專利名稱：使用單倍體交配策略在酵母中合成異聚多亞基多肽的方法
背景技術(shù)：
重組蛋白生產(chǎn)是高通量篩選、功能驗證、結(jié)構(gòu)生物學、和藥物多肽生產(chǎn)的一項必需工作。大腸桿菌是廣泛用于表達異源蛋白的生物體，因為它易于在便宜的培養(yǎng)基上生長至高細胞密度，且具有完善建立的遺傳技術(shù)和表達載體。然而，這對高效生產(chǎn)活性生物分子并非總是足夠的。為了保持生物學活性，多肽鏈必需折疊成正確的天然三維結(jié)構(gòu)，包括適當形成二硫鍵，而且可能還需要正確聯(lián)合多種鏈。
盡管蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)在熱力學上可能是有利的，然而折疊的時間量程可以由幾毫秒至幾天變化。例如對亞基和亞結(jié)構(gòu)域排列的需要導入了動力學屏障。而且，特別是真核蛋白，為了形成正確折疊的蛋白質(zhì)，必需發(fā)生共價反應。后一類反應包括二硫鍵的形成、脯氨酸肽鍵周圍多肽鏈的順式/反式異構(gòu)化、前蛋白質(zhì)(preprotein)的加工、和輔基的連接。這些動力學限制可能導致部分折疊中間物的積聚，而它們所包含的暴露的疏水性“粘性”表面促進自我結(jié)合和集合體的形成。
抗體是在臨床診斷和治療中具有許多用途的四聚體蛋白質(zhì)。每個抗體四聚體由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。特定類型的純粹人源或人源化抗體難以或不可能由天然來源純化足夠數(shù)量以用于許多目的。結(jié)果是，生物技術(shù)和制藥公司轉(zhuǎn)向通過基于重組DNA的方法來進行大規(guī)模制備。功能抗體的生產(chǎn)不僅需要合成兩種多肽，而且需要許多翻譯后修飾，包括N端分泌信號序列的蛋白水解加工；多肽正確折疊和組裝成四聚體；二硫鍵的形成；和特定的N-連接糖基化。所有這些事件都發(fā)生在真核細胞分泌途徑中，即真核細胞獨特的細胞器聯(lián)合體。
這些復雜蛋白質(zhì)的重組合成必需依賴基于高等真核組織培養(yǎng)的系統(tǒng)來獲得生物學活性物質(zhì)。然而，基于哺乳動物組織培養(yǎng)的生產(chǎn)系統(tǒng)顯著比微生物發(fā)酵方法更加昂貴和復雜。另外，關于使用衍生自動物副產(chǎn)品的物質(zhì)來生產(chǎn)治療性產(chǎn)品仍然存在懷疑。
作為真核細胞，巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)具有高等真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點，諸如蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)折疊、和翻譯后修飾，同時又像大腸桿菌或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)那樣易于操作。它比其它真核表達系統(tǒng)諸如桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)要更快、更容易、且更便宜，而且通常得到更高表達水平。作為酵母，它享有與糖酵母屬一樣的分子和遺傳操作優(yōu)勢。這些特點使得畢赤氏酵母成為非常有用的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。
為糖酵母屬開發(fā)的許多技術(shù)可應用于畢赤氏酵母屬，包括互補轉(zhuǎn)化、基因破壞、和基因取代。另外，用于糖酵母屬的命名法已應用于畢赤氏酵母屬。糖酵母屬和畢赤氏酵母屬二者基因產(chǎn)物之間還存在交叉互補。來自糖酵母屬的幾種野生型基因補足了畢赤氏酵母屬的對應突變基因。
在巴斯德畢赤氏酵母中進行的異源表達可以是胞內(nèi)的或分泌的。分泌要求所表達蛋白質(zhì)上存在信號序列，從而將它靶向分泌途徑。盡管已經(jīng)成功使用了幾種不同的分泌信號序列，包括一些異源蛋白上存在的天然分泌信號，然而結(jié)果是易變的。異源蛋白分泌的一項潛在優(yōu)勢是巴斯德畢赤氏酵母分泌天然蛋白的水平很低?？紤]到畢赤氏酵母基本生長培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的數(shù)量很低，這意味著所分泌異源蛋白占據(jù)了培養(yǎng)基中總蛋白質(zhì)的極大部分，并且作為蛋白質(zhì)純化的第一步。
許多酵母物種(包括畢赤氏酵母屬)是能夠進行交配的。這使得兩種不同單倍體菌株能夠天然交配并生成具有兩個染色體拷貝的二倍體物種。
盡管巴斯德畢赤氏酵母已經(jīng)成功用于生產(chǎn)多種異源蛋白，例如乙肝表面抗原(Cregg等，1987，Bio/Technology 5479)、溶菌酶、和轉(zhuǎn)化酶(Digan等，1988，Dev.Indust.Micro.2959；Tschopp等，1987，Bio/Technology 51305)，然而在畢赤氏酵母中生產(chǎn)其它異源基因產(chǎn)物的努力(尤其是通過分泌)得到了不同的結(jié)果。在目前對巴斯德畢赤氏酵母表達系統(tǒng)的理解水平，不能預測是否能夠在這種酵母中將給定基因表達到明顯水平，或者畢赤氏酵母是否能夠耐受在它的細胞中存在重組基因產(chǎn)物。另外，尤其難以預報特定蛋白質(zhì)是否會由巴斯德畢赤氏酵母分泌，以及效率如何(如果分泌的話)。
本發(fā)明提供了用于由能交配的酵母(包括畢赤氏酵母屬物種)分泌異源異多聚體的改進方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重組異聚多亞基蛋白的方法。目的異聚多亞基蛋白包含至少兩種不同的多肽鏈，例如抗體的重鏈和輕鏈、MHC的α和β鏈、諸如此類。為每一種不同多肽鏈提供表達載體。
將每一種表達載體轉(zhuǎn)化到單倍體酵母細胞中。在本發(fā)明的有些實施方案中，單倍體酵母細胞是有遺傳標記的，其中單倍體酵母細胞是互補對中的一員。將第一種表達載體轉(zhuǎn)化到第一種單倍體細胞中；并將第二種表達載體轉(zhuǎn)化到第二種單倍體細胞中。通過直接遺傳融合使單倍體細胞發(fā)生交配，或者通過原生質(zhì)球融合誘導相似事件。
可以各個校準不同多肽在單倍體細胞中的表達水平，并通過適當?shù)倪x擇、載體的拷貝數(shù)、啟動子的強度和/或誘導、諸如此類進行調(diào)整。在本發(fā)明的一個實施方案中，每一種表達載體中的啟動子是不同的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，為每一種表達載體提供了相同的啟動子。啟動子可以是組成型的或誘導型的。
鑒定各自合成不同多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體細胞，然后進行遺傳雜交或融合。將由此產(chǎn)生的二倍體菌株用于生成和分泌完整組裝且有生物學功能的異聚多亞基蛋白。二倍體方法學容許優(yōu)化亞基配對，從而提高全長產(chǎn)物的生成和分泌。
附圖描述

圖1A-1D。組裝完成的全長重組抗體的生成。使用免疫印跡檢測方法學來鑒定各自生成抗體一種亞基的親本單倍體畢赤氏酵母菌株以及生成兩種亞基并形成完整組裝抗體的目標二倍體菌株。圖1A所示酵母菌株顯示了各自代表性菌株的靜態(tài)培養(yǎng)物，其中頂部是分別含有重鏈(H)和輕鏈(L)亞基的不同單倍體菌株；底部是生成兩種亞基的交配后穩(wěn)定的二倍體。圖1B顯示了重鏈的選擇性檢測，只發(fā)現(xiàn)于親本重鏈單倍體以及含有重鏈和輕鏈二者的交配后二倍體。圖1C顯示了重鏈和輕鏈的一般檢測，它確定了所有三種菌株中生成的蛋白質(zhì)都是有活性的。圖1D顯示了二倍體菌株中正確組裝的完整抗體的選擇性檢測，確認了只有二倍體系統(tǒng)能夠生成完整組裝的抗體。
圖2。巴斯德畢赤氏酵母中全長抗體的生成。使用二倍體巴斯德畢赤氏酵母菌株進行全長抗體的異源表達。使用蛋白A親和層析由條件培養(yǎng)基分離所輸出的抗體蛋白。顯示了峰級分的等份試樣。人IgG標準物衍生自純化的合并人IgG。
圖3。由經(jīng)改造生成全長小鼠/人嵌合抗體的二倍體巴斯德畢赤氏酵母菌株亞克隆的培養(yǎng)基上清液檢測和鑒定組裝完成的抗體。用抗人Fc選擇性抗體包被微量滴定板，由培養(yǎng)基捕捉抗體。使用識別配對的重鏈CH1和κ輕鏈恒定區(qū)的人選擇性(Fab′)2檢測正確組裝的抗體。將澄清培養(yǎng)基的連續(xù)稀釋液施加到板上。通過標準ELISA顯像方法進行顯影。如圖所示，檢測是選擇性的，mIgG標準物沒有產(chǎn)生任何可檢測信號。
圖4。由畢赤氏酵母生成的重組抗體以及傳統(tǒng)哺乳動物衍生抗體將包含CD3的Jurkat T細胞染色。將Jurkat T細胞固定在載波片上，并使用在酵母和哺乳動物細胞中生成的抗CD3抗體進行染色。使用生物素綴合抗嚙齒類二抗進行檢測，并用HRP-鏈霉親和素衍生物進行顯影。圖像是用各種重組抗體處理的載玻片上的代表性視野。背景是顯影的對照，即不使用抗CD3一抗。
實施方案詳述由能交配的酵母的二倍體菌株分泌重組異聚多亞基蛋白。用包含異聚多亞基蛋白的亞基的表達載體轉(zhuǎn)化一對有遺傳標記的酵母單倍體細胞。第一種單倍體細胞包含第一種表達載體，且第二種單倍體細胞包含第二種表達載體。任選的是，為了合成異三聚物、異四聚物等，可以將額外的表達載體導入單倍體或二倍體細胞，或者第一種或第二種表達載體可以包含額外的編碼序列?？梢愿鱾€校準不同多肽的表達水平，并通過適當?shù)倪x擇、載體的拷貝數(shù)、啟動子的強度和/或誘導、諸如此類進行調(diào)整。將經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體細胞進行遺傳雜交或融合。將由此產(chǎn)生的二倍體或四倍體菌株用于生成和分泌完整組裝且有生物學活性的異聚多亞基蛋白。
使用二倍體或四倍體細胞來生成蛋白質(zhì)提供了意想不到的好處?？梢猿鲇谏a(chǎn)目的即擴大規(guī)模，在延長的一段時間里，在可能對單倍體細胞的生長有害的條件下培養(yǎng)細胞，所述條件可以包括高細胞密度；在基本培養(yǎng)基中生長；在低溫生長；在缺乏選擇壓力下生長；以及為了維持異源基因序列的完整性和長時間維持高水平表達可能提供的條件。這些好處可能至少部分源自由兩個不同親本單倍體菌株形成二倍體菌株。這些單倍體菌株可以包含許多次要的自養(yǎng)突變，這些突變在二倍體或四倍體中得到互補，從而能夠在高度選擇條件下生長。
定義應當理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法學、方案、細胞系、動物物種或?qū)佟⒑驮噭?，因為它們是可以改變的。還應當理解，本文所使用的術(shù)語只是出于描述具體實施方案的目的，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍只受到所附權(quán)利要求的限制。
在用于本文時，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復數(shù)對象，除非文中另有明確指示。由此，例如，提到“細胞”包括一群這樣的細胞，提及“蛋白質(zhì)”包括提及一種或多種蛋白質(zhì)及其本領域技術(shù)人員知道的等同物，諸如此類。本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術(shù)人員一般理解相同的含義，除非另有明確指示。
能交配的酵母物種這些酵母物種以單倍體和二倍體形式存在。二倍體細胞在合適條件下可以以二倍體形式增殖無限代。二倍體細胞還能夠形成孢子而形成單倍體細胞。另外，通過營養(yǎng)缺陷型二倍體的交配，連續(xù)交配可能產(chǎn)生四倍體菌株。
在本發(fā)明的一個實施方案中，能交配的酵母是糖酵母科(Saccharomycetaceae)的成員，包括Arxiozyma、Ascobotryozyma、固囊酵母屬(Citeromyces)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、德克氏酵母屬(Dekkera)、假囊酵母屬(Eremothecium)、伊氏酵母屬(Issatchenkia)、Kazachstania、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、Kodamaea、Lodderomyces、Pachysolen、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、Saturnispora、Tetrapisispora、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、擬威爾氏酵母屬(Williopsis)、和接合糖酵母屬(Zygosaccharomyces)。
特別感興趣的是畢赤氏酵母屬。畢赤氏酵母屬包括許多物種，包括巴斯德畢赤氏酵母、Pichia methanolica、和多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha，Pichia angusta)。最優(yōu)選的物種是巴斯德畢赤氏酵母。
單倍體酵母細胞在其正?；蚪M(染色體)編制中每種基因只有一個拷貝的細胞。
二倍體酵母細胞在其正?；蚪M編制中每種基因有兩個拷貝(等位基因)的細胞，通常是通過兩個單倍體細胞的融合(交配)過程形成的。
四倍體酵母細胞在其正?；蚪M編制中每種基因有四個拷貝(等位基因)的細胞，通常是通過兩個二倍體細胞的融合(交配)過程形成的。四倍體可以攜帶兩種、三種、或四種不同的盒。為了獲得這些四倍體，在釀酒酵母中，可以將純合的異宗配合的a/a與α/α二倍體進行選擇性交配；而在畢赤氏酵母中，可以將單倍體連續(xù)交配獲得營養(yǎng)缺陷型二倍體。例如，可以將[met his]單倍體與[ade his]單倍體交配獲得二倍體[his]，將[met arg]單倍體與[ade arg]單倍體交配獲得二倍體[arg]，然后將二倍體[his]與二倍體[arg]交配得到四倍體原養(yǎng)型。本領域技術(shù)人員應當理解，對二倍體細胞提到的優(yōu)點和用途也適用于四倍體細胞。
酵母交配兩個單倍體酵母細胞天然融合而形成一個二倍體酵母細胞的過程。
減數(shù)分裂二倍體酵母細胞進行減數(shù)的分裂而形成四個單倍體孢子產(chǎn)物的過程。然后，每個孢子可以發(fā)芽并形成單倍體無性生長細胞系。
選擇標記選擇標記指賦予接受(例如通過轉(zhuǎn)化事件)該基因的細胞以生長表型(物理生長特征)的基因或基因片段。選擇標記容許細胞在未接受該選擇標記的細胞不能生長的條件下在選擇性培養(yǎng)基中存活和生長。選擇標記基因通常分成幾類，包括正選擇標記基因，諸如賦予細胞以抗生素或其它藥物抗性的基因；溫度，將兩種ts突變體雜交或轉(zhuǎn)化ts突變體時；負選擇標記基因，諸如賦予細胞以在不含某種營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中生長的能力的生物合成基因，而不含該生物合成基因的所有細胞都需要這種營養(yǎng)物；或誘變生物合成基因，它使得細胞不能像不含野生型基因的細胞般生長；諸如此類。合適的標記包括但不限于ZEO、G418、HIS5、LYS3、MET1、MET3a、ADE1、ADE3、URA3等等。
表達載體這些DNA種類包含便于為了在靶宿主細胞內(nèi)表達外源蛋白而進行的操作的元件。為了方便，首先在細菌宿主(例如大腸桿菌)中進行對序列的操作和用于轉(zhuǎn)化的DNA的生成，載體通常包含便于這些操作的元件，包括細菌復制起點和合適的細菌選擇標記。選擇標記編碼經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長所必需的蛋白質(zhì)。未用含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞在培養(yǎng)基中將不能存活。選擇基因通常編碼如下性質(zhì)的蛋白質(zhì)(1)賦予針對抗生素或其它毒素的抗性，(2)補足營養(yǎng)缺陷，或(3)供應不能由復合培養(yǎng)基獲得的重要營養(yǎng)物。
用于本發(fā)明方法的表達載體還將包含酵母特異序列，包括用于鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母菌株的可選擇營養(yǎng)缺陷型或藥物標記。藥物標記還可用于擴增酵母宿主細胞中的載體拷貝數(shù)。
將目的多肽編碼序列與為了在酵母細胞中表達多肽而提供的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可操作連接。這些載體成分可以包括但不限于下列一項或多項增強子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。還可以包含用于分泌多肽的序列，例如信號序列等。酵母復制起點是可選的，因為表達載體常常整合到酵母基因組中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將目的多肽與為了優(yōu)化酵母二倍體細胞分泌多肽而提供的序列可操作連接或融合。
當核酸與另一段核酸序列在位置上功能相關時，則它們是“可操作連接”的。例如，若信號序列的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，則認為它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則認為它與該序列可操作連接。一般而言，“可操作連接”指相連DNA序列是鄰近的，而且在分泌前導序列的情況中是鄰近的且處于閱讀相。但是增強子不必是鄰近的。相連是通過本領域技術(shù)人員熟悉的便利限制性位點處的連接反應或者通過PCR/重組法實現(xiàn)的(GatewayRTechnology；Invitrogen，Carlsbad，California)。如果不存在這些位點，那么依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(5′)(通常在約100-1000bp內(nèi))的非翻譯序列，它控制與它可操作連接的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些啟動子分成幾類誘導型、組成型、和可抑制啟動子，最后一種在不存在抑制物時提高轉(zhuǎn)錄水平。誘導型啟動子可以應答培養(yǎng)條件的某些變化(例如營養(yǎng)物的存在與否或溫度的變化)而提高受它控制的DNA的轉(zhuǎn)錄水平。
酵母啟動子片段還可以擔當表達載體進入酵母基因組相同位點的同源重組和整合的位點；或者，使用選擇標記作為同源重組的位點。畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化見Cregg等，1985，Mol.Cell.Biol.53376-3385。
來自畢赤氏酵母的合適啟動子的實例包括AOX1啟動子(Cregg等，1989，Mol.Cell.Biol.91316-1323)、ICL1啟動子(Menendez等，2003，Yeast 20(13)1097-108)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子(Waterham等，1997，Gene 186(1)37-44)、和FLD1啟動子(Shen等，1998，Gene 216(1)93-102)。GAP啟動子是強組成型啟動子，而AOX和FLD1啟動子是誘導型的。
可以重組生成目的多肽，或是直接的，或是作為與異源多肽(例如信號序列或在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端具有特異切割位點的其它多肽)的融合多肽。一般而言，信號序列可以是載體的成分，或者它可以是插入載體的多肽編碼序列的一部分。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞內(nèi)標準途徑之一識別和加工的信號序列。釀酒酵母α因子前原信號(pre-prosignal)已經(jīng)證明在用于由巴斯德畢赤氏酵母分泌多種重組蛋白時是有效的。目的分泌信號還包括哺乳動物信號序列，它對于所分泌的蛋白質(zhì)可以是異源的，或者對于所分泌的蛋白質(zhì)可以是天然序列。信號序列包括前肽(pre-peptide)序列，而且在有些情況中可以包括原肽(propeptide)序列。本領域知道許多這樣的信號序列，包括在免疫球蛋白鏈中發(fā)現(xiàn)的信號序列，例如K28前毒素原(preprotoxin)、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清清蛋白信號序列、人Ig重鏈、人Ig輕鏈、諸如此類。例如見Hashimoto等，1998，ProteinEng.11(2)75；以及Kobayashi等，1998，Therapeutic Apheresis2(4)257。
可以通過在載體中插入轉(zhuǎn)錄激活子序列來提高轉(zhuǎn)錄。這些激活子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，作用于啟動子以提高其轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄增強子相對不依賴取向和位置，發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子以及自身編碼序列中以及轉(zhuǎn)錄單位的5′端和3′端?？梢詫⒃鰪娮蛹艚拥奖磉_載體中，位于編碼序列的5′端或3′端，但是優(yōu)選位于啟動子的5′端。
用于真核宿主細胞的表達載體還可包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常可以由翻譯終止密碼子的3′端在真核或病毒DNA或cDNA的非翻譯區(qū)中獲得。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄成mRNA非翻譯部分中的多聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。
采用標準連接技術(shù)或PCR/重組方法來構(gòu)建包含一種或多種上文所列成分的合適載體。以期望的形式將分離的質(zhì)粒或DNA片段切割、剪裁、并重新連接或者通過重組方法生成所需質(zhì)粒。為了確認所構(gòu)建質(zhì)粒中的序列是正確的，使用連接混合物轉(zhuǎn)化宿主細胞，如果合適，通過適當?shù)目股乜剐?例如氨芐青霉素或Zeocin)選擇成功的轉(zhuǎn)化子。由轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化和/或測序進行分析。
作為將片段限制性切割和連接的替換方法，可以使用基于att位點和重組酶的重組方法將DNA序列插入載體。這些方法見例如Landy，1989，Ann.Rev.Biochem.58913-949；而且是本領域技術(shù)人員知道的。這些方法利用由λ噬菌體和大腸桿菌編碼的重組蛋白的混合物介導的分子間DNA重組。重組發(fā)生在相互作用的DNA分子上的特異附著(att)位點之間。關于att位點的描述見Weisberg和Landy，1983，Site-Specific Recombination in Phage Lambda，在《(Lambda II》中，Weisberg編，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Press，第211-250頁。重組位點側(cè)翼的DNA區(qū)段發(fā)生轉(zhuǎn)換，使得重組后att位點變成雜合序列，包含由每一種親本載體提供的序列。重組可以發(fā)生在具有任何拓撲學的DNA之間。
為了將att位點導入目的序列，可以將目的序列連接到合適的載體中；使用特異引物生成包含att B位點的PCR產(chǎn)物；在含有att位點的合適載體中生成cDNA文庫；等等。
折疊在用于本文時指多肽和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其中氨基酸殘基之間的相互作用起到了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。盡管非共價相互作用在決定結(jié)構(gòu)時是重要的，然而目的蛋白常常含有由兩個半胱氨酸形成的分子內(nèi)和/或分子間共價二硫鍵。對于天然存在的蛋白質(zhì)和多肽或其衍生物和變體，正確的折疊通常指產(chǎn)生最佳生物學活性的排列，而且可以通過活性(例如配體結(jié)合、酶促活性等)測定法方便的監(jiān)測。
在有些情況中，例如當期望的產(chǎn)物源自合成時，基于生物學活性的測定法的意義將降低?？梢愿鶕?jù)物理特性、能量約束(energeticconsiderations)、建模研究、諸如此類來確定這些分子的正確折疊。
還可以通過導入編碼增強折疊和二硫鍵形成的酶(即折疊酶、陪伴蛋白等)的一種或多種序列來修飾表達宿主?？梢允褂帽绢I域已知的載體、標記等在酵母宿主細胞中組成性或誘導性表達這些序列。優(yōu)選的是，通過靶向方法學將包括足以實現(xiàn)期望表達型式的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在內(nèi)的序列穩(wěn)定整合到酵母基因組中。
例如，真核PDI不僅是蛋白質(zhì)半胱氨酸氧化和二硫鍵異構(gòu)化的有效催化劑，而且還展示陪伴分子的活性。PDI的共表達能夠促進具有多個二硫鍵的活性蛋白質(zhì)的生成。同樣感興趣的還有BIP(免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白)、親環(huán)素、諸如此類的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，每一種單倍體親本菌株表達一種不同的折疊酶，例如一種菌株可能表達BIP，另一種菌株可能表達PDI。
術(shù)語“期望蛋白”或“靶蛋白”可以互換使用，通常指具有兩條或多條不同多肽鏈的任何分泌蛋白，其中這些鏈是獨立合成的，即不是由一條多肽鏈的翻譯后切割產(chǎn)生的。多肽對于酵母是異源的，即外來的。優(yōu)選的是，使用哺乳動物多肽，即在哺乳動物基因組中編碼的多肽。
在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)是抗體。術(shù)語“抗體”意圖包括任何含多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，所述分子結(jié)構(gòu)具有適合且識別表位的特定形狀，其中一處或多處非共價結(jié)合相互作用穩(wěn)定了分子結(jié)構(gòu)與表位之間的復合物。原型抗體分子是免疫球蛋白，而且認為來自所有來源(例如人、嚙齒類、兔、牛、綿羊、豬、犬、其它哺乳動物、雞、其它禽類等)的所有類型(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)的免疫球蛋白都是“抗體”。已經(jīng)描述了許多抗體編碼序列，而且通過本領域眾所周知的方法還會增加。
例如，可以通過遺傳工程生成抗體或抗原結(jié)合片段。在這種技術(shù)中，正如其它方法一樣，使抗體生成細胞對期望抗原或免疫原敏化。使用由抗體生成細胞分離的信使RNA作為模板通過PCR擴增生成cDNA。通過將擴增得到的免疫球蛋白cDNA的合適區(qū)段插入表達載體生成了每個載體都包含保留最初抗原特異性的一種重鏈基因和一種輕鏈基因的文庫。通過聯(lián)合重鏈基因文庫和輕鏈基因文庫構(gòu)建組合文庫。這導致了共表達重鏈和輕鏈(組裝抗體分子的Fab片段或抗原結(jié)合片段)的克隆的文庫。將攜帶這些基因的載體共轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。在經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主中誘導抗體基因合成后，重鏈和輕鏈蛋白自我組裝，生成可以通過抗原或免疫原篩選檢測的活性抗體。
目的抗體編碼序列包括由天然序列編碼的，以及由于遺傳密碼簡并性因而序列與所公開核酸不同的核酸，及其變體。變體多肽可以包含氨基酸(aa)替代、添加、或刪除。氨基酸替代可以是保守的氨基酸替代，或者是清除非必需氨基酸的替代，諸如為了改變糖基化位點，或者為了通過替代或刪除一個或多個不是功能必需的半胱氨酸殘基而將錯誤折疊降至最低。變體可以設計成保留或提高蛋白質(zhì)特定區(qū)域(例如功能結(jié)構(gòu)域、催化氨基酸殘基等)的生物學活性。變體還包括本文公開的多肽的片段，特別是生物學活性片段和/或?qū)诠δ芙Y(jié)構(gòu)域的片段。用于對克隆的基因進行體外誘變的技術(shù)是已知的。本發(fā)明還包括通過普通分子生物學技術(shù)的修飾而提高了對蛋白水解降解作用的抵抗力或優(yōu)化了溶解特性或者使之更適于作為治療劑的多肽。
可以通過重組方法生成嵌合抗體，即將由一種物種的抗體生成細胞得到的輕鏈和重鏈可變區(qū)(VK和VH)與由另一種物種得到的輕鏈和重鏈恒定區(qū)結(jié)合在一起。通常，嵌合抗體采用嚙齒類或兔的可變區(qū)和人的恒定區(qū)，從而生成人結(jié)構(gòu)域占主體的抗體。這種嵌合抗體的生成在本領域是眾所周知的，而且可以通過標準方法來完成(見例如美國專利號5,624,659，完整收入本文作為參考)。
人源化抗體是經(jīng)過改造包含甚至更多人樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而且只摻入動物衍生抗體的互補決定區(qū)。這是通過仔細檢查單克隆抗體可變區(qū)超變環(huán)的序列并使之適合人抗體鏈的結(jié)構(gòu)而完成的。雖然表面上看有些復雜，但是實踐過程是直截了當?shù)摹Ｒ娎缑绹鴮＠?,187,287，完整收入本文作為參考。
除了完整免疫球蛋白(或其重組副本)以外，還可以合成包含表位結(jié)合位點的免疫球蛋白片段(例如Fab′、F(ab′)2、或其它片段)?？梢岳弥亟M免疫球蛋白技術(shù)設計“片段”或最小免疫球蛋白。例如，可以通過合成輕鏈和重鏈可變區(qū)來生成用于本發(fā)明的“Fv”免疫球蛋白。對抗體的聯(lián)合同樣感興趣，例如包含兩個不同F(xiàn)v特異性的diabody。
可以在翻譯后修飾免疫球蛋白，例如添加化學接頭、可檢測模塊(諸如熒光染料、酶、底物、化學發(fā)光模塊、諸如此類)、或特異結(jié)合模塊(諸如鏈霉親和素、親和素、或生物素)、諸如此類，它們可用于本發(fā)明的方法和組合物。
多肽合成方法經(jīng)轉(zhuǎn)化的能交配的單倍體酵母細胞提供了能夠?qū)ζ谕鞍走M行亞基配對的遺傳方法。用兩種表達載體中的每一種轉(zhuǎn)化單倍體酵母菌株，第一種載體指導一種多肽鏈的合成，而第二種載體指導第二種不同多肽鏈的合成。將兩種單倍體菌株交配以提供二倍體宿主，從而獲得優(yōu)化的靶蛋白生成。
任選的是，提供額外的不同編碼序列。這些序列可以存在于額外的表達載體上，或者存在于第一種或第二種表達載體中。正如本領域已知的，可以由各個啟動子獨立表達多種編碼序列；或者可以通過包含“內(nèi)部核糖體進入位點”或“IRES”而進行并列表達，該元件促進核糖體直接進入順反子(蛋白質(zhì)編碼區(qū))的起始密碼子諸如ATG，由此導致不依賴帽的基因翻譯。在酵母中有功能的IRES元件見Thompson等，2001，PNAS 9812866-12868。
在本發(fā)明的一個實施方案中，聯(lián)合分泌性J鏈生成抗體序列，該J鏈提供了增強的IgA穩(wěn)定性(見美國專利號5,959,177和5,202,422)。
兩種單倍體菌株各自是營養(yǎng)缺陷的，為了單倍體細胞的生長需要補充培養(yǎng)基。成對的營養(yǎng)缺陷型是互補的，使得二倍體產(chǎn)物將在缺乏單倍體細胞所需要的補充物的條件下生長。已知酵母中的許多這種遺傳標記，包括對氨基酸(例如met、lys、his、arg等)、核苷酸(例如ura3、ade1等)、諸如此類的需要。對于本發(fā)明的方法而言，氨基酸標記物可能是優(yōu)選的。
可以將兩種經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體細胞遺傳雜交，并通過它們的雜合營養(yǎng)需求選擇源自此交配事件的二倍體菌株?；蛘撸瑢煞N經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體菌株的群體制成原生質(zhì)球并融合，重建并選擇二倍體后代。通過這兩種方法，可以鑒定并選擇性培養(yǎng)二倍體菌株，因為與它們的單倍體親本不同，它們沒有相同的營養(yǎng)需求。例如，可以在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)二倍體細胞。二倍體合成策略具有某些優(yōu)勢。二倍體菌株具有通過潛在突變的更廣泛互補而提高異源蛋白水平的潛力，其中所述突變可能影響重組蛋白的生成和/或分泌。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用多肽文庫(例如抗體重鏈或輕鏈文庫)轉(zhuǎn)化每一種單倍體菌株。將合成多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體細胞與互補的單倍體細胞進行交配。對由此產(chǎn)生的二倍體細胞篩選功能蛋白。二倍體細胞提供了集合大量多肽組合進行功能檢驗的快速、方便、且便宜的手段。這種技術(shù)尤其可用于生成異聚多亞基蛋白產(chǎn)物，其中優(yōu)化的亞基合成水平對于功能蛋白的表達和分泌是至關重要的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，調(diào)整兩種亞基的表達水平比例，從而將產(chǎn)物生成最大化。先前已經(jīng)證明了異二聚亞基蛋白水平影響終產(chǎn)物生成(Simmons LC，2002年5月1日，J Immunol Methods 263(1-2)133-47)。可以在交配步驟之前通過選擇表達載體上存在的標記物來完成調(diào)整。通過穩(wěn)定增加載體的拷貝數(shù)，可以提高表達水平。在有些情況中，可能希望相對于一種鏈提高另一種鏈的水平，從而在多肽的亞基之間達到平衡的比例。抗生素抗性標記可用于此目的，例如Zeocin抗性標記、G418抗性等，并提供了通過對轉(zhuǎn)化子選擇對更高水平Zeocin或G418的抗性來富集含多個整合的拷貝的表達載體的菌株的手段。亞基基因的適當比例(例如1∶1、1∶2等)對于高效蛋白質(zhì)生成可能是重要的。甚至在使用相同啟動子來轉(zhuǎn)錄兩種亞基時，許多其它因素促成了所表達蛋白質(zhì)的最終水平，因此相對于一種編碼基因增加另一種的拷貝數(shù)可能是有用的?；蛘?，通過將都具有多個拷貝表達載體的兩種單倍體菌株交配來產(chǎn)生相對于單拷貝載體菌株生成更高水平多肽的二倍體菌株。
用上文所述表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，交配而形成二倍體菌株，并在為了誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴增編碼期望序列的基因而適當改進的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本領域已知適于培養(yǎng)酵母的許多基本培養(yǎng)基。可以根據(jù)需要向這些培養(yǎng)基中添加鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂、和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素、和葡萄糖或相當?shù)哪茉础＿€可以以合適濃度包含本領域技術(shù)人員知道的任何其它必需補充物。諸如溫度、pH、諸如此類的培養(yǎng)條件就是先前用于宿主細胞(用于選擇表達)的條件，而且對于本領域普通技術(shù)人員而言是明白的。
由培養(yǎng)基回收所分泌的蛋白質(zhì)。蛋白酶抑制物諸如苯甲基磺酰氯(PMSF)可用于在純化過程中抑制蛋白水解降解，而且可以包含抗生素以預防外來污染物的生長。可以使用本領域已知方法將組合物濃縮、過濾、透析、等。
出于生產(chǎn)目的培養(yǎng)本發(fā)明的二倍體細胞。這些生產(chǎn)目的希望包括在基本培養(yǎng)基中進行的培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基缺乏預先形成的氨基酸和其它復雜生物分子，例如包含氨作為氮源、葡萄糖作為能源和碳源、和鹽作為磷酸鹽、鈣、諸如此類的來源的培養(yǎng)基。優(yōu)選的是，這種生產(chǎn)培養(yǎng)基缺乏選擇劑，諸如抗生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等?？梢詫⒍扼w細胞培養(yǎng)至高細胞密度，例如至少約50g/L；更常見的是至少約100g/L；而且可以是至少約300、約400、約500g/L或更多。
在本發(fā)明的一個實施方案中，出于生產(chǎn)目的進行的受試細胞培養(yǎng)是在低溫進行的，對數(shù)期、穩(wěn)定期、或二者的溫度可能更低。術(shù)語“低溫”指溫度為至少約15℃，更常見的是至少約17℃，而且可以是約20℃，且通常不超過約25℃，更常見的是不超過約22℃。培養(yǎng)溫度可能影響生產(chǎn)培養(yǎng)物中全長分泌蛋白的生成，而且降低培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度能夠大大提高完整產(chǎn)物的產(chǎn)量。溫度降低似乎有助于通過宿主用于生成目標產(chǎn)物的折疊和翻譯后加工途徑的胞內(nèi)交通，并且降低細胞蛋白酶的降解作用。
本發(fā)明的方法提供了用于表達分泌型活性蛋白的方法，特別是分泌型活性抗體，其中“活性抗體”在用于本文時指至少兩種正確配對鏈的正確折疊的多聚物，它能夠精確結(jié)合它的相關抗原。活性蛋白的表達水平通常是至少約50mg/升培養(yǎng)物，更常見的是至少約100mg/升，優(yōu)選至少約500mg/升，而且可以是1000mg/升或更多。
本發(fā)明的方法能夠提高宿主和異源編碼序列在生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是通過例如長時間維持高表達水平而證明的，其中在時間延長約20倍、50倍、100倍、或更長時間后起始表達水平降低不超過約20％，通常不超過10％，而且可能降低不超過約5％。
菌株穩(wěn)定性還能夠長時間維持異源基因序列完整性，其中在時間延長約20倍、50倍、100倍、或更長時間后活性編碼序列和必需轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的序列在至少約99％的二倍體細胞中得到維持，通常是至少約99.9％的二倍體細胞，而且優(yōu)選至少約99.99％的二倍體細胞。優(yōu)選的是，基本上所有的二倍體細胞都維持活性編碼序列和必需轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的序列。
應當理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法學、方案、細胞系、動物物種或?qū)佟?gòu)建體、和試劑，因為它們當然可以改變。還應當理解，本文所用術(shù)語學只是出于描述具體實施方案的目的，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍只受所附權(quán)利要求的限制。
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術(shù)人員一般理解相同的含義。盡管可以在實踐或檢驗本發(fā)明時使用與本文所述相似或相當?shù)娜魏畏椒?、裝置、和材料，然而本文描述了優(yōu)選的方法、裝置、和材料。
出于描述和公開例如發(fā)表物中描述的可用于本發(fā)明的細胞系、構(gòu)建體、和方法學的目的，將本文提及的所有發(fā)表物收入本文作為參考。提供上文和全文討論的發(fā)表物只是因為它們是在本發(fā)明的提交日期之前公布的。這里沒有任何內(nèi)容可以解釋為承認發(fā)明人由于先前的發(fā)明沒有權(quán)力獲得這樣的公開內(nèi)容。
列舉下面的實施例是為了給本領域普通技術(shù)人員提供關于如何制作和使用本發(fā)明的完整公開書和說明書，而非意圖限制本發(fā)明所關注的范圍。為了在所用數(shù)值(例如數(shù)量、溫度、濃度等)方面確保精確性已經(jīng)做出了努力，但是有些實驗誤差和偏差應當是容許的。除非另有說明，份數(shù)指重量份數(shù)，分子量指平均分子量，溫度指攝氏度，而壓力指處于或接近大氣壓。
實施例1為了證明二倍體抗體生產(chǎn)方法的功效，制備了下列試劑。
抗體基因克隆并構(gòu)建了指導三種形式的嵌合人源化小鼠單克隆抗體OKT 3合成的基因。這些構(gòu)建物中所使用的可變區(qū)的來源可以在基因庫中找到。編號A22261；小鼠OKT3重鏈(國際專利申請WO9109967-A3，1991年7月11日)。編號A22259；小鼠OKT3輕鏈(國際專利申請WO 9109967-A3，1991年7月11日)。
所有三種形式都采用相同的VκCκ輕鏈基因(SEQ ID NO10)。三種重鏈基因都編碼相同的小鼠可變區(qū)(Vh)，但是彼此因人重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列而有所不同。第一種構(gòu)建物指導全長野生型重鏈(Cγ1)的合成，它只存在一個正常N-連接糖基化位點(全長糖基化重鏈)(SEQID NO13和14)。第二種基因指導非糖基化重鏈的合成，即通過將序列中的核苷酸突變使得糖基化位點識別序列(ASN-X-Thr/Ser)中的第301位蘇氨酸變成丙氨酸(全長非糖基化重鏈)(SEQ ID NO15)。第三種基因構(gòu)建物指導其中鉸鏈區(qū)后的大部分恒定區(qū)刪除的重鏈的合成(Fab重鏈)(SEQ ID NO16)。
表達載體載體包含下列功能元件1)突變型ColE1復制起點，它促進質(zhì)粒載體在細菌大腸桿菌的細胞中復制；2)細菌Sh ble基因，它賦予抗生素Zeocin抗性且擔當大腸桿菌和巴斯德畢赤氏酵母二者轉(zhuǎn)化的選擇標記；3)表達盒，它由甘油醛脫氫酶基因(GAP基因)啟動子、與之融合的編碼釀酒酵母α交配因子前原分泌前導序列的序列、隨后的來自巴斯德畢赤氏酵母乙醇氧化酶I基因(AOX1)的編碼巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)錄終止信號的序列組成。Zeocin抗性標記基因提供了通過選擇抵抗高水平Zeocin的轉(zhuǎn)化子來富集包含多個整合拷貝的表達載體的菌株的手段。
巴斯德畢赤氏酵母菌株本實施例中所使用的營養(yǎng)缺陷型菌株是巴斯德畢赤氏酵母ade1和ura3菌株，它們的生長分別需要補充腺嘌呤和尿嘧啶。還使用了菌株met1和lys3。盡管可以使用這兩個營養(yǎng)缺陷型菌株互補組中的任一對來構(gòu)建和維持二倍體菌株，然而這兩種菌株出于兩個原因尤其適于本方法。第一，它們比交配或融合所得的二倍體菌株生長更加緩慢。由此，如果培養(yǎng)物中殘留或由減數(shù)分裂或其它機制產(chǎn)生少量的單倍體ade1或ura3細胞，那么培養(yǎng)物中二倍體菌株應當比它們長得快。
第二是易于監(jiān)測這些菌株的性狀態(tài)，因為由它們交配產(chǎn)生的二倍體的菌落是正常白色或奶油色，而培養(yǎng)物中單倍體ade1突變體的任何菌株的細胞形成顏色為獨特粉紅色的菌落。另外，單倍體ura3突變體的任何菌株抵抗藥物5-氟-乳清酸(FOA)，而且可以通過將培養(yǎng)物樣品涂布在含F(xiàn)OA的基本培養(yǎng)基+尿嘧啶平板上靈敏鑒定。在這些平板上，只有需要尿嘧啶的ura3突變體(推測是單倍體)菌株能夠生長并形成菌落。由此，使用ade1和ura3標記的單倍體親本菌株，可以容易的監(jiān)測由此產(chǎn)生的抗體生成二倍體菌株的性狀態(tài)(單倍體對二倍體)。
方法用于轉(zhuǎn)錄輕鏈和重鏈抗體基因的pGAPZ-α表送載體的構(gòu)建。為了克隆輕鏈和重鏈可變區(qū)，培養(yǎng)小鼠OKT3 CD3雜交瘤細胞系的細胞，并提取總RNA。然后進行兩個RT-PCR反應，一個對OKT3抗體基因的輕鏈可變區(qū)編碼序列特異，一個對重鏈特異。用于擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)的引物是(SEQ ID NO1)5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3′和(SEQID NO 3 )
5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC-3′，以及 (SEQ ID NO 2)5′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3′和(SEQ ID NO4)5′-GACAGATGGTGCAGCCACAGCCCGGTTTATTTCCAACTTTGTCC-3′。
至于人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因，人白細胞5′-stretch plus cDNA文庫購自Clontech(HL 5019t)。分別使用對重鏈和輕鏈恒定區(qū)特異的引物對該文庫進行兩個PCR反應(重鏈(SEQ ID NO6)5′-GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCA-3和(SEQ ID NO5)5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3′(用于全長)以及(SEQ ID NO7)5′-TGCGGCCGCTCATGGGCACGGTGGGCATGTGT-3′(用于Fab)；輕鏈(SEQ ID NO9)5′-GGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTC-3′和(SEQ IDNO8)5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3′)。
將編碼小鼠輕鏈可變區(qū)的DNA序列與編碼人輕鏈恒定區(qū)的序列按讀碼框融合(SEQ ID NO11和12)。通過pGAPZ-α中5′-XhoI和3′-NotI位點的連接，將編碼最終融合構(gòu)建物的片段插入巴斯德畢赤氏酵母表達載體pGAPZ-α。將編碼小鼠重鏈可變區(qū)的DNA序列與各自編碼三種人重鏈恒定區(qū)的序列按讀碼框融合。然后使用類似的5′-XhoI和3′-NotI策略將這些融合產(chǎn)物插入pGAPZ-α(SEQ ID NO13和14用于糖基化形式；SEQ ID NO15用于非糖基化形式；SEQ ID NO16用于Fab片段)。在下一步工作前通過直接DNA測序確認所有載體中的抗體基因DNA序列是正確的。
將表達載體轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤氏酵母的單倍體ade1 ura3、met1、和lys3宿主菌株中。用于轉(zhuǎn)化單倍體巴斯德畢赤氏酵母菌株和基因操作巴斯德畢赤氏酵母性周期的所有方法見Higgins，D.R.和Cregg，J.M.編，1998，Pichia Protocols.Methods in Molecular Biology.HumanaPress，Totowa，NJ。
轉(zhuǎn)化前，用AvrII將每一種表達載體在GAP啟動子序列內(nèi)線性化以指導載體整合到巴斯德畢赤氏酵母基因組的GAP啟動子基因座中。然后通過電穿孔將每一種載體的樣品各自轉(zhuǎn)化到ade1、ura3、met1、和lys3菌株的電感受態(tài)培養(yǎng)物中，并通過它們對Zeocin抗生素的抗性在YPDZeocin平板上選擇成功的轉(zhuǎn)化子。選擇由此產(chǎn)生的菌落，在YPD Zeocin平板上劃線分離單菌落，然后為了檢驗每一種菌株中插入了正確的抗體基因，通過PCR測定法對由每一種菌株提取的基因組DNA檢驗抗體基因插入片段的存在和/或通過菌落轉(zhuǎn)移/免疫印跡法(Wung等，1996，Biotechniques 21808-812)檢驗每一種菌株合成抗體鏈的能力。收集表達三種重鏈構(gòu)建物之一的單倍體ade1、met1、和lys3菌株，與表達輕鏈基因的單倍體ura3菌株一起用于構(gòu)建二倍體。將表達重鏈基因的單倍體與適當?shù)妮p鏈單倍體ura3交配以生成分泌蛋白質(zhì)的二倍體。
合成單一抗體鏈的單倍體菌株的交配和合成四聚體功能抗體的二倍體衍生物的選擇。為了將巴斯德畢赤氏酵母單倍體菌株進行交配，將待雜交的每一種ade1或met1或lys3重鏈生成菌株在豐富YPD平板上劃線，且將ura3輕鏈生成菌株在第二個YPD平板上劃線(每個平板約10條線)。于30℃保溫一或兩天后，以交叉劃線型式將來自含重鏈菌株的一塊平板和含ura3輕鏈菌株的一塊平板的細胞轉(zhuǎn)移到復制涂板模塊上的無菌天鵝絨布上，使得每一種重鏈菌株含有與每一種輕鏈菌株混合的一片細胞。然后將交叉劃線的復制涂板細胞轉(zhuǎn)移到交配板上，并于25℃保溫以刺激菌株間交配的開始。兩天后，將交配板上的細胞再次轉(zhuǎn)移到復制涂板模塊上的無菌天鵝絨上，然后轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基平板上。將這些平板于30℃保溫三天，從而容許原養(yǎng)型二倍體菌株的選擇性生長。挑取出現(xiàn)的菌落，并在第二塊基本培養(yǎng)基平板上劃線以分離單菌落和純化每一種二倍體菌株。然后對由此產(chǎn)生的二倍體細胞系檢驗抗體生成。
測試假定的二倍體菌株以證明它們是二倍體且包含用于生成抗體的兩種表達載體。對于二倍體，將菌株的樣品涂布在交配板上以刺激它們進行減數(shù)分裂并形成孢子。收集單倍體孢子產(chǎn)物并測試表型。如果由此產(chǎn)生的孢子產(chǎn)物中的顯著百分比是單一或雙重營養(yǎng)缺陷型，那么我們得出結(jié)論，最初的菌株肯定是二倍體。通過由每一種菌株提取基因組DNA并在對每一種基因特異的PCR反應中使用這種DNA，對二倍體菌株檢驗兩種抗體基因的存在。
合成單一抗體鏈的單倍體菌株的融合和合成四聚體功能抗體的二倍體衍生物的選擇。作為上文所述交配流程的替換方法，將單鏈抗體生成單倍體ade1和ura3菌株的各自培養(yǎng)物制成原生質(zhì)球，并使用聚乙二醇/CaCl2將由此產(chǎn)生的原生質(zhì)球融合。然后將融合的單倍體菌株包埋在含1M山梨醇和基本培養(yǎng)基的瓊脂中，容許二倍體菌株重建它們的細胞壁并生長成可見菌落。由瓊脂挑取由此產(chǎn)生的菌落，在基本培養(yǎng)基平板上劃線，并將平板于30℃保溫兩天，由二倍體細胞系的單個細胞生成菌落。然后如上所述對由此產(chǎn)生的假定二倍體細胞系檢驗二倍體性和抗體生成。
抗體的純化和分析。使用上文所述方法通過將ura3輕鏈菌株2252和lys3重鏈菌株2254交配衍生出用于生成全長抗體的二倍體菌株。收集二倍體巴斯德畢赤氏酵母表達菌株搖瓶或發(fā)酵罐培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并通過SDS-PAGE和免疫印跡使用針對人IgG重鏈和輕鏈的抗體或特異針對IgG重鏈的抗體檢驗抗體蛋白的存在。數(shù)據(jù)顯示于圖2。
為了純化酵母分泌的抗體，使來自抗體生成培養(yǎng)物的澄清培養(yǎng)基流過蛋白A柱，用20mM磷酸鈉pH7.0結(jié)合緩沖液清洗后，用0.1M甘氨酸-HCl緩沖液pH3.0洗脫蛋白A結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過考馬斯藍染色SDS-PAGE和抗體蛋白的免疫印跡檢驗含有最多總蛋白質(zhì)的級分。還通過ELISA測定法檢驗級分，其中首先用F(ab′)2山羊抗人IgG即Fcγ(Jackson Immuno，產(chǎn)品目錄編號109-006-008)包被微量滴定板，接著將板與選定稀釋度的酵母生成抗體進行反應，最后將板與HRP綴合的山羊抗人IgG F(ab′)2片段(Jackson Immuno，產(chǎn)品目錄編號109-036-097)進行反應。然后將板用TMP底物(Sigma Chemical)顯影，并用0.5M HCl淬滅反應。在BioRad微量滴定板讀板儀上于415nm將結(jié)果量化。數(shù)據(jù)圖示于圖3。
抗體活性的測定法。通過含靶抗原細胞的免疫組化染色對重組酵母衍生的嵌合抗體評估功能活性。嵌合抗體選擇性識別在T細胞上發(fā)現(xiàn)的CD3復合物。采用Jurkat T細胞作為抗原的來源，并使用Andersson和Sander(1989年1月31日，Immunol Lett 20(2)115-20)或Andersson等(1988年12月，Eur J Immunol 18(12)2081-4)中所述流程進行細胞表面染色。
將Jurkat T細胞固定在載玻片上，用適當?shù)姆忾]血清進行封閉，并用哺乳動物和酵母生成的重組一抗染色1小時。然后用過氧化物酶封閉劑處理固定好的樣品，隨后用對每一種形式的抗體特異的生物素化Fc選擇性二抗進行染色(抗小鼠二抗用于哺乳動物生成的抗體而抗人二抗用于酵母生成的抗體)。使用HRP-鏈霉親和素系統(tǒng)進行檢測。進行數(shù)字成像以收集每一個染色樣品的數(shù)據(jù)。經(jīng)由在哺乳動物和酵母衍生的OKT-3的小圖中觀察到細胞的暗染色，在樣品中檢測到陽性信號。數(shù)據(jù)顯示于圖4。
序列表<110>Cregg，James M.
Latham，JohnLitton，MarkSchatzman，RandallTolstorukov，Ilya<120>使用單倍體交配策略在酵母中合成異聚多亞基多肽的方法<130>ALDR-001WO<140>unassigned<141>2004-10-22<150>60/513,876<151>2003-10-22<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>47<212>DNA<213>小鼠<400>1ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcag gtccagctgc agcagtc47<210>2<211>41<212>DNA<213>小鼠<400>2tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gagagtggtg c 41<210>3<211>50<212>DNA<213>小鼠<400>3ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcaa attgttctca cccagtctcc50<210>4<211>44<212>DNA<213>小鼠<400>4gacagatggt gcagccacag cccggtttat ttccaacttt gtcc 44<210>5<211>38<212>DNA<213>智人<400>5
ataagaatgc ggccgctcat ttacccggag acagggag 38<210>6<211>41<212>DNA<213>智人<400>6gcaccactct cacagtctcc tcagcctcca ccaagggccc a 41<210>7<211>32<212>DNA<213>智人<400>7tgcggccgct catgggcacg gtgggcatgt gt32<210>8<211>39<212>DNA<213>智人<400>8ataagaatgc ggccgctaac actctcccct gttgaagct 39<210>9<211>44<212>DNA<213>智人<400>9ggacaaagtt ggaaataaac cgggctgtgg ctgcaccatc tgtc 44<210>10<211>212<212>PRT<213>智人<400>10Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu1 5 10 15Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn20 25 30Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp35 40 45Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly50 55 60Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp65 70 75 80Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe85 90 95Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser100 105 110Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala115 120 125Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val130 135 140Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser145 150 155 160Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr165 170 175
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權(quán)利要求
1.用于在酵母二倍體細胞中合成包含至少兩個不同亞基多肽鏈的分泌型異聚多亞基蛋白的方法，該方法包括用第一種表達載體轉(zhuǎn)化第一種酵母單倍體細胞，所述表達載體包含所述蛋白質(zhì)的第一種亞基且其可操作連接第一種酵母啟動子；用第二種表達載體轉(zhuǎn)化第二種酵母單倍體細胞，所述表達載體包含所述蛋白質(zhì)的第二種亞基且其可操作連接第二種酵母啟動子；由所述第一種和第二種酵母單倍體細胞生成二倍體細胞；在所述第一種和第二種亞基表達且以所述多亞基蛋白的形式分泌的條件下培養(yǎng)所述二倍體細胞。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母二倍體細胞是畢赤氏酵母屬的物種。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述畢赤氏酵母屬的物種選自下組巴斯德畢赤氏酵母、Pichia methanolica、和Pichia angusta。
4.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述異聚多亞基蛋白是包含至少重鏈和輕鏈的可變區(qū)的抗體。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述異聚多亞基蛋白是包含至少重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。
6.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述第一種表達載體包含輕鏈或重鏈序列的文庫，且所述第二種表達載體包含單一輕鏈或重鏈序列。
7.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述第一種表達載體包含輕鏈或重鏈序列的文庫，且所述第二種表達載體包含輕鏈或重鏈序列的文庫。
8.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種和第二種酵母單倍體細胞是互補營養(yǎng)缺陷型。
9.依照權(quán)利要求8的方法，其中由所述第一種和第二種酵母單倍體細胞生成二倍體細胞的所述步驟包括所述單倍體細胞的交配。
10.依照權(quán)利要求9的方法，其中由所述第一種和第二種酵母單倍體細胞生成二倍體細胞的所述步驟包括所述第一種和第二種單倍體細胞的原生質(zhì)球融合。
11.依照權(quán)利要求1的方法，還包括在生成所述二倍體細胞前校準所述第一種或第二種亞基的表達水平的步驟。
12.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種酵母啟動子和所述第二種酵母啟動子是相同的。
13.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種酵母啟動子和所述第二種酵母啟動子是不同的。
14.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述兩種酵母啟動子或其一是組成型啟動子。
15.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述兩種酵母啟動子或其一是誘導型啟動子。
16.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動子是GAP啟動子。
17.依照權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述不同亞基多肽鏈包含為二倍體分泌和表達優(yōu)化的信號序列。
18.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在基本培養(yǎng)基中進行的。
19.依照權(quán)利要求18的方法，其中所述基本培養(yǎng)基缺乏選擇劑。
20.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在低溫進行的。
21.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述多亞基蛋白由所述二倍體細胞分泌達到至少約100mg/升培養(yǎng)基的濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重組異聚多亞基蛋白的方法。將第一種表達載體轉(zhuǎn)化到第一種單倍體細胞中；并將第二種表達載體轉(zhuǎn)化到第二種單倍體細胞中。鑒定各自合成不同多肽的這兩種經(jīng)轉(zhuǎn)化單倍體細胞，然后進行遺傳雜交或融合。將由此產(chǎn)生的二倍體菌株用于生成和分泌完整組裝且有生物學功能的異聚多亞基蛋白。
文檔編號C12N15/74GK1871359SQ200480031217
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月22日
發(fā)明者J·M·克里格, J·萊瑟姆, M·利頓, R·沙茨曼, I·I·托爾斯托魯科夫 申請人:凱克研究生院, 奧爾德生物制藥公司