專利名稱：微生物表達(dá)的木聚糖酶及其作為飼料添加劑的用途和其他用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及密碼子最優(yōu)化的木聚糖酶編碼序列和木聚糖酶在微生物和酵母中的表達(dá)。本發(fā)明還涉及使用多拷貝木聚糖酶表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行高水平的蛋白表達(dá)。本發(fā)明也涉及木聚糖酶作為飼料和食物的添加劑的用途。本發(fā)明也涉及這樣的酶的表達(dá)方法，即通過(guò)在對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化的生物體中表達(dá)酶，和不對(duì)相同酶進(jìn)行糖基化的表達(dá)相比，增加了所述酶的耐熱性。此外，本發(fā)明涉及制備飼料、酶飼料添加劑的方法，和減少飼料轉(zhuǎn)化率或增加動(dòng)物的體重增量的方法。
背景技術(shù)：
非淀粉多糖(NSP)涉及雞的谷類飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的易變性，其和消化物的粘性變化關(guān)聯(lián)(Bedford，M.R.&H.L.Classen(1993)″An in vitro Assay for Prediction of Broiler IntestinalViscosity and Growth When Fed Rye-Based Diets in the Presenceof Exogeneous Enzymes″Poult.Sci.72，137-143)。阿拉伯木聚糖是小麥的主要NSP，幾種從木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)和曲霉屬(Aspergillus)產(chǎn)生的商購(gòu)可獲得的木聚糖酶產(chǎn)物已顯示降低消化物的粘性并通常提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(xylo-oligomer)。
木聚糖是通過(guò)β-1，4連接的D-吡喃木糖形成的線性多糖。在谷物中，木聚糖通常含有α-1，2、α-1，3或α-1，2和α-1，3連接的L-阿拉伯糖呋喃糖苷的側(cè)鏈。這些取代木聚糖通常稱作阿拉伯木聚糖。木聚糖酶(例如，內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶，EC3.2.2.8)水解木聚糖中的內(nèi)β-1，4-木糖苷鍵，從而產(chǎn)生更小分子量的木糖寡聚體。
可在例如富含阿拉伯木聚糖和葡糖木聚糖(glucoxylan)的動(dòng)物飼料組合物中、焙烤中、釀造中和在紙漿和紙的應(yīng)用(例如提高紙漿的漂白率)中使用木聚糖酶。當(dāng)加入至含有谷物(例如大麥、小麥、玉米、黑麥、黑小麥(triticale)或燕麥)或谷物副產(chǎn)品的飼料(例如給單胃動(dòng)物包括家禽或豬食用的)時(shí)，半纖維素溶解酶(hemicellulolytic enzyme)提高了植物細(xì)胞壁的分解，導(dǎo)致動(dòng)物更好地利用植物營(yíng)養(yǎng)物。這導(dǎo)致了提高的生長(zhǎng)速率和飼料轉(zhuǎn)化率。同樣，也可減少含有木聚糖的飼料的粘性。
在許多實(shí)際應(yīng)用中，物理?xiàng)l件(例如，溫度和pH)阻礙了木聚糖酶的使用；木聚糖酶必需在其被使用的過(guò)程中的溫度和pH條件下是活性的。使用?；?pelleting)、擠壓擠出(extrusion)或膨脹(expanding)配制商品化飼料包括涉及高溫(70-180℃)的步驟。配制過(guò)程中加入的酶應(yīng)當(dāng)經(jīng)受住這些條件。在另一方面，在動(dòng)物的腸中相應(yīng)的溫度是大約40℃。因此，用于飼料組合物的理想的木聚糖酶應(yīng)當(dāng)經(jīng)受住上述極端溫度。在漂白應(yīng)用中，木聚糖酶的應(yīng)用并非如加入木聚糖酶處理步驟那樣簡(jiǎn)單。因?yàn)槠走^(guò)程，和甚至在漂白過(guò)程中使用的步驟的順序在不同的制漿中都會(huì)不同，因此仍然需要發(fā)現(xiàn)在不同的溫度和pH條件下具有活性的新的木聚糖。
大多數(shù)商購(gòu)獲得的設(shè)計(jì)用于飼料用途的木聚糖酶并不非常耐熱，特別是當(dāng)使用中性或堿性pH條件時(shí)。實(shí)際上，在高于60℃的溫度下木聚糖酶通常是失效或失活的，并且這些酶通常在酸性條件下起作用。一般地，真菌和細(xì)菌的木聚糖酶的物理學(xué)特性存在差異(綜述參見(jiàn)Wong等人，Microbiol.Rev.52305-317(1988))。通常，真菌的木聚糖酶具有大約50℃的最適溫度和具有比細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶更低的最適pH。細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶通常具有50至70℃的范圍內(nèi)最適溫度。許多來(lái)自真菌和細(xì)菌微生物的木聚糖酶已被鑒定和表征。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,437,992；Coughlin，M.P.；Biely，P.等人，“Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichodermareesei Cellulases and Other Hydrolases，”Espoo 1993，P.Souminen和T.Reinikainen(編著)，F(xiàn)oundation for Biotechnicaland Industrial Fermentation Research 8125-135(1993) 和WO03/16654)。特別地，在里氏木霉(T.reesei)中已鑒定了三種特異性的木聚糖酶(XYL-I，XYL-I I和XYL-III)(Tenkanen等人，EnzymeMicrob.Technol.14566(1992)；Torronen等人，Bio/Technology101461(1992)；和Xu等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.49718(1998))。盡管在文獻(xiàn)中已描述了大量的木聚糖酶，但仍存在對(duì)鑒定新的木聚糖酶的需要，所述新的木聚糖酶在應(yīng)用例如涉及動(dòng)物飼料和谷物加工、生物燃料、清潔處理、織物維護(hù)(fabriccare)、化學(xué)藥品、植物加工和紙漿和紙的脫木質(zhì)素(delignifying)和增亮的應(yīng)用中是有效的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了具有SEQ ID NOS1、3、5或7的序列的分離的核酸分子和包含這些序列的表達(dá)盒、載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供了制備耐熱性木聚糖酶的方法，其包括以下步驟在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)含有啟動(dòng)子有效地連接至編碼木聚糖酶的核酸分子的表達(dá)盒，所述木聚糖酶在60℃30分鐘后保持至少40％的活性并在低于pH5.0和高于pH1.5的pH下具有大于400U/mg的比活性。本發(fā)明還提供了制備耐熱性木聚糖酶的方法，其中所述木聚糖酶被糖基化。本發(fā)明也提供了由這些方法產(chǎn)生的分離的耐熱性木聚糖酶。本發(fā)明也提供了包含耐熱性木聚糖酶的酶飼料添加劑和動(dòng)物飼料。本發(fā)明還提供了制備包含耐熱性木聚糖酶的經(jīng)?；膭?dòng)物飼料的方法以及通過(guò)這些方法生產(chǎn)的粒化動(dòng)物飼料。本發(fā)明也提供了降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加動(dòng)物體重增量的方法，其包括用含有降低動(dòng)物中飼料轉(zhuǎn)化率有效量的耐熱性木聚糖酶的動(dòng)物飼料喂養(yǎng)動(dòng)物的步驟。其也提供了提高動(dòng)物飼料的表觀代謝能(apparent metabolizable energy)的方法，其包括用以提高飼料的表觀代射能有效量的一種或多種耐熱性木聚糖酶配制動(dòng)物飼料的步驟。本發(fā)明也提供了提高動(dòng)物飼料或人食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其包括在制備動(dòng)物飼料或人食品的過(guò)程中加入耐熱性木聚糖酶的步驟。
附圖概述

圖1是質(zhì)粒pBCS12771的載體圖譜。
圖2是質(zhì)粒pBCS12772的載體圖譜。
圖3是質(zhì)粒pSYN12773的載體圖譜。
圖4是經(jīng)選擇的木聚糖酶經(jīng)過(guò)18小時(shí)發(fā)酵的氣體產(chǎn)生率的圖表。各點(diǎn)代表6個(gè)觀察的平均值。
圖5是畢赤氏酵母表達(dá)的木聚糖酶PP6002的酶活性對(duì)pH的圖表。
表6是PP6002 Quantum zylanase的熱耐受性的圖表。
圖7是比較各種木聚糖酶的熱穩(wěn)定性和耐熱性的圖表。
序列表簡(jiǎn)述SEQ ID NO1是PP6002的木聚糖酶編碼區(qū)的核苷酸序列(無(wú)kex2蛋白酶切割位點(diǎn)或AvaI限制性位點(diǎn))。經(jīng)最優(yōu)化以在畢赤氏酵母中表達(dá)的密碼子。
SEQ ID NO2是PP6002的木聚糖酶編碼區(qū)的氨基酸序列(也和無(wú)分泌信號(hào)的BD6002相同)。
SEQ ID NO3是PP6016的木聚糖酶編碼區(qū)的核苷酸序列(無(wú)kex2蛋白酶切割位點(diǎn)或AvaI限制性位點(diǎn))。經(jīng)最優(yōu)化以在畢赤氏酵母中表達(dá)的密碼子。
SEQ ID NO4是PP6016的木聚糖酶編碼區(qū)的氨基酸序列(也和無(wú)分泌信號(hào)的BD6016的氨基酸序列相同)。
SEQ ID NO5是PP6407的木聚糖酶編碼區(qū)的核苷酸序列(無(wú)kex2蛋白酶切割位點(diǎn)或AvaI限制性位點(diǎn))。經(jīng)最優(yōu)化以在畢赤酵母中表達(dá)的密碼子。
SEQ ID NO6是PP6407的木聚糖酶編碼區(qū)的氨基酸序列(也和無(wú)分泌信號(hào)的BD6407的氨基酸序列相同)。
SEQ ID NO7是PP7436的木聚糖酶編碼區(qū)的核苷酸序列(不具有kex2蛋白酶切割位點(diǎn)或AvaI限制性位點(diǎn))。經(jīng)最優(yōu)化以在畢赤氏酵母中表達(dá)的密碼子。
SEQ ID NO8是PP7436的木聚糖酶編碼區(qū)的氨基酸序列(也和無(wú)分泌信號(hào)的BD 7436的氨基酸序列相同)。
SEQ ID NO9是包含AvaI限制性位點(diǎn)、kex2蛋白酶切割位點(diǎn)和畢赤氏酵母密碼子最優(yōu)化性木聚糖酶的PP6002的核苷酸序列。
SEQ ID NO10是包含AvaI限制性位點(diǎn)、kex2蛋白酶切割位點(diǎn)和畢赤氏酵母密碼子最優(yōu)化性木聚糖酶的PP6016的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是包含AvaI限制性位點(diǎn)、kex2蛋白酶切割位點(diǎn)和畢赤氏酵母密碼子最優(yōu)化性木聚糖酶的PP6407的核苷酸序列。
SEQ ID NO12是包含AvaI限制性位點(diǎn)、kex2蛋白酶切割位點(diǎn)和畢赤氏酵母密碼子最優(yōu)化性木聚糖酶的PP7436的核苷酸序列。
SEQ ID NO13是木聚糖酶Xy1A1A的核苷酸序列(也稱作無(wú)分泌信號(hào)的BD6002)。
SEQ ID NO14是無(wú)原始分泌信號(hào)序列的木聚糖酶Xy1A1A的氨基酸酸序列(也稱作BD6002)。
SEQ ID NO15是缺少分泌信號(hào)編碼區(qū)的木聚糖酶Xy1A1B的核苷酸序列(全長(zhǎng)序列也稱為BD7436)。
SEQ ID NO16是缺少原始分泌信號(hào)區(qū)的木聚糖酶Xy1A1B的氨基酸序列(BD7436)。
SEQ ID NO17是缺少分泌信號(hào)序列編碼區(qū)的木聚糖酶Xy1A1C的核苷酸序列(全長(zhǎng)序列也稱作BD2230)。
SEQ ID NO18是缺少分泌信號(hào)序列區(qū)的木聚糖酶Xy1A1C的氨基酸序列(BD2230)。
SEQ ID NO19是缺少分泌信號(hào)序列編碼區(qū)的木聚糖酶Xy1A1D的核苷酸序列(全長(zhǎng)序列也稱作BD6016)。
SEQ ID NO20是缺少分泌信號(hào)序列區(qū)的木聚糖酶Xy1A1D的氨基酸序列(BD6016)。
SEQ ID NO21是缺少分泌信號(hào)序列編碼區(qū)的木聚糖酶Xy1A1E的核苷酸序列(全長(zhǎng)序列也稱作BD6407)。
SEQ ID NO22是缺少分泌信號(hào)序列區(qū)的木聚糖酶Xy1A1E的氨基酸序列(BD6407)。
SEQ ID NO23是引物1的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是引物2的核苷酸序列。
SEQ ID NO25是引物3的核苷酸序列。
SEQ ID NO26是引物4的核苷酸序列。
SEQ ID NO27是引物5的核苷酸序列。
SEQ ID NO28是引物6的核苷酸序列。
SEQ ID NO29是引物7的核苷酸序列。
SEQ ID NO30是引物8的核苷酸序列。
SEQ ID NO31是引物9的核苷酸序列。
SEQ ID NO32是引物10的核苷酸序列。
SEQ ID NO33是質(zhì)粒pBCS12771的核苷酸序列。
SEQ ID NO34是質(zhì)粒pBCS12772的核苷酸序列。
SEQ ID NO35是質(zhì)粒pSYN12773的核苷酸序列。
SEQ ID NO36編碼kex2蛋白酶切割位點(diǎn)的核苷酸序列。
SEQ ID NO37是kex2蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸序列。
SEQ ID NO38是編碼啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)α交配因子前原肽分泌信號(hào)肽(pre-pro-peptide secretion signalpeptide)的核苷酸序列。
SEQ ID NO39是啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信號(hào)肽的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及木聚糖酶和其突變體及變體作為動(dòng)物飼料添加劑的用途，和涉及含有木聚糖酶的飼料。
本發(fā)明也涉及使用木聚糖酶提高飼料轉(zhuǎn)化率和/或飼料的表觀代射能的方法。
本發(fā)明提供了提高動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。在該方法中，為了提高飼料營(yíng)養(yǎng)利用度，使用一種或多種木聚糖酶例如Xy1A1A、Xy1A1B、Xy1A1C、Xy1A1D和Xy1A1E(序列分別為SEQ ID NOS13-22)來(lái)配制飼料。所述飼料包括任何谷物，因?yàn)樗泄任锏貏e是小麥、黑麥、黑小麥、稻或玉米都以低于是1.0％、更特別地以低于0.1％w/w的包含率包含木聚糖。使用1至10000U/kg的包含率(inclusion rate)將酶加入飼料?？稍陲暳霞庸ぶ盎蛑髮⒚讣尤腼暳匣蚝?jiǎn)單地加入至未經(jīng)加工的(搗碎的)飼料中，飼料加工包括?；?、膨脹和擠壓擠出，但存在其他的方法。與未添加補(bǔ)充物的飼料相比，這些酶的一種或更多種的加入導(dǎo)致表觀代射能(AME)的增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的降低。
本發(fā)明也提供了制備和使用編碼木聚糖酶的核酸分子(即多核苷酸)的方法。所述木聚糖酶可以是耐熱性的，但其不是必需是耐熱性的。因此，本發(fā)明也涉及制備和使用編碼耐熱性木聚糖酶的核酸分子的方法。耐熱性木聚糖酶包括在大約60℃30分鐘后仍保留至少40％活性和具有高比活性(即，在37℃下和例如pH5.3的酸性pH下至少大約200U/mg)的木聚糖酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，木聚糖酶在70℃30分鐘后保持至少40％的活性，或在80℃30分鐘后保持至少40％的活性，或在85℃30分鐘后保持至少40％的活性。所述方法表達(dá)缺少糖基化的耐熱性木聚糖酶?；蛘?，所述方法包括表達(dá)被宿主糖基化的耐熱性木聚糖酶。
本發(fā)明也提供制備木聚糖酶包括耐熱性木聚糖酶的方法。所述方法包括在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)包含有效地連接至編碼木聚糖酶的核酸分子的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。所述微生物宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞(例如，埃希氏桿菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳芽孢桿菌屬(Lactobacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)、酵母(例如，糖酵母屬(saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)或漢遜氏酵母屬(Hansenula)或真菌(例如曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma))細(xì)胞。特別地，所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤氏酵母。用于制備重組木聚糖酶的微生物細(xì)胞可產(chǎn)生糖基化形式的重組木聚糖酶。
本發(fā)明也提供了制備耐熱性木聚糖酶的方法，其中所述木聚糖酶由SEQ ID NOS1、3、5或7的核苷酸序列編碼。此外，該核酸分子編碼包含木聚糖酶的融合多肽。所述融合蛋白可進(jìn)一步包含有效地連接至木聚糖酶的分泌信號(hào)肽。
本發(fā)明還包含有效地連接至少一個(gè)調(diào)控序列和任選地連接編碼信號(hào)序列的第二多核苷酸的編碼木聚糖酶的多核苷酸，所述調(diào)控序列是例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列或其任何組合，所述信號(hào)序列指導(dǎo)由第一多核苷酸編碼的酶至特定的細(xì)胞區(qū)域例如，細(xì)胞外區(qū)域。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型(條件性)啟動(dòng)子。如此處所描述的，將編碼木聚糖酶的親本多核苷酸的誘變用于制備編碼具有提高的特性(相對(duì)于由親本多核苷酸編碼的木聚糖酶)的木聚糖酶的變體(合成的)DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，就提高的在酸性或堿性pH下的活性、提高的腸穩(wěn)定性或提高的在宿主生物體中的表達(dá)水平對(duì)木聚糖酶進(jìn)行篩選。在另外的實(shí)施方案中，組合許多變體DNA上的突變以制備編碼具有增強(qiáng)的耐熱性和胃穩(wěn)定性和具有相似或更高的比活性(相對(duì)于由親本多核苷酸編碼的木聚糖酶)的合成的多核苷酸?？蓮娜魏蝸?lái)源包括植物、細(xì)菌或真菌的核酸獲得親本多核苷酸，和可用任何方法例如組合誘變、遞歸誘變(recursive mutagenesis)和/或DNA改組來(lái)制備來(lái)自選擇的親本多核苷酸的本發(fā)明的合成的多核苷酸。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的木聚糖酶，耐熱性木聚糖酶具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換，所述替換與在等于或大于60℃的溫度下的活性保持相關(guān)。
在另外的實(shí)施方案中，耐熱性木聚糖酶在大約60℃30分鐘后具有至少40％的活性，或在大約65℃30分鐘后具有至少40％的活性，或在大約70℃30分鐘后具有至少35％的活性，和在37℃和在例如低于pH6.0或在低于pH4.0而高于pH1.5的酸性pH下具有至少400U/mg、更優(yōu)選地至少600U/mg、和/或至少800U/mg的比活性。一個(gè)木聚糖酶單位(XU)是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在37℃、pH5.3下每分鐘從WAXY(小麥阿拉伯木聚糖)釋放1μmol的還原性末端(木糖等同物)的酶量。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了因糖基化而使酶耐熱的方法，其包括在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)酶的步驟。在特定的實(shí)施方案中，所述酶是木聚糖酶。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，分離的核酸分子具有SEQ ID NOS1、3、5或7的序列。本發(fā)明也提供了包含含有SEQ ID NOS1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)盒。所述表達(dá)盒還可包含蛋白水解切割位點(diǎn)例如KEX2蛋白酶切割位點(diǎn)。在更特別的實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒由SEQ ID NOS9、10、11或12的核酸序列編碼。所述表達(dá)盒還可包含編碼分泌信號(hào)肽例如啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信號(hào)的分離核苷酸序列。表達(dá)盒還可包含至少一個(gè)有效地連接至啟動(dòng)子的編碼本發(fā)明的木聚糖酶的核酸分子。
本發(fā)明也提供包含至少一個(gè)SEQ ID NOS1、3、5或7的核酸分子的重組宿主細(xì)胞。所述重組細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞。優(yōu)選地所述宿主細(xì)胞是埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、乳芽孢菌屬、芽孢桿菌屬、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、曲霉屬或木霉屬細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤氏酵母。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含載體pBCS12771、pBCS12772或pSYN12773。優(yōu)選地宿主細(xì)胞是包含載體pSYN12773的巴斯德畢赤氏酵母。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的表達(dá)盒或多核苷酸的載體和包含本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá)盒或載體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞。本發(fā)明的載體可編碼超過(guò)一個(gè)多肽，包括超過(guò)一個(gè)木聚糖酶，或可編碼包含本發(fā)明的木聚糖酶的融合多肽，經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞可包含本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)載體。本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用于制備本發(fā)明的重組木聚糖酶。因此，本發(fā)明提供從本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞中分離的木聚糖酶和通過(guò)合成制備的酶。特別地，所述載體包含稱為pBCS12771(SEQ IDNO33)、pBCS12772(SEQ ID NO34)或pSYN12773(SEQ ID NO35)的質(zhì)粒。
本發(fā)明也提供了由本發(fā)明的方法制備的分離的耐熱性木聚糖酶。此外，分離的耐熱性木聚糖酶被糖基化。
本發(fā)明還提供了用于木聚糖酶、木聚糖酶制劑或經(jīng)配制的酶混合物的配制的方法。包含耐熱性木聚糖酶的飼料添加劑包含本發(fā)明的耐熱性木聚糖酶。飼料添加劑制劑還包含穩(wěn)定化化合物，例如但不限于山梨糖醇(sorbital)。在食物或飼料加工之前、期間或之后，可將重組木聚糖酶或其制劑作為補(bǔ)充物加入至食物或動(dòng)物飼料中或加入至食物和飼料的成分中。優(yōu)選地，在制粒機(jī)(pelletmill)中加熱(例如，蒸汽)處理之前和/或期間將本發(fā)明的重組木聚糖酶加入至飼料成分的混合物中。因此，本發(fā)明包括制備和使用木聚糖酶的方法。
此外，因?yàn)楸景l(fā)明的木聚糖酶能夠經(jīng)受住在飼料配制過(guò)程中在商購(gòu)獲得的制粒機(jī)中遇到的加熱處理步驟，所以本發(fā)明提供了制備動(dòng)物飼料例如包含木聚糖酶的堅(jiān)硬的顆粒狀飼料顆粒的方法。為制備飼料，可將配制的木聚糖酶和飼料成分混合，在制粒機(jī)中調(diào)節(jié)混合蒸氣以使至少50％的經(jīng)預(yù)熱處理的酶活性得以保持，通過(guò)制粒模具(pellet dye)擠壓出飼料。在另外的實(shí)施方案中，在85℃下?；蠡謴?fù)了超過(guò)70％的酶活性，或更優(yōu)選地，在85℃下粒化后恢復(fù)了超過(guò)90％的酶活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在90℃下?；蠡謴?fù)了至少80％的預(yù)處理酶促活性。
因此除了和維生素、礦質(zhì)、其他飼料酶、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品(例如，小麥麥敷(wheat middlings)或玉米面筋粉(corn gluten meal)一起或在其組合物外，木聚糖酶自身可用作動(dòng)物飼料中的補(bǔ)充物。所述酶也可加入搗碎的飼料，即飼料還未通過(guò)制粒機(jī)。
在飼料生產(chǎn)過(guò)程中，例如在加熱處理期間，此時(shí)溫度，如在常規(guī)的?；?，在75至95℃范圍內(nèi)(膨脹是在105-125℃)變化，產(chǎn)生了在飼料中使用木聚糖酶的一些有益方面。這些處理可降低動(dòng)物的消化道中的飼料的粘性。參見(jiàn)Silversides和Bedford，Poultry Sci.781184-1190(1999)。
非耐熱性的木聚糖酶通常在粒化后使用，通常通過(guò)將酶溶液噴灑在經(jīng)粒化的飼料上進(jìn)行使用。與噴灑方法關(guān)聯(lián)的一些問(wèn)題是只有較低百分比的小球與酶接觸，酶只存在于被包被的小球表面，而且需要為飼料粉碎機(jī)(feed mills)投資和操作復(fù)雜的噴霧機(jī)。相反地，本發(fā)明的耐熱性木聚糖酶，可在粒化前加入，從而有利于生產(chǎn)具有提高的酶分布的飼料。此外，包含本發(fā)明的耐熱性木聚糖酶的飼料可具有比用木聚糖酶噴灑的飼料更長(zhǎng)的貨架期，因?yàn)閲姙⑦^(guò)程引入了在貯存期間可支持真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)的水分。目前可通過(guò)用石蠟層包被以將濕汽排除在外來(lái)制備不耐熱的木聚糖酶，以使其經(jīng)受住較高的加工溫度。但是該方法較昂貴并且降低了在經(jīng)較低溫度粒化的飼料或搗碎的飼料中產(chǎn)物的功效，因?yàn)樵趯?dǎo)入動(dòng)物的消化道后，石蠟包衣緩慢地釋放酶。
因此本發(fā)明提供了制備動(dòng)物飼料的方法，其包括提供包含一種或多種飼料成分和包含本發(fā)明的木聚糖酶例如耐熱性木聚糖酶的制劑的混合物，和在合適的溫度和濕度條件下處理所述混合物以使存在于所述混合物中的木聚糖水解。還提供了通過(guò)該方法制備的動(dòng)物飼料。所述動(dòng)物飼料包括但不限于家禽飼料、豬飼料或反芻動(dòng)物飼料。
還提供了制備用于飼料制劑的包含木聚糖酶的組合物的方法，其包括將含有本發(fā)明的耐熱性木聚糖酶液體溶液和粉例如大豆粉混合以產(chǎn)生混合物；和干燥所述混合物以產(chǎn)生干燥的組合物?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的技術(shù)(包括但不限于凍干和/或加熱)實(shí)現(xiàn)干燥所述混合物。
本發(fā)明還提供了方法，在所述方法中加熱處理包含動(dòng)物飼料成分和含有本發(fā)明的木聚糖酶的制劑的混合物，從而產(chǎn)生經(jīng)熱處理的動(dòng)物飼料混合物。也提供了通過(guò)所述方法制備的經(jīng)熱處理的動(dòng)物飼料。木聚糖酶制劑可以是液體或固體制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含本發(fā)明的液體溶液和大豆粉組合以產(chǎn)生混合物，然后凍干所述混合物?；旌衔镆部砂辽僖环N維生素、礦質(zhì)、非木聚糖酶的酶、有機(jī)酸、益生菌產(chǎn)物、精油(essential oil)或谷物加工的副產(chǎn)品?？赏ㄟ^(guò)例如將經(jīng)熱處理的飼料通過(guò)制粒機(jī)擠壓產(chǎn)生?；膭?dòng)物飼料來(lái)進(jìn)一步加工經(jīng)熱處理的飼料。也提供了包含本發(fā)明的木聚糖酶的動(dòng)物飼料組合物，和包含該酶的酶飼料添加劑或食品添加劑。
本發(fā)明還提供了經(jīng)粒化的動(dòng)物飼料。在一個(gè)實(shí)施方案中，在制粒機(jī)中，在大約85℃下用蒸汽處理經(jīng)?；膭?dòng)物飼料，這樣超過(guò)70％的經(jīng)預(yù)熱處理的酶促活性得到保持，并通過(guò)pellet dye擠壓飼料。在另外的實(shí)施方案中，經(jīng)粒化的動(dòng)物飼料在制粒機(jī)中在大約90℃下經(jīng)蒸汽處理，這樣至少80％的經(jīng)預(yù)熱的酶促活性得到保持，并通過(guò)pellet dye擠壓出飼料。
還提供了降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加動(dòng)物的體重增量的方法，其包括以降低動(dòng)物中飼料轉(zhuǎn)化率和增加動(dòng)物的體重增加的有效量給動(dòng)物喂食包含本發(fā)明的耐熱性木聚糖酶的飼料。
本發(fā)明提供了提高動(dòng)物飼料或人食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。所述方法包括在動(dòng)物飼料或人食品制備過(guò)程中加入本發(fā)明的木聚糖酶的步驟。也提供了制備人食品的方法，其包括提供食品成分和包含本發(fā)明的木聚糖酶的制劑的混合物；和在有利于木聚糖水解的合適的溫度和濕度條件下處理所述混合物。
本發(fā)明也提供了提高動(dòng)物飼料的表觀代謝能(AME)的方法，其包括這樣的步驟，即以提高飼料的表觀代謝能的有效量的本發(fā)明的一種或多種的耐熱性木聚糖酶和動(dòng)物飼料一起配制動(dòng)物飼料的步驟。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的動(dòng)物包括多胃動(dòng)物例如小牛(calf)和單胃動(dòng)物包括但不限于豬、家禽(例如，雞、火雞、鵝、鴨、野雞、松雞(grouse)、鵪鶉(quail)和駝鳥(niǎo))、馬、綿羊(ovine)、公山羊(caprine)、犬科動(dòng)物(canine)和貓科動(dòng)物(feline)以及魚(yú)和甲殼類動(dòng)物(crustaceans)。此外，反芻動(dòng)物例如母牛也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。以大約1至10000U/kg，更優(yōu)選地50至5000U/kg或200至3,200U/kg的包含率將木聚糖加入飼料或食品。
木聚糖酶和上述的酶混合物基本上可加入至所有的飼料中。合適的和優(yōu)選的例子是遵守飼料立法條款的飼料，例如完全飼料、補(bǔ)充物飼料和礦質(zhì)飼料。
本發(fā)明是提高動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。在該方法中，為了提高飼料營(yíng)養(yǎng)利用度，用一種或多種酶例如Xy1A1A、Xy1A1B、Xy1A1C、Xy1A1D和Xy1A1E配制飼料。所述飼料可由任何谷物組成，因?yàn)樗泄任锾貏e是小麥、黑麥、黑小麥、稻或玉米以低于1.0％、更特別地低于0.1％w/w的包含率包含木聚糖。使用1至10000U/kg的包含率將酶加入該飼料?？稍陲暳霞庸で盎蚱陂g將酶加入飼料或簡(jiǎn)單地加入至未經(jīng)加工的(搗碎的)的飼料中，所述飼料加工包括?；⑴蛎浐蛿D壓，當(dāng)然也存在其他方法。與未經(jīng)補(bǔ)充的飼料相比，也和用目前商購(gòu)可獲得的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶補(bǔ)充的飼料相比，這些酶中的一種或多種的添加導(dǎo)致飼料表觀代謝能(AME)的增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的降低。
施用的酶在0.01至10,000ppm的范圍內(nèi)，或可選擇地在20至1000ppm的范圍之內(nèi)。木聚糖酶產(chǎn)物的活性通常以單位(U)表示。
按重量計(jì)算以合適的比例通過(guò)分批方式將單獨(dú)的或混合物中的酶產(chǎn)物與飼料混合。在該上下文中，在飼料中均勻地分配活性物質(zhì)是非常重要的。
含有木聚糖酶的飼料可用于喂養(yǎng)所有家畜，但對(duì)喂養(yǎng)用于食品生產(chǎn)的農(nóng)業(yè)家畜特別是broiler、火雞、豬和牛尤其有利。
飼料中酶產(chǎn)物或混合物的加入在其利用度上產(chǎn)生相當(dāng)大的提高并且與之關(guān)聯(lián)的是家畜生長(zhǎng)的提高。與具有抗生素活性的添加劑相比，其作為飼料添加劑的用途具有巨大的有利方面，即在長(zhǎng)期使用后沒(méi)有抗性發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
其他用途本發(fā)明的木聚糖酶可用于其他木聚糖被使用的任何用途，例如但不限于谷物加工、生物燃料、清潔處理、織物維護(hù)(fabric care)、化學(xué)藥品、植物加工和紙漿和紙的脫木素(delignifying)和增亮。
本發(fā)明的構(gòu)建體和宿主細(xì)胞本發(fā)明優(yōu)選地提供這樣的表達(dá)盒，即其包含能夠指導(dǎo)編碼木聚糖酶的多核酸在體外或體內(nèi)表達(dá)的核酸序列(啟動(dòng)子)。用于制備和/或鑒定木聚糖酶的方法包括誘變例如recursive誘變、和/或選擇或篩選，例如，選擇或篩選在高于60℃的溫度下具有活性的木聚糖酶。用于誘變和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見(jiàn)，例如，Kunkel，1985；Kunkel等人，1987；美國(guó)專利號(hào)4,873,192；Walker和Gaastra，1983和其中引用的參考文獻(xiàn)；和Arnold等人，1996。
A.用于轉(zhuǎn)化的DNA和宿主細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)和分離的核酸分子通常包含木聚糖酶編碼核酸分子和其他核酸分子，例如想要導(dǎo)入細(xì)胞的cDNA、基因。這些核酸構(gòu)建體還可包含這樣的核酸分子例如想要的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多接頭或甚至調(diào)控基因。經(jīng)選擇用于細(xì)胞導(dǎo)入的核酸分子或基因中的一個(gè)通常編碼在所得的轉(zhuǎn)化(重組的)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，這將產(chǎn)生可篩選或可選擇的性狀和/或其將給所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供提高的表型。然而，情況可能并不總是這樣，因而本發(fā)明也包含整合了非表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
用于導(dǎo)入細(xì)胞的分離核酸分子包含來(lái)自于任何來(lái)源或從任何來(lái)源分離的核酸，然后就結(jié)構(gòu)、大小和/或功能對(duì)所述核酸進(jìn)行表征，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改變，然后導(dǎo)入細(xì)胞?！皝?lái)自”于某一來(lái)源的分離核酸分子的例子是這樣的核酸序列，即其在給定的生物中被鑒定為有用的片段，然后以基本純的形式經(jīng)化學(xué)合成。這種從某一來(lái)源“分離”的核酸分子的例子是通過(guò)化學(xué)方法，例如通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶從所述來(lái)源切割或移取的有用的核酸序列，這樣通過(guò)基因工程，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行操作例如擴(kuò)增，以用于本發(fā)明。這樣的核酸分子通常稱作“重組體”。因此有用的核酸分子包含完全合成的核酸分子、半合成的核酸分子、從生物學(xué)來(lái)源分離的核酸分子和來(lái)源于經(jīng)導(dǎo)入的RNA的核酸分子。一般地，導(dǎo)入的核酸分子不是原來(lái)就存在于作為所述核酸分子的受體的基因型中，但從給定的基因型中分離基因，然后將該基因的多拷貝導(dǎo)入相同的基因型例如以增加給定的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
導(dǎo)入的核酸分子包括但不限于從基因例如來(lái)自細(xì)菌、酵母、真菌或病毒的基因分離的核酸分子。導(dǎo)入的核酸分子包括經(jīng)修飾或合成的基因、基因的部分或嵌合基因，包括來(lái)自相同或不同基因型的基因。術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”或“嵌合核酸分子”定義為包含至少兩個(gè)核酸序列或片段的基因或核酸分子序列或片段，所述的至少兩個(gè)核酸序列或片段來(lái)自在天然狀況下不組合核酸的物種，或所述核酸序列或片段以一般在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的天然基因組中不發(fā)生的方式被定位和連接。
用于此處轉(zhuǎn)化的被導(dǎo)入的核酸分子是環(huán)形的或線性的、雙鏈的或單鏈的。一般地，分離的核酸分子以嵌合DNA例如質(zhì)粒DNA的形式存在，所述嵌合DNA也可包含側(cè)翼連接有調(diào)控序列的編碼區(qū)，所述調(diào)控序列提高存于轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的重組DNA的表達(dá)。例如，核酸分子包含或由在細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子構(gòu)成，其來(lái)源于并非該細(xì)胞的某一來(lái)源，或可利用已存在于作為轉(zhuǎn)化靶的細(xì)胞中的啟動(dòng)子。
一般地，導(dǎo)入的核酸分子相對(duì)較小，即小于大約30kb，從而使對(duì)物理、化學(xué)或酶促降解的任何易感性降至最低，已知該降解隨著核酸分子的大小增加而增加。通常預(yù)先選擇和確定被導(dǎo)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)、RNA轉(zhuǎn)錄物或其混合物的數(shù)目，例如可形成從1至大約5-10個(gè)這樣的導(dǎo)入的DNA的產(chǎn)物。
合適的表達(dá)載體的選擇依賴于宿主細(xì)胞。一般地，表達(dá)載體包含(1)編碼細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)的原核核酸分子元件和抗生素抗性基因以進(jìn)行表達(dá)載體在細(xì)菌宿主中的擴(kuò)增和選擇；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的核酸分子例如啟動(dòng)子；(3)控制轉(zhuǎn)錄物加工的核酸分子例如內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷?；蛄校缓?4)有效地連接至控制轉(zhuǎn)錄起始的核酸分子的目的核酸分子或基因。在特定的實(shí)施方案中，木聚糖酶基因和可操作元件不會(huì)在宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。使用的表達(dá)載體可以是能夠在上述宿主中自主復(fù)制或能夠整合入染色體中的載體，可以是原先在能夠使連接的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上就含有啟動(dòng)子的載體。
如果原核生物例如細(xì)菌被用作宿主，用于木聚糖酶的表達(dá)載體優(yōu)選地是能夠在微生物中自主自制和包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、新的木聚糖基因和轉(zhuǎn)錄終止序列的載體。所述載體也可以含有調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的基因。
酵母或真菌表達(dá)載體可包含復(fù)制起始位點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，還有任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷?；稽c(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼連接的非轉(zhuǎn)錄序列。
合適的載體包括例子對(duì)于細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；對(duì)于真核細(xì)胞pXT1、pSG5(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。這些商購(gòu)可獲得的載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEMI(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)。然而，可使用任何其他的質(zhì)?；蜉d體，只要其可在宿主中復(fù)制和存活。
可能提到的合適的宿主的代表性例子細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；和埃希氏菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)內(nèi)的不同種，盡管也可將其他細(xì)菌用作選擇的宿主；屬于曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、鏈孢霉屬(Neurospora)、毛霉菌屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)等屬的真菌細(xì)胞，例如屬于克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬等的酵母。
根據(jù)現(xiàn)有內(nèi)容(參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press，1989；Gelvin等人，Plant MolecularBiology Manual，1990)，可于本發(fā)明使用的載體的構(gòu)建對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。本發(fā)明的表達(dá)盒可包含一個(gè)或多個(gè)這樣的限制性位點(diǎn)，即其可使編碼木聚糖酶的多核苷酸置于調(diào)控序列的調(diào)控之下。表達(dá)盒也可包含有效地連接至多核苷酸的終止信號(hào)和所述多核苷酸的正確轉(zhuǎn)錄所需要的調(diào)控序列。含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)盒可以是嵌合型的，即其組分中的至少一個(gè)對(duì)于其他組分中的至少一個(gè)是異源的。表達(dá)盒中多核苷酸的表達(dá)可在組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、受調(diào)控的啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子或合成的啟動(dòng)子的控制之下。
表達(dá)盒可在轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向上包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、本發(fā)明的多核苷酸和在體內(nèi)和/或體外起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)對(duì)于錄起始區(qū)可以是天然的，對(duì)于多核苷酸可以是天然的，或可來(lái)源于另外的來(lái)源。調(diào)控序列可位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部(內(nèi)含子)、或下游(3’非編碼序列)，并影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，和/或相關(guān)編碼序列的翻譯。調(diào)控序列可包括但不限于增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、阻抑物結(jié)合位點(diǎn)、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷化信號(hào)序列。其可包括天然和合成的序列以及可作為合成的和天然的序列的組合的序列。
用于本發(fā)明的載體也可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
B.調(diào)控序列啟動(dòng)子是通過(guò)為RNA聚合酶和其他正確轉(zhuǎn)錄所需要的因子提供識(shí)別來(lái)控制編碼序列表達(dá)的核苷酸序列。啟動(dòng)子包括最小啟動(dòng)子和/或起始區(qū)，所述最小啟動(dòng)子僅由轉(zhuǎn)錄起始所需要的所有基本元件例如TATA盒構(gòu)成，所述起始區(qū)是包含TATA盒和用作確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的其他序列的短DNA序列，其是加入了調(diào)控元件以控制表達(dá)的區(qū)域。啟動(dòng)子可完全來(lái)源于天然的基因，或由來(lái)源于天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至由合成的DNA片段組成。啟動(dòng)子可含有參與蛋白因子的結(jié)合的DNA序列，所述蛋白因子控制響應(yīng)生理學(xué)或發(fā)育狀況的轉(zhuǎn)錄起始的效率。啟動(dòng)子也可包含最小啟動(dòng)子加能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的元件。該類型的啟動(dòng)子序列包含鄰近的和更遠(yuǎn)的元件，后一種元件通常稱作增強(qiáng)子。
啟動(dòng)子的代表性例子包括但不限于已知的在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。特定的細(xì)菌啟動(dòng)子包括大腸桿菌的lac或trp、噬功體λPL、lacI、lacZ、T3、T7、gpt和λPR啟動(dòng)子。
任何能夠在酵母宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子可用作啟動(dòng)子。其例子包括糖酵解途徑中的己糖激酶等基因的啟動(dòng)子，和啟動(dòng)子例如gal 1啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱激蛋白啟動(dòng)子、MFa-1啟動(dòng)子和CUP1啟動(dòng)子。
可使用任何能夠在絲狀真菌中表達(dá)的啟動(dòng)子。例子是由淀粉或纖維素強(qiáng)烈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如葡糖淀粉酶或來(lái)自曲霉屬的淀粉酶或來(lái)自木霉屬的纖維素酶(cellobiohydrase)的啟動(dòng)子、糖酵解途徑中的酶例如磷酸甘油酸激酶(pgk)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)等的啟動(dòng)子。
用于表達(dá)的控制的兩個(gè)主要方法是已知的，即過(guò)量表達(dá)和下調(diào)表達(dá)(under-expression)。通過(guò)一個(gè)或超過(guò)一個(gè)額外拷貝的經(jīng)選擇的基因可實(shí)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)。對(duì)于下調(diào)表達(dá)，存在兩個(gè)主要的方法，其在本領(lǐng)域通常被稱為“反義下調(diào)”和“有意下調(diào)”。通常這些方法被稱為“基因沉默”。這兩種方法都導(dǎo)致靶基因表達(dá)的抑制。
幾種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是已知的。許多啟動(dòng)子描述于Gatz的綜述中，(Curent Opinion in Biotech.7(2)168-172(1996)(也參見(jiàn)Gatz，Annual Rev.Plant.Physiol.and Plant Mol.Biol.4889-108，1997)。例子包括四環(huán)素阻抑物系統(tǒng)、Lac阻抑物系統(tǒng)、銅誘導(dǎo)的系統(tǒng)、水楊酸誘導(dǎo)的系統(tǒng)(例如PRla系統(tǒng))、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的(Aoyama T.等人，Plant Journal 11(3)605-612，1997)和蛻皮素誘導(dǎo)的系統(tǒng)。還包括苯磺胺誘導(dǎo)的系統(tǒng)(美國(guó)專利號(hào)5,364,780)、乙醇誘導(dǎo)的(WO 97/06269和WO 97/06268)誘導(dǎo)系統(tǒng)和谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子。
嵌合型反式作用病毒復(fù)制蛋白的受控表達(dá)可進(jìn)一步由其他的基因策略調(diào)控。例如，如Odell等人，(Molecular and General Genetics223369-3781990)描述的Cre介導(dǎo)的基因激活。因此，含有由啟動(dòng)子和復(fù)制蛋白編碼序列之間的lox位點(diǎn)結(jié)合的3’調(diào)控序列的DNA片段可由Cre介導(dǎo)的切割除去并導(dǎo)至反式作用復(fù)制基因的表達(dá)，所述DNA片段阻止嵌合型復(fù)制基因從啟動(dòng)子的表達(dá)。在該情況下，嵌合型Cre基因，嵌合型反式作用復(fù)制基因或兩者都可在發(fā)育特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。可選擇的基因策略是使用tRNA抑制子基因。例如，tRNA阻抑物基因的受控表達(dá)可條件性地控制反式作用復(fù)制蛋白編碼序列的表達(dá)，所述編碼序列含有合適的終止密碼子，如Ulmasov等人，PlantMol.Biol.35(4)417-424，1997所描述的。此外，嵌合型tRNA阻抑物基因、嵌合型反式作用復(fù)制基因或兩者都可在發(fā)育特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。
除了使用特定的啟動(dòng)子以外，其他類型的元件也可影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。特別地，已證明內(nèi)含子具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的潛能。
其他元件包括可被內(nèi)源或外源性因子例如被鋅指蛋白(包括天然發(fā)生的鋅指蛋白或嵌合的鋅指蛋白)調(diào)控的元件。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,789,538、WO 99/48909；WO 99/45132；W0 98/53060；WO98/53057；WO 98/53058；WO 00/23464；WO 95/19431和WO 98/54311。
增強(qiáng)子是能夠刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，其可以是啟動(dòng)子的固有元件或是經(jīng)插入以增強(qiáng)特定啟動(dòng)子的水平或組織特異性的異源性元件。增強(qiáng)子能夠從兩個(gè)方向(相對(duì)于目的基因編碼序列5′至3′和3′至5′)起作用，并且即使在被移至所述啟動(dòng)子的上游或下游時(shí)仍能發(fā)揮功能。增強(qiáng)子和其他上游啟動(dòng)子元件都結(jié)合介導(dǎo)其功能的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。
可構(gòu)建用于本發(fā)明的載體使其包含增強(qiáng)子元件。本發(fā)明的構(gòu)建體也包含目的基因和3’末端DNA序列，所述3′末端DNA序列用作終止轉(zhuǎn)錄和使所得的mRNA腺苷?；男盘?hào)。
因?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列的起始位點(diǎn)之間的DNA序列即非翻譯前導(dǎo)序列可影響基因的表達(dá)，所以也可希望使用特定的前導(dǎo)序列。優(yōu)選的前導(dǎo)序列預(yù)期包含這樣的序列，即其包含經(jīng)預(yù)測(cè)指導(dǎo)被連接的基因最優(yōu)化表達(dá)的序列，即包含可增加或保持mRNA穩(wěn)定性和阻止不恰當(dāng)?shù)姆g起始的優(yōu)選的一致性前導(dǎo)序列。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，這些序列的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
C.標(biāo)記基因?yàn)榱颂岣哞b定轉(zhuǎn)化子的能力，除了可表達(dá)的目的基因外，人們可能希望使用可選擇的或可篩選的標(biāo)記基因或使用其作為目的基因?！皹?biāo)記基因”是給表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞提供不同表型從而使該經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞區(qū)別于不具有該標(biāo)記的細(xì)胞的基因。這些基因可編碼可選擇的或可篩選的標(biāo)記物，依賴于所述標(biāo)記物是否可提供可通過(guò)化學(xué)方法即通過(guò)使用選擇性試劑(例如，抗生素等)進(jìn)行選擇的性狀，或其是否僅是個(gè)可通過(guò)觀察或檢測(cè)例如通過(guò)‘篩選’來(lái)鑒定的性狀。當(dāng)然，許多合適的標(biāo)記基因的例子在本領(lǐng)域是已知的并且可用于本發(fā)明的實(shí)踐。
術(shù)語(yǔ)可選擇或可篩選的標(biāo)記基因還包括編碼“可分泌的標(biāo)記物”的基因，可檢測(cè)所述標(biāo)記物的分泌，作為鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。例子包括這樣的標(biāo)記，即其編碼分泌性抗原或甚至分泌性酶，所述抗原可通過(guò)抗體相互作用被鑒定，所述分泌性酶可通過(guò)其催化活性被檢測(cè)。分泌蛋白分成許多種類，包括可通過(guò)例如ELISA檢測(cè)的小的、可擴(kuò)散的蛋白和可在細(xì)胞外溶液中被檢測(cè)的小的活性酶。
用于原核生物的選擇標(biāo)記包括四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性基因。可使用的篩選標(biāo)記包括但不限于編碼酶的b-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，所述酶的各種產(chǎn)色底物是已知的；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75(8)3737-3741，1978)，其編碼各種產(chǎn)色底物(例如，PADAC，產(chǎn)色的頭孢菌素)是已知的酶；xy1E基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA801101，1983)，其編碼可轉(zhuǎn)化產(chǎn)色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，Bio-technology 8(3)241-242，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，J.General Microbiol.129(Pt.9)2703-14，1983)，其編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸蒁OPA和多巴醌的酶，多巴醌最終縮合(condenses)形成容易檢測(cè)的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其編碼酶，對(duì)于所述酶存在其產(chǎn)色底物；螢光素酶(lux)基因(Ow等人，Scienoe 234856-859，1986)，其使得能夠進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)(bioluminescenoe detection)；或甚至水母發(fā)光蛋白基因(Prasher等人，Biochem Biophys Res Commun.126(3)1259-68，1985)，其可用于鈣敏感性生物發(fā)光檢測(cè)，或綠色熒光蛋白(Niedz等人，Plant Cell Reports 14(7)403-406，1995)。選擇標(biāo)記也可以是負(fù)選擇標(biāo)記例如但不限于，將基因轉(zhuǎn)入基因型為ura3-的生物體中并在培養(yǎng)基中使用ura3系統(tǒng)+/-5FOA，+/-尿嘧啶。
轉(zhuǎn)化可將表達(dá)盒或含有所述表達(dá)盒的載體構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞?？梢杂坞x的方式攜帶表達(dá)盒或表達(dá)載體或?qū)⑵湔先爰?xì)胞的基因組中，例如，SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒、酵母質(zhì)粒；來(lái)源于質(zhì)粒和噬菌體DNA的載體、病毒(例如牛痘病毒(vaccinia)、腺病毒(adenovirus)、禽痘病毒(fowl pox virus)和偽狂犬病病毒(pseudorabies))DNA。然而，可使用任何載體，只要其在宿主中可復(fù)制和可存活。
用于將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞宿主的許多技術(shù)是可獲得的并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知?？赏ㄟ^(guò)使用聚乙二醇、氯化鈣、病毒感染、DEAE葡聚糖、噬菌體感染、電穿孔和本領(lǐng)域已知的其他方法實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。真菌的轉(zhuǎn)化，特別是畢赤氏酵母屬的轉(zhuǎn)化，可按照Methods Mol.Biol.，Higgins，David R.and Cregg，James M.；Eds.(Humana，Totowa，N.J.)(1998)中的“畢赤氏酵母方案”來(lái)進(jìn)行。將重組載體導(dǎo)入酵母可通過(guò)包括電穿孔、使用原生質(zhì)球、醋酸鋰等方法實(shí)現(xiàn)?？墒褂萌魏文軌?qū)NA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法例如，電穿孔、磷酸鈣、脂轉(zhuǎn)染法(lipofection)等。
重組酶為了重組木聚糖酶的制備，在轉(zhuǎn)化合適的宿主(例如細(xì)菌或酵母宿主)菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，可通過(guò)合適的方法(例如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)經(jīng)選擇的啟動(dòng)并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間以產(chǎn)生重組酶。然后通常通過(guò)離心收集細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)的方法破壞細(xì)胞，并保留所得的粗提取物以進(jìn)一步純化。或者，可將重組蛋白作為融合物(融合至有利于重組蛋白從宿主細(xì)胞外運(yùn)信號(hào)肽)生產(chǎn)。在該情況下，通過(guò)離心收集細(xì)胞并保留上清液。然后從上清液中純化重組蛋白。
可通過(guò)任何方便的方法破壞用于蛋白表達(dá)的微生物細(xì)胞，其包括凍-融循環(huán)、超聲、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
可通過(guò)這些方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化酶，所述方法括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽(yáng)離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性相互作用層析法、親和層析法、羥基磷灰石層析法和外源凝集素層析法。在完成成熟蛋白的構(gòu)型中，如果需要，可使用蛋白重折疊方法。最后，可使用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的酶可以是化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或可通過(guò)重組技術(shù)從微生物(例如通過(guò)培養(yǎng)中的細(xì)菌、酵母和真菌細(xì)胞)宿主中產(chǎn)生。依賴于重組體生產(chǎn)過(guò)程中使用的宿主，本發(fā)明的酶可以是或不是通過(guò)糖基化共價(jià)修飾的。在真核生物細(xì)胞中，分泌蛋白的糖基化起著調(diào)節(jié)蛋白折疊、構(gòu)象和熱穩(wěn)定穩(wěn)定性以及對(duì)蛋白質(zhì)水解的抗性的作用。給定木聚糖酶的用途的特定用途，酶的糖基化形式可優(yōu)于非糖基化的形式。例如，在動(dòng)物飼料中使用糖基化的木聚糖酶可在飼料的?；陂g幫助保護(hù)酶免受熱變性和當(dāng)其通過(guò)動(dòng)物的胃時(shí)保護(hù)其免受蛋白水解失活，幫助將有活性的酶遞送至腸道和作用位點(diǎn)。對(duì)于在只在加工過(guò)程中而不是在最后的產(chǎn)物中想要酶的活性的食品加工應(yīng)用中，非糖基化、不耐熱的和易受蛋白水解的木聚糖酶是優(yōu)選的。通過(guò)在各種微生物宿主中產(chǎn)生本發(fā)明的木聚糖酶，耐熱性和對(duì)蛋白水解降解的易感性都被改變了。
本發(fā)明的酶可用于任何目的，在所述目的中這樣的酶的活性是必需的或想要的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶用于在動(dòng)物飼料中催化木聚糖的水解。在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶用于在食品中催化木聚糖的水解。
木聚糖酶組合物一般地，木聚糖酶組合物是液體或干燥的。液體組合物不必含有木聚糖酶以外的任何物質(zhì)，優(yōu)選地其以高度純化的形式存在以外的任何物質(zhì)。盡管這樣，還可加入穩(wěn)定劑例如甘油、山梨糖醇或單丙二醇。液體組合物也可包含其他添加劑，例如鹽、糖類、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑和蛋白。典型的液體組合物是含水的或基于油的漿液?？扇芜x地在食品或飼料粒化之前或之后，將液體組合物加入其中。
干燥組合物可以是凍干的或噴霧干燥的組合物，在該情況下組合物不必包含以干燥形式存在的酶以外的任何物質(zhì)。干燥組合物可以是可容易地與例如食品或飼料成分混合或更優(yōu)選形成預(yù)混合物的成分的顆粒。酶顆粒的顆粒大小優(yōu)選地與混合物的其他組分的大小相容。這提供了安全和便利的將酶整合入例如被加工的食品或動(dòng)物飼料中的手段。
例如，可通過(guò)冰凍具有膨脹劑(bulking agent)例如粉碎的大豆粉(ground soybean meal)的液體酶溶液的混合物，然后凍干所述混合物來(lái)制備穩(wěn)定的木聚糖酶制劑。濕度的降低和木聚糖酶和膨脹劑的結(jié)合相互作用保護(hù)酶免受外部環(huán)境因子例如在混合飼料生產(chǎn)期間經(jīng)歷的極端溫度的破壞。通過(guò)將潛在的蛋白水解酶的活性降到最低，干燥制劑可進(jìn)一步增強(qiáng)穩(wěn)定性，所述蛋白水解酶可在用于生產(chǎn)靶酶的液體發(fā)酵混合物中作為副產(chǎn)品存在。所得的本發(fā)明的干燥的酶-大豆粉混合物可經(jīng)受住極高的溫度。該配制的酶混合物可用作用于家禽和豬生產(chǎn)的飼料補(bǔ)充物。
當(dāng)獲得干燥的酶制劑后，在高剪切力混合器中使用團(tuán)聚技術(shù)制備團(tuán)聚顆粒，在該過(guò)程中填充材料和酶共團(tuán)聚形成顆粒。通過(guò)使載體材料的核心吸附酶/被酶包被來(lái)制備吸附性顆粒。典型的填充材料是鹽例如硫酸二鈉。其他填充物包括高嶺土、滑石粉、鋁鎂硅酸鹽和纖維素纖維。任選地，粘合劑例如糊精也包含在團(tuán)聚體顆粒中。
典型的載體材料包括淀粉，例如以木薯、玉米、馬鈴薯、稻和小麥形式的淀粉。也可使用鹽。
任選地，用包衣混合物包被顆粒。這些混合物包含包衣劑、優(yōu)選地疏水性包衣劑例如氫化棕櫚油和牛脂，如果想要，可用其他添加劑例如碳酸鈣或高嶺土。
此外，木聚糖酶組合物可含有其他組分(substituents)例如生色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦質(zhì)、其他飼料和食品增強(qiáng)酶等。這對(duì)所謂的預(yù)混合物尤其如此。
“食品或飼料添加劑”是意欲或適合于被加入食品或飼料中的基本純的化合物或多組分組合物。特別地其是這樣的物質(zhì)，即其旨欲用途是成為食品或飼料產(chǎn)品中的成分或影響食品或飼料產(chǎn)品的任何特性。因此，木聚糖酶添加劑理解為作為主要的飼料或食品物質(zhì)的非天然成分或不以其天然濃度存在于其中的木聚糖酶，即，將與飼料物質(zhì)分開(kāi)的木聚糖酶單獨(dú)地或和其他飼料添加劑一起加入飼料中。典型的添加劑一般包含一種或多種化合物例如維生素、礦質(zhì)或飼料增強(qiáng)性酶和合適的載體和/或賦形劑。
“可立即使用”的木聚糖酶添加劑此處定義為這樣的添加劑，即其不是在動(dòng)物飼料或經(jīng)加工的食品中原位產(chǎn)生的?？蓪⒖闪⒓词褂玫哪揪厶翘砑觿┲苯拥鼗騼?yōu)選地在與其他飼料或食品成分混合后直接給人或動(dòng)物食用。例如，將根據(jù)本發(fā)明的該方面的飼料添加劑和其他飼料成分組合以生產(chǎn)飼料。這樣的其他飼料成分包括一種或多種其他(優(yōu)選地?zé)岱€(wěn)定性的)酶補(bǔ)充物、維生素飼料添加劑、礦質(zhì)飼料添加劑和氨基酸飼料添加劑。然后可將可能包含幾種不同類型的化合物的所得的(組合的)飼料添加劑以合適的量與其他飼料成分例如谷物和蛋白補(bǔ)充物混合，從而形成動(dòng)物飼料?？墒褂媚壳八褂玫募庸ぱb置例如雙制粒機(jī)器、蒸汽制粒機(jī)、膨脹機(jī)或擠壓機(jī)將這些成分加工入動(dòng)物飼料中。
類似地，可將本發(fā)明的該方面的食品添加劑與其他食品成分組合以產(chǎn)生經(jīng)加工的食物產(chǎn)品。這些其他食品成分包括一種或多種其他(特別是熱穩(wěn)定性的)酶補(bǔ)充物、維生素食品添加劑和礦質(zhì)食品添加劑。然后可將可能包含幾種不同類型的化合物的所得的(組合的)食品添加劑以合適的量與其他食品成分例如谷物和植物蛋白混合，從而形成經(jīng)加工的食物產(chǎn)品?？墒褂媚壳八褂玫募庸ぱb置將這些成分加工入經(jīng)加工的食物產(chǎn)品中。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的木聚糖酶組合物額外地包含有效量的一種或多種飼料或食品增強(qiáng)性酶，特別是選自下列酶的飼料或食品增強(qiáng)性酶α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶特別是乳糖酶、其他木聚糖酶、β-葡聚糖酶，特別是內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)β-1，3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特別是阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1，3-β-半乳糖苷酶、內(nèi)-葡聚糖酶，特別是內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶，內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶，和內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶、果膠降解性酶，特別是果膠酶、果膠脂酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、阿拉伯聚糖酶(arabinanases)、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸聚-α-鼠李糖苷酶(rhamnogalacturonan-α-rhamnosidase)、pectate lyases，和α-半乳糖醛酸苷酶(α-galacturonisidases)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖木聚糖酶和酯肪分解酶例如酯酶、磷酯酶、肌醇六磷酸酶和cutinases
在飲食前或與飲食同時(shí)將本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑補(bǔ)充給動(dòng)物。優(yōu)選地與飲食一起將本發(fā)明的動(dòng)物添加劑補(bǔ)充給動(dòng)物。
食品或飼料中的木聚糖酶的有效量是大約1至10,000U/kg；更優(yōu)選地是大約50至5,000U/kg，更優(yōu)選地大約500至4,000U/kg或250至3200U/kg。
木聚糖酶在加工和生產(chǎn)人食品和動(dòng)物飼料中的用途也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可用木聚糖酶酶促處理確定為人食物的谷物和面粉以減少材料中木聚糖的含量。減少的木聚糖水平通過(guò)增加必需礦質(zhì)例如鐵、鈣和鋅的營(yíng)養(yǎng)利用度提高了食品的品質(zhì)。除了增加食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)外，在食品加工過(guò)程中使用的木聚糖酶可提高食品生產(chǎn)方法的總體效率。在食品生產(chǎn)過(guò)程中，木聚糖酶只在生產(chǎn)和加工期間具有活性而在最終的食物產(chǎn)品中沒(méi)有活性。該方面與例如生面團(tuán)的制備和烘烤有關(guān)。類似地，在混合飼料生產(chǎn)前，可用木聚糖酶預(yù)處理動(dòng)物飼料谷物例如經(jīng)烘烤的大豆粉或canola粉。在混合飼料生產(chǎn)之前除去動(dòng)物飼料成分中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(anti-nutritive)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)更高和更有價(jià)值的動(dòng)物飼料成分。在該加工方法中，在飼料生產(chǎn)期間木聚糖酶是有活性的，在攝入經(jīng)處理的飼料后，在動(dòng)物的消化道中其可以是有活性的或無(wú)活性的。
除了使用木聚糖酶作為食品加工輔助物外，本發(fā)明的范圍包括木聚糖酶作為人補(bǔ)充性消化輔助物的用途。在進(jìn)食時(shí)間可攝入片劑形式的木聚糖酶以將有活性的酶遞送至受者的胃腸道中。對(duì)于取食者，營(yíng)養(yǎng)的獲得要經(jīng)歷體內(nèi)過(guò)程并且可以從在食品加工期間不能用木聚糖酶處理的食品中獲得。
本發(fā)明的木聚糖酶在制備食品或飼料制劑或添加劑的過(guò)程中的用途也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，即木聚糖酶只在生產(chǎn)期間具有活性而在最終的食物或飼料產(chǎn)品中無(wú)活性。該方面特別地與例如生面團(tuán)的制備和烘烤以及其他即食的基于谷物的產(chǎn)品的生產(chǎn)相關(guān)。
木聚糖酶也可有利地用于單胃和多胃動(dòng)物，特別是小牛。也可用木聚糖酶補(bǔ)充魚(yú)和甲殼類動(dòng)物的飲食以進(jìn)一步改善飼料轉(zhuǎn)化率。也可向動(dòng)物例如家禽例如火雞、鵝、鴨和豬、馬、牛、綿羊、公山羊、犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物以及魚(yú)和甲殼類動(dòng)物提供本發(fā)明的飼料。然而，特別優(yōu)選的是給豬或家禽(包括但不限于broiler、母雞特別是蛋雞、火雞和鴨)提供所述飼料。
飼料組合物和使用方法如上所述配制的本發(fā)明的木聚糖酶可和其他成分一起產(chǎn)生具有特定優(yōu)點(diǎn)的新的飼料組合物。
本發(fā)明的木聚糖酶的活性非常高，以至其可用于產(chǎn)生新的動(dòng)物飼料制劑，相對(duì)于一般食物，該飼料制劑使得能夠產(chǎn)生更優(yōu)的飼料轉(zhuǎn)化效率和提高的體重增量。
明確地，本發(fā)明的動(dòng)物飼料包含本發(fā)明的木聚糖酶和動(dòng)物飼料成分的組合，從而形成具有顯著較低的完整木聚糖的含量的飼料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的飼料組合物包含一般的飼料成分、微量營(yíng)養(yǎng)素(micronutrients)、維生素等和有效量的熱穩(wěn)定性木聚糖酶，其中木聚糖酶的量在每kg飼料1至10,000個(gè)單位的木聚糖酶的水平；更優(yōu)選地在每kg飼料50至5,000個(gè)單位的木聚糖酶的水平。
提高體重增量和與畜養(yǎng)動(dòng)物的產(chǎn)量相關(guān)的飼料轉(zhuǎn)換率(FCR)的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的木聚糖酶使得能夠產(chǎn)生提高的體重增量和FCR。特別地，本發(fā)明的方法通過(guò)給動(dòng)物喂食包含本發(fā)明的木聚糖酶的飲食來(lái)改善FCR或體重增量。
本發(fā)明的動(dòng)物飼料可用于單胃或多胃動(dòng)物。可用本發(fā)明的動(dòng)物飼料飼養(yǎng)家禽，或豬，或小牛，或伴侶動(dòng)物例如狗、貓或馬。所述動(dòng)物飼料也可用于反芻動(dòng)物例如牛。
本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，所述實(shí)施例絕不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1Xy1A1A表達(dá)構(gòu)建體
pBSC12771(包含合成的Xy1A1A木聚糖酶基因的pPIC9)。在Entelechon(Regensburg，Germany)使用巴斯德畢赤氏酵母偏愛(ài)密碼子構(gòu)建編碼Xy1A1A木聚糖酶氨基酸序列的合成基因并稱為PP6002(Xy1A1A的針對(duì)巴斯德氏畢赤氏酵母優(yōu)化的密碼子形式)(SEQ IDNO1)。設(shè)計(jì)合成基因的序列以使其在成熟的肽編碼序列之前包含KEX2蛋白酶切割信號(hào)(Glu-Lys-Arg)(SEQ ID NO37和核苷酸序列SEQ ID NO36)。在pPIC9載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中提供合成的基因，該基因被Syngenta Quality Control稱為pBSC12771(圖1和SEQ ID NO33)。該克隆策略產(chǎn)生了這樣的融合蛋白，即在所述融合蛋白中啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信號(hào)(核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ ID NOS38和39)符合閱框地融合至PP6002基因序列的N末端。由該基因編碼的融合肽在產(chǎn)生后從細(xì)胞中分泌出來(lái)。在分泌過(guò)程中，融合蛋白的α因子肽部分被Kex2蛋白酶切割，從而將Xy1A1A木聚糖酶釋放至細(xì)胞外環(huán)境。
這有助于Xy1A1A酶的分離和純化。該構(gòu)建體中的PP6002基因在巴斯德畢赤氏酵母乙醇氧化酶-1(AOX1)的啟動(dòng)子控制之下，所述啟動(dòng)子用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。通過(guò)使用由廠商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的特異性的5AOX和3AOX測(cè)序引物確定合成的基因。在序列確定后，如前面所描述的，將pBSC12771質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸肝菌TOP10細(xì)胞并使用由Sambrook J，Russel D W.2001.″MolecularCloningA Laboratory Manual，″第3版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)所描述的方法制備甘油貯存物。
pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT中間體的構(gòu)建。使用酵母多拷貝表達(dá)載體pAO815(Invitrogen，Carlsbad，CA)制備PP6002表達(dá)盒的多聚體。為了制備pAO815多聚化表達(dá)載體，構(gòu)建系列中間載體。通過(guò)BamHI消化使親本載體pBSC12771線性化。然后使用T4聚合酶(NEB，Beverly，MA)回填BamHI限制性位點(diǎn)。接著使用T4快速連接酶(NEB，Beverly MA)將其自身經(jīng)回填的BamHI位點(diǎn)連接。通過(guò)第二次BamHI消化除去任何剩下的、未經(jīng)修飾的親本載體。將BamHI消化的、回填的和重新連接的DNA轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞并在37℃下在LBamp100上進(jìn)行過(guò)夜選擇。將單個(gè)分離的菌落培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上并通過(guò)Qiagen(Qiagen mini-prep purification kit，Valencia，CA)描述的方法純化DNA。通過(guò)用BamHI限制性消化確定BamHI位點(diǎn)的消除。經(jīng)修飾的載體稱為pPIC9mod-PP6002并被用作PCR的模板。使用下列的寡核苷酸和熱循環(huán)參數(shù)，用GeneAmpPCR System 9700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)和Advantage cDNA聚合酶(Clontech，Palo Alto，CA)擴(kuò)增靶DNA引物15′-AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAAC-3′(SEQ ID NO23)引物25′-CATTAGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3′(SEQ ID NO24)表1熱循環(huán)儀參數(shù)
引物1和2設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增從AOX1啟動(dòng)子的5′末端至AOX1轉(zhuǎn)錄終止子的3′末端，包括α-分泌因子-木聚糖酶ORF。同樣，這些引物也通過(guò)設(shè)計(jì)將BglII位點(diǎn)整合在產(chǎn)物的5′末端和將BamHI位點(diǎn)整合在產(chǎn)物的3′末端以進(jìn)行隨后的表達(dá)盒的多聚化。通過(guò)Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)描述的方法將得到的PCR產(chǎn)物直接克隆入拓?fù)洚悩?gòu)酶-I激活的載體pCR4Blunt-TOPO。該載體稱為pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT。SP6、T7和基因特異性測(cè)序列引物確定了擴(kuò)增和克隆的保真度。
pBSC12772(pAO815_1×PP6002)表達(dá)載體的構(gòu)建。
設(shè)計(jì)寡核苷酸(參見(jiàn)下面的引物3和4)用來(lái)通過(guò)PCR擴(kuò)增含有來(lái)自pBSC12771的啤酒糖酵母α-交配因子和PP6002的ORF。使用GeneAmpPCR System 9700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)和PfuUltra Hotstart聚合酶(Statagene，La Jolla，CA)擴(kuò)增靶DNA。
引物35′-GGGGCCGGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAATTTTT-3′(SEQID NO25)引物45′-GCCGGGGAATTCCGCGGCCGCCTATTACCAGACAGTAACATTTGA-3′(SEQ ID NO26)引物將EcoRI位點(diǎn)整合至PCR產(chǎn)物的末端以允許產(chǎn)物隨后插入pAO815受體載體。使用下列參數(shù)進(jìn)行通過(guò)熱循環(huán)反應(yīng)的擴(kuò)增表2.熱循環(huán)參數(shù)
用EcoRI消化PCR產(chǎn)物。通過(guò)在0.8％TAE凝膠上電泳分離限制性酶切反應(yīng)物并通過(guò)Qiagen(Qiaquick Gel extraction Kit；Qiagen，Valencia，CA)描述的方法對(duì)0.8kb片段進(jìn)行凝膠純化。在平行的限制性消化反應(yīng)中，使用EcoRI消化7.7kb的巴斯德畢赤氏酵母多拷貝表達(dá)載體pAO815(Invitrogen；Carlsbad，CA)并通過(guò)牛小腸磷酸酶(New England Biolabs，Berverly，MA)對(duì)其粘性末端去磷酸化。如上所述通過(guò)在0.8％TAE的凝膠上電泳分離載體片段和進(jìn)行凝膠純化。使用T4 DNA連接酶(Quick Ligation Kit，New England Biolabs；Beverly，MA)直接將EcoRI消化的和凝膠純化的PCR片段連接入線性化的、去磷酸化的pAO815。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞中并在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB板上涂板。將單個(gè)分離的菌落培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上并通過(guò)Qiagen(Qiagen mini-preppurification kit，Valencia，CA)描述的方法純化DNA。使用由廠商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的質(zhì)粒特異性5AOX和3AOX測(cè)序列引物確定基因的方向和序列。在確定序列后，將pAO815_1x PP6002質(zhì)粒重轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞中，使用Sambrook，等人2001描述的方法制備甘油貯存物。將pAO815_1x PP6002構(gòu)建體提交給Syngenta Biotechnology，Inc.Quality Control并稱其為pBSC12772(參見(jiàn)表2和SEQ ID NO34)。
PP6002表達(dá)盒的多聚化。通過(guò)用BglII和BamHI(New EnglandBiolabs；Beverly，MA)進(jìn)行雙消化從pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT移去表達(dá)盒(5AOX-PP6002-3AOXTT)并對(duì)2.1kb片段進(jìn)行凝膠純化。在分開(kāi)的反應(yīng)中，如前面所述用BamHI消化pBSC12772并通過(guò)CIP處理對(duì)其粘性末端去磷酸化。通過(guò)0.8％TAE的凝膠對(duì)經(jīng)BamHI消化的、經(jīng)CIP處理的pBSC12772進(jìn)行電泳并進(jìn)行凝膠純化。使用T4 DNA連接酶(Quick Ligation Kit，New EnglandBiolabs；Beverly，MA)將經(jīng)凝膠純化的BamHI-BglII表達(dá)片段連接入經(jīng)BamHI線性化的、經(jīng)CIP處理的pBSC12772載體并將其轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞(Invitrogen；Carlsbad，CA)。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB板上涂板并在37℃下將板溫育過(guò)液。將單個(gè)分離的菌落培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上并通過(guò)Qiagen(Valencia，CA)描述的方法制備DNA。通過(guò)限制性酶切分析和在連接處使用載體特異性引物進(jìn)行DNA序列分析來(lái)確定兩拷貝的木聚糖酶構(gòu)建體。所得的含有兩個(gè)PP6002拷貝的pAO815載稱為pAO815_2xPP6002。
pSYN12773(pAO815_3xPP6002)的構(gòu)建。通過(guò)使用BamHI消化pAO815_2xPP6002和CIP處理粘性末端構(gòu)建含有三個(gè)合成的Xy1A1A表達(dá)盒拷貝的構(gòu)建體。使用T4 DNA連接酶(Quick Ligation Kit，NewEngland Biolabs；Beverly，MA)將來(lái)自BamHI-BglII雙消化反應(yīng)物pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT的經(jīng)純化的表達(dá)盒片段連接入經(jīng)BamHI消化的、CIP處理的pAO815_2xPP6002載體，然后如前面所描述的，將其轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞。將所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂板在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB板上并在37℃下將板溫育過(guò)夜。將單個(gè)分離的菌落培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上并通過(guò)Qiagen(Valencia，CA)描述的方法制備DNA。通過(guò)限制性片段分析來(lái)確定3拷貝表達(dá)構(gòu)建體。此外，由Syngenta Biotechnology Inc.QualityControl確定pAO815_3xPP6002的完全核苷酸序列。pAO815_3xPP6002構(gòu)建體被Syngenta QC命名為pSYN12773(參見(jiàn)圖3和SEQ IDNO35)。
實(shí)施例子2用于巴斯德畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化的pSYN12773 DNA的制備。將50mL補(bǔ)充有氨芐青霉素(100μ/mL)的TB培養(yǎng)液和含有pSYN12773的大腸桿菌TOP10細(xì)胞的甘油貯存物一起溫育，在37℃下培養(yǎng)過(guò)液。通過(guò)Qiagen(Qiaprep Midiprep protocol，Qiagen，Valencia，CA)描述的方法從培養(yǎng)物中純化DNA。用BglII內(nèi)切核酸酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)消化分離的質(zhì)粒DNA過(guò)液。通過(guò)在0.8％Tris-醋酸EDTA(TAE)瓊脂糖凝膠上對(duì)消化混合物進(jìn)行電泳，并通過(guò)Qiagen(QiaQuick gel purification protocol，Valencia，CA)描述的方法從凝膠上純化對(duì)應(yīng)于Xy1A1A整合表達(dá)盒的10.4kb的片段。通過(guò)在0.8％TAE凝膠上對(duì)部分純化的片段進(jìn)行電泳以確定完全消化和其相對(duì)濃度。此外，將經(jīng)純化的片段的部分轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞以確定樣品中沒(méi)有殘留的環(huán)化的含有氨芐青霉素標(biāo)記的質(zhì)粒污染。將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物在的LBAmp100平板上涂板并在37℃下將板溫育16小時(shí)。板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。
實(shí)施例3巴斯德畢赤氏酵母Xy1A1A表達(dá)宿主的構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母GS115細(xì)胞的制備。使用無(wú)菌技術(shù)在層流罩超靜臺(tái)中進(jìn)行所有微生物操作。通過(guò)將巴斯德畢赤氏酵母GS115酵母細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在YPD瓊脂糖板上劃線培養(yǎng)來(lái)制備所述細(xì)胞。然后在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜，將來(lái)自YPD瓊脂板的單個(gè)酵母集落轉(zhuǎn)移至5ml YPD培養(yǎng)液中并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。該“種子培養(yǎng)物”的部分用于接種無(wú)菌的、裝有500ml YPD培養(yǎng)液的帶擋板的2升培養(yǎng)瓶。在30℃下通過(guò)強(qiáng)烈的搖動(dòng)培養(yǎng)該培養(yǎng)物過(guò)夜直至光學(xué)密度OD600＝1.5。通過(guò)在4000Xg、4℃下離心5分鐘收集細(xì)胞，并重懸浮于80mL無(wú)菌雙蒸(sdd)水中。將10毫升10X TE緩沖液(10mMTris-HCl、0.1mM EDTA)，pH7.5加入至懸浮液中，然后加入10mL1M醋酸鋰(LiAc)。通過(guò)輕柔的渦旋在30℃下溫育細(xì)胞懸浮液。溫育45分鐘后，加入2.5mL 1M的二硫蘇糖醇(DTT)并將細(xì)胞懸浮液重新在30℃下再溫育15分鐘。然后用系列的水洗滌細(xì)胞，最后重懸浮于5mL冰冷的1M山梨糖醇中。
pSYN12773 DNA至巴斯德畢赤氏酵母GS115的轉(zhuǎn)化。將經(jīng)純化的來(lái)自BglII消化的pSYN12773質(zhì)粒的Xy1A1A表達(dá)盒的DNA(100ng)與80μL經(jīng)LiAc/山梨糖醇處理的巴斯德畢赤氏酵母GS115細(xì)胞在0.2cm電穿孔小杯(Gene Pulser Cuvettes，BioRad，Hercules，CA)中混合并在冰上孵育5分鐘。將電穿孔小杯放入BioRad Gene Pulser II儀器中并用1.5kV、2 5μF和200Ω的設(shè)置進(jìn)行脈沖，向電穿孔混合物中加入冰冷的山梨糖醇(0.5mL)，然后將所述混合物在不含組氨酸的、基本葡萄糖培養(yǎng)基(minimal media-dextrose)(MD)瓊脂板上涂板。巴斯德畢赤氏酵母株系GS115是組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷體，從而不能在缺少組氨酸的情況下生長(zhǎng)，但在Xy1A1A表達(dá)盒上含有his4基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子恢復(fù)成組氨酸原養(yǎng)型并且能夠在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在30℃下培養(yǎng)3天，產(chǎn)生大量的組氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子。將在缺少轉(zhuǎn)化DNA的情況下經(jīng)電穿孔的經(jīng)LiAc/山梨糖醇清洗的GS115細(xì)胞在MD和MD/組氨酸瓊脂板上涂板作為對(duì)照。在電穿孔期間無(wú)轉(zhuǎn)化DNA的GS115細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生能夠在缺少組氨酸的MD板上生長(zhǎng)的集落。
產(chǎn)生木聚糖酶的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定。從MD板上的原代轉(zhuǎn)化子中挑出256個(gè)單個(gè)的his+原養(yǎng)型分離集落并在MD主平板上進(jìn)行復(fù)制涂板。然后將這些集落復(fù)制涂板至缺少組氨酸、含有1.0％甲醇的基本培養(yǎng)基(MM)瓊脂板，該瓊脂板含有0.1％Azo-小麥阿拉伯木聚糖(縮寫(xiě)AzoWAXY；Megazyme，County Wicklow，Ireland)。在30℃下溫育16小時(shí)后，圍繞在MM AzoWAXY板上的集落的清澈區(qū)帶鑒定了92個(gè)產(chǎn)生木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子。將92個(gè)木聚糖酶表達(dá)性克隆中的24個(gè)接種至24個(gè)位點(diǎn)的深孔板中的3mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并讓克隆表達(dá)5天。誘導(dǎo)后，通過(guò)木聚糖酶測(cè)定法和ELISA法對(duì)上清液進(jìn)行分析。8個(gè)轉(zhuǎn)化子以推定高于對(duì)照的產(chǎn)量的水平產(chǎn)生木聚糖酶。在50mL搖動(dòng)培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步檢查這8個(gè)轉(zhuǎn)化子的表達(dá)水平。在5天的誘導(dǎo)后，事件5501、5517和5520在產(chǎn)量和產(chǎn)率上表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提高。
用于含有pSYN12273的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化子的長(zhǎng)期貯存的甘油貯存物的制備。通過(guò)用來(lái)自MD主培養(yǎng)板的8個(gè)推定的高度表達(dá)木聚糖酶的陽(yáng)性克隆接種帶帽的16×150mm玻璃管中的7mL無(wú)菌液體MD培養(yǎng)基來(lái)制備甘油冷凍貯存物。將其在30℃下在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)wheel上培養(yǎng)過(guò)夜。將1毫升(1mL)無(wú)菌甘油與各培養(yǎng)物混合，產(chǎn)生15％(v/v)的甘油對(duì)培養(yǎng)物的混合物。將各培養(yǎng)物等分分裝入無(wú)菌冷凍小瓶并在-80℃下貯存。
Xy1A1A巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)宿主的表征篩選MutS表型。為了鑒定MutS克隆，將木聚糖酶陽(yáng)性克隆在缺少組氨酸的、含有1.0％甲醇的基本培養(yǎng)基(MM)的瓊脂板上劃線，其旁邊是MutS陽(yáng)性對(duì)照(含有pPIC9-secHSA的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)和Mut+對(duì)照(含有pPIC3-βGal的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)。在30℃下溫育板4天并記錄在MM上的生長(zhǎng)狀況。和對(duì)照相比，前面鑒定的原始的92個(gè)his+xyn+事件中的39個(gè)在MM培養(yǎng)基上表現(xiàn)出較慢的生長(zhǎng)。在這39個(gè)事件中，有8個(gè)之前已通過(guò)活性和ELISA測(cè)定法被鑒定為高表達(dá)者。
對(duì)Xy1A1A表達(dá)盒的初步雜交篩選。進(jìn)行系列雜交實(shí)驗(yàn)。在初步的雜交篩選中，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Miles JD，Busser K，Stalder C，和Higgins DR(1998)Isolation of nucleic acids，in PichiaProtocols，第103卷(Higgins DR&Cregg JM，eds.)，Humana Press，Totowa，NJ，pp.73-80)制備8個(gè)推定的高表達(dá)性事件的基因組DNA。使用BglII限制性內(nèi)切核酸酶消化2微克的基因組DNA。通過(guò)0.8％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化物進(jìn)行電泳，然后雙向轉(zhuǎn)移至兩張硝酸纖維素膜上，產(chǎn)生雙份印跡。制備對(duì)于PP6002 CDS PP6002和氨芐青霉素基因(cAmp-04)特異性的DNA雜交探針。使用基因特異性引物(參見(jiàn)針對(duì)PP6002的引物5和6以及針對(duì)amp的引物7和8)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生木聚糖酶和amp的探針。
引物55′-GCATCTACTGACTACTGGCAG-3′(SEQ ID NO27)引物65′-CCAGACAGTAACATTTGAATAACC-3′(SEQ ID NO28)引物75′-GGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT-3′(SEQ ID NO29)引物85′-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′(SEQ ID NO30)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并使用Rediprime-II標(biāo)記系統(tǒng)(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)用[32P]-dCTP標(biāo)記經(jīng)純化的產(chǎn)物。在用[32P]-dCTP-amp探針在65℃在雜交緩沖液中進(jìn)行嚴(yán)緊雜交后，除了陽(yáng)性對(duì)照(經(jīng)BglII消化的pSYN12773)，第一印跡沒(méi)有顯示任何雜交條帶。該實(shí)驗(yàn)表明氨芐青霉素基因在這些事件中的任一事件中沒(méi)有整合入巴斯德畢赤氏酵母的基因組中。使用前面描述的高嚴(yán)緊度方法用[32P]dCTP-PP6002探測(cè)雙份印跡，在事件5517和5520中產(chǎn)生大約10.4kb的單一條帶，表明木聚糖酶基因的三個(gè)拷貝已成功地整合入這些事件中。
對(duì)事件5520詳細(xì)的雜交篩選。為支持初步的雜交篩選，進(jìn)行事件5520基因組DNA的另外的限制性消化。用BamHI、BgllI、EcoRIxNotIPssI、PvuII，和XhoIxNotI消化2微克的事件5520基因組DNA。在0.8％的瓊脂糖凝膠上對(duì)消化物進(jìn)行電泳，然后雙向轉(zhuǎn)移至兩張硝酸纖維素膜上，產(chǎn)生雙份印跡。制備對(duì)于cXy14-01 CDSαss-PP6002和載體主鏈基因(cAmp-04和oCOLE-10)特異性的DNA雜交探針。使用基因特異性引物(對(duì)于cXy14-01的引物3和6以及對(duì)于主鏈的下面的引物9和10)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生木聚糖酶和主鏈的探針。
引物95′-GCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGA-3′(SEQ ID NO31)引物105′-GGGAACACTGAAAAATAACAGTTAT-3′(SEQ ID NO32)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并使用Rediprime-II標(biāo)記系統(tǒng)(AmershamBioscienoes，Piscataway，NJ)用[32P]-dCTP標(biāo)記純化的產(chǎn)物。在用[32P]-dCTP-主鏈探針在65℃在PerfectHybTMPlus雜交緩沖液(SigmaChemical Co.，St.Louis Mo)中進(jìn)行嚴(yán)緊雜交后，除了陽(yáng)性對(duì)照(經(jīng)BglII消化的pSYN12773)外，第一印跡沒(méi)有顯示任何雜交條帶。該實(shí)驗(yàn)表明載體主鏈在事件5520中沒(méi)有整合入巴斯德畢赤氏酵母的基因組中。使用前面描述的高嚴(yán)緊度方法用[32P]dCTP-cXy14-01探測(cè)雙份印跡，在經(jīng)Bgl11消化的樣品中產(chǎn)生大約10.4kb的單個(gè)條帶，表明木聚糖酶基因的三個(gè)拷貝已成功地整合入事件5520中。經(jīng)BamHI、EcoRIxNotI、PstI、PvuII和XhoIxNotI消化的產(chǎn)物產(chǎn)生具有預(yù)期的針對(duì)在巴斯德畢赤氏酵母的AOX1基因座上整合的遷移特征譜的條帶?？偠灾?，由Southern印變法測(cè)定的巴斯德畢赤氏酵母PP6002表達(dá)事件5520的所有特征和在含有甲醇的基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征表明所述事件具有His+、Muts表型，包含插入至AOX1基因座上的PP6002表達(dá)盒的三個(gè)拷貝，不包含氨芐青霉素抗性基因或載體主鏈的其他成分。
實(shí)施例4PP6002巴斯德畢赤氏酵母主細(xì)胞文庫(kù)的制備從事件5520的MD甘油冷凍貯存物制備主細(xì)胞文庫(kù)；此處稱為SYN12773。在無(wú)菌條件下，通過(guò)在MD板上劃線和在30℃下溫育直至集落出現(xiàn)來(lái)復(fù)蘇(revive)來(lái)自SYN12773甘油冷凍貯存物樣品。從MD板中挑出單個(gè)集落并接種至裝有5mL MD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中。將管在旋轉(zhuǎn)wheel上在30℃下溫育過(guò)夜。第二天，將SYN12773起始培養(yǎng)物接種至2.8L、含有350mL的YPD培養(yǎng)基的帶擋板的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)物在30℃下在250rpm的搖床上培養(yǎng)直至OD600＝2.0-3.0，達(dá)到3.0x107個(gè)細(xì)胞。在無(wú)菌條件下，將150mL無(wú)菌甘油加入至350mL YPD培養(yǎng)物，導(dǎo)致30％(v/v)的甘油對(duì)YPD的比例。將培養(yǎng)物的等分部分(1.0mL)轉(zhuǎn)移至243個(gè)無(wú)菌的2.0mL的帶有螺帽和O-環(huán)形密封附件的聚丙烯冷凍管(Fisher Science，Cat No.056698)中。將243個(gè)冷凍小瓶子放入3個(gè)冷凍盒中并于-80℃下貯存。
巴斯德畢赤氏酵母木聚糖酶主細(xì)胞庫(kù)的純化。將來(lái)自主細(xì)胞庫(kù)中的其中一個(gè)小瓶的1微升樣品在YPD瓊脂板上劃線。將板在30℃下溫育過(guò)夜以產(chǎn)生單個(gè)的集落。目視檢測(cè)這些集落，發(fā)現(xiàn)其具有均一的與親本株系巴斯德畢赤氏酵母GS115的表型一致的集落表型。將來(lái)自YPD板的單個(gè)集落在MD和MM AzoWAXY瓊脂板上劃線并在30℃下培養(yǎng)直至單個(gè)集落的出現(xiàn)。所得的集落在MD和缺少組氨酸的MM瓊脂上都能生長(zhǎng)，表明與事件SYN12773相似，但與親本株系GS115不同，它們都具有His+表型。此外，所有集落在含有甲醇作為碳源的MM瓊脂上生長(zhǎng)緩慢，表明與事件SYN12773相似，但和株系GS115不同，它們具有預(yù)期的AOX1突變體的Muts表型。此外，所有在MM AzoWAXY板上的集落都產(chǎn)生清澈的區(qū)帶，表明有活性的木聚糖酶的表達(dá)。這些分析的結(jié)果表明此處描述的MCB是純的并且沒(méi)有其他微生物的污染。
巴斯德畢赤氏酵母木聚糖酶克隆的遺傳穩(wěn)定性。通過(guò)在MD瓊脂上進(jìn)行20次連續(xù)的涂板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)事件SYN12773中多拷貝PP6002表達(dá)盒的遺傳穩(wěn)定性。通過(guò)在MD瓊脂板上劃線和在30℃下培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)來(lái)復(fù)蘇來(lái)自MCB低溫冷凍小瓶中的一瓶的細(xì)胞(板1)。從板1中挑出單個(gè)菌落并重新在第二塊MD板上劃線。連續(xù)20次進(jìn)行挑出單個(gè)菌落并重涂板的該循環(huán)。純化來(lái)自板1和20的單個(gè)菌落的基因組DNA，并用于Southern分析。比較第1代和第20代之間的雜交特征譜。如前面所述進(jìn)行Southern分析，在第1和20代之間未觀察到差異。從板1和板20的單個(gè)菌落制備液體培養(yǎng)物用于蛋白表達(dá)分析。使用來(lái)自這些板中的每一個(gè)板上的3個(gè)單獨(dú)的菌落接種50mL BMGY培養(yǎng)基。在30℃下將細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，離心并重新懸浮于50mL BMMY中。在30℃下溫育培養(yǎng)物5天，每天加入甲醇，使終濃度達(dá)到1.0％(v/v)。在發(fā)酵期的末期，分析澄清的(clarified)上清液的木聚糖酶活性。
來(lái)自兩個(gè)板的克隆都以這樣的水平產(chǎn)生有活性的木聚糖酶，即在來(lái)自相同板的培養(yǎng)物之間和來(lái)自板1和20的培養(yǎng)物之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同的水平(p＜0.05)。通過(guò)Southern分析和通過(guò)蛋白表達(dá)對(duì)來(lái)自板1和20的細(xì)胞的基因組的分析證實(shí)了整合在巴斯德畢赤氏酵母GS 115的基因組中的PP6002表達(dá)盒的穩(wěn)定性和其中的木聚糖酶基因的表達(dá)穩(wěn)定性。
實(shí)施例5木聚糖酶活性的確定使用小麥的阿拉伯木聚糖作為底物并測(cè)量通過(guò)還原性末端和3，5-二硝基水楊酸(DNS)或2，2′-bicinchoninic acid(BCA)的反應(yīng)釋放的還原性末端來(lái)確定酶促活性。將底物配制為100mM醋酸鈉緩沖液pH5.30(含有0.02％疊氮化鈉)中的1.4％w/w的小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)溶液。DNS試劑由0.5％w/w、15％酒石酸鉀鈉和1.6％w/w氫氧化鈉組成。該溶液是穩(wěn)定的并在室溫下貯存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。通過(guò)將50份試劑A和1份試劑B(試劑A和B來(lái)自Pierce，產(chǎn)品編號(hào)分別為23223和23224)混合制備BCA試劑。在使用前不超過(guò)4小時(shí)混合這些試劑。
在DNS測(cè)定法中，將500微升的底物和200微升酶樣品混合。在想要的溫度下溫育想要的時(shí)間后，加入700微升的DNS試劑。混合內(nèi)容物并在100℃下放置10分鐘。將內(nèi)容物冷卻，然后轉(zhuǎn)移至小杯中，相對(duì)于已知濃度的木糖，在540nm處測(cè)量吸光度。酶的稀釋度、溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇視本領(lǐng)域技術(shù)人員的不同而變化。
在BCA測(cè)定法中，將200微升的底物與80微升的酶樣品混合。在想要的溫度下溫育想要的時(shí)間后，加入2.80毫升的BCA試劑?；旌蟽?nèi)容物并在80℃下放置35分鐘。將內(nèi)容物冷卻，然后轉(zhuǎn)移至小杯中，相對(duì)于已知濃度的木糖，在560nm處測(cè)量吸光度。酶的稀釋度、溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇視本領(lǐng)域技術(shù)人員的不同而變化。根據(jù)MillerG.L.(1959)Anal.Chem.31 426-428的方法確定酶促活性。
實(shí)施例6使用雞的試驗(yàn)使用含有小麥、黑麥和大豆粉作為主要成分的標(biāo)準(zhǔn)家禽食物。示例性食物列于表3。使用產(chǎn)生于重組巴斯德畢赤氏酵母的Xy1A1A木聚糖酶。針對(duì)每種食物，將6個(gè)重復(fù)欄的雞，每欄6只雞，養(yǎng)至21天齡，并通過(guò)減去一天齡的雞的重量確定最終的重量。持續(xù)記錄每欄雞消費(fèi)的飼料量，確定平均飼料消費(fèi)。通過(guò)凍干有活性的酶制劑然后在試驗(yàn)地點(diǎn)用水恢復(fù)來(lái)配制Xy1A1A木聚糖酶。直接將該制劑加入食物中。按照商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以與Xy1A1A木聚糖酶相似的劑量使用Avizyme 1300。
表3.3.2食物配方成分 起始(Starter)黑麥 20.00％小麥-飼料37.49％大豆粉48 33.65％大豆油 5.31％鹽 0.39％DL甲硫氨酸 0.22％賴氨酸HCl0.04％石灰?guī)r 1.13％磷酸二鈣 1.28％VIT/MIN 0.49％
粗蛋白％22.88Poult ME kcal/kg3,000.00豬DE Kcal 3,487.48鈣％0.85Phos％ 0.67Avail Phos％0.40脂肪％ 6.46纖維％ 2.52Met％ 0.56Cys％ 0.39Me+Cys％0.95Lys％ 1.25His％ 0.56Tryp％ 0.28Thr％ 0.84Arg％ 1.52Iso％ 0.95Leu％ 1.69Phe％ 1.07Tyr％ 0.75Val％ 1.05Gly％ 0.93Ser％ 1.07Phe+Tyr％ 1.82Na％0.18Cl％0.29K％ 0.96亞油酸％2.54Na+K-Cl 241.72
DUA 396.57Sulphur％0.22鎂 0.16甜菜堿 0.47膽堿 1,378.97Poult ME MJ/kg 12.55完整大豆 0.34表4舉例子說(shuō)明了含有Xy1A1A木聚糖酶的規(guī)定食物對(duì)家禽生長(zhǎng)表現(xiàn)的影響，其以飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)來(lái)表示。飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)是指消耗的飼料量除以雞的凈體重增量。較低的比例表示雞消耗每單位飼料獲得更大的重量。較低的比例表示雞更有效地利用被消耗的飼料。
對(duì)照食物(無(wú)酶補(bǔ)充物)明顯地顯示比加入了即使是最低量的任一種酶的飼料更差的效果。對(duì)照的FCR隨著酶每次增加的劑量而得到不斷的改善(從1.671至最適宜的1,449，此時(shí)XylA1A木聚糖酶的包含率為400個(gè)單位)。同時(shí)，隨著劑量的增加兩種木聚糖酶都提高表現(xiàn)，如通過(guò)有效的酶統(tǒng)計(jì)學(xué)項(xiàng)所顯示的，XylA1A木聚糖酶明顯地優(yōu)于Avizyme 1300的表現(xiàn)。因此，和不含補(bǔ)充物的食物和含有商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的食物相比，使用該本發(fā)明的XylA1A木聚糖酶補(bǔ)充這些飼料減少了每生產(chǎn)一個(gè)單位肉雞(broiler chicken)重量所需要的飼料量。
表4.雞的飼養(yǎng)研究數(shù)據(jù)
實(shí)施例7產(chǎn)生于不同宿主的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性木聚糖酶蛋白，BD6002(也稱為XylA1A，SEQ ID NO14)表達(dá)于宿主大腸桿菌、巴斯德畢赤氏酵母、啤酒糖酵母和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。獲得純化的酶并在85℃下測(cè)量殘留活性以確定是否由于在不同的宿主中表達(dá)而導(dǎo)致木聚糖酶的熱穩(wěn)定性不同。這些宿主在對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行糖基化上的能力上是有差異的。
殘留的木聚糖酶測(cè)定法該測(cè)定方法對(duì)內(nèi)-1，4-β-D-木聚糖酶的活性是特異性的。當(dāng)Azo-小麥阿拉伯木聚糖和內(nèi)切-木聚糖酶一起溫育時(shí)，底物通過(guò)內(nèi)切機(jī)制(endo-mechanism)被解聚，在向反應(yīng)混合物中加入工業(yè)甲基化酒精(spirits)(IMS)或95％乙醇后，產(chǎn)生保留在溶液中的低分子量的被染色的(dyed)片段。通過(guò)離心除去高分子量的物質(zhì)，測(cè)量上清液的顏色。通過(guò)參考標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測(cè)定溶液中的內(nèi)木聚糖酶。每一種酶都有其自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在不同的宿主中產(chǎn)生的相同的酶可具有不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
溶液A.0.1M檸檬酸。將21.02g檸檬酸一水合物(EM SciencesCX1725-1)通過(guò)攪拌溶解在玻璃燒杯中的900mL去礦質(zhì)(demineralized)水中。將溶液轉(zhuǎn)至1L的容量瓶中并用去礦質(zhì)水配成1L。過(guò)濾滅菌并在室溫下貯存。
B.0.2M磷酸鈉，二堿將53.6g磷酸氫二鈉7水合物(sodium phosphate dibasicheptahydrate)(Sigma S9390)通過(guò)攪拌溶解在玻璃燒杯中的900mL去礦質(zhì)(demineralized)水中。將溶液轉(zhuǎn)至1L的容量瓶中并用去礦質(zhì)水配成1L。過(guò)濾滅菌并在室溫下貯存。
C.50mM磷酸檸檬酸鹽(citrate hosphate)緩沖液pH5.4(縮寫(xiě)50CPB54)將22.2mL 0.1M檸檬酸(ξ3.A.)和27.8mL0.2M磷酸鈉在100mL容量瓶中混合。用去礦質(zhì)水將體積調(diào)至100mL。
D.50mM檸檬酸磷酸鹽緩沖液pH5.4中的1％w/v小麥阿拉伯木聚糖用攪拌棒將90ml 50CPB54加入至200ml燒杯中。用鋁箔蓋住燒杯。將燒杯和內(nèi)容物放在熱平板攪拌器上，將水加熱至沸騰并伴隨強(qiáng)烈的攪拌。小心地取走鋁箔，加入粉沫狀底物(1.000g)，再放回鋁箔。攪拌溶液10分鐘，同時(shí)燒沸，然后關(guān)掉加熱。攪拌溶液直至其冷卻至室溫，不應(yīng)該看到成團(tuán)塊的底物。將溶液轉(zhuǎn)入100mL帶塞子的容量瓶中。向容量瓶中加入疊氮化鈉(2％w/v，1ml)。用少量(3-4ml)50CPB54洗滌燒杯的側(cè)壁兩次以除去殘留的底物。將洗出物與容量瓶中的內(nèi)容物混合。用50CPB54將體積調(diào)整至100ml并插上塞子。劇烈搖動(dòng)容量瓶。使用間期應(yīng)當(dāng)將該底物溶液在4℃下貯存。在這些條件下和排除污染的情況下，該底物在至少數(shù)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
測(cè)定A.將16×100mm玻璃試管放在架子上于37℃進(jìn)行水浴。
B.向各管中加入500μL 1％w/v WAXY并平衡至37℃至少5分鐘。
C.以合適的稀釋度將600μL+樣品放入1.5mL eppendorf管中并置于37℃中水浴至少5分鐘。
·一般地，對(duì)于該測(cè)定，靶向大約0.1U/mL下列稀釋物以在線性范圍內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)是想要的。
D.向玻璃試管中加入500μL樣品啟動(dòng)反應(yīng)。立即渦旋并開(kāi)始起動(dòng)定時(shí)器。
E.在37℃溫育正好10分鐘。
F.用重復(fù)移液器加入2.5mL 95％乙醇并立即渦旋。將管轉(zhuǎn)移至在室溫下的架子上。
G.在室溫下放置10分鐘，然后再渦旋。
H.以最大的速度加速和制動(dòng)，在1,000g，22℃下在離心10分鐘。
I.將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL聚苯乙烯小杯中。
J.在590nm測(cè)量吸光度。
對(duì)木聚糖酶BD6002的殘留活性測(cè)定的結(jié)果列于表5中。結(jié)果顯示在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)的木聚糖酶BD6002在85℃30分鐘后具有最大的殘留活性。耐熱性上的差異預(yù)計(jì)是由于在不同宿主生物體中表達(dá)蛋白的糖基化上的差異造成的。已知原核宿主例如大腸菌屬和假單孢桿菌株系不糖基化蛋白。
表5.產(chǎn)生于不同宿主的BD6002在85℃下的殘留活性。
實(shí)施例8木聚糖酶酶的加入對(duì)瘤胃液(Ruminal fluid)中的累積氣體產(chǎn)量的影響該實(shí)施例舉例說(shuō)明了額外的加入至反芻動(dòng)物飼料的木聚糖酶的差異，通過(guò)木聚糖酶與瘤胃液一起溫育時(shí)氣體產(chǎn)量上的差異來(lái)測(cè)量。
該實(shí)驗(yàn)的目的是估計(jì)木聚糖酶補(bǔ)充物對(duì)苜蓿屬干草瘤胃降解的影響。根據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)活性的結(jié)果和廠商的推薦，對(duì)酶選擇劑量水平2和3。在另一方面，以1.0mg/g DM苜蓿屬干草的比例使用四種商購(gòu)獲得的產(chǎn)品。使用Knifetec 1095樣品粉碎機(jī)(Foss Tecator，Hgans，Sweden)研磨1克DM的苜蓿屬干草10秒鐘并稱重裝入發(fā)酵瓶(125ml容量)中。通過(guò)加入10ml H2O重懸所有的酶，以6個(gè)重復(fù)將合適體積的各酶加入到對(duì)應(yīng)的瓶中。在用瘤胃液接種前20小時(shí)使用酶。3小時(shí)后，加入40ml厭氧性緩沖培養(yǎng)基，其是按照Goering和Van Soest(1970)提出的方法制備的，并使用1M反烏頭酸(Sigma Chemicals)將pH調(diào)整至pH6.0，并將瓶在20℃下貯存過(guò)夜。在喂養(yǎng)(1100h)后4小時(shí)從喂食TMR食物的哺乳期奶牛獲取瘤胃液，所述TMR飼料是由大麥青貯飼料、剁碎的苜蓿屬干草、軋制的玉米粒組成，并經(jīng)壓縮供早哺乳期使用。將經(jīng)粗濾的瘤胃液裝入密閉的、預(yù)熱的容器中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室并保持在39℃的水浴中。將接種體分配(每瓶10ml)至已在溫箱中加溫至39℃的培養(yǎng)瓶中并充入不含氧氣的CO2。在加入后立即用帶有鋁crimp帽的14mm的丁基合成橡膠塞封閉瓶子并溫育18小時(shí)。也溫育陰性對(duì)照(瘤胃液加單獨(dú)的緩沖液以及瘤胃液加緩沖液和酶產(chǎn)物)。這些對(duì)照用于修正直接由接種體產(chǎn)生的氣體釋放和發(fā)酵殘留物。6個(gè)重復(fù)中都包含了這些處理和對(duì)照。通過(guò)插入23號(hào)(0.6mm)針頭在接種后2、6、12和18小時(shí)測(cè)量由于底物發(fā)醇產(chǎn)生的頂部空間氣體，所述23號(hào)(0.6mm)針頭連接在和可視顯示器(Data Track，Christchurch，UK)連接的壓力傳感器(T443A型，Bailey and Mackey，Birmingham，UK)上。然后取下傳感器，將針留在原位以使得可以排氣。使用由Mauricio等人，Anim.Feed Sci.Technol.79321-330(1999)報(bào)道的二次方程(氣體體積＝0.18+3.697x氣壓+0.0824x氣壓2)將氣壓值(通過(guò)被溫育的底物OM的量和從陰性對(duì)照釋放的氣體量修正的)用于產(chǎn)生體積估計(jì)值。當(dāng)取出時(shí)，將瓶子放入4℃的冰箱以停止發(fā)酵，并用真空通過(guò)商購(gòu)獲得的咖啡濾紙進(jìn)行過(guò)濾。通過(guò)在100℃下干燥殘留物24小時(shí)來(lái)確定表觀DM降解率(DMD)和通過(guò)在500℃下過(guò)夜灰化干燥的殘留物后的差來(lái)確定OM降解率(OMD)。
測(cè)定結(jié)果列于下面的表6和7中。這些結(jié)果表明木聚糖酶在瘤胃液中，其活性不同。
表6.木聚糖酶添加對(duì)于和瘤胃液一起溫育18小時(shí)的苜蓿屬干草的累積氣體產(chǎn)量(mL/g OM)的影響。
1根據(jù)在18小時(shí)溫育測(cè)量的累積氣體產(chǎn)量的相對(duì)排序a，b，c分別表示在P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05時(shí)在列內(nèi)與對(duì)照的不同。
表7.木聚糖酶添加對(duì)于和瘤胃液一起溫育18小時(shí)的苜蓿屬干草的DM(DMD)、OM(OMD)的表觀降解力和發(fā)酵分配因子(partitioningfactor)(PF)的影響。
1木聚糖酶活性表示為每分鐘釋放的葡萄糖的納摩爾數(shù)。
2根據(jù)DMD、OMD和FE的相對(duì)排序。
3分配因子＝降解的OM的mg/mL產(chǎn)生的氣體a，b，c分別表示在P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05時(shí)在列內(nèi)與對(duì)照的不同。
實(shí)施例9.酶的表征從受試物品材料(test article material)(TAM)的純化(無(wú)同種型的區(qū)分)木聚糖酶親和柱的制備將凍干的木聚糖酶，大約10mg巴斯德畢赤氏酵母產(chǎn)生的BD6002(rXy1PP6002，lot Xv1-BD6002-PB206)重懸于1.25ml雙蒸水中并用0.1M NaHCO3pH8.3配至5ml。將該溶液在4℃下對(duì)4 L 0.1M NaHCO3透析5.5小時(shí)，然后按照廠商說(shuō)明書(shū)加入至經(jīng)雙蒸水洗滌的affigel-10(Bio-Rad)。將結(jié)合木聚糖酶的affigel-10倒入2ml柱中。
山羊抗血清用純化的木聚糖酶蛋白BD7346來(lái)產(chǎn)生抗木聚糖酶的抗體并在山羊(American Alpine)中制備抗體。用500μg完全弗氏佐劑中的木聚糖酶注射山羊，讓山羊休息3周，然后用500μg不完全弗氏佐劑中的木聚糖酶注射山羊。每次注射后10天對(duì)山羊取血。
木聚糖酶抗體的免疫親和純化用1ml0.1M甘氨酸-HCl pH2.5預(yù)洗脫木聚糖酶親和柱，接著在磷酸緩沖鹽溶液，pH7.3(PBS)中進(jìn)行平衡。通過(guò)重力將5ml山羊抗木聚糖酶血清加入柱子。然后用PBS洗滌柱子直至達(dá)到基線。使用1ml的0.1M甘氨酸-HCl pH2.5接著用PBS洗脫結(jié)合的木聚糖酶抗體。收集2ml的級(jí)分。對(duì)每個(gè)級(jí)分記錄280nm處的吸光度。將回收的抗體對(duì)0.1M NaHCO3pH8.3進(jìn)行透析。
山羊抗木聚糖酶親和柱的制備
按照廠商說(shuō)明書(shū)，將山羊抗木聚糖酶(大約13mg)加入至經(jīng)雙蒸水洗滌的affigel-10(Bio-Rad)。將木聚糖酶抗體結(jié)合的affigel-10倒入2ml柱中。
木聚糖酶的免疫親和純化用1ml 0.1M甘氨酸-HCl pH2.5預(yù)洗脫木聚糖酶抗體親和柱，接著在磷酸緩沖鹽溶液，pH7.3(PBS)中進(jìn)行平衡。將1克凍干的畢赤酶母木聚糖酶(XYL-PP6002-PD064)懸浮于5ml dH2O和5ml PBS中并在4℃下混合30分鐘。通過(guò)重力將全部懸浮液加到柱上并收集未結(jié)合的溶液(流過(guò))。然后用PBS洗滌柱子直至達(dá)到基線。使用1ml 0.1M甘氨酸-HCl pH2.5接著用PBS洗脫結(jié)合的木聚糖酶。收集2ml級(jí)分。記錄每個(gè)級(jí)分在280nm的吸光度。將含有蛋白(A280＞0.09)的級(jí)分混合。將流過(guò)液反復(fù)過(guò)柱直至無(wú)木聚糖酶可被回收。
實(shí)施例10經(jīng)純化的酶的蛋白濃度使用2種不同的方法測(cè)量經(jīng)純化的畢赤氏酵母木聚糖酶(XYL-PP6002-PD064)的濃度。第一種方法BCA蛋白測(cè)定法(PierceChemicals)使用牛血清白蛋白(BSA)作為參照蛋白。兩個(gè)不同的條件(37℃下進(jìn)行30分鐘，室溫下進(jìn)行2小時(shí))獲得非常相似的結(jié)果。
所述蛋白濃度估計(jì)為0.403 mg/mL(參見(jiàn)表8和9)。
表837℃，30分鐘
表9室溫下，2小時(shí)
第二種方法由測(cè)量蛋白質(zhì)的象素密度組成，所述蛋白在SDS-PAGE上電泳并用蛋白特異性染料SYPRO Tangerine(Invitrogen)進(jìn)行染色。因?yàn)楫叧嗍辖湍府a(chǎn)生的木聚糖酶除了20kD的天外然蛋白外，還含有多種同種型，選擇所有條帶進(jìn)行象素定量。將酶的濃度和標(biāo)準(zhǔn)的碳酸酐酶進(jìn)行比較，該酶遷移至大約33kDa。在純化的木聚糖酶樣品中濃度大約為0.125mg/mL。
表10
木聚糖酶PP6002 PD064
實(shí)施例11.純化的酶的比活性測(cè)量抗體純化的樣品對(duì)小麥阿拉伯木聚糖的比活性。將等分樣品稀釋至大約1000倍并用DNS方案進(jìn)行測(cè)定。
該方案描述了測(cè)量在糖類特別是木聚糖和葡聚糖水解過(guò)程中產(chǎn)生的還原性末端的方法。所述測(cè)定法基于還原性末端和二硝基水楊酸(DNS)的反應(yīng)。DNS測(cè)定法具有幾個(gè)優(yōu)于其他還原性糖測(cè)定法例如Somogyi-Nelson法的有利方面，包括更低的檢測(cè)限、稍快的分析時(shí)間和使用較少的有毒試劑(即在Somogyi-Nelson方案中使用的砷酸鈉)。此處提供的方法基于Miller G.L.(1959)Anal.Chem.31 426-428中的方案。
試劑使用18mΩ的水制備所有試劑和檢測(cè)溶液0.4M氫氧化鈉。將16.0g無(wú)水氫氧化鈉(Fisher S318)通過(guò)攪拌溶解在1L燒杯中的900mL水中。轉(zhuǎn)移至1L的容量瓶中，并用水將體積調(diào)整為1L。標(biāo)好標(biāo)簽并在4℃下貯存，不超過(guò)90天。
DNS試劑。將5.0g3，5-二硝基水楊酸(Sigma D0550)和150.g酒石酸鉀鈉四水合物(Fisher S387)溶解在900ml 0.4M氫氧化鈉。轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中并用0.4M氫氧化鈉將體積調(diào)整至1L。通過(guò)0.2μm過(guò)濾器器過(guò)濾。在室溫下貯存。注意該試劑是橙黃色顏色。
200mM醋酸鈉緩沖液，pH5.30(2xSAB)。將27.2g醋酸鈉三水合物(Fisher S209-3)通過(guò)攪拌溶解在1L燒杯中的900mL水中。用冰醋酸(Fisher A38)將pH調(diào)整至5.304±0.05并轉(zhuǎn)至1L容量瓶中。加入20.mL 2％w/v水中的疊氮化鈉并將體積調(diào)整至1L。通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾。標(biāo)上標(biāo)簽并在4℃下貯存。溶液在數(shù)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
2％w/v水中的疊氮化鈉。將2.00g疊氮化鈉(Sigma S8032)通過(guò)攪拌溶解在玻璃燒杯中的90mL水中。轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中。用水洗滌燒杯并混合入容量瓶。用水將體積調(diào)整至100mL。
100mM醋酸鈉緩沖液，pH 5.30(1xSAB)。
將500mL 2xSAB加入至1L容量瓶中。用水將體積調(diào)整至1L。標(biāo)上標(biāo)簽并在4℃下貯存。溶液在數(shù)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
底物溶液1xSAB中的1.40％w/v小麥阿拉伯木聚糖。精確地稱取1.40g小麥阿拉木聚糖(Megazyme P-WAXYM)裝入120ml干燥耐熱燒杯(pyrex beaker)。用8mL 95％乙醇濕潤(rùn)樣品。加入磁力攪拌棒，然后加入50mL 2xSAB和30mL水。蓋上蓋并立即將漿放在磁力攪拌器平板上，劇烈攪拌過(guò)夜或直至溶解。轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中。用約0mL水洗滌燒杯與容量瓶中的內(nèi)容物混合。用水將體積調(diào)整至100mL。標(biāo)上標(biāo)簽并在4℃下貯存。溶液在數(shù)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
木糖濃縮貯存液，1xSAB中的10.0mg/mL D(+)木糖。
將250.0mg D(+)木糖(Sigma X1500)通過(guò)攪拌溶解在50mL玻璃燒杯中的20mL 1xSAB中。將溶液轉(zhuǎn)至25mL容量瓶中。用4mL 1xSAB洗滌燒杯并混合入容量瓶。用1xSAB將體積調(diào)整至25mL。
木糖工作貯存液，1xSAB中的1.00mg/mL D(+)木糖將10.0mL木糖濃縮貯存液加入至100mL容量瓶中。加入1xSAB至100mL。
木糖標(biāo)準(zhǔn)液使用下面的表在15mL錐形瓶中為木糖標(biāo)準(zhǔn)液制備合適的稀釋度，其中溶液A＝木糖工作貯存液而溶液B＝1xSAB。應(yīng)用使用positive移液器轉(zhuǎn)移溶液A和B。使用間期，木糖標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)當(dāng)在4℃下貯存。
表11.
可制備更大等分的木糖標(biāo)準(zhǔn)液并在4℃下貯存長(zhǎng)達(dá)90天。
樣品制劑對(duì)于用于木聚糖酶活性測(cè)量的DNS測(cè)定法的新手，如下所述制備單瓶對(duì)照木聚糖酶。為了多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的交叉(cross-over)研究，如下制備5瓶對(duì)照木聚糖酶。
注意應(yīng)當(dāng)只使用玻璃器皿制備木聚糖酶溶液，因?yàn)橐扬@示塑料器皿結(jié)合木聚糖酶從而降低活性。
對(duì)照木聚糖酶(包括用于交叉研究的)記錄瓶中所裝固體的重量(根據(jù)標(biāo)簽)。向一個(gè)對(duì)照木聚糖酶(lotXYL-PP6002-PDO14R)的瓶中加入10.0g±0.100g水并記錄重量。對(duì)照木聚糖酶的各個(gè)瓶含有100.mg±1.0mg固體。輕微地渦旋直至完全溶解。
工作對(duì)照木聚糖酶溶液由于在該測(cè)定法中遇到非常高的稀釋率，詳述樣品的制備非常重要。使用1xSAB制備所有稀釋度。為確定比活性，如下所述制備每個(gè)小瓶的對(duì)照木聚糖酶的稀釋度。
對(duì)于起始稀釋度，稱取大約0.100g對(duì)照木聚糖酶放入經(jīng)稱重的16×100mm玻璃試管中并記錄重量。加入大約10mL 1xSAB并記錄重量，產(chǎn)生1∶100的稀釋度(參見(jiàn)下表中的稀釋度)。
通過(guò)稱取大約0.100g 1∶100稀釋物放入經(jīng)稱重的16×100mm玻璃試管中來(lái)制備第二稀釋度，并記錄重量。加入大約10mL 1xSAB并記錄重量，產(chǎn)生1∶10,000稀釋度(參見(jiàn)下表中的稀釋度)。
表12.
液體木聚糖酶樣品的制備將液體木聚糖酶樣品不加修飾地用作制備如下所述的工作木聚糖酶溶液的貯存液。
固體(例如，凍干的)木聚糖酶樣品的制備向100mg木聚糖酶樣品中加入1.00mL水。輕輕地渦旋直至完全溶解。
液體或固體木聚糖酶樣品的工作木聚糖酶溶液由于非標(biāo)準(zhǔn)樣品中的可變的預(yù)期表達(dá)水平，樣品之間的合適的稀釋度可發(fā)生變化。如上所述為工作對(duì)照木聚糖酶溶液制備起始稀釋度(1∶100)。
如果想要的稀釋度在1∶100和1∶10,000之間，那么，制備最終的工作稀釋度并記錄樣品的重量，將1xSAB用于稀釋。如果想要的稀釋度高于1∶10,000，那么如上所述為工作木聚糖酶溶液首先制備1∶10,000的稀釋度。通過(guò)如上所述的重量法為對(duì)照木聚糖酶制備最終的工作稀釋度。
比活性確定方法概述為精確地確定比活性，使用用于DNS測(cè)定法測(cè)量木聚糖酶活性，要求對(duì)各工作木聚糖酶溶液進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)試。為進(jìn)行該測(cè)定方案在第0和15分鐘采集數(shù)據(jù)。注意，當(dāng)處理許多樣品時(shí)，只要單個(gè)0時(shí)間重復(fù)就足夠了。在該情況下，各工作木聚糖酶溶液產(chǎn)生4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。同樣，推薦木糖標(biāo)準(zhǔn)液至少要包含兩份重復(fù)。
注意0μg/mL木糖標(biāo)準(zhǔn)液也被認(rèn)為是試劑空白，即，該樣品代表單獨(dú)由底物溶液產(chǎn)生的背景。
下表旨在顯示樣品、標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照反應(yīng)是如何得來(lái)的表13.
移液器校準(zhǔn)使用P-1000測(cè)量和記錄5個(gè)1xSAB的0.2mL等分試樣的質(zhì)量，所述SAB被遞送至經(jīng)分析天平稱重的燒杯中。電子表格計(jì)算1xSAB的0.2mL等分試樣的平均質(zhì)量。使用該經(jīng)較準(zhǔn)的P-1000移液管進(jìn)行該方案。
比活性的確定方法·使用positive移液分配器，用5mL重復(fù)移液頭將底物溶液的500μL等分試樣分配至13×100mm玻璃管中記住對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)對(duì)各酶進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè)(第0和15分鐘；因此，對(duì)于每一個(gè)工作木聚糖酶溶液需要6個(gè)底物等分試樣)。
·將裝有底物溶液的試管放37℃水浴中進(jìn)行至少5分鐘。
·將5mL待檢測(cè)的各工作木聚糖酶溶液等分至16×100mm玻璃試管中并在37℃水浴中平衡至少5分鐘。
·將500μL的各木糖標(biāo)準(zhǔn)液等分至1.5mL eppendorf管中并在37℃水浴中平衡至少5分鐘。
·對(duì)于0時(shí)間點(diǎn)的樣品，使用positive移液器，用5mL移液頭向這些管中加入700μL DNS試劑。
·使用5mL重復(fù)移液頭向底物溶液的等分試樣中加入200μL工作木聚糖酶溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。通過(guò)渦旋混合溶液并放回至37℃水浴中。
·在所有的酶反應(yīng)啟動(dòng)后，向恰當(dāng)標(biāo)記的含有底物溶液的管中加入200μL木糖標(biāo)準(zhǔn)液。
·15分鐘后，使用positive移液器，用5mL移液頭向恰當(dāng)標(biāo)記的管中加入700μL DNS試劑并從水浴中取出。強(qiáng)烈渦旋。
·在所有酶反應(yīng)終止后，向各底物溶液中的木糖標(biāo)準(zhǔn)液的各等分試樣加入700μL DNS試劑并將樣品從水浴中取出，強(qiáng)烈渦旋。
·將管放入強(qiáng)烈沸騰的水浴中或油浴中進(jìn)行正好10分鐘。
注意在正好100℃下水浴是必需的并且溫育時(shí)間正好是10分鐘。
·將管從沸騰的水浴中取出并放在室溫下的水浴鍋中。讓溫度冷卻至室溫至少5分鐘。
·轉(zhuǎn)移至少1mL內(nèi)容物至1.5mL聚苯乙烯杯中并測(cè)量在540nm處的吸光度。
比活性的計(jì)算在內(nèi)嵌式(embedded)工作表格的恰當(dāng)單元格中輸入標(biāo)準(zhǔn)和樣品的吸光度。工作表格通過(guò)以吸光度讀數(shù)(OD540)對(duì)木糖濃度(μmol/測(cè)定物)作圖自動(dòng)地產(chǎn)生木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后使用下面的方程用該標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品的吸光度轉(zhuǎn)化成比活性。
[＝]μmoles木糖等同物/分鐘/g原始酶[＝]單位/g原始未稀釋的酶樣品其中DF＝稀釋因子(根據(jù)第一、第二和另外的稀釋度計(jì)算的)t2＝第二時(shí)間點(diǎn)(例如，15分鐘)t1＝第一時(shí)間點(diǎn)(例如，0分鐘)Vs＝樣品重量(例如，0.2g)在不同的三天進(jìn)行的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表14。也顯示了TAM材料PD064的活性以比較兩個(gè)部分。
表14
所用的公式是活性(單位/g)＝(稀釋因子/時(shí)間×樣品重量)×(OD15分鐘-OD0分鐘/斜率)純化的酶的平均活性是每克酶溶液259個(gè)單位，各實(shí)驗(yàn)之間存在很小的變化。未純化的類型顯示超過(guò)10倍的更高的活性，這是因?yàn)槠錆舛纫叩枚?如通過(guò)BCA方法測(cè)量的，10mg/mL對(duì)純化的樣品中的0.400mg/mL)。當(dāng)修正酶的濃度后，每克干物質(zhì)的活性在純化的部分中現(xiàn)在為每mg固體650U，對(duì)比在TAM樣品中每mg固體373U。
實(shí)施例12.最適反應(yīng)條件在很廣的pH值范圍內(nèi)測(cè)量Quantum木聚糖酶的活性以確定最適pH，還確定酶在pH2至3的酸性條件下是否顯示明顯的活性，該酸性條件是模擬單胃動(dòng)物消化道中的條件。
以1∶9187稀釋PP6002類型(lot)PD064Quantum木聚糖酶(10mg/mL)并經(jīng)受從1.5至9的pH條件范圍。在下面表15中指定的緩沖液中準(zhǔn)備反應(yīng)條件和小麥阿拉伯木聚糖底物。
表15.
在pH緩沖溶液中稀釋酶貯存液(10mg/mL)并將其加至也用相同緩沖液配制的底物中。使用DNS方案在37℃進(jìn)行所有反應(yīng)15分鐘。建立木糖(在0.1M Na Ac中，pH5.3)的校準(zhǔn)曲線，斜率為0.8582，也修正該曲線以獲得0值截距。(R2＝0.9982)。結(jié)果來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)并且代表3個(gè)吸光度讀數(shù)的平均值，將其修正至t＝0分鐘的吸光度(即反應(yīng)前加入的DNS)。
然后以對(duì)應(yīng)于最大活性值(此處在pH＝5.5時(shí)觀察到的)的百分比記錄Quantum木聚糖酶的活性。在更高的pH下，活性下降，在pH9.0時(shí)變成極限值(大約為在pH6.0時(shí)的活性的5％)。在酸性pH下具有殘留的活性，但在pH＝3.0時(shí)只具有11％)，在低于pH(1.5；2；2.5)則無(wú)活性。結(jié)果顯示于圖5中。
實(shí)施例13.熱耐受性通過(guò)ELISA和活性測(cè)定法確定酶的熱耐受性在以5℃的增量從37至99℃進(jìn)行熱處理后，測(cè)量Quantum木聚糖酶的活性。在0.1M NaOAc pH5.3中制備10mg/mL的酶溶液并稀釋至1∶100。將1mL經(jīng)1∶100稀釋的酶樣品加熱，然后進(jìn)一步稀釋至1∶10,000并使用DNS方案測(cè)定活性。
確定木糖的校準(zhǔn)曲線。結(jié)果以37℃時(shí)的活性的百分比顯示于圖6中。其是兩個(gè)在不同的兩天進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示于圖6。
PP6002在到達(dá)55℃之前顯示100％的活性，此時(shí)其開(kāi)始下降。然后直到65℃其活性保持在80％以上，這時(shí)其進(jìn)一步下降，到80℃時(shí)下降至大約45％。高于該溫度活性維持在相同的水平。這清楚地表明PP6002在即使更高的溫度上仍顯示特異性活性。
純蛋白和其他木聚糖酶通過(guò)活性進(jìn)行的熱耐受性的比較將Quantum木聚糖酶的活性和Thermomyces lanuginosus(Megazyme)以及大腸桿菌產(chǎn)生的BD6002木聚糖酶的活性進(jìn)行比較。在0.1M NaOAc pH.5.3中配制10mg/mL的酶溶液并稀釋至各種水平，以使在對(duì)照溫度37℃下吸光度值在相似的范圍內(nèi)。
測(cè)定的溫度在37℃至95℃范圍內(nèi)。確定針對(duì)木糖的較正曲線。結(jié)果以在37℃時(shí)的活性的百分比顯示于圖7中。如上面所看到的PP6002即使在高溫下仍顯示較強(qiáng)的特異性活性，其在95℃顯示超過(guò)40％的活性。
BD6002大腸桿菌在達(dá)到55℃之前顯示100％的活性。高于該溫度其急劇下降直至在或高于75℃時(shí)檢測(cè)不到活性。
來(lái)自長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma Longibrachiatum)(MegazymeInternational)的商購(gòu)可獲得的酶也未顯示耐熱性。其活性在高于55℃時(shí)急劇下降，直至高于65℃時(shí)失去活性。這些結(jié)果證實(shí)了Quantume木聚糖酶(當(dāng)在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生時(shí))的耐熱特性，并且一個(gè)可能的原因是耐熱性與其同種型有關(guān)，其中之一些是糖基化修飾的。結(jié)果參見(jiàn)圖7。
盡管本發(fā)明已通過(guò)其特定的實(shí)施例進(jìn)行描述，但要理解大量的變化、修飾和其他實(shí)施方案也是可能的，因此所有這些變化、修飾和實(shí)施方案被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本說(shuō)明書(shū)中討論或引用了大量專利、申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)，所有資料其全文在此引用作為參考。
序列表<110>Syngenta Participations AGBauer，MichaelBedford，MichaelPulliam，Derrick<120>微生物表達(dá)的木聚糖酶及其作為飼料添加劑的用途和其他用途<130>70357WOPCT<150>60/531,404<151>2003-12-19<160>39<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>555<212>DNA<213>人工序列<220>
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Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr35 40 45aga gta atc aac tac aat gcc gga gct ttt tct cct tct ggt aat ggt192Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn Gly50 55 60tac ttg gcc ttg tat gga tgg aca aga aac tct ttg att gaa tat tac240Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr65 70 75 80gtt gtg gat tcc tgg ggt act tat cgt cca act gga aca tat aaa ggt288Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly85 90 95act gta act tct gac gga ggt acc tat gat att tac aca act aca aga336Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg100 105 110act aat gct cca tct atc gac gga aat aac act aca ttt acc cag ttt384Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe115 120 125tgg tct gtc aga caa tct aaa aga cct att gga act aat aat acc ata432Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile130 135 140act ttc agt aat cat gtt aac get tgg aag tca aaa ggt atg aac ttg480Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu145 150 155 160ggt tcc tcc tgg tee tac caa gtt ttg gca act gag ggt tac caa tct528Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser165 170 175agt ggt tat tca aat gtt act gtc tgg555Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185<210>2<211>185<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>pp6002的木聚糖酶編碼區(qū)<400>2Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val1 5 10 15Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn20 25 30Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr35 40 45Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn Gly50 55 60Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr65 70 75 80Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly85 90 95Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg100 105 110Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe115 120 125Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile130 135 140Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu145 150 155 160
Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser165 170 175Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185<210>3<211>591<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pp6016的木聚糖酶編碼區(qū)<220>
<221>CDS<222>(1)..(591)<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(591)<400>3gct cag act atc tgt tct aac cag act ggt act aat aac gga tat ttt 48Ala Gln Thr Ile Cys Ser Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Phel 5 10 15tac tca ttt tgg aag gac act ggt tct gca tgc atg acc ctt ggt tcc 96Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Thr Gly Ser Ala Cys Met Thr Leu Gly Ser20 25 30gga gga aac tat tct gtt aat tgg aac ttg ggt tct ggt aat atg gtc144Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Asn Leu Gly Ser Gly Asn Met Val35 40 45tgt ggt aag gga tgg tct acc gga tct tca tca aga aga atc ggt tac192Cys Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ile Gly Tyr50 55 60
aac gca gga gtt tgg gcc cca aac ggt aac gct tac ttg aca ttg tat240Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr65 70 75 80ggt tgg act agg aac cct ttg ata gaa tac tac gtc gta gat agt tgg288Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp85 90 95gga tca tgg cgt cct cca ggt gga act tca gct ggt acc gta aat tcc336Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Ala Gly Thr Val Asn Ser100 105 110gat gga ggt act tat aat tta tac aga act caa agg gtg aac gct cca384Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Ala Pro115 120 125tct att gat ggt acc aga act ttt tac caa tat tgg tcc gtt aga aca432Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr130 135 140agt aaa cgt cct act gga tct aat cag aca att aca ttc gca aat cat480Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Gln Thr Ile Thr Phe Ala Asn His145 150 155 160gtt aat gct tgg aga tcc aaa ggt tgg aat ctg ggt tct cac gtg tac528Val Asn Ala Trp Arg Ser Lys Gly Trp Asn Leu Gly Ser His Val Tyr165 170 175caa att atg gcc act gag ggt tat caa tct agt gga aat tct aat ttg576Gln Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Asn Ser Asn Leu180 185 190aca gtt tgg gct caa591Thr Val Trp Ala Gln195<210>4<211>197<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pp6016的木聚糖酶編碼區(qū)
<400>4Ala Gln Thr Ile Cys Ser Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Phe1 5 10 15Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Thr Gly Ser Ala Cys Met Thr Leu Gly Ser20 25 30Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Asn Leu Gly Ser Gly Asn Met Val35 40 45Cys Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ile Gly Tyr50 55 60Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr65 70 75 80Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp85 90 95Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Ala Gly Thr Val Asn Ser100 105 110Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Ala Pro115 120 125Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr130 135 140Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Gln Thr Ile Thr Phe Ala Asn His145 150 155 160Val Asn Ala Trp Arg Ser Lys Gly Trp Asn Leu Gly Ser His Val Tyr
165 170 175Gln Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Asn Ser Asn Leu180 185 190Thr Val Trp Ala Gln195<210>5<211>972<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PP6407的木聚糖酶編碼區(qū)<220>
<221>CDS<222>(1)..(972)<220>
<221>msic_特征<222>(1)..(972)<400>5gca caa act ttg aac aac aac tcc act gga act cac gac ggt ttt tat 48Ala Gln Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Tyr1 5 10 15tac aca ttt tgg aaa gac tct ggt tct gct tcc atg acc ctt cac cct 96Tyr Thr Phe Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Ser Met Thr Leu His Pro20 25 30ggt gga aga tat tca tca cag tgg aca tct aac act aac aat tgg gtt144Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Gln Trp Thr Ser Asn Thr Asn Asn Trp Val35 40 45ggt ggt aag ggt tgg aac cct gga ggt cct aga gta gtt aac tac agt192Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Gly Pro Arg Val Val Asn Tyr Ser50 55 60
gga tat tac ggt gtt aat aac tcc caa aac tcc tac ctt gcc ttg tac240Gly Tyr Tyr Gly Val Asn Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr65 70 75 80ggt tgg act cgt aat cct ttg gtg gaa tac tac gtt att gag agt tac288Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr85 90 95ggt tct tac aat cca gca tcc tgt gct gga gga gtt gat tat ggt tcc336Gly Ser Tyr Asn Pro Ala Ser Cys Ala Gly Gly Val Asp Tyr Gly Ser100 105 110ttc caa tct gac ggt gct acc tat aac gta aga agg tgc ttg aga caa384Phe Gln Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Leu Arg Gln115 120 125aat gct cca agt atc gaa ggt aat aac tct aca ttt tac cag tac ttt432Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Asn Asn Ser Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe130 135 140tca gtt cgt aat cca aag aag ggt ttc ggt aat att tct ggt act att480Ser Val Arg Asn Pro Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Ser Gly Thr Ile145 150 155 160acc gtc gct aat cat ttt aat tat tgg gca tcc aga ggt ctg aac tta528Thr Val Ala Asn His Phe Asn Tyr Trp Ala Ser Arg Gly Leu Asn Leu165 170 175gga aac cat gat tat atg gtt ttc gcc act gaa ggt tat caa tct caa576Gly Asn His Asp Tyr Met Val Phe Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Gln180 185 190ggt tct agt gat att act gtg tca agt ggt act gga ggt ggt gga gga624Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly195 200 205gga gga aat acc gga tct aaa aca ata gtc gtc aga gcc aga ggt acc672Gly Gly Asn Thr Gly Ser Lys Thr Ile Val Val Arg Ala Arg Gly Thr210 215 220gca ggt gga gag aat ata tcc ttg aag gta aat aat gcc act atc gct720Ala Gly Gly Glu Asn Ile Ser Leu Lys Val Asn Asn Ala Thr Ile Ala225 230 235 240
tca tgg acc ttg aca act tca atg gct aac tac aca gct act aca tct768Ser Trp Thr Leu Thr Thr Ser Met Ala Asn Tyr Thr Ala Thr Thr Ser245 250 255gct tct ggt gga tct ctg gtt gag ttc act aac gat gga ggt aat aga816Ala Ser Gly Gly Ser Leu Val Glu Phe Thr Asn Asp Gly Gly Asn Arg260 265 270gat gtt caa gtg gac tat tta rca gtc aat ggt gct gtc aga caa gca864Asp Val Gln Val Asp Tyr Leu Ser Val Asn Gly Ala Val Arg Gln Ala275 280 285gaa gat cag act tat aat act ggt gtg tat cag aac gga cag tgc gga912Glu Asp Gln Thr Tyr Asn Thr Gly Val Tyr Gln Asn Gly Gln Cys Gly290 295 300ggt gga aac gga agg tct gag tgg ttg cat tgt aac ggt gcc att gga960Gly Gly Asn Gly Arg Ser Glu Trp Leu His Cys Asn Gly Ala Ile Gly305 310 315 320ttt ggt aat ttg972Phe Gly Asn Leu<210>6<211>324<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PP6407的木聚糖酶編碼區(qū)<400>6Ala Gln Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Tyr1 5 10 15Tyr Thr Phe Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Ser Met Thr Leu His Pro20 25 30
Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Gln Trp Thr Ser Asn Thr Asn Asn Trp Val35 40 45Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Gly Pro Arg Val Val Asn Tyr Ser50 55 60Gly Tyr Tyr Gly Val Asn Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr65 70 75 80Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr85 90 95Gly Ser Tyr Asn Pro Ala Ser Cys Ala Gly Gly Val Asp Tyr Gly Ser100 105 110Phe Gln Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Leu Arg Gln115 120 125Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Asn Asn Ser Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe130 135 140Ser Val Arg Asn Pro Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Ser Gly Thr Ile145 150 155 160Thr Val Ala Asn His Phe Asn Tyr Trp Ala Ser Arg Gly Leu Asn Leu165 170 175Gly Asn His Asp Tyr Met Val Phe Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Gln180 185 190Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly195 200 205
Gly Gly Asn Thr Gly Ser Lys Thr Ile Val Val Arg Ala Arg Gly Thr210 215 220Ala Gly Gly Glu Asn Ile Ser Leu Lys Val Asn Asn Ala Thr Ile Ala225 230 235 240Ser Trp Thr Leu Thr Thr Ser Met Ala Asn Tyr Thr Ala Thr Thr Ser245 250 255Ala Ser Gly Gly Ser Leu Val Glu Phe Thr Asn Asp Gly Gly Asn Arg260 265 270Asp Val Gln Val Asp Tyr Leu Ser Val Asn Gly Ala Val Arg Gln Ala275 280 285Glu Asp Gln Thr Tyr Asn Thr Gly Val Tyr Gln Asn Gly Gln Cys Gly290 295 300Gly Gly Asn Gly Arg Ser Glu Trp Leu His Cys Ash Gly Ala Ile Gly305 310 315 320Phe Gly Asn Leu<210>7<211>579<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pp7436的木聚糖酶編碼區(qū)<220>
<221>CDS<222>(1)..(579)
<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(579)<400>7gag gct gaa gct gct ctg atg gct tcc act ttc tac tgg cat ctt tgg 48Glu Ala Glu Ala Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp1 5 10 15act gat gga atc ggt aca gtt aac gcc acc aac ggt tcc gat gga aac 96Thr Asp Gly Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn20 25 30tac tcc gtt tct tgg agt aac tgt gga aac ttt gtc gta ggc aag gga144Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly35 40 45tgg acc act ggc agt gca acc aga gtc att aac tac aat gcc cat gcc192Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala50 55 60ttt tct gtg gtt ggt aat gct tat tta gct ctc tat gga tgg aca aga240Phe Ser Val Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80aat tca cta atc gaa tac tat gtg gtt gat tct tgg ggt act tat aga288Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg85 90 95cca act ggt act tac aaa ggt act gtt acc tcc gac ggt ggc act tac336Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110gac att tac aca aca aca cgt act aac gct cct agt atc gac gga aat384Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn115 120 125aat aca acc ttt act cag ttc tgg tca gtt cga cag agt aag agg cca432Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro130 135 140att ggt acc aac aat act att acc ttc tct aat cac gta aat gca tgg480Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp
145 150 155 160aaa tct aag ggt atg aac ttg gga tct tca tgg agt tac caa gtc ttg528Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu165 170 l75gct act gag ggt tat caa rca tct ggt tat tct aat gta aca gtg tgg576Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185 190taa579<210>8<211>192<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pp7436的木聚糖酶編碼區(qū)<400>8Glu Ala Glu Ala Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp1 5 10 15Thr Asp Gly Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn20 25 30Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly35 40 45Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala50 55 60Phe Ser Val Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg
85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn115 120 125Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro130 135 140Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp145 150 155 160Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu165 170 175Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185 190<210>9<211>598<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PP6002盒<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(598)<400>9tttccctctc gagaagaggg catctactga ctactggcag aactggactg acggtggtgg 60taccgtgaac gctactaatg gtagtgatgg taattactca gtttcttggt caaactgtgg120
aaacttcgtc gttggtaagg gatggacaac cggatctget actagagtaa tcaactacaa180tgccggagct ttttctcctt ctggtaatgg ttacttggec ttgtatggat ggacaagaaa240ctctttgatt gaatattacg ttgtggattc ctggggtact tatcgtccaa ctggaacata300taaaggtact gtaacttctg acggaggtac ctatgatatt tacacaacta caagaactaa360tgctccatct atcgacggaa ataacactac atttacccag ttttggtctg tcagacaatc420taaaagacct attggaacta ataataccat aactttcagt aatcatgtta acgcttggaa480gtcaaaaggt atgaacttgg gttcctcctg gtcctaccaa gttttggcaa ctgagggtta540ccaatctagt ggttattcaa atgttactgt ctggtaatag gcggccgcaa aaggaaaa 598<210>10<211>628<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PP6016表達(dá)盒<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(628)<400>10tttccctctc gagaagagag ctcagactat ctgttctaac cagactggta ctaataacgg 60atatttttac tcattttgga aggacactgg ttctgcatgc atgacccttg gttccggagg120aaactattct gttaattgga acttgggttc tggtaatatg gtctgtggta agggatggtc180taccggatct tcatcaagaa gaatcggtta caacgcagga gtttgggccc caaacggtaa240cgcttacttg acattgtatg gttggactag gaaccctttg atagaatact acgtcgtaga300tagttgggga tcatggcgtc ctccaggtgg aacttcagct ggtaccgtaa attccgatgg360
aggtacttat aatttataca gaactcaaag ggtgaacgct ccatctattg atggtaccag420aactttttac caatattggt ccgttagaac aagtaaacgt cctactggat ctaatcagac480aattacattc gcaaatcatg ttaatgcttg gagatccaaa ggttggaatc tgggttctca540cgtgtaccaa attatggcca ctgagggtta tcaatctagt ggaaattcta atttgacagt600ttgggctcaa tagtaagcgg ccgcaaaa 628<210>11<211>1009<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PP6407表達(dá)盒<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1009)<400>11tttccctctc gagaaaagag cacaaacttt gaacaacaac tccactggaa ctcacgacgg 60tttttattac acattttgga aagactctgg ttctgcttcc atgacccttc accctggtgg 120aagatattca tcacagtgga catctaacac taacaattgg gttggtggta agggttggaa 180ccctggaggt cctagagtag ttaactacag tggatattac ggtgttaata actcccaaaa 240ctcctacctt gccttgtacg gttggactcg taatcctttg gtggaatact acgttattga 300gagttacggt tcttacaatc cagcatcctg tgctggagga gttgattatg gttccttcca 360atctgacggt gctacctata acgtaagaag gtgcttgaga caaaatgctc caagtatcga 420aggtaataac tctacatttt accagtactt ttcagttcgt aatccaaaga agggtttcgg 480taatatttct ggtactatta ccgtcgctaa tcattttaat tattgggcat ccagaggtct 540gaacttagga aaccatgatt atatggtttt cgccactgaa ggttatcaat ctcaaggttc 600
tagtgatatt actgtgtcaa gtggtactgg aggtggtgga ggaggaggaa ataccggatc660taaaacaata gtcgtcagag ccagaggtac cgcaggtgga gagaatatat ccttgaaggt720aaataatgcc actatcgctt catggacctt gacaacttca atggctaact acacagctac780tacatctgct tctggtggat ctctggttga gttcactaac gatggaggta atagagatgt840tcaagtggac tatttatcag tcaatggtgc tgtcagacaa gcagaagatc agacttataa900tactggtgtg tatcagaacg gacagtgcgg aggtggaaac ggaaggtctg agtggttgca960ttgtaacggt gccattggat ttggtaattt gtaataggcg gccgcaaaa 1009<210>12<211>619<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PP7436表達(dá)盒<220>
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gttctggtca gttcgacaga gtaagaggcc aattggtacc aacaatacta ttaccttctc 480taatcacgta aatgcatgga aatctaaggg tatgaacttg ggatcttcat ggagttacca 540agtcttggct actgagggtt atcaatcatc tggttattct aatgtaacag tgtggtaata 600ggcggccgca aaaggaaaa 619<210>13<211>561<212>DNA<213>人工核苷酸序列<220>
<223>XYLA1A(BD6002)<220>
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Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys85 90 95ggc act gtg act agt gat gga ggg act tat gac ata tac acg act aca336Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr100 105 110cga acc aac gca cct tcc att gac ggc aat aat aca act ttc acc cag384Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln115 120 125ttc tgg agt gtt agg cag tcg aag aga ccg att ggt acc aac aat acc432Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr130 135 140atc acc ttt agc aac cat gtt aac gcc tgg aag agt aaa gga atg aat480Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn145 150 155 160ttg ggg agt agt tgg tct tat cag gta tta gca aca gag ggc tat caa528Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln165 170 175agt agt ggg tac tct aac gta acg gtc tgg taa561Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185<210>14<211>186<212>PRT<213>人工核苷酸序列<220>
<223>XylA1A(BD6002)<400>14Met Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr1 5 10 15Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser20 25 30
Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala35 40 45Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn50 55 60Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr65 70 75 80Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys85 90 95Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr100 105 110Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln115 120 125Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr130 135 140Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn145 150 155 160Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln165 170 175Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp180 185<210>15<211>561
<212>DNA<213>人工核苷酸<220>
<223>xylA1B(BD7436)<220>
<221>CDS<222>(1)..(561)<400>15atg gct tcg aca ttc tac tgg cac ttg tgg act gat ggt ata ggg aca 48Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp Thr Asp Gly Ile Gly Thr1 5 10 15gta aat gct acc aat gga tct gat ggc aat tac agc gtt tca tgg tca 96Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser20 25 30aat tgc ggg aat ttt gtt gtt ggt aaa ggc tgg act acc gga tea gca144Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala35 40 45act agg gta ata aac tat aat gcc cac gcc ttt tcg gta gtg ggt aat192Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala Phe Ser Val Val Gly Asn50 55 60gct tat ttg get ctt tat ggg tgg acg aga aat tca ctc ata gaa tat240Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr65 70 75 80tac gtc gtt gat agc tgg ggg act tat aga cct act gga act tat aaa288Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys85 90 95ggc act gtg act agt gat gga ggg act tat gac ata tac acg act aca336Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr100 105 110cga acc aac gca cct tcc att gac ggc aat aat aca act ttc acc cag384Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln115 120 125
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<220>
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<220>
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權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NOS1、3、5或7的序列的分離的核酸分子。
2.包含權(quán)利要求1的核酸序列的表達(dá)盒。
3.權(quán)利要求2的表達(dá)盒，其進(jìn)一步包含蛋白酶切割位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求3的表達(dá)盒，其中所述蛋白酶切割位點(diǎn)是KEX2蛋白酶切割位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其由SEQ ID NOS9、10、11或12的核酸序列編碼。
6.權(quán)利要求2的表達(dá)盒，其進(jìn)一步包含編碼分泌性信號(hào)肽的分離的核苷酸序列。
7.包含至少一個(gè)有效地連接至啟動(dòng)子的權(quán)利要求1的核酸分子的表達(dá)盒。
8.包含至少一個(gè)權(quán)利要求2的表達(dá)盒的載體。
9.權(quán)利要求8的載體，其包括稱為pBCS12771(SEQ ID NO33)、pBCS12772(SEQ ID NO34)或pSYN12773(SEQ ID NO35)的質(zhì)粒。
10.包含至少一個(gè)權(quán)利要求1的核酸分子的重組宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的重組宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞是克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Shizosaccharomyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜氏酵母屬(Hansuela)、埃希氏桿菌屬(Eschericia)、假單孢菌屬(Psudomonas)、乳芽孢桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、鏈孢霉屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)或青霉屬(Penicillium)細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)。
14.權(quán)利要求13的重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求9的載體。
15.制備耐熱性木聚糖酶的方法，其包括步驟a)在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)含有有效地連接至編碼木聚糖酶的核酸分子的啟動(dòng)子的表達(dá)盒，所述木聚糖酶在60℃30分鐘后保持至少40％的活性并在低于pH5.0并高于pH1.5的pH下具有大于400U/mg的比活性。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在70℃下30分鐘后仍保持至少40％的活性。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在80℃下30分鐘后仍保持至少40％的活性。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在85℃下30分鐘后仍保持至少40％的活性。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在缺少糖基化的情況下是耐熱性木聚糖酶。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶當(dāng)被宿主細(xì)胞糖基化時(shí)是耐熱性的。
21.權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包含分離耐熱性木聚糖酶的步驟。
22.權(quán)利要求15的方法，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細(xì)胞是克魯維氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、絲孢酵母屬、許旺氏酵母屬、畢赤氏酵母屬或漢遜氏酵母屬細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細(xì)胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)細(xì)胞。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤氏酵母。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細(xì)胞是埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、乳芽孢桿菌屬或芽孢桿菌屬。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬、根霉屬、木霉屬、鏈孢霉屬、毛霉屬或青霉屬細(xì)胞。
28.權(quán)利要求15的方法，其中所述木聚糖酶是由權(quán)利要求1的核酸編碼的。
29.權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸分子編碼包含木聚糖酶的融合多肽。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述融合多肽包含有效地連接至木聚糖酶的分泌性信號(hào)序列。
31.由權(quán)利要求21的方法制備和分離的分離的耐熱性木聚糖酶。
32.權(quán)利要求31的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶被糖基化。
33.包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的酶飼料添加劑。
34.制備動(dòng)物飼料的方法，其包括步驟a)提供包含動(dòng)物飼料成分和包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的制劑的混合物，和b)在高于75-90℃的溫度下加熱該混合物，從而生產(chǎn)經(jīng)加熱處理的動(dòng)物飼料混合物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述包含木聚糖酶的制劑是液體制劑。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述包含木聚糖酶的制劑是固體制劑。
37.權(quán)利要求34的方法，其中a)中所述混合物還包含至少一種維生素、礦質(zhì)、除耐熱性木聚糖酶以外的酶、有機(jī)酸、益生菌產(chǎn)物、精油或谷物加工聯(lián)產(chǎn)品。
38.由權(quán)利要求34的方法產(chǎn)生的經(jīng)熱處理的動(dòng)物飼料混合物。
39.權(quán)利要求34的方法，其還包含通過(guò)制粒機(jī)將熱處理的混合物擠壓而產(chǎn)生經(jīng)?；膭?dòng)物飼料的步驟。
40.由權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的經(jīng)粒化的動(dòng)物飼料。
41.權(quán)利要求40的經(jīng)粒化的動(dòng)物飼料，其中在制粒機(jī)中在大約85℃下對(duì)所述混合物進(jìn)行蒸汽處理，這樣超過(guò)70％的預(yù)熱處理的酶促活性得到保持，并通過(guò)pellet dye擠壓出所述飼料。
42.權(quán)利要求40的經(jīng)?；膭?dòng)物飼料，其中在制粒機(jī)中在大約85℃下對(duì)所述混合物進(jìn)行蒸汽處理，這樣超過(guò)90％的預(yù)熱處理的酶促活性得到保持，并通過(guò)pellet dye擠壓出所述飼料。
43.權(quán)利要求40的經(jīng)粒化的動(dòng)物飼料，其中在制粒機(jī)中在大約90℃下對(duì)所述混合物進(jìn)行蒸汽處理以使至少80％的預(yù)熱處理的酶促活性得到保持，并且過(guò)pellet dye擠壓出所述飼料。
44.包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的動(dòng)物飼料組合物。
45.權(quán)利要求44的飼料，其中所述谷物是小麥、黑麥、黑小麥、稻或玉米。
46.權(quán)利要求44的飼料，其中以1至10,000U/kg的包含率將一種或多種木聚糖酶加入至飼料中。
47.權(quán)利要求44的飼料，其中以50至5,000U/kg的包含率將一種或多種木聚糖酶加入至飼料中。
48.權(quán)利要求44的飼料，其中以200至3,200U/kg的包含率將一種或多種木聚糖酶加入至飼料中。
49.制備用于飼料制劑的含有耐熱性木聚糖酶的組合物的方法，其包括步驟a)將包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的液體溶液和大豆粗粉混合以產(chǎn)生混合物；和b)凍干所述混合物以產(chǎn)生包含耐熱性木聚糖酶的凍干組合物。
50.權(quán)利要求49的方法，其還包括將凍干的組合物和其他飼料成分混合以產(chǎn)生其他混合物的步驟。
51.由權(quán)利要求50的方法制備的凍干的組合物。
52.制備用于飼料制劑的含有木聚糖酶的組合物的方法，其包括步驟a)將包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的液體溶液和粗粉混合，從而產(chǎn)生混合物；b)和干燥所述混合物以產(chǎn)生經(jīng)干燥的組合物。
53.降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加動(dòng)物的體重增量的方法，其包括步驟給動(dòng)物喂食以在動(dòng)物中降低飼料轉(zhuǎn)化率有效量的包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的飼料。
54.提高動(dòng)物飼料的表觀代謝能的方法，其包括這樣的步驟，即以提高飼料的表觀代謝能有效量的一種或多種權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶配制動(dòng)物飼料。
55.提高動(dòng)物飼料或人食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其包括在動(dòng)物飼料或人食品制備期間加入權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶與步驟。
56.權(quán)利要求55的方法，其進(jìn)一步包括在合適的溫度和濕度條件下處理混合物從而促進(jìn)木聚糖的水解的步驟。
57.制備動(dòng)物飼料的方法，其包括步驟a)提供包含一種或多種飼料成分和包含權(quán)利要求31的耐熱性木聚糖酶的制劑的混合物；和b)在合適的溫度和濕度條件下處理所述混合物，從而水解存在于所述混合物中的木聚糖。
58.由權(quán)利要求57的方法制備的動(dòng)物飼料。
59.權(quán)利要求52至57中任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料是家禽飼料。
60.權(quán)利要求52至57中任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料是豬飼料。
61.權(quán)利要求52至57中任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料是反芻動(dòng)物飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及密碼子最優(yōu)化的木聚糖酶編碼序列和木聚糖酶在微生物和酵母中的表達(dá)。本發(fā)明還涉及使用多拷貝木聚糖酶表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行高水平的蛋白表達(dá)。本發(fā)明也涉及木聚糖酶作為飼料或食物添加劑的用途。本發(fā)明也涉及這樣的酶的表達(dá)方法，即通過(guò)在對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化的生物體中表達(dá)酶，和不對(duì)相同酶進(jìn)行糖基化的表達(dá)相比，增加了所述酶的耐熱性。此外，本發(fā)明涉及制備飼料、酶飼料添加劑的方法，和減少飼料轉(zhuǎn)化率或增加動(dòng)物的體重增量的方法。
文檔編號(hào)C12P21/06GK1981036SQ200480037926
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者M·S·鮑爾, M·R·貝德福德, D·A·普利亞姆 申請(qǐng)人:辛根塔參與股份公司