòng)子之后，導(dǎo)致HXT3過量表達(dá)。所有引物都列于表2中。
實(shí)施例4 分析方法監(jiān)測(cè)發(fā)酵通過每20分鐘對(duì)發(fā)酵罐重量損失進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量來測(cè)定CO2釋放。通過對(duì)釋放的CO2進(jìn)行多項(xiàng)式光滑來自動(dòng)計(jì)算CO2產(chǎn)生速率。這種發(fā)酵監(jiān)測(cè)方法提供了高重現(xiàn)性。對(duì)釋放出的總CO2的測(cè)量被用于檢查糖發(fā)酵是否完成。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少重復(fù)兩次，顯示出有代表性的結(jié)果。
監(jiān)測(cè)葡萄糖和果糖消耗發(fā)酵期間，每天取培養(yǎng)基至少兩次，將其離心以去除細(xì)胞，將上清液儲(chǔ)存于-20℃，之后通過HPLC進(jìn)行葡萄糖和果糖測(cè)量。使用裝有Aminex87H柱(Bio-Rad Laboratories)的Hewlet-Packard HP系列1100系統(tǒng)，通過HPLC來分析糖。將發(fā)酵上清液按照1/6稀釋于流動(dòng)相(0.004MH2SO4)中，通過折射儀來檢測(cè)糖。
實(shí)施例5 對(duì)Fermichamp菌株的HXT3基因進(jìn)行序列分析使用引物HXT3P2和HXT3P1(引物如表2所示)，通過PCR來擴(kuò)增HXT3基因。純化之后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示于表3A和3B中。HXT3基因的啟動(dòng)子區(qū)域(-900至1位核苷酸)僅顯示6處突變，而編碼區(qū)域(1至1700位核苷酸)則含有38處突變。與親葡萄糖的野生型菌株S288C相比，這些突變中的十處導(dǎo)致了蛋白質(zhì)序列中的氨基酸變化。這些變化中的大多數(shù)都在包括一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)外部環(huán)的蛋白質(zhì)區(qū)域內(nèi)成簇(

圖1)。大多數(shù)變化是保守取代。來自菌株V5的HXT3基因與S288C看起來相同(Saccharomyces cerevisiae基因組數(shù)據(jù)庫，Stanford)。
表3A.與S288C(和V5)比較，來自Fermichamp的HXT3基因(啟動(dòng)子)中的親果糖性突變。
表3B.與S288C(和V5)比較，來自Fermichamp的HXT3基因(開放讀碼框)中的親果糖性突變。
實(shí)施例6 整合進(jìn)V5HT1-7Δ菌株中的HXT3的表達(dá)通過材料和方法中所述的整合，將來自V5或Fermichamp的HXT3基因引入V5HT1-7Δ菌株。表2中給出了在HTX3基因作進(jìn)行整合的位置細(xì)節(jié)。用含有HXT3基因的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酵母之后，在僅含葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基上直接對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行選擇。
含有整合進(jìn)來的來自V5或Fermichamp的HXT3基因的V5 HXT1-7D被獲得，其被分別命名為V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)和V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)。
針對(duì)發(fā)酵性質(zhì)、發(fā)酵速率和葡萄糖/果糖利用來檢驗(yàn)得到的菌株。V5HXT1-7ΔHXT3(V5)和V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)展示出不同的糖類利用情況(圖3a、3b)。對(duì)果糖和葡萄糖利用的相對(duì)速率不同，表達(dá)來自Fermichamp的HXT3基因的菌株展示出較高的使用果糖的能力。表達(dá)來自Fermichamp的HXT3基因的菌株將葡萄糖/果糖比保持在較高的水平上。
對(duì)發(fā)酵期間比率變化的比較顯示，表達(dá)來自Fermichamp的HXT3基因的菌株展示出與Fermichamp菌株相似的情況，而表達(dá)來自V5的HXT3基因的菌株則展示出“標(biāo)準(zhǔn)的”葡萄糖/果糖曲線，類似于Fermivin(圖3d、3e)。因此，通過表達(dá)Fermichamp HXT3基因，V5 HXT1-7Δ中的Fermichamp果糖利用能力被誘發(fā)。
發(fā)酵速率情況也受表達(dá)的HXT3載體的顯著影響。雖然在發(fā)酵的第一部分沒有觀察到差別，但是當(dāng)表達(dá)來自Fermichamp的基因時(shí)，在發(fā)酵終點(diǎn)獲得了更高的發(fā)酵速率(圖3c)。與之一致地，攜帶該基因的重組子中，發(fā)酵時(shí)間減少。發(fā)酵終點(diǎn)處更好的發(fā)酵速率和在終點(diǎn)處更好地使用果糖(其是存在的主要的糖)的能力一致，也與該后期中的較小葡萄糖/果糖不平衡的現(xiàn)象一致。
實(shí)施例7 HXT3基因過量表達(dá)的作用在V5 HXT1-7Δ過量表達(dá)來自Fermichamp和來自V5的HXT3基因。來自Fermichamp或V5的HXT3基因被引入到多拷貝質(zhì)粒中，這允許相應(yīng)基因的被正調(diào)節(jié)和高表達(dá)(見材料和方法)。
如圖4所示，較之整合的、單拷貝的菌株，HXT3基因的過量表達(dá)不會(huì)顯著改變菌株的果糖/葡萄糖利用。但是，能觀察到果糖利用改進(jìn)的較小程度的增加。
在含有葡萄糖和果糖(50/50)的MS300培養(yǎng)基上，來自V5和Fermichamp的HXT3基因的過量表達(dá)誘發(fā)了非常不同的對(duì)于發(fā)酵速率的作用。較之整合進(jìn)去的單拷貝，來自V5的HXT3基因的過量表達(dá)對(duì)于發(fā)酵速率僅有一點(diǎn)影響(圖5)。來自Fermichamp的HXT3基因的過量表達(dá)則誘發(fā)了發(fā)酵速率的強(qiáng)烈提高以及發(fā)酵時(shí)間的明顯減少。通過過量表達(dá)來自Fermichamp的HXT3基因獲得的發(fā)酵速率比用來自V5的基因所獲得的要高很多。
為研究過量表達(dá)對(duì)發(fā)酵速率的影響是否是由于對(duì)果糖的更好利用，我們?cè)趦H含有葡萄糖或果糖的MS培養(yǎng)基中對(duì)過量表達(dá)HXT3的菌株的發(fā)酵能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。如圖6a、6b所示，來自Fermichamp的HXT3的過量表達(dá)，較之來自V5的基因的過量表達(dá)，誘發(fā)了高得多的發(fā)酵速率，而與被發(fā)酵的糖無關(guān)。較之表達(dá)V5基因的菌株而言，發(fā)酵能力的強(qiáng)烈提高在使用葡萄糖和使用果糖的情況下都能觀察到。由兩種基因的過量表達(dá)誘發(fā)的發(fā)酵能力的區(qū)別因此獨(dú)立于它們轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力。
用純的糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，HXT3基因(在整合的菌株中)的單拷貝表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致相同的情況(圖7a、7b)。當(dāng)僅有果糖存在于培養(yǎng)基中時(shí)，來自Fermichamp的HXT3基因使得發(fā)酵終點(diǎn)有了顯著的改進(jìn)。而使用葡萄糖進(jìn)行糖發(fā)酵時(shí)，兩個(gè)基因間僅能觀察到發(fā)酵情況的輕微變化。這表明，當(dāng)HXT3基因表達(dá)較低時(shí)，發(fā)酵速率的區(qū)別主要是提高的轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力導(dǎo)致的。
實(shí)施例8 評(píng)價(jià)多種突變對(duì)果糖發(fā)酵表型的作用構(gòu)建嵌合的HXT3蛋白通過構(gòu)建表達(dá)嵌合蛋白(含有來自Fermichamp的HXT3序列的部分以及來自標(biāo)準(zhǔn)(V5)HXT3序列的其它部分)的菌株，來展示FermichampHXT3蛋白中若干組突變的作用。
構(gòu)建含有單個(gè)、無活性的HXT3基因的菌株為制造此類嵌合體，構(gòu)建出若干種具有被破壞的HXT3拷貝的酵母菌株。這些菌株是通過將KanMX盒插入到含有來自Fermichamp或來自V5的單個(gè)HXT3基因的菌株之一的HXT3序列中來制得的。此類菌株構(gòu)建的原理展示于圖8中。
通過用含有KanMX基因(側(cè)翼是HXT3 Fermichamp序列)的PCRDNA產(chǎn)物來轉(zhuǎn)化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)，制得菌株V5HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650。該DNA片段是通過PCR擴(kuò)增獲得的，其中使用攜帶有KanMX基因(Güldener et al.，1996.NucleicAcids Res.24，2519-2524)的PUG6質(zhì)粒作為DNA基質(zhì)(DNA matrix)，部分地由標(biāo)準(zhǔn)(V5)HXT3序列編碼，另外的部分由HXT3 Fermichamp序列編碼。這些嵌合HXT3蛋白的表達(dá)使得被轉(zhuǎn)化的酵母能恢復(fù)在葡萄糖上的生長，并針對(duì)在YPD(YP-葡萄糖2％)的生長來進(jìn)行選擇。
表達(dá)嵌合HXT3蛋白的菌株圖11中展示了表達(dá)的嵌合蛋白。
通過用引物IA397-416和IA818-798(表5)，從V5菌株DNA中擴(kuò)增HXT3片段，等同397至818位，并且用PCR產(chǎn)物來轉(zhuǎn)化菌株V5HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650，獲得表達(dá)嵌合HXT3V5TM3-6的菌株。在YPD培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。得到的菌株表達(dá)HXT3蛋白，其序列由Fermichamp HXT3基因編碼，只除了核苷酸397至818位(氨基酸132-272位)是由V5 HXT3序列編碼的。這相應(yīng)于用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸T200和I209去替換Fermichamp HXT3中兩個(gè)突變的氨基酸A200和V209。
通過用引物IIIC973-992和IIIC1232-1213(表5)，從FermichampDNA進(jìn)行對(duì)HXT3片段的PCR擴(kuò)增，等同973至1232位，并且轉(zhuǎn)化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)ΔKanMX1107-1157，獲得表達(dá)嵌合HXT3FmpTM7-9的菌株。在YPD培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。得到的菌株表達(dá)HXT3蛋白，其序列由V5 HXT3基因編碼，只除了核苷酸932至1232位(氨基酸325-410位)是由Fermichamp HXT3序列編碼的。這相應(yīng)于在標(biāo)準(zhǔn)的HXT3序列中引入Fermichamp M388、W389、V392這三處突變的氨基酸。
通過用引物IIID973-992和IIID1 1280-1261(表5)，從FermichampDNA進(jìn)行對(duì)HXT3片段的PCR擴(kuò)增，等同973至1280位，并且轉(zhuǎn)化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)ΔKanMX1107-1157，獲得表達(dá)嵌合HXT3FmpTM7-9L9的菌株。在YPD培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。得到的菌株表達(dá)HXT3蛋白，其序列由V5HXT3基因編碼，只除了核苷酸932至1280位(氨基酸325-427位)是由Fermichamp HXT3序列編碼的。這相應(yīng)于在標(biāo)準(zhǔn)的HXT3序列中引入Fermichamp M388、W389、V392、Q414、N415這五處突變的氨基酸。
表5用于擴(kuò)增HXT3 DNA的引物
通過定點(diǎn)誘變來改變氨基酸在pUC19質(zhì)粒中克隆夾自Fermichamd的HXT3基因用引物BamHXT3ATG_F和HindHXT3STOP_R(表6)，從基因組Fermichamp DNA中通過PCR擴(kuò)增HXT3編碼DNA。這些引物允許對(duì)完整的ORF進(jìn)行擴(kuò)增，并在HXT3序列的5’末端加上了BamHI限制性位點(diǎn)，在3’末端加上了HindIII位點(diǎn)。用BamHI和HindIII限制性酶來消化pUC19 DNA和擴(kuò)增出的HXT3 Fermichamp DNA，純化并用于連接。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化E.coli，DH5a。
定點(diǎn)誘變將攜帶有HXT3基因的重組PUC19質(zhì)粒DNA用于定點(diǎn)誘變。用Stratagene QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖衼磉M(jìn)行定點(diǎn)誘變，其中使用含有想要的突變的兩種互補(bǔ)寡核苷酸引物用于用PfuTruboTM DNA聚合酶進(jìn)行的擴(kuò)增。
寡核苷酸對(duì)FmpT200-F和FmpT200-R(表6)被用于定點(diǎn)誘變，以產(chǎn)生構(gòu)建體HXT3FmpT200。這導(dǎo)致HXT3的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸T200對(duì)Fermichamp HXT3序列的A200進(jìn)行取代(圖12)。
寡核苷酸對(duì)FmpI209-F和FmpI209-R(表6)被用于定點(diǎn)誘變，以產(chǎn)生構(gòu)建體HXT3FmpI209。這導(dǎo)致HXT3的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸I209對(duì)FermichampHXT3序列的V209進(jìn)行取代(圖12)。
使用引物IA 397-416和IA 818-798(表5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到突變的HXT3基因，PCR產(chǎn)物被用于轉(zhuǎn)化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650。在YPD培養(yǎng)基上選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的菌株。獲得兩種菌株。一種表達(dá)構(gòu)建體HXT3FmpT200，被命名為V5 HXT1-7ΔHXT3FmpT200。另一種表達(dá)構(gòu)建體HXT3FmpI209，被命名為V5HXT1-7ΔHXT3FmpI209。
表6.用于在pUC19中克隆HXT3以及用于點(diǎn)突變的引物
大寫字母與HXT3同源；斜體限制性位點(diǎn)；加粗用于氨基酸改變的引入突變。
對(duì)乙醇發(fā)酵期間葡萄糖-果糖利用情況的分析，其中使用表達(dá)嵌合或突變HXT3載體的菌株在于MS300培養(yǎng)基(含有100g/L葡萄糖和100g/L果糖)上進(jìn)行乙醇發(fā)酵期間，對(duì)表達(dá)嵌合及突變HXT3蛋白的菌株的性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)糖利用性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，其被表示為作為發(fā)酵進(jìn)程函數(shù)的葡萄糖/果糖比率發(fā)展圖。
表達(dá)嵌合HXT3V5TM3-6的菌株的葡萄糖-果糖利用情況顯示于圖13中。該菌株顯示了與V5菌株相同的糖利用情況。這表明，從Fermichamp蛋白上除下的氨基酸中的一種或兩種，A200或(和)V209對(duì)于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性質(zhì)來說是重要的。從Fermichamp除掉這兩種突變的氨基酸會(huì)導(dǎo)致果糖利用性質(zhì)的丟失。
表達(dá)嵌合HXT3FmpTM7-9的菌株的葡萄糖-果糖利用情況顯示于圖14中。該菌株顯示了與V5菌株相同的糖利用情況。這表明，F(xiàn)ermichamp的3個(gè)突變的氨基酸M388、W389、V392的引入對(duì)于誘發(fā)Fermichamp HXT3提供的果糖利用性質(zhì)來說是不足夠的。
表達(dá)嵌合HXT3FmpTM7-9L9的菌株的葡萄糖-果糖利用情況顯示于圖15中。該菌株顯示了與V5菌株相同的糖利用情況。這表明，5個(gè)氨基酸M388、W389、V392、Q414、N415單獨(dú)使用對(duì)于誘發(fā)Fermichamp HXT3提供的果糖利用性質(zhì)來說是不夠的。
表達(dá)突變的Fermichamp載體HXT3FmpT200的菌株的葡萄糖-果糖利用情況顯示于圖16中。該菌株顯示了與Fermichamp菌株相同的糖利用情況。這表明，氨基酸A200對(duì)于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性質(zhì)來說是不重要的。
表達(dá)突變的Fermichamp載體HXT3FmpI209的菌株的葡萄糖-果糖利用情況顯示于圖17中。該菌株顯示了與V5菌株相同的糖利用情況。這表明，氨基酸Ile 209的存在對(duì)于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性質(zhì)來說是重要的。
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340 345 350Met Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Phe Gly Val Val Asn Phe355 360 365Phe Ser Thr Cys Cys Ser Leu Tyr Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg370 375 380Asn Cys Leu Leu Tyr Gly Ala Ile Gly Met Val Cys Cys Tyr Val Val385 390 395 400Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly Glu Gly Asn405 410 415Gly Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe Ala Cys Phe420 425 430Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Ala Tyr Val Val435 440 445Ile Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala Met Ser Ile450 455 460Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly Phe Phe Thr465 470 475 480Pro Phs Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met485 490 495Gly Cys Met Val Phe Ala Tyr Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu500 505 510Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Asp Met Tyr Ala Glu Gly515 520 525Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Thr Ser Gln Arg Gly530 535 540Ala Asn Tyr Asp Ala Asp Ala Leu Met His Asp Asp Gln Pro Phe Tyr545 550 555 560Lys Lys Met Phe Gly Lys Lys565
<210>27<211>567<212>PRT<213>突變的HXT3蛋白<400>27Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Ser Glu Asn1 5 10 15Ser Asn Ala Asp Leu Pro Ser Asn Ser Ser Gln Val Met Asn Met Pro20 25 30Glu Glu Lys Gly Val Gln Asp Asp Phe Gln Ala Glu Ala Asp Gln Val35 40 45Leu Thr Asn Pro Asn Thr Gly Lys Gly Ala Tyr Val Thr Val Ser Ile50 55 60Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr65 70 75 80Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phs Leu Arg Arg Phe85 90 95Gly Met Lys His Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Thr100 105 110Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Ile115 120 125Ile Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Lys Met Gly Leu Ile130 135 140Val Val Val Val Ile Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser145 150 155 160Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu165 170 175Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile Ser Glu Val180 185 190
Ala Pro Lys Glu Met Arg Gly Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met195 200 205Val Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe Gly Thr Lys210 215 220Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe225 230 235 240Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val Pro Glu Ser245 250 255Pro Arg Tyr Leu Val Glu Ala Gly Gln Ile Asp Glu Ala Arg Ala Ser260 265 270Leu Ser Lys Val Asn Lys Val Ala Pro Asp His Pro Phs Ile Gln Gln275 280 285Glu Leu Glu Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Arg Ala Ala Gly290 295 300Ser Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Thr Gly Lys Pro Ala Met Phe Lys305 310 315 320Arg Thr Met Met Gly Ile Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly325 330 335Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Val Phe Asn Ala Val Gly340 345 350Met Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Phe Gly Val Val Asn Phe355 360 365Phe Ser Thr Cys Cys Ser Leu Tyr Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg370 375 380Asn Cys Leu Leu Tyr Gly Ala Ile Gly Met Val Cys Cys Tyr Val Val385 390 395 400Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly Glu Gly Asn405 410 415Gly Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe Ala Cys Phe
420 425 430Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Ala Tyr Val Val435 440 445Ile Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala Met Ser Ile450 455 460Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly Phe Phe Thr465 470 475 480Pro Phe Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met485 490 495Gly Cys Met Val Phe Ala Tyr Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu500 505 510Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Asp Met Tyr Ala Glu Gly515 520 525Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Thr Ser Gln Arg Gly530 535 540Ala Asn Tyr Asp Ala Asp Ala Leu Met His Asp Asp Gln Pro Phe Tyr545 550 555 560Lys Lys Met Phe Gly Lys Lys565<210>28<211>1704<212>DNA<213>突變的HXT3基因<400>28atgaattcaa ctccagattt aatatctcca caaaagtcaa gtgagaattc gaatgctgac 60ctgccttcga atagctctca ggtaatgaac atgcctgaag aaaaaggtgt tcaagatgat120ttccaagctg aggccgacca agtacttacc aacccaaata caggtaaagg tgcatatgtc180actgtgtcta tctgttgtgt tatggttgcc ttcggtggtt tcgttttcgg ttgggatact240ggtaccattt ctggtttcgt cgcccaaact gatttcttga gaagattcgg tatgaagcat300aaagatggta gttattattt gtctaaggtt agaactggtt taattgtctc cattttcaac360
attggttgtg ccattggtgg tattattttg gctaaattgg gtgatatgta cggtcgtaaa420atgggtttga ttgtcgttgt tgttatctac atcatcggta ttattattca aattgcatcc480atcaacaaat ggtaccaata tttcatcggt agaattattt ccggtttggg tgttggtggt540attgccgttt tatctcctat gttgatttct gaagtcgctc ctaaggaaat gagaggtact600ttagtctcct gttaccaact gatggttacc ttgggtattt tcttgggtta ctgtaccaac660ttcggtacta agaactactc caactctgtg caatggagag ttccattagg tttgtgtttt720gcctgggctt tgtttatgat cggtggtatg actttcgttc cagaatcccc acgttatttg780gttgaagctg gtcaaattga cgaagcaaga gcatctcttt ccaaagttaa caaggttgcc840ccagaccatc cattcattca acaagagttg gaagttattg aagctagtgt tgaagaagct900agagctgctg gttcagcatc atggggtgag ttgttcactg gtaagccggc catgtttaag960cgtactatga tgggtatcat gatccaatct ctacaacaat tgactggtga taactatttc 1020ttctactatg gtactaccgt ttttaacgct gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct 1080attgttttcg gtgtcgtcaa cttcttctct acttgttgtt ctttgtacac tgtcgatcgt 1140tttggacgtc gtaactgttt gttatatggt gccattggta tggtctgctg ttatgtagtt 1200tacgcttctg ttggtgtcac cagactatgg ccaaatggtg aaggtaatgg ttcatccaag 1260ggtgctggta actgtatgat tgtctttgcc tgtttctata ttttctgttt tgctaccact 1320tgggctccaa ttgcttatgt tgttatttct gaaactttcc cattgagagt caagtctaag 1380gctatgtcta ttgctacagc tgctaattgg ttgtggggtt tcttgattgg tttcttcact 1440ccatttatta ctggtgctat taacttctac tacggttacg ttttcatggg ctgtatggtt 1500ttcgcctact tctacgtttt cttctttgtg ccagaaacta agggtttgac tttggaagaa 1560gtcaatgata tgtacgctga aggtgttcta ccatggaagt ctgcttcatg ggttccaaca 1620tctcaaagag gtgctaacta cgatgctgat gcattgatgc atgatgacca gccattctac 1680aagaaaatgt tcggcaagaa ataa 1704<210>29<211>1704<212>DNA<213>突變的HXT3基因II<400>29atgaattcaa ctccagattt aatatctcca caaaagtcaa gtgagaattc gaatgctgac 60ctgccttcga atagctctca ggtaatgaac atgcctgaag aaaaaggtgt tcaagatgat120
ttccaagctg aggccgacca agtacttacc aacccaaata caggtaaagg tgcatatgtc180actgtgtcta tctgttgtgt tatggttgcc ttcggtggtt tcgttttcgg ttgggatact240ggtaccattt ctggtttcgt cgcccaaact gatttcttga gaagattcgg tatgaagcat300aaagatggta gttattattt gtctaaggtt agaactggtt taattgtctc cattttcaac360attggttgtg ccattggtgg tattattttg gctaaattgg gtgatatgta cggtcgtaaa420atgggtttga ttgtcgttgt tgttatctac atcatcggta ttattattca aattgcatcc480atcaacaaat ggtaccaata cttcatcggt agaattattt ccggtttggg tgttggtggt540attgccgttt tatctcctat gttgatttct gaagtcgctc ctaaggaaat gagaggtgct600ttagtctoct gttaccaact gatggttaca ttgggtattt tcttgggtta ctgtaccaao660ttcggtacta agaactactc caactctgtg caatggagag ttccattagg tttgtgtttt720gcctgggctt tgtttatgat cggtggtatg actttcgttc cagaatcccc acgttatttg780gttgaagctg gtcaaattga cgaagcaaga gcatctcttt ccaaagttaa caaggttgcc840ccagaccatc cattcattca acaagagttg gaagttattg aagctagtgt tgaagaagct900agagctgctg gttcagcatc atggggtgag ttgttcactg gtaagccggc catgtttaag960cgtactatga taggtatcat gatccaatct ctacaacaat tgactggtga taactatttc 1020ttctactatg gtactaccgt ttttaacgct gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct 1080attgttttcg gtgtcgtcaa cttcttctcc acttgttgtt ctctgtacac cgttgaccgt 1140tttggccgtc gtaactgttt gatgtggggt gctgtcggta tggtctgctg ttatgttgtc 1200tatgcttctg ttggagtcac tagattatgg ccaaatggtc aaaacaacgg ctcatccaag 1260ggtgctggta actgtatgat tgtctttgcc tgtttctata ttttctgttt cgctactacc 1320tgggccccaa ttgcttatgt cgttgtttct gaaactttcc cattgagagt caagtctaag 1380gctatgtcta ttgctacagc tgctaactgg atctggggtt tcttgattgg tttcttcact 1440ccatttatta ctggtgctat taacttctac tacggttacg ttttcatggg ctgtatggtt 1500ttcgcctact tctacgtttt cttctttgtg ccagaaacta agggtttgac tttggaagaa 1560gtcaatgata tgtacgctga aggtgttcta ccatggaagt ctgcttcatg ggttccaaca 1620tctcaaagag gtgctaacta cgatgctgat gcattgatgc atgatgacca gccattctac 1680aagaaaatgt tcggcaagaa ataa 1704<210>30<211>567
<212>PRT<213>突變的HXT3蛋白II<400>30Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Ser Glu Asn1 5 10 15Ser Asn Ala Asp Leu Pro Ser Asn Ser Ser Gln Val Met Asn Met Pro20 25 30Glu Glu Lys Gly Val Gln Asp Asp Phe Gln Ala Glu Ala Asp Gln Val35 40 45Leu Thr Asn Pro Asn Thr Gly Lys Gly Ala Tyr Val Thr Val Ser Ile50 55 60Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr65 70 75 80Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe85 90 95Gly Met Lys His Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Thr100 105 110Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Ile115 120 125Ile Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Lys Met Gly Leu Ile130 135 140Val Val Val Val Ile Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser145 150 155 160Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu165 170 175Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile Ser Glu Val180 185 190Ala Pro Lys Glu Met Arg Gly Ala Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met195 200 205
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1.一種經(jīng)過分離的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其功能片段，所述蛋白或其功能片段具有提高的轉(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物的能力。
2.一種經(jīng)過分離的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力相對(duì)于具有SEQ ID NO26的野生型己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力來說有所提高。
3.如權(quán)利要求1-2中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過分離的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有選自由如下物質(zhì)構(gòu)成的組的氨基酸序列-一種序列，來自SEQ ID NO26，并且至少具有選自由Gln 206、Leu 207、Met 208、Ile 209、Thr 210、Leu 211、Gly 212所構(gòu)成的組的位置上的突變，優(yōu)選地，至少具有Ile 209位置上的突變；或者-SEQ ID NO27
4.如權(quán)利要求3所述的經(jīng)過分離的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，額外至少包含選自由Met 324、Leu 388、Tyr 389、Ile 392、Glu 414、Gly 415、Ile449、Leu 471所構(gòu)成的組的位置上的突變；優(yōu)選地，該突變是Met 324Ile、Leu 388 Met、Tyr 389 Trp、Ile 392 Val、Glu 414 Gln、Gly 415 Asn、Ile 449 Val或Leu 471 Ile。
5.一種經(jīng)過分離的核酸序列，編碼如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的HXT3己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的經(jīng)過分離的核酸序列，具有根據(jù)SEQ ID NO28、SEQ ID NO29或其功能同源物的序列。
7.重組酵母細(xì)胞，其經(jīng)過了如權(quán)利要求5-6中任意一項(xiàng)所述的核酸的轉(zhuǎn)化。
8.獲得具有提高的親果糖性質(zhì)的酵母細(xì)胞的方法，其中，包含編碼HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的酵母細(xì)胞被改變，使得所述HXT3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有提高的轉(zhuǎn)運(yùn)果糖的能力，所述方法包括如下步驟a.突變所述的HXT3基因，以及b.選擇出具有提高的親果糖性質(zhì)的酵母細(xì)胞。
9.可通過權(quán)利要求8的方法獲得的酵母細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求7或9中任意一項(xiàng)所述的酵母細(xì)胞，其中，所述酵母是Saccharomyces cerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus或S.paradoxus。
11.如權(quán)利要求9或10中任意一項(xiàng)所述的酵母用于發(fā)酵碳水化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有提高的碳水化合物發(fā)酵能力的酵母菌株，具體而言，涉及用編碼改進(jìn)的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因轉(zhuǎn)化的菌株，更具體地，用突變的HXT3基因轉(zhuǎn)化的菌株。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1902218SQ200480038036
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者帕特瑟·雅克·馬里·佩勒因, 布魯諾·博洛尼丁, 讓-馬里·薩博雷洛勒斯, 卡洛勒·圭勞麥 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司, 法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所