專利名稱：用滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增多核苷酸的制作方法
交叉參考相關(guān)申請
本申請要求發(fā)明人Youxiang Wang和Yaping Zong于2003年9月26日提交的標(biāo)題為“滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增多核苷酸序列”的美國專利申請No.60/506,218的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明屬于用滾環(huán)擴(kuò)增法(RCA)擴(kuò)增核酸的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
在鑒定基因中，獲得全長cDNA是關(guān)鍵但常常是困難的任務(wù)。構(gòu)建cDNA文庫的傳統(tǒng)方法通常只能產(chǎn)生部分cDNA片斷。cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)是為恢復(fù)全長編碼序列而開發(fā)的一項(xiàng)技術(shù)，然而，RACE技術(shù)仍然復(fù)雜且效率不佳。我們的發(fā)明采用RT-RCA技術(shù)，其為制備全長cDNA提供了大為改進(jìn)和簡化的方法。
RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是用于檢測和定量mRNA的高靈敏技術(shù)。該技術(shù)由兩部分組成通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)從RNA合成cDNA，和通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增特異性cDNA。我們的發(fā)明采用RT-PCR技術(shù)，其提供了用滾環(huán)擴(kuò)增法使擴(kuò)增和檢測mRNA大為改進(jìn)且更簡單的方法。
已建立的核酸擴(kuò)增方法包括以溫度循環(huán)為基礎(chǔ)的方法例如PCR、LCR和SPA，及采用等溫?cái)U(kuò)增的方法例如NASBA、RCA、TMA、Qβ復(fù)制酶和SDA。最近，已開發(fā)了各種利用RCA的檢測和擴(kuò)增方法，參見例如美國專利No.5,871，921、5,648,245、5,866,377、5,854,033、6,287,824、6,323，009。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了利用滾環(huán)擴(kuò)增檢測和克隆核酸分子的方法。本發(fā)明提供了利用滾環(huán)擴(kuò)增從復(fù)合混合物中擴(kuò)增、檢測和克隆靶核酸分子的方法。本發(fā)明的許多優(yōu)點(diǎn)可見于各種實(shí)施方案中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于環(huán)化整個靶核酸分子以進(jìn)行擴(kuò)增的方法。此方法能克隆大多數(shù)靶核酸的全長序列，如果需要的話，也能擴(kuò)增和克隆整個基因組。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用滾環(huán)擴(kuò)增來擴(kuò)增和檢測靶核酸分子所需區(qū)域的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用發(fā)夾環(huán)以產(chǎn)生用于滾環(huán)擴(kuò)增和檢測的環(huán)形多核苷酸的方法，而不是使用鎖式探針(padlock probe)或附加模板以連接形成環(huán)形核酸分子的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過采用自身引發(fā)(self-priming)接著通過連接而閉合環(huán)來環(huán)化核酸分子的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的檢測方法，利用靶序列本身產(chǎn)生游離3’端而引起環(huán)化核酸分子的滾環(huán)擴(kuò)增，其中環(huán)化的核酸分子可包含用于基因特異性檢測和擴(kuò)增的全長基因序列，其中不需要加入引物。這使得檢測擴(kuò)增不需要連接，幾乎不需要或不需要外部提供的引物，從而簡化了整個反應(yīng)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于靶核酸分子與所供給寡核苷酸或片段之間的相互作用，從所供給的片段或寡核苷酸而不是靶序列產(chǎn)生用于環(huán)化核酸分子滾環(huán)擴(kuò)增的游離3’端的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供多個方法來檢測和擴(kuò)增靶多核苷酸序列，其包包括用環(huán)化寡核苷酸分子進(jìn)行突變檢測。一方面，不必先經(jīng)PCR擴(kuò)增而環(huán)化靶核酸分子。靶核酸分子的環(huán)化可包括該靶核酸、其互補(bǔ)物的環(huán)化或二者均被環(huán)化。如果需要或者希望，可產(chǎn)生或提供游離的3’端。然后用滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增該環(huán)化的核酸分子。
本發(fā)明的多個實(shí)施方案采用不同的方法來環(huán)化靶核酸分子(或其互補(bǔ)物)。通常靶核酸分子的環(huán)化可采用許多不同的方法，例如用酶(如T4DNA連接酶)或化學(xué)方法連接、光化學(xué)反應(yīng)、用酶(如Cre-重組酶)進(jìn)行位點(diǎn)特異性或同源性重組、以及各種形式的聚合酶延伸法。環(huán)化，例如采用酶(如Cre-重組酶)進(jìn)行重組，可能需要將特異性序列結(jié)合到靶核酸分子(或其互補(bǔ)物)的一端或兩端。此外，本發(fā)明的環(huán)化方法可能需要或可能不需要將特異性序列加到復(fù)合混合物中的靶核酸分子(或其互補(bǔ)物)的一端或兩端。被加到靶核酸分子兩端的特異性序列分別稱為第一接頭核酸分子和第二接頭核酸分子。在一個實(shí)施方案中，將第一接頭核酸分子連接于靶核酸分子。該第一接頭核酸含有能使其與靶核酸分子連接的序列或部分。該第一接頭核酸分子可可選擇地包含可用于后面環(huán)化、克隆、檢測、擴(kuò)增或產(chǎn)生RNA的其它確定的序列。不限于上述概念，這種確定的序列包含有限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)、Cre-lox交叉重疊位點(diǎn)、RNA聚合酶啟動子位點(diǎn)、聚合酶終止位點(diǎn)、發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等。例如，該第一接頭可含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，借此可在靶核酸的一端或兩端產(chǎn)生粘性末端。如果這兩個粘性末端是互補(bǔ)的，或通過所提供的發(fā)夾環(huán)引物的兩個粘性末端相連接，所得到的靶核酸可以被環(huán)化。
在另一個實(shí)施方案中，通過與靶核酸分子雜交或與靶核酸分子連接可以將第一接頭核酸分子添加到靶核酸分子。在利用雜交的實(shí)施方案中，第一接頭核酸分子在其3’端有一用于雜交的互補(bǔ)區(qū)。例如，該互補(bǔ)區(qū)可以是能與mRNA的聚A尾雜交的聚T序列。如果靶核酸的序列是已知的話，則另一個實(shí)施例是確定的序列。如果靶核酸的序列是未知的，那么該互補(bǔ)區(qū)可以是能隨機(jī)雜交的隨機(jī)短序列，例如六聚、七聚、八聚、九聚、十聚、十一聚或十二聚序列。在某些實(shí)施方案中，如果靶核酸是RNA，則可在與靶核酸分子雜交后通過加入聚合酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)來延伸該第一接頭核酸，該第一接頭核酸可含有靶的環(huán)化所需的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在另一個實(shí)施方案中，一旦聚合酶抵達(dá)模板鏈的末端，即可將特定的核苷酸加到新生鏈的末端。例如，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可將胞嘧啶核苷酸加到新生鏈的末端?？芍苯邮褂眠@種突出端，或?qū)⑵溆糜谘由欤鐚⒐丫酆塑账徂D(zhuǎn)換而環(huán)化靶核酸以確保擴(kuò)增全長靶核酸。例如，可將發(fā)夾環(huán)寡(核苷酸)轉(zhuǎn)換引物直接連接于所加的胞嘧啶核苷酸，或作為模板進(jìn)一步延伸所加的胞嘧啶核苷酸，然后與發(fā)夾環(huán)寡轉(zhuǎn)換引物相連。在其它實(shí)施方案中，末端轉(zhuǎn)移酶被用于產(chǎn)生這種突出端。在其它實(shí)施方案中，第一接頭核酸分子可包含接頭池，在其3’端具有隨機(jī)序列，在其5’端具有可選擇的預(yù)選任意序列，包括確定的結(jié)構(gòu)序列?？梢詫⑦@種第一接頭核酸分子與單鏈或雙鏈靶核酸分子一起使用。對于單鏈靶核酸分子，該第一接頭核酸分子可具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可接連于兩端，然后延伸并連接以進(jìn)行環(huán)化。對于雙鏈靶核酸分子，由于該雙鏈靶核酸分子兩端在“呼吸”時或通過雙鏈的變性的隨機(jī)解鏈，隨機(jī)序列在雙鏈靶核酸分子的兩端發(fā)生雜交。該第一接頭核酸分子作為模板，來延伸雙鏈靶核酸分子的兩端，以產(chǎn)生用于環(huán)化的突出端。此外，該第一接頭核酸分子可具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可在環(huán)化延伸之前或之后或不延伸時，連接于雙鏈靶核酸分子的兩端。因此，這種接頭核酸分子可用于環(huán)化未知或已知序列的整個靶核酸分子。
在某些實(shí)施方案中，在靶核酸(或其互補(bǔ)鏈)環(huán)化前或作為其環(huán)化的一部分，將第二接頭核酸分子連接到靶核酸或靶核酸的互補(bǔ)鏈上。該第二接頭核酸分子含有能使其連接到靶核酸分子上的序列或部分。該第二接頭核酸可選擇地還含有與第一核酸分子互補(bǔ)的區(qū)域，從而能通過重組如通過Cre-LoxP系統(tǒng)而環(huán)化。例如，利用含LoxP序列的polyT作為RT引物和含LoxP序列作為寡聚轉(zhuǎn)換引物，將LoxP序列加到靶mRNA的兩端。使用Cre-重組酶可以環(huán)化所得的兩端含LoxP序列的RNA-DNA雙鏈體?？捎肦NA酶H使RNA產(chǎn)生缺口從而作為進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的引物。在其它實(shí)施方案中，第二接頭核酸分子可包含具有粘性末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并可與靶核酸的粘性末端連接以形成環(huán)形結(jié)構(gòu)。在另一個實(shí)施方案中，第二接頭核酸分子可含有能與第一接頭核酸分子雜交的區(qū)域，從而通過第一接頭核酸分子與第二接頭核酸分子的雜交而環(huán)化靶核酸分子。如同第一接頭核酸分子，第二接頭核酸分子還可含有其它有助于環(huán)化靶核酸分子的區(qū)域和確定的環(huán)結(jié)構(gòu)，它們含有有用的序列，如限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、聚合酶啟動子位點(diǎn)、發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等。在另一個實(shí)施方案中，當(dāng)靶核酸分子是mRNA時，可通過寡聚轉(zhuǎn)換方法添加第二接頭核酸分子。在這種情況下，該寡聚轉(zhuǎn)換引物可以是發(fā)夾，并通過連接或延伸后連接而共價結(jié)合于cDNA的第一鏈。其優(yōu)點(diǎn)是只擴(kuò)增全長mRNA轉(zhuǎn)錄物。對于某些實(shí)施方案，可將3’端具有隨機(jī)化序列的第二接頭核酸分子，通過其與靶核酸分子的隨機(jī)雜交然后用聚合酶延伸，而加到靶核酸的另一端。
在靶核酸分子是mRNA的一個方面，環(huán)化的核酸分子理論上包括全長的cDNA?？捎檬褂锰峁┑囊锘蜃鳛橐锏碾S機(jī)聚合物來擴(kuò)增該環(huán)化的全長cDNA，以產(chǎn)生多拷貝的全長雙鏈cDNA。所提供的隨機(jī)聚合物在其5’端可含有T7啟動子序列。指數(shù)擴(kuò)增后，可用T7聚合酶對所得到的雙鏈產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)增以產(chǎn)生RNA。另一方面，可用嵌合引物(例如5’端含有核糖核苷酸的引物)對環(huán)化的全長cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。一旦引物與作為模板的環(huán)化cDNA雜交并延伸，RNA酶H將使5’端的核糖核苷酸序列產(chǎn)生缺口。然后另一引物取代原先的引物與之雜交而發(fā)生聚合和延伸，此過程將循環(huán)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，環(huán)化的核酸分子包含RNA聚合酶啟動子序列，例如T7RNA聚合酶啟動子。根據(jù)T7啟動子的方向和位置，擴(kuò)增的DNA可以用作模板來產(chǎn)生多拷貝反義RNA(aRNA)或mRNA。通過將RNA轉(zhuǎn)錄與滾環(huán)擴(kuò)增相結(jié)合，使aRNA或mRNA的擴(kuò)增效率與采用T7聚合酶而不擴(kuò)增相比得到極大的增強(qiáng)。而且，本發(fā)明的方法可消除3’偏差和簡化擴(kuò)增RNA的過程。在其它實(shí)施方案中，可在靶核酸分子的兩端提供RNA聚合酶啟動子插入到環(huán)化核酸分子中，以產(chǎn)生雙鏈RNA。所得雙鏈RNA可被Dicer片段化以用于RNAi擴(kuò)增。
本發(fā)明還提供利用滾環(huán)擴(kuò)增以擴(kuò)增和檢測靶核酸分子所需區(qū)域的方法。可利用第一接頭核酸分子或第二接頭核酸分子或二者的組合，來確定擬采用與所需區(qū)域上靶核酸雜交或雜交連接的方法進(jìn)行擴(kuò)增的靶核酸分子的有關(guān)區(qū)域。第一和第二接頭都含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在它們與靶雜交之前或之后形成。如果存在靶(序列)，第一和第二接頭可通過連接、或它們與該靶(序列)相互作用后而環(huán)化。在連接形成環(huán)之前可能需要其它反應(yīng)步驟，如聚合。而且，根據(jù)靶(序列)中是否存在突變，第一和第二接頭的環(huán)化可與突變檢測相結(jié)合。
靶核酸分子可通過許多方法環(huán)化，包括但不限于平端連接、將互補(bǔ)的兩端進(jìn)行退火然后連接、互補(bǔ)區(qū)之間的重組或?qū)⒁锱c聚合酶延伸進(jìn)行退火。環(huán)化作用可導(dǎo)致核酸的至少一條鏈被環(huán)化?？赏ㄟ^自身引發(fā)進(jìn)行mRNA靶核酸分子的環(huán)化，即可通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第二條鏈后自身連接閉合環(huán)。cDNA的第一條鏈5’端的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)將進(jìn)一步協(xié)助該自身連接反應(yīng)。第二條鏈的這種自身引發(fā)的合成產(chǎn)物是對應(yīng)于mRNA的5’端被發(fā)夾環(huán)閉合的雙鏈cDNA分子。同樣，也可利用自身引發(fā)來環(huán)化單鏈DNA。
本發(fā)明包括在靶核酸分子被環(huán)化后的多種滾環(huán)擴(kuò)增方法。在某些實(shí)施方案中，采用了能在適當(dāng)?shù)膯幼有蛄胁课徽T導(dǎo)聚合的聚合酶。該啟動子序列可以是已加到第一接頭核酸、第二接頭核酸或二者組合中的序列。某些實(shí)施方案中，聚合酶需要游離的3’端才能開始聚合。有許多方法可產(chǎn)生這種游離的3’端。在一個實(shí)施方案中，該3’端來自環(huán)化。在另一個實(shí)施方案中，在環(huán)化后，通過加入一個或多個能與環(huán)化核酸的某部分雜交的引物來產(chǎn)生3’端。在某些實(shí)施方案中，引物可以是RNADNA嵌合體。在某些實(shí)施方案中，可利用隨機(jī)聚合物作為引物。在其它實(shí)施方案中，采用有限量的內(nèi)切核酸酶使環(huán)化DNA隨機(jī)產(chǎn)生缺口而導(dǎo)入該游離3’端。在擴(kuò)增RNA的情況時，可用有限量的RNA酶H使RNA產(chǎn)生缺口，或用過量的RNA酶H完全去除RNA。在其它實(shí)施方案中，用限制性內(nèi)切酶在半甲基化的限制位點(diǎn)切割導(dǎo)入該游離3’端。
在需要游離3’端的實(shí)施方案中，靶核酸可通過該游離3’端經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增。某些實(shí)施方案包括通過加入RNA酶引發(fā)靶核酸分子中所加入的啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。在某些實(shí)施方案中，只采用一個能導(dǎo)致線性擴(kuò)增的引發(fā)點(diǎn)。這可通過添加單一引物、采用一個聚合酶起點(diǎn)或只在環(huán)化核酸分子的一條鏈上產(chǎn)生游離3’端來實(shí)現(xiàn)。其它實(shí)施方案中，通過產(chǎn)生對應(yīng)于兩條鏈的游離3’端來實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。實(shí)施例是加入一對引物，各自與環(huán)化核酸分子的不同鏈退火。
在另一個實(shí)施方案中，可將環(huán)化的全長靶多核苷酸序列構(gòu)建為含有影響轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)元件以便可以利用它們在體內(nèi)外表達(dá)蛋白質(zhì)，和/或特定用途的標(biāo)記序列，例如檢測標(biāo)記。這些方法消除了將雙鏈cDNA插入到載體或質(zhì)粒中的復(fù)雜性。
在本發(fā)明的另一方面，通過加入含有能與靶核酸分子雜交的第一區(qū)域的環(huán)形核酸分子，來檢測和/或擴(kuò)增靶核酸分子。靶核酸分子與該環(huán)形核酸分子雜交，在靶核酸分子的可延伸游離3’端啟動滾環(huán)擴(kuò)增。在靶核酸分子與環(huán)形核酸分子雜交之前或之后，可在該靶核酸分子中產(chǎn)生可延伸的游離3’端。當(dāng)靶核酸分子是3’端具有聚A尾的mRNA時，這特別重要。雜交前或雜交后通過靶核酸分子的位點(diǎn)特異性切割或隨機(jī)切割可產(chǎn)生游離的3’端。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多位點(diǎn)特異性切割方法，它們均包括在本發(fā)明中。實(shí)施例包括限制性內(nèi)切酶，對于RNA，有核酶、RNAi Dicer等。隨機(jī)切割可用化學(xué)試劑或非特異性核酸酶進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可利用合成的寡核苷酸自連接而不是模板依賴性連接或通過鎖式探針來構(gòu)建環(huán)形核酸分子。此法是一種單分子反應(yīng)或者分子間反應(yīng)，比采用鎖式探針或模板依賴的連接反應(yīng)更有效和精確。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可利用已有的全長cDNA克隆文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或從RNA來構(gòu)建任何基因的全長環(huán)形核酸分子。所產(chǎn)生的全長環(huán)形核酸分子可用于特定基因和靶分子的擴(kuò)增、檢測和定量。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通過使用環(huán)形核酸分子探針檢測和擴(kuò)增靶核酸分子。該環(huán)形核酸分子能與靶雜交，可含有靶序列?？蓮奶峁┑腄NA片段、RNA片段、或RNA DNA嵌合片段選擇性產(chǎn)生游離3’端?？衫冒蟹肿优c所加片段之間相互作用后的其它反應(yīng)步驟，如RNA酶切割缺口、聚合酶反應(yīng)或其它反應(yīng)，來產(chǎn)生游離3’端。產(chǎn)生的游離3’端只用于以環(huán)形核酸分子作為模板的聚合和檢測，僅僅當(dāng)存在靶核酸分子時，無論靶核酸分子中是否存在突變。加入的片段可以是有或沒有特殊結(jié)構(gòu)的線性、發(fā)夾或環(huán)形片段?？赡苡幸环N以上的片段能同時與靶核酸分子相互作用。加入的片段與靶核酸分子之間相互作用的過程可以是環(huán)化，能重復(fù)產(chǎn)生用于滾環(huán)擴(kuò)增的游離3’端。靶核酸分子可以是單鏈DNA、雙鏈DNA或RNA。實(shí)施例見圖5D、5E、5F。因此，可用此法來選擇性擴(kuò)增具有特定序列(例如突變或無突變的靶核酸分子)，此法中只是在具有該特定序列的環(huán)化核酸分子上引發(fā)RCA。
一旦在某游離3’端處引發(fā)了滾環(huán)擴(kuò)增，可利用加入的與新生鏈互補(bǔ)的引物進(jìn)一步增強(qiáng)擴(kuò)增。
在本發(fā)明的另一方面，可通過只在突變或非突變的靶核酸分子中選擇性產(chǎn)生用于RCA的游離3’端，來檢測靶核酸分子中的突變，例如單個核苷酸多態(tài)性。實(shí)施例包括靶向突變位點(diǎn)的核酶、使靶核酸分子與有或無突變的靶核酸分子相互補(bǔ)的核酸分子雜交，然后用能切割錯配處的酶(如S1核酸酶)產(chǎn)生缺口。
在本發(fā)明的另一方面，靶分子可以是單鏈或雙鏈DNA。在3’端延伸被阻斷處可加入RNA片段。如果存在靶核酸分子，該RNA片段將與靶雜交，然后酶(如RNA酶H)將消化加入的RNA片段產(chǎn)生游離3’端。因此，加入的環(huán)形核酸分子將啟動滾環(huán)擴(kuò)增。所述RNA片段可含有發(fā)夾環(huán)以提高反應(yīng)特異性。
可用諸如以下所述可用于檢測核酸的任何方法來進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。
本發(fā)明的許多實(shí)施方案可在固相基質(zhì)上進(jìn)行。合適的固相基質(zhì)包括所述序列(靶序列、探針、提供的片段等)可與之偶聯(lián)或吸附的任何固體材料，包括例如丙烯酰胺、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、玻璃、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆、碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚富馬酸丙脂、膠原、葡胺聚糖和聚氨基酸。合適的固相基質(zhì)可以是任何有用的形式，包括薄層/膜、珠、瓶、碟、玻片、纖維、紡織纖維、成型聚合物、顆粒和微粒。固相基質(zhì)的優(yōu)選形式是微量滴定平皿和載玻片，特別是微陣列載玻片，其上可附著多達(dá)256個形成小斑點(diǎn)陣列的不同靶樣品。各點(diǎn)直徑優(yōu)選為0.1～2.5mm，最優(yōu)選直徑約2.5mm。這種微陣列可用熟知的光刻蝕法、接觸沉積法和噴墨打印法等加以制作。
固定在固相基質(zhì)上的序列可使形成定位于該固相基質(zhì)上的靶特異性擴(kuò)增的核酸。這種定位提供了兩種便捷方法，包括洗去可能干擾后續(xù)檢測步驟的反應(yīng)成分及同時測定多個不同樣品。在不同樣品附著的各位點(diǎn)可獨(dú)自形成擴(kuò)增的核酸?？衫靡寻l(fā)表的方法來固定靶序列或其它寡核苷酸分子以形成固相樣品。
附圖的簡要說明 圖1概括了用RCA擴(kuò)增RNA的幾種本發(fā)明實(shí)施方案。
圖2和3概括了環(huán)化RNA和DNA模板的本發(fā)明實(shí)施方案。
圖4概括了如何用RCA檢測SNP和如何擴(kuò)增特定基因片段。
圖4概括了用RCA擴(kuò)增DNA的方法。
圖5概括了用環(huán)形探針檢測RNA和DNA的方法。
發(fā)明詳述 如本文所用的術(shù)語，“環(huán)形核酸分子”是具有至少一條不間斷鏈的核酸分子。可利用該環(huán)形核酸分子來檢測和擴(kuò)增靶核酸分子。該環(huán)形核酸分子中可含有靶核酸分子的至少一部分，或靶核酸分子的至少一部分與該環(huán)形核酸分子的一部分相互補(bǔ)。該環(huán)形核酸分子可以是RNA、DNA、PNA或它們的任何組合。該環(huán)形核酸分子可含有天然或非天然堿基，也可含有丟失的堿基。該環(huán)形核酸分子可用合適的技術(shù)來產(chǎn)生包括但不限于合成和天然的方法。
如本文所用的術(shù)語，“環(huán)化的核酸分子”是其環(huán)形部分中含有靶核酸分子或與靶核酸分子相互補(bǔ)的核酸分子。該環(huán)化的核酸分子作為擴(kuò)增和克隆過程的一部分而產(chǎn)生。該環(huán)化的核酸分子含有至少一條不間斷鏈。該環(huán)化的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA或它們的任何組合。該環(huán)化的核酸分子可含有天然或非天然堿基也可含有丟失的堿基。
如本文所用的術(shù)語，“游離3’端”是退火為聚合酶可延伸的模板核酸鏈的核酸分子的3’端。
如本文所用的術(shù)語，“靶核酸分子”是擬通過滾環(huán)擴(kuò)增來進(jìn)行克隆、擴(kuò)增或檢測的核酸分子。靶核酸分子可獲自任何來源。可以是mRNA、rRNA、RNAi、被加工的RNA、基因組DNA和cDNA等。
靶核酸的制備 本發(fā)明包括待擴(kuò)增用于克隆、檢測等的靶核酸分子。所公開的方法適合于任何感興趣的核酸分子。該核酸分子可獲自任何來源，包括但不限于細(xì)胞或組織樣品、文庫中的核酸分子、化學(xué)合成的核酸分子、基因組核酸分子、克隆的核酸、這些核酸的混合物、信使RNA、包括它們的剪接變體和中間體。所述方法特別適合于產(chǎn)生mRNA混合物文庫。唯一要求是該核酸能根據(jù)本發(fā)明的方法被環(huán)化，或具有確定的序列以用本發(fā)明方法檢測。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用的各種方法可獲得該核酸。許多這種方法的詳細(xì)方案見例如Ausubel等，Current Protocol in Molecular Biology(Supplemented through2000)Jone Wiley & Sons，New York；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Berger和Kimmel，Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology第152卷，AcademicPress，Inc.，San Diego，CA。
一旦獲得了感興趣的核酸分子，可根據(jù)后面施用于該分子的方法對該分子進(jìn)行進(jìn)一步操作。例如，用環(huán)形核酸檢測靶核酸分子時，該靶核酸可經(jīng)預(yù)處理以產(chǎn)生不同的或額外的游離3’端。實(shí)施例包括用位點(diǎn)特異性核酶靶向切割，或與互補(bǔ)核酸序列雜交后用適當(dāng)?shù)暮怂崦赶?。對于mRNA，可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的任何合適技術(shù)去除聚A尾。關(guān)于mRNA的一個實(shí)施例是加入單鏈polyT DNA和RNA酶H。此外，可切割較長的核酸分子產(chǎn)生較短的片段。這類切割的實(shí)施例包括用移液器或超聲波物理性剪切DNA，用限制性內(nèi)切酶消化等。
此外，為幫助環(huán)化，可用各種其它方法處理核酸，如用限制性酶產(chǎn)生的突出端充填、用多核苷酸激酶加入磷酸基團(tuán)進(jìn)行后續(xù)連接或用磷酸酶去除磷酸基團(tuán)防止后面的連接?？蓪⑾拗菩詢?nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端退火連接而環(huán)化進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的核酸。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在文獻(xiàn)中找到所有這些方法的詳細(xì)方案。
靶核酸的環(huán)化 本發(fā)明包括通過連接、雜交連接、雜交聚合和連接、重組、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)來進(jìn)行環(huán)化。為特定反應(yīng)選擇合適的連接酶是本領(lǐng)域常規(guī)的如為DNA分子選擇DNA連接酶和為RNA選擇RNA連接酶等。合適的連接酶包括用于環(huán)化單鏈DNA或RNA的T4RNA連接酶、T4DNA連接酶(Davis等，Advanced Bacterial Genetics-A Manual for Genetic Engineering(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1980)、大腸桿菌(E.Coli)DNA連接酶(Panasnko等，J.Biol.Chem.2534590-4592，1978)、AMPLIGASE.RTM(Kalin等，Mutat Res.，283(2)119-123，1992；Winn-Deen等，Mol Cell Probes(England)7(3)179-186，1993)、Taq DNA連接酶(Barany，Proc.Natl.Acad Sci.USA 88189-193，1991)、Termas Thermophilus DNA連接酶(Abbott Laboratories)、Thermus scotoductus DNA連接酶和Rhodothermusmarinus DNA連接酶(Thorbjarnardottir等，Gene.151177-180，1995)。對于涉及RNA靶核酸分子的連接優(yōu)選T4DNA連接酶，因?yàn)樗軌蜻B接DNARNA雜交體中的DNA端(Hsuih.等，用新的依賴連接的聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測HCV RNA，American Association for the Study of Liver Diseases(Chicago IL，Nov.3-7，1995)。
靶核酸分子的環(huán)化可包括環(huán)化靶核酸(包括靶分子的所需區(qū)域或亞組)或其互補(bǔ)物，或靶核酸互補(bǔ)鏈的互補(bǔ)鏈，或靶核酸與其互補(bǔ)物的組合，或靶核酸互補(bǔ)鏈與靶核酸互補(bǔ)鏈的互補(bǔ)鏈的組合。
可采用特異性序列與靶核酸或靶核酸的互補(bǔ)鏈或靶核酸與其互補(bǔ)鏈的結(jié)合物的一端或兩端結(jié)合來環(huán)化靶核酸。加在靶核酸兩端的特異性序列被稱為第一和第二接頭核酸分子。將第一接頭或第二接頭連接于靶核酸后，可采用其它反應(yīng)，如雜交、連接、聚合和連接、或限制性酶反應(yīng)和連接來環(huán)化靶核酸。
使接頭連接于靶核酸包括使可選擇的序列與確定的結(jié)構(gòu)相連接，使反應(yīng)性功能基團(tuán)與靶核酸或其互補(bǔ)鏈的所需區(qū)域相連接，這樣可用RCA環(huán)化和擴(kuò)增整個靶核酸或其互補(bǔ)鏈，或它們的一部分。
可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的許多技術(shù)將第一接頭核酸分子連接于靶核酸分子。宜將第一接頭核酸分子連接于靶核酸的一端。在某些實(shí)施方案中，可將第一接頭核酸分子連接于靶核酸的兩端。使第一接頭與靶核酸連接的方法包括連接、雜交連接、雜交后用聚合酶延伸、及諸如末端轉(zhuǎn)移酶和連接酶的其它酶反應(yīng)。優(yōu)選的實(shí)施例是第一接頭3’端含有針對mRNA靶核酸的聚-T序列。此外，該接頭可含有一個或多個其它序列，可選擇地具有能促進(jìn)環(huán)化、檢測等預(yù)先確定的特定結(jié)構(gòu)。實(shí)施例包括RNA和/或DNA聚合酶啟動子、位點(diǎn)特異性重組序列如loxP、一般性重組的同源性序列、限制性位點(diǎn)(包括半甲基化位點(diǎn))、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核酶結(jié)合位點(diǎn)、RNAi、復(fù)制起始點(diǎn)、基因，包括ORF、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等?？蛇x擇的，可用與這些相似的方法來連接第二接頭。第二接頭可含有可用于環(huán)化、檢測等的一個或多個其它序列。此外，當(dāng)靶核酸分子是mRNA時，第二接頭可用CAP-切換(switch)方法連接(如美國專利5,962,271)。此外，第二接頭可用寡-加帽(oligo-capping)方法連接(如美國專利5,597,713)。如Patel等，PNAS，932969-2974所述的，第二接頭也可以利用CAP-切換的方式來雜交連接。CAP切換的模板或模板切換的寡核苷酸可具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)并被連接于靶核酸，或可具有限制性酶位點(diǎn)而產(chǎn)生環(huán)化所需的粘性末端。實(shí)施例見圖2A。
在具體實(shí)施方案中，第一和/或第二接頭具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。憑借第一接頭或第二接頭中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在靶核酸所需區(qū)域中產(chǎn)生第二發(fā)夾并與第一發(fā)夾形成一個環(huán)而環(huán)化靶核酸。環(huán)化第一和第二發(fā)夾之間的靶序列的反應(yīng)，包括雜交、聚合或連接步驟，或雜交、聚合與連接的組合。通過連接或雜交，或雜交與連接二者的組合，或自身引發(fā)，可產(chǎn)生第二發(fā)夾。實(shí)施例見圖2A，2B。
在具體實(shí)施方案中，第一和/或第二接頭含有一個或多個限制性酶位點(diǎn)。憑借第一和/或第二接頭中的限制性酶位點(diǎn)，可在靶核酸的一端或兩端產(chǎn)生粘性末端。通過與發(fā)夾片段的一個或兩個粘性末端連接可環(huán)化靶核酸?；蛘?，將靶核酸的兩個粘性末端互補(bǔ)連接以形成環(huán)。實(shí)施例見圖2C、3B。
在具體實(shí)施方案中，第一和/或第二接頭含有同源序列。兩端具有同源序列的靶核酸可用重組酶環(huán)化。實(shí)施例見圖2D。
對于單鏈或雙鏈核酸分子，如果靶序列未知，第一和可選擇地第二接頭核酸分子可含有隨機(jī)序列；或如果靶序列已知，可在它們的3’端含有確定的序列，該序列可雜交連接于靶核酸分子，或雜交并通過加入適當(dāng)?shù)木酆厦付由爝B接。接頭核酸分子可含有具有確定結(jié)構(gòu)的額外序列，如用于環(huán)化的發(fā)夾。由于雙鏈體的瞬間解鏈(breathing)或雙鏈體的變性，造成兩端的雙螺旋發(fā)生隨機(jī)解鏈(random unzipping)，具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第一接頭或可選擇地第二接頭將在雙鏈核酸分子的兩端發(fā)生雜交和連接。一旦此鏈打開，接頭雜交或連接，聚合酶即可從游離3’端延伸。連接3’端與5’端而形成環(huán)?；蛘撸捎陔p鏈體的瞬間解鏈(breathing)造成兩端的雙螺旋發(fā)生隨機(jī)解鏈(random unzipping)，含有限制性酶位點(diǎn)的第一接頭或可選擇地第二接頭將在雙鏈核酸分子的兩個末端發(fā)生雜交。一旦打開此鏈并且接頭被雜交或者連接，聚合酶即可從靶核酸分子的游離3’端延伸產(chǎn)生平末端。所產(chǎn)生的雙鏈靶核酸分子然后可被環(huán)化和擴(kuò)增。實(shí)施例見圖3C、3D。
靶核酸分子可通過雜交環(huán)化。連接的第一接頭可與靶核酸分子的另一端雜交，或可選擇地連接的第二接頭雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，如果需要，本發(fā)明可以可選擇地包括其它的間插接頭。雜交后，應(yīng)采用連接酶來產(chǎn)生至少一條鏈，該鏈連接于毗連分子。靶核酸分子也可用化學(xué)反應(yīng)或光反應(yīng)加以環(huán)化。實(shí)施例見圖3A。
此外，mRNA靶核酸分子可通過自身引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生第二條DNA鏈而環(huán)化。一旦該鏈合成，可通過連接而閉環(huán)。在某些實(shí)施方案中，第一接頭核酸具有發(fā)夾，可增強(qiáng)自身引發(fā)后的環(huán)化。發(fā)夾環(huán)可以是任何大小，可容納可能需要的其它序列元件。在某些實(shí)施方案中，第一接頭核酸也具有限制性酶位點(diǎn)?？稍诤铣傻诙淒NA后產(chǎn)生粘性末端。然后與發(fā)夾片段的粘性末端連接而閉環(huán)。實(shí)施例見圖2B、2C。
此外，從mRNA合成的cDNA的第一鏈可以不是全長的。此時，第一和可選擇地第二接頭核酸分子的3’端可含有隨機(jī)序列，它們能與cDNA第一鏈的3’端雜交，并通過加入適當(dāng)?shù)木酆厦高M(jìn)行延伸。可用具有修飾的polyT或修飾的隨機(jī)引物(含或不含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或含或不含限制性酶位點(diǎn))合成cDNA的第一鏈。接頭核酸分子可含有環(huán)化所需的其它序列。
由于雙鏈體的短暫解鏈(breathing)或雙鏈體的變性，造成RNADNA雙鏈體在第一鏈3’端的隨機(jī)解鏈，隨機(jī)序列憑借發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在第一鏈的3’端雜交。一旦鏈打開，接頭雜交或連接，聚合酶可從游離3’端延伸，連接3’端與5’端而形成環(huán)?；蛘?，由于雙鏈體瞬間解鏈造成的兩端雙鏈體隨機(jī)解鏈，含有限制性酶位點(diǎn)的第一接頭或可選擇地第二接頭可在RNA-DNA雙鏈體的兩末端雜交。一旦鏈打開，接頭雜交，聚合酶可從cDNA第一鏈游離3’端延伸產(chǎn)生平末端。然后所得雙鏈靶核酸可被環(huán)化和擴(kuò)增。實(shí)施例可見，例如我們先前的申請中的圖14。
此外，靶核酸可通過重組而環(huán)化?？衫梦稽c(diǎn)特異性重組酶，如Cre，或通過可將分子與同源區(qū)段重組的重組酶(如與LoxP-CreI重組，美國專利5,591,609)來實(shí)現(xiàn)這種重組。實(shí)施例見圖2D。
在一個實(shí)施方案中，為了采用RCA來擴(kuò)增和檢測靶核酸的所需區(qū)域，可利用第一和/或第二接頭，通過與靶核酸所需區(qū)域的雜交或雜交連接，來確定靶核酸中待擴(kuò)增的區(qū)域。第一和/或第二接頭中所含的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在它們與靶核酸雜交之前或之后形成。如果存在靶核酸，第一和第二接頭可與之連接而環(huán)化，或在它們與靶核酸相互作用后環(huán)化。雜交后連接成環(huán)前可采用其它反應(yīng)步驟如聚合反應(yīng)。此外，可根據(jù)靶核酸中是否存在突變，結(jié)合突變檢測來環(huán)化第一和第二接頭。實(shí)施例見圖4A、4B、4C、4D。
第一和/或第二接頭可與靶核酸雜交形成三螺旋體并連接形成環(huán)。RCA可釋放靶核酸用于第二輪雜交、環(huán)化和擴(kuò)增。
可切割連接的環(huán)形核酸分子形成線性產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可用PCR擴(kuò)增而不用滾環(huán)擴(kuò)增。
游離3’端的產(chǎn)生 一旦靶核酸環(huán)化，需要游離3’端開始RCA，可能需要從靶核酸產(chǎn)生或提供此游離3’端。在靶核酸環(huán)化前或環(huán)化后從其產(chǎn)生游離3’端。對于涉及靶核酸環(huán)化的方法，環(huán)化本身可導(dǎo)致游離3’端的產(chǎn)生。如果需要，可用很多方法產(chǎn)生游離3’端。當(dāng)靶核酸是RNA分子時，它可與互補(bǔ)DNA分子雜交，可用RNA酶H來完全消化此RNA分子，可用限量內(nèi)切酶切割此RNA，產(chǎn)生游離3’端。此外，可用限量內(nèi)切酶切割雙鏈核酸分子產(chǎn)生缺口?？刂圃撓拗屏渴箖蓷l鏈不被切斷，因?yàn)楸仨毐Ａ糁辽僖粭l鏈完整，用于滾環(huán)擴(kuò)增。類似地，可利用能切割DNA形成缺口的有限量化學(xué)物質(zhì)來產(chǎn)生游離3’端。
此外，可用硫代磷酸化的或半甲基化的雙鏈核酸來產(chǎn)生特異性游離3’端。某些限制性內(nèi)切酶在限制性位點(diǎn)被硫代磷?；虬爰谆瘯r只切割一條鏈。這種半甲基化的DNA可用許多方法產(chǎn)生。例如，可用甲基化的核苷酸在關(guān)鍵部位化學(xué)合成核酸分子；可在體外用位點(diǎn)特異性DNA甲基化酶將核酸分子甲基化；或可從表達(dá)所需位點(diǎn)特異性DNA甲基化酶的生物體獲得核酸分子。還有可采用天然只能切割雙鏈體一條鏈的某些限制性內(nèi)切酶，如N.AlwI、N.BstNBI(二者均可獲自New England Biolabs)。
此外，可采用核酶或RNAi構(gòu)建物如Dicer在特定位置切割核糖核酸，產(chǎn)生游離3’端。
產(chǎn)生游離3’端的另一種方法是通過提供寡核苷酸引物來完成的。優(yōu)選的引物是鏈置換引物。一種形式的鏈置換引物是具有與環(huán)形核酸一條鏈互補(bǔ)序列的寡核苷酸。此序列稱為鏈置換引物的匹配部分。鏈置換引物的匹配部分可與任何序列互補(bǔ)。然而，如果用于此目的，優(yōu)選的是它不與任何其它鏈置換引物互補(bǔ)，這可防止引物之間彼此雜交。鏈置換引物的匹配部分可與插入的核酸分子的全部或一部分互補(bǔ)，雖然這不是優(yōu)選的。鏈置換引物的匹配部分可以是能支持引物及其互補(bǔ)物之間特異和穩(wěn)定雜交的任何長度。通常此長度是12-35個核苷酸，優(yōu)選長度為18-25個核苷酸。
鏈置換引物的5’端最好還含有不與環(huán)形核酸一條鏈的任何部分相匹配的其它序列。此序列稱為鏈置換引物的非匹配部分。鏈置換引物的非匹配部分如果存在的話，其作用是促進(jìn)DNA復(fù)制時的鏈置換。鏈置換引物的非匹配部分可以是任何長度，但通常長度為1-100個核苷酸，優(yōu)選長度為4-8個核苷酸。
鏈置換引物的5’端可選擇地可含有其它RNA序列，該序列可與環(huán)形核酸一條鏈的任何部分匹配或不匹配。采用這種嵌合引物的實(shí)施例見美國專利No.6，251,639和美國專利申請No.2003/0087251。
可采用其它鏈置換引物來增強(qiáng)靶核酸的擴(kuò)增。其它鏈置換引物可與第一鏈置換引物互補(bǔ)物的相同鏈相互補(bǔ)，以線性增強(qiáng)擴(kuò)增，或具有與第一鏈置換引物互補(bǔ)物相同的序列而呈幾何級數(shù)地增強(qiáng)擴(kuò)增。還有，優(yōu)選引物鏈置換引物不與其它任何鏈置換引物相互補(bǔ)，以防止引物彼此雜交。
鏈置換引物也可含有修飾的核苷酸以使它們能抵抗外切酶的消化。例如，引物在其5’端核苷酸之間可以有3個或4個硫代磷酸酯鍵。這種核酸酶抗性引物可選擇性地降解過量的未連接的線性載體，否則這些載體可能干擾探針與引物雜交形成擴(kuò)增的核酸。如下所述，鏈置換引物可用于鏈置換復(fù)制和鏈置換級聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)增。
此外，可通過加入隨機(jī)序列的短寡核苷酸來提供游離3’端。優(yōu)選的長度為六聚體。為幫助鏈置換，核苷酸的5’端可以是RNA。
滾環(huán)擴(kuò)增 可用本發(fā)明的環(huán)化核酸分子和環(huán)形核酸分子進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。該反應(yīng)需要兩種成分(a)游離3’端和(b)滾環(huán)聚合酶。此聚合酶在進(jìn)行性滾環(huán)聚合反應(yīng)中可催化引物延伸和鏈置換直到所需的程度，可產(chǎn)生多達(dá)100000個核苷酸的分子或更大的分子。該重復(fù)DNA序列DNA(R-DNA)由環(huán)形或環(huán)化核酸分子序列的長重復(fù)單元組成。許多參考文獻(xiàn)公開了所用的引物、引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增技術(shù)，包括美國專利No.5,871,921、No.5,648,245、No.5,866,377和No.5,854，033，也參見美國專利申請No.20030165948。
用環(huán)形核酸探針檢測 本發(fā)明還包括用環(huán)形核酸分子作為探針，根據(jù)是否發(fā)生了RCA來檢測靶核酸分子。該探針可包含整個靶序列或其一部分或其互補(bǔ)鏈，根據(jù)游離3，端的來源與探針雜交引發(fā)RCA。如果游離3’端產(chǎn)生自引發(fā)RCA的靶序列或其互補(bǔ)序列，這些探針包含整個靶序列或其互補(bǔ)序列的一部分，和/或能與之雜交。如果游離3’端不是產(chǎn)生自靶序列或其互補(bǔ)序列，該探針不必含有整個靶序列或其互補(bǔ)序列的一部分，和/或不必與之雜交。
該探針的第一部分含有能與感興趣的靶核酸分子雜交的序列，其第二部分含有能檢測擴(kuò)增的環(huán)的序列。
本發(fā)明的一個方面，可利用自身連接從線性短寡核苷酸片段構(gòu)建探針。這些線性短寡核苷酸片段可含有特定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使它們能自身連接形成環(huán)形核酸分子。這種方法與鎖式探針和其它模板相比具有優(yōu)點(diǎn)。連接效率高得多，能避免錯誤連接形成更大的線性鏈或更大的環(huán)形核酸分子。
本發(fā)明的另一個方面，可從市售全長cDNA克隆文庫構(gòu)建全長的環(huán)形cDNA核酸分子。用PCR選擇性擴(kuò)增特異性基因克隆，然后通過自身連接而環(huán)化。所得到的環(huán)形cDNA核酸分子可用于基因特異性檢測和擴(kuò)增，不需要采用TaqMan或RT-PCR。
一個實(shí)施方案中，探針可可選擇地含有可用于后續(xù)無隆、檢測、擴(kuò)增或產(chǎn)生RNA的其它確定的序列。這種確定的序列包括限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、RNA聚合酶啟動子位點(diǎn)、聚合酶終止位點(diǎn)、長度短的隨機(jī)化序列，如六聚體、七聚體、八聚體、九聚體、十聚體、十一聚體或十二聚體。
本發(fā)明包括以簡化程序聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄酶和等溫鏈置換酶以逆轉(zhuǎn)錄酶滾環(huán)擴(kuò)增(RT-RCA)方式擴(kuò)增RNA的組合物和方法。用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)生cDNA。用等溫鏈置換酶環(huán)化cDNA并擴(kuò)增。如果存在T7啟動子，可轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生RNA。這種RNA擴(kuò)增方法結(jié)合了滾環(huán)擴(kuò)增和T7擴(kuò)增的擴(kuò)增效力。因此本發(fā)明促進(jìn)了核酸分子的快速有效擴(kuò)增和RNA分子的檢測與定量。本發(fā)明也可用于快速生產(chǎn)和擴(kuò)增可用于各種產(chǎn)業(yè)、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)目的的cDNA(單鏈和雙鏈)。
探針也可通過環(huán)化靶核酸分子來構(gòu)建；本說明書中敘述可用于環(huán)化靶核酸分子的方法。
一旦靶核酸分子與環(huán)形核酸雜交，可利用靶核酸分子作為游離3’端啟動滾環(huán)擴(kuò)增。本說明書敘述從靶核酸產(chǎn)生游離3’端啟動滾環(huán)擴(kuò)增的合適方法。與上述采用依賴于連接形成環(huán)形核酸的滾環(huán)擴(kuò)增來檢測的方法相反。然而，在某些實(shí)施方案中，可利用直鏈進(jìn)行需要連接以啟動RCA的檢測。此法可用于提高檢測的靈敏度。本發(fā)明在加入樣品前，利用已環(huán)化的核酸，而靶核酸本身可提供游離3’端。如果需要，可利用上述產(chǎn)生游離3’端的方法來產(chǎn)生一個或多個游離3’端。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可利用引物來提供游離3’端，只要設(shè)計(jì)這樣的引物時注意到該引物不能與環(huán)形核酸雜交而直接參與RCA。因此，該引物的3’端可具有與環(huán)形核酸相同的序列。這種引物可充許階乘(n！)擴(kuò)增。引物較佳為不與靶核酸分子雜交。在一個實(shí)施方案中，環(huán)形核酸分子還含有聚-A部分。此實(shí)施方案可用于檢測感興趣的mRNA。一旦感興趣的靶核酸結(jié)合于該環(huán)形核酸即開始滾環(huán)擴(kuò)增，mRNA的聚-A尾將通過互補(bǔ)的聚-T部分結(jié)合新生的核酸。這樣，在此實(shí)施方案中，不需加入任何引物即可實(shí)現(xiàn)階乘(n！)擴(kuò)增。
本發(fā)明的方法也可用于檢測突變。可根據(jù)只擴(kuò)增突變的靶核酸分子，或只擴(kuò)增非突變的靶核酸分子來選擇產(chǎn)生游離3’端的方法和反應(yīng)條件。一個實(shí)施例是利用DNA發(fā)夾用RNA酶H靶向降解RNA。如果靶核酸分子只攜帶了一個核苷酸多形性，則該DNA中的發(fā)夾將不能退火，RNA酶H將不能消化該RNA產(chǎn)生游離3’端。因此突變的靶核酸分子不能啟動RCA。
本發(fā)明提供了采用環(huán)形核酸分子探針檢測和/或擴(kuò)增靶核酸分子的另一種方法。所述探針可與靶核酸雜交，可含有靶核酸序列?？蓮奶峁┑腄NA片段、RNA片段、或靶核酸分子與上述片段之間相互作用所產(chǎn)生的RNA DNA嵌合性片段的非靶核酸序列，選擇性產(chǎn)生游離3’端。靶核酸與提供的片段之間相互作用后，可采用其它步驟，如RNA酶H的切割缺口、聚合酶反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、限制性酶切或其它反應(yīng)，來產(chǎn)生游離3’端。當(dāng)存在靶核酸時，或靶核酸分子中存在或不存在明確的突變時，產(chǎn)生的游離3’端可用于以環(huán)形核酸分子作為模板的聚合和檢測。提供的片段可以是直線、發(fā)夾或環(huán)形，具有或沒有確定的結(jié)構(gòu)，可同時用多個片段與靶核酸相互作用。所提供的片段與靶核酸分子之間的相互作用過程可循環(huán)反復(fù)產(chǎn)生游離3’端用于滾環(huán)擴(kuò)增。靶核酸分子可以是單鏈DNA、雙鏈DNA或RNA。實(shí)施例見圖5D、5E、5F。探針可可選擇地含有可用于后續(xù)克隆、檢測、擴(kuò)增或產(chǎn)生RNA的其它確定的序列。這種確定的序列包括限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、RNA聚合酶啟動子位點(diǎn)、聚合酶終止位點(diǎn)、長度短的隨機(jī)化序列，如六聚體、七聚體、八聚體、九聚體、十聚體、十一聚體或十二聚體。
用檢測核酸的合適技術(shù)可進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。檢測方法的一些實(shí)施例是染料，它們可直接地或通過額外的連接部分與核酸以共價鍵、嵌入、或某些其它形式的結(jié)合發(fā)生相互作用。也可采用放射性標(biāo)記。
本發(fā)明的方法也可用于多重反應(yīng)中，即同時檢測一個樣品中的兩種或多種核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用適合多重檢測核酸的方法。通常滾環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物可能由于其中摻入了不同的標(biāo)記、產(chǎn)物的長度不同或產(chǎn)物的序列不同而有所差別。摻入不同標(biāo)記的方法有一個實(shí)施例是使用具有附著標(biāo)記的不同次級引物。設(shè)計(jì)用于多重檢測的環(huán)形核酸時，與靶核酸互補(bǔ)的區(qū)域以基本上不相同為宜，以限制非特異性引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。理想地，應(yīng)設(shè)計(jì)任何環(huán)形核苷酸以限制可能存在于靶核酸混合物中的非靶核酸的非特異性引發(fā)。
檢測產(chǎn)物 為了有助于采用克隆和檢測核酸用的滾環(huán)擴(kuò)增法對擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測和定量，可將檢測標(biāo)記直接摻入到擴(kuò)增的核酸中，或可偶聯(lián)于檢測分子。如本文所用，檢測標(biāo)記是能與擴(kuò)增的核酸直接或間接結(jié)合的一種分子，這種結(jié)合導(dǎo)致可直接或間接測量或檢測的信號。許多這類可摻入核酸或偶聯(lián)于核酸的標(biāo)記或抗體探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。適合用于滾環(huán)擴(kuò)增的檢測標(biāo)記的實(shí)施例有放射活性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體、核酸結(jié)合蛋白和配體。
合適的熒光標(biāo)記實(shí)施例包括熒光素(FITC)、5，6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅、硝基苯-2-氧雜-1，3二唑-4-基酯(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、羅丹明、4’，6-二脒基-2-phenylinodo-le(DAPI)、和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。優(yōu)選的熒光標(biāo)記有熒光素(5-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)和羅丹明(5，6-四甲基羅丹明)。優(yōu)選的組合性多色彩熒光標(biāo)記有FITC和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。這些熒光染料的吸收和發(fā)射的最大值分別是FITC(490nm；520nm)，Cy3(554nm；568nm)，Cy3.5(581nm；588nm)，Cy5(652nm；672nm)，Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)，因而可同時檢測它們。熒光標(biāo)記可獲自各種商業(yè)來源，包括Molecular Probes，Eugene，OR and Research Organics，Cleveland，Ohio。
標(biāo)記的核苷酸是檢測標(biāo)記的較佳形式，因?yàn)樗鼈兛稍诤铣蓵r或合成后連接時直接摻入到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物中?？蓳饺霐U(kuò)增的核酸產(chǎn)物中的檢測標(biāo)記包括例如核苷酸類似物，如BrdUrd(Hoy和Schimke，Mutation Research.290217-230，1993)；BrUTP(Wansick等，J Cell Biology 122283-293，1993)和生物素修飾的核苷酸(Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.786633，1981)或含有合適的半抗原如洋地黃毒苷的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205359-364，1994)。合適的熒光素標(biāo)記的核苷酸如異硫氰酸熒光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yu等，Nucleic Acid Res.，223226-3233，1994)。DNA的優(yōu)選核苷酸類似物檢測標(biāo)記是BrdUrd(三磷酸BUDR Sigma)，RNA的優(yōu)選核苷酸類似物檢測標(biāo)記是生物素-16-尿苷-5’-三磷酸(生物素-16-dUTP，Boehringher Mannheim)。熒光素、Cy3和Cy5可連接于dUTP進(jìn)行直接標(biāo)記。可購得Cy3.5和Cy7作為親和素或抗洋地黃毒苷偶聯(lián)物進(jìn)行生物素-或洋地黃毒苷標(biāo)記探針的次級檢測。
然后可用本領(lǐng)域已知的靈敏方法檢測摻入到擴(kuò)增核酸中的檢測標(biāo)記如生物素。例如，可用能結(jié)合于生物素的鏈霉親和素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Tropix，Inc)，然后用合適底物(如化學(xué)發(fā)光底物CSPD3-(4-甲氧螺基(1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3-2’-(5’-氯)三環(huán)(3.3-1.1.sup.3，7)癸烷)-4-基)磷酸苯酯；Tropix，Inc.)的化學(xué)發(fā)光來檢測生物素。
用于檢測擴(kuò)增RNA的優(yōu)選檢測標(biāo)記是吖啶酯標(biāo)記的DNA探針(見GenProbe，Inc.Arnold等，Clinical Chemistry 351588-1594，1989中所述)。吖啶酯標(biāo)記的檢測探針可不用洗滌而檢測擴(kuò)增的RNA，因?yàn)榭捎脡A破壞未雜交的探針(Arnold等，1989)。
也可考慮采用聯(lián)合二種或多種這些檢測標(biāo)記的分子作為檢測標(biāo)記?？捎萌魏我阎臋z測標(biāo)記與公開的探針、標(biāo)記和標(biāo)記方法，以及用公開的方法檢測擴(kuò)增的核酸。檢測和測定檢測標(biāo)記所產(chǎn)生信號的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。例如，可用閃爍計(jì)數(shù)或直接觀察檢測放射活性同位素；可用熒光分光光度計(jì)檢測熒光分子；可用分光光度計(jì)檢測磷光分子；或用照相機(jī)直接觀察；可檢測或觀察酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物來檢測酶；可檢測偶聯(lián)于抗體的次級檢測標(biāo)記來檢測抗體?？芍苯硬捎霉_的擴(kuò)增和檢測方法中的這些方法。如本文所用，檢測分子是能與擴(kuò)增的核酸相互作用的分子，可將一種或多種檢測標(biāo)記偶聯(lián)于該分子。


本發(fā)明包括附圖中說明的方法，包括環(huán)化靶mRNA用于擴(kuò)增的方法，如圖2中2A、2B、2D、圖3中3B和圖4中4B所示。這些方法包括采用自身引發(fā)和/或寡核苷酸轉(zhuǎn)換模板環(huán)化mRNA(優(yōu)選全長mRNA)的方法，和擴(kuò)增一個或多個mRNA區(qū)段、混合的或單獨(dú)的mRNA分子的方法。本發(fā)明也包括采用預(yù)先環(huán)化的核酸分子進(jìn)行mRNA和DNA檢測和擴(kuò)增的方法，如圖5中5A、5B、5F所示。所有的這些方法可與公開的多重檢測和擴(kuò)增方法一起聯(lián)合實(shí)施。
圖1總結(jié)了本發(fā)明環(huán)化RNA模板的實(shí)施方案。在圖1A中，RNA模板被轉(zhuǎn)變成3’和5’端都含有發(fā)夾的單鏈cDNA。為形成環(huán)，通過聚合3’端發(fā)夾，然后將它與5’端發(fā)夾相連接合成cDNA的第二鏈，用RCA擴(kuò)增所得環(huán)形cDNA。3’和5’端的發(fā)夾還可含有功能性序列，如檢測序列、位點(diǎn)特異性重組序列、同源重組序列、限制性內(nèi)切酶序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、核糖體結(jié)合序列、核酶序列、復(fù)制起始序列、基因或編碼序列、發(fā)夾環(huán)序列和隨機(jī)序列。
在圖1B中，RNA模板轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢撕虚]環(huán)結(jié)構(gòu)另一端為粘性末端的雙鏈cDNA。為形成環(huán)，使含粘性末端的發(fā)夾與雙鏈DNA相連接。得到的環(huán)形cDNA用RCA進(jìn)行擴(kuò)增。待連接于雙鏈cDNA的發(fā)夾DNA還可含有功能性序列(同上)。
在圖1C中，RNA模板轉(zhuǎn)變?yōu)?’和5’兩端都含有LoxP位點(diǎn)的RNA-DNA雙鏈體。Cre-重組酶將環(huán)化此雙鏈體；RNA酶H將切割缺口該雙鏈體；利用RNA片段作為引物進(jìn)行RCA。所得cDNA包含可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)的3’和5’端。
在圖1D中，RNA模板轉(zhuǎn)變?yōu)?’和5’兩端都含有發(fā)夾的單鏈cDNA。兩個發(fā)夾相毗鄰并連接形成環(huán)。用RCA擴(kuò)增所得環(huán)形cDNA。發(fā)夾可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
在圖1E中，RNA模板轉(zhuǎn)變?yōu)閮啥硕紴檎承阅┒说碾p鏈cDNA。連接3’和5’粘性末端形成雙鏈環(huán)(圖1F)?；蛘撸墒购承阅┒说陌l(fā)夾與雙鏈cDNA連接形成環(huán)(圖1G)。用RCA擴(kuò)增所得環(huán)形cDNA。圖1E、1F和1G中那些與雙鏈cDNA連接的發(fā)夾，以及雙鏈cDNA的3’和5’兩末端的發(fā)夾可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
圖2顯示用RCA環(huán)化和擴(kuò)增RNA的幾個本發(fā)明實(shí)施方案。圖2A中，采用3’端含有聚-T的發(fā)夾引物合成cDNA的第一鏈。將寡核苷酸發(fā)夾引物通過連接、或聚合連接加到cDNA第一鏈的3’端。用RNA酶H消化RNA-DNA雙鏈體。然后合成cDNA的第二鏈，連接形成環(huán)。該發(fā)夾引物可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
在圖2B中，采用3’端含有聚-T的發(fā)夾引物合成cDNA的第一鏈。用自身引發(fā)合成cDNA的第二鏈。連接3’和5’端形成環(huán)。該發(fā)夾引物可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
在圖2C中，采用含有限制性酶位點(diǎn)的聚-T引物合成cDNA的第一鏈，用自身引發(fā)合成cDNA的第二鏈。限制性酶切割雙鏈cDNA產(chǎn)生粘性末端，然后使含粘性末端的發(fā)夾與雙鏈cDNA連接形成環(huán)。待連接雙鏈cDNA的聚-T引物或發(fā)夾可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
在圖2D中，采用含有LoxP位點(diǎn)序列的聚-T引物和含有LoxP序列的寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物合成cDNA的第一鏈，得到的RNA DNA雙鏈體用Cre-重組酶形成環(huán)。用RNA酶H切割缺口RNA，產(chǎn)生的RNA片段用作引物進(jìn)行RCA。聚-T引物和寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
圖3顯示用RCA環(huán)化和擴(kuò)增RNA和DNA的本發(fā)明另一個實(shí)施方案。在圖3A中，用于合成cDNA第一鏈的引物含有聚-T序列、5’端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和其它與寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物某區(qū)段相同的序列。利用消化和純化來消除RNA模板和未起反應(yīng)的寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物。cDNA第一鏈的3’和5’端形成兩個毗鄰的發(fā)夾，它們可連接形成環(huán)。聚-T引物和寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
在圖3B中，合成cDNA第一鏈的引物含有聚-T引物和5’端的限制性位點(diǎn)。寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物同樣含有限制性位點(diǎn)。用聚-T引物和寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物合成cDNA的第一鏈。所得RNA-DNA雙鏈體用限制性酶切割，產(chǎn)生的粘性末端連接形成環(huán)?；蛘?，環(huán)化前，可用RNA酶H消化去除RNA模板，用第二輪DNA聚合產(chǎn)生雙鏈DNA，如上所述進(jìn)行環(huán)化。聚-T引物和寡核苷酸轉(zhuǎn)換引物可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
圖3C中，為擴(kuò)增單鏈或雙鏈cDNA，在3’和5’端連接兩個發(fā)夾。延伸3’端發(fā)夾并與5’端發(fā)夾連接產(chǎn)生環(huán)形DNA。用RCA擴(kuò)增所產(chǎn)生的環(huán)形DNA。3’和5’端的發(fā)夾DNA可進(jìn)一步含有功能性序列(同上)。
圖3D中，為擴(kuò)增雙鏈DNA，通過加入兩個短片段作為模板與用于聚合酶延伸的兩端雜交進(jìn)一步延伸該雙鏈DNA的兩端。延伸的3’端彼此互補(bǔ)；因此該雙鏈DNA可環(huán)化?；蛘?，可將具有粘性末端的兩個發(fā)夾連接于延伸的雙鏈DNA以產(chǎn)生環(huán)形DNA。可用RCA擴(kuò)增所產(chǎn)生的環(huán)形DNA。
圖4總結(jié)了本發(fā)明采用RCA進(jìn)行SNP檢測和擴(kuò)增特定基因片段的實(shí)施方案。圖4A顯示RNA模板中的SNP位點(diǎn)，其前后具有區(qū)域A’和B。探針含有與區(qū)域A’互補(bǔ)的區(qū)域及與區(qū)域B相同的區(qū)域。其余是核苷酸任意序列。該探針3’端的堿基在SNP位置右側(cè)，如果這最后的堿基與SNP相匹配，該探針可延伸產(chǎn)生與探針區(qū)域B相互補(bǔ)的序列區(qū)。利用終止寡核苷酸與靶RNA雜交產(chǎn)生RNA-DNA雙鏈體，使延伸終止于所需區(qū)域。如果最后的堿基與SNP不匹配，探針不能延伸。將不會產(chǎn)生與探針區(qū)域B相互補(bǔ)的序列區(qū)。一旦探針延伸，即可產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。可用諸如圖2-3所示方法環(huán)化所得的cDNA。用RCA擴(kuò)增該環(huán)形cDNA。如果探針不延伸或非特異性延伸，所得的cDNA不能環(huán)化，也不能用RCA擴(kuò)增。
圖4B顯示靶RNA中有一個SNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)前后具有區(qū)域A’和B’，B’區(qū)域的下游還另有區(qū)域C’和D’。此靶RNA中區(qū)域B’和C’之間可有或無其它序列區(qū)域。探針含有與靶RNA區(qū)域A’互補(bǔ)的區(qū)域A，與靶RNA區(qū)域B’相同的區(qū)域B’，和其它預(yù)先選的任意序列。該探針的3’端是SNP位置右側(cè)的堿基。如果此最后的堿基與SNP相匹配，則該探針將延伸產(chǎn)生與探針區(qū)域B’互補(bǔ)的序列區(qū)域。采用能與靶RNA雜交產(chǎn)生RNA DNA雙鏈體的終止發(fā)夾寡核苷酸可將此延伸終止在所需區(qū)域。該終止發(fā)夾寡核苷酸含有相互補(bǔ)的區(qū)域D和D’、預(yù)選的任意核苷酸環(huán)形序列和另一區(qū)域C’。通過控制TM，該終止發(fā)夾寡核苷酸能與此靶RNA雜交。如果此探針最后的堿基與SNP不匹配，則該探針不能延伸，不能產(chǎn)生與探針區(qū)域B’相互補(bǔ)的序列區(qū)域。因此，此探針在靶RNA被消化后不產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一旦此探針正確延伸，在靶RNA被消化后將能產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。延伸后形成的探針發(fā)夾具有與上述終止發(fā)夾寡核苷酸粘端相互補(bǔ)的粘性末端。因此形成的該探針發(fā)夾與終止發(fā)夾寡核苷酸能連接形成環(huán)。產(chǎn)生的環(huán)形核酸分子可進(jìn)行RCA。如果此探針不能延伸或不能特異性延伸，則不能形成探針發(fā)夾而不能與終止發(fā)夾寡核苷酸環(huán)化，不能用RCA擴(kuò)增。如果靶RNA的區(qū)域B’和C之間有一個或多個其它序列區(qū)域，在靶RNA被消化后需要終止發(fā)夾寡核苷酸延伸的C’端與形成的探針發(fā)夾寡核苷酸環(huán)化。
圖4C顯示靶RNA中有一個SNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)前后具有區(qū)域A’和B’，B’區(qū)域的下游還另有區(qū)域C’和D’。探針含有與靶RNA區(qū)域A’互補(bǔ)的區(qū)域A，與靶RNA區(qū)域B’相同的區(qū)域B’，與靶RNA區(qū)域C’相同的區(qū)域C’，及其它預(yù)選的任意序列。該探針的3’端是SNP位置右側(cè)的堿基。如果此最后的堿基與SNP相匹配，則該探針將延伸產(chǎn)生與探針區(qū)域B’互補(bǔ)的序列區(qū)域。采用能與靶RNA雜交產(chǎn)生RNA DNA雙鏈體的終止發(fā)夾寡核苷酸可將此延伸終止在所需區(qū)域。該終止發(fā)夾寡核苷酸含有相互補(bǔ)的區(qū)域D和D’、可選擇的核苷酸環(huán)形序列和另一區(qū)域C。通過控制TM該終止發(fā)夾寡核苷酸能與此靶RNA雜交。如果此探針最后的堿基與SNP不匹配，則該探針不能延伸，不能產(chǎn)生與探針區(qū)域B’相互補(bǔ)的序列區(qū)域。并且，此探針在靶RNA被消化后不產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一旦此探針正確延伸，在靶RNA被消化后將能產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。延伸后形成的探針發(fā)夾具有與上述終止發(fā)夾寡核苷酸粘端相互補(bǔ)的粘性末端。因此形成的該探針發(fā)夾與終止發(fā)夾寡核苷酸能連接形成環(huán)。產(chǎn)生的環(huán)形核酸分子可進(jìn)行RCA。如果此探針不能延伸或不能特異性延伸，則不能形成探針發(fā)夾而不能與終止發(fā)夾寡核苷酸環(huán)化，不能用RCA擴(kuò)增。
圖4D顯示SNP位點(diǎn)下游具有區(qū)域A的DNA模板。SNP探針的5’端含有與區(qū)域A相同的序列。SNP探針的3’端是SNP位置右側(cè)的堿基。如果此最后的堿基與SNP相匹配，則該探針將延伸產(chǎn)生能與SNP序列的5’端雜交的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如果此最后的堿基與SNP不匹配，該探針不能延伸，不能產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。SNP探針上游的其它探針是鏈置換探針，可置換模板中的SNP探針。一旦延伸后模板中的SNP探針被置換，可用圖4A所示方法將其環(huán)化。產(chǎn)生的環(huán)形DNA可用RCA擴(kuò)增分化出SNP。
圖5總結(jié)了用環(huán)形探針檢測RNA和DNA。圖5A中，從全長cDNA克隆文庫或從RNA產(chǎn)生了單鏈全長的基因并環(huán)化。此環(huán)也可含有預(yù)選的任意核苷酸序列。產(chǎn)生的環(huán)形DNA可用作探針來檢測復(fù)雜混合物中的靶RNA。待檢測的RNA將與此環(huán)形DNA雜交和用RNA酶H切割缺口。帶缺口的靶RNA片段可用作RCA的引物。為避免聚-A RNA尾起引物作用，此全長單鏈環(huán)形DNA可含有聚-A部分代替聚-T部分。一旦靶RNA結(jié)合此環(huán)形DNA即開始RCA，mRNA的聚-A尾將與含互補(bǔ)性聚-T部分的RCA產(chǎn)物結(jié)合，作為引物進(jìn)一步擴(kuò)增。此時，反應(yīng)系統(tǒng)中不必加入任何引物即可達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增。
圖5B中，全長環(huán)形基因可與cDNA的第一鏈雜交，cDNA的第一鏈用作RCA的引物。該全長環(huán)形DNA還可含有功能序列(同上)。
圖5C中，環(huán)形DNA用作探針加入到RNA靶檢測的復(fù)合混合物中。在與環(huán)形探針雜交之前或之后處理靶RNA產(chǎn)生3’端作為RCA的引物。例如，環(huán)形DNA可含有O-甲基-RNA的區(qū)段。一旦此O-甲基-RNA DNA環(huán)形探針與RNA靶雜交，靶向的RNA-DNA雙鏈體而非此O-甲基-RNA-DNA雙鏈體將被RNA酶H消化。帶缺口的靶向RNA可用作RCA的引物。可加入其它引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。環(huán)形DNA也可含有功能序列(同上)。
圖5D顯示用于DNA檢測的環(huán)形DNA。RNA片段、DNA片段或嵌合性DNA-RNA片段探針作為引物要直到它們與靶DNA雜交被RNA酶H切割產(chǎn)生缺口才能與環(huán)形DNA雜交而啟動RCA。一個實(shí)施方案中，一個探針是DNA發(fā)夾，另一個探針是RNA-DNA嵌合性發(fā)夾。一旦這兩個發(fā)夾與靶向DNA在毗鄰位置處雜交，將形成RNA-DNA雙鏈體。RNA酶H將切割此雙鏈體產(chǎn)生RCA的引物，表明存在靶DNA。一旦RNA DNA雙鏈體被切割，其余的RNA-DNA嵌合性發(fā)夾片段將被新的RNA-DNA嵌合性發(fā)夾取代，形成新的RNA-DNA雙鏈體。此過程循環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生的擴(kuò)增達(dá)到RNA擴(kuò)增峰。此環(huán)形DNA也可含有功能序列(同上)。
圖5E顯示用于RNA檢測的環(huán)形DNA。RNA片段、DNA片段或嵌合性DNA-RNA片段探針作為引物要直到它們與靶DNA雜交被RNA酶H切割產(chǎn)生缺口才能與環(huán)形DNA雜交而啟動RCA。一個實(shí)施方案中，一個探針是具有DNA互補(bǔ)區(qū)域和環(huán)形RNA區(qū)域的發(fā)夾，另一個探針是具有互補(bǔ)性RNA區(qū)域、環(huán)形RNA區(qū)域和其它DNA片段的RNA DNA嵌合性發(fā)夾。一旦這兩個發(fā)夾與靶向DNA在毗鄰位置處雜交，將形成RNA DNA雙鏈體。RNA酶H將切割此雙鏈體產(chǎn)生RCA的引物，表明存在靶DNA。一旦RNA DNA雙鏈體被切割，其余RNA DNA嵌合性發(fā)夾片段之一將被新的RNA DNA嵌合性發(fā)夾取代形成新的RNA DNA雙鏈體。此過程循環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生的擴(kuò)增達(dá)到RCA擴(kuò)增峰。此環(huán)形DNA也可含有功能序列(同上)。
圖5F顯示用于RNA和DNA二者檢測和擴(kuò)增的環(huán)形DNA。將兩個探針引入RNA DNA檢測的復(fù)合混合物中。一個探針是預(yù)先環(huán)化的DNA，另一個探針是DNA發(fā)夾。該環(huán)形探針含有三個區(qū)域第一區(qū)域與檢測的靶互補(bǔ)，第二區(qū)域與發(fā)夾DNA探針的臂互補(bǔ)；第三區(qū)域是預(yù)選的任意核苷酸序列。該發(fā)夾DNA也含有三個區(qū)域與毗鄰于該環(huán)形探針靶區(qū)域的檢測靶區(qū)域相互補(bǔ)的環(huán)形區(qū)域；與環(huán)形探針一部分互補(bǔ)的臂區(qū)域；可選擇的第三區(qū)域是預(yù)選的任意核苷酸區(qū)域。如果不存在靶核酸，該環(huán)形探針不能與DNA發(fā)夾的臂雜交而啟動RCA。然而，如果存在靶核酸，該環(huán)形探針和發(fā)夾探針二者將與毗鄰位置的靶模板雜交。同時，發(fā)夾探針也與環(huán)形探針雜交成為引物而啟動RCA。RCA反應(yīng)將使環(huán)形探針從與靶雜交中脫落下來。如果采用其它引物進(jìn)行RCA指數(shù)擴(kuò)增，該引物將與擴(kuò)增的RCA產(chǎn)物雜交使發(fā)夾探針從靶上脫落下來。因此釋放的靶核酸可用于第二次和后一輪與環(huán)形和發(fā)夾探針雜交而啟動RCA。此過程循環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生指數(shù)擴(kuò)增達(dá)到RNA擴(kuò)增峰。
實(shí)施例 本說明書包含以下實(shí)施例以顯示本發(fā)明的各種實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，實(shí)施例中所揭示的技術(shù)是本發(fā)明的代表性實(shí)施方案，但本發(fā)明并不限于本說明書提供的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本說明書公開內(nèi)容，可以知道，有許多可替代本說明書所述的實(shí)施方案也可產(chǎn)生相似的結(jié)果，但這仍屬于本發(fā)明的思路和范圍。
實(shí)施例1利用互補(bǔ)的兩末端合成cDNA MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)當(dāng)?shù)竭_(dá)mRNA模板的5’端時，能將胞嘧啶殘基加到新合成的cDNA3’端上。通?？杉?-4個胞嘧啶殘基，這取決于反應(yīng)條件。
用能預(yù)防RNA降解的標(biāo)準(zhǔn)方法純化mRNA。采用低至皮克量的小量mRNA作為靶核酸分子。第一鏈合成引物的5’端含有聚(dT)和T7轉(zhuǎn)錄啟動子，將引物1和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶加入mRNA樣品中。使第一鏈合成引物的聚(dT)與mRNA的聚(A)尾退火，作為逆轉(zhuǎn)錄酶的引物來合成cDNA的第一鏈。同時，使用引物2與引物1退火。逆轉(zhuǎn)錄酶在cDNA第一鏈的3’端加上幾個胞嘧啶殘基。cDNA第一鏈的5’端有T7啟動子后隨聚(T)序列，當(dāng)該序列用作第一鏈合成的引物時。T7啟動子的取向是一旦該分子環(huán)化，啟動子即指導(dǎo)初始mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄。
引物15’-d(T7啟動子序列)+d(T)15-3’ 引物25’-d(T7啟動子序列互補(bǔ)物)+d(G)4-3’ 在5μl體積去離子水中，通過70℃加熱混合物2分鐘使10pmol的cDNA合成引物與1μg人胎盤聚(A)+RNA(Clontech)退火，然后冰上冷卻2分鐘。將退火的引物-RNA復(fù)合物與200單位M-MLV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(superScript II逆轉(zhuǎn)錄酶，Life Technology)在含50mM Tris-HCL(pH8.3、22℃)；75mM KCL；6mM MgCl2；1mM DTT；dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1mM的終體積為10μl溶液中混合，來引發(fā)cDNA的第一鏈合成。
在上述反應(yīng)液中加入1μl RNA酶H培育1.5小時。用Qiagen試劑盒純化得到的溶液，然后用Nanodrop儀檢測UV吸光度以測定cDNA的量。OD值表明獲得約140ng的cDNA。所得核酸一端具有d(C)3’突出端，另一端具有d(G)3’突出端。此兩端可退火，使模板轉(zhuǎn)換產(chǎn)生環(huán)形分子。加入連接酶連接該分子的兩端。
實(shí)施例2合成含有LoxP重組位點(diǎn)的cDNA 可通過寡核苷酸轉(zhuǎn)換技術(shù)加入LoxP重組位點(diǎn)。在cDNA的第一鏈合成介質(zhì)中加入3’最遠(yuǎn)端具有聚(G)或聚(rG)序列的寡核苷酸。其末端3-4個G殘基將與新合成cDNA的2-4個C殘基堿基配對，作為RT(模板轉(zhuǎn)換)的新模板。然后RT轉(zhuǎn)換此模板和復(fù)制寡(G)寡核苷酸序列，包括新合成cDNA的3’端互補(bǔ)的CapFinder寡核苷酸序列。
引物35’-d(LoxP序列)+d(T)15-3’ 引物4(寡轉(zhuǎn)換序列)5’-d(LoxP序列)r(GGGp)-3’ 在5μl體積去離子水中，通過70℃加熱混合物2分鐘使10pmol的cDNA合成引物與1μg人胎盤聚(A)+RNA(Clontech)退火，然后冰上冷卻2分鐘。將退火的引物-RNA復(fù)合物與200單位M-MLV RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶(superScript II逆轉(zhuǎn)錄酶，Life Technology)在含50mM Tris-HCL(pH8.3、22℃)；75mM KCL；6mM MgCl2；1mM DTT；dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1mM的終體積為10μl溶液中混合，來引發(fā)cDNA的第一鏈合成。在空氣培育箱中42℃培育cDNA的第一鏈-模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)物1.5小時，然后置冰上冷卻。
在上述反應(yīng)液中加入1ul RNA酶H培育1.5小時。用Qiagen試劑盒純化得到的溶液用Nanodrop儀作UV吸光度檢測以測定cDNA的量。OD值表明獲得約160ng的cDNA。
實(shí)施例3另一種方法用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA第一鏈的3’端加上同源序列 用Qiagen試劑盒純化合成的cDNA的第一鏈，然后將0.5μg的cDNA的第一鏈與0.5μM dCTP、1X末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液和1單位末端轉(zhuǎn)移酶37℃混合1.5小時。用Qiagen試劑盒純化所得溶液用Bioanalyer(Agilent)檢測。最后用Nanodrop吸光度值定量，表明獲得0.45μg cDNA。
實(shí)施例4合成環(huán)形分子 可利用短的寡核苷酸作為橋梁連接環(huán)化cDNA第一鏈。合成cDNA第一鏈后，將含有與新合成cDNA的3’端和5’端序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸與T4連接酶在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。環(huán)化產(chǎn)生的cDNA。
引物55’-d(T7的互補(bǔ)序列)+dGdGdG-3’ 將cDNA的第一鏈與T4DNA連接酶(Promega)在1×T4DNA連接緩沖液(Promega)、0.5mMATP和引物5中室溫培育過夜。在上述溶液中加入0.5U內(nèi)切酶V(Amersham)和0.5mM ATP，再培育1.5小時。消化所有線性DNA鏈。用Qiagen試劑盒純化所得的環(huán)形cDNA，測定吸光值。產(chǎn)生0.5μg環(huán)形cDNA。
實(shí)施例5通過隨機(jī)雜交進(jìn)行環(huán)化 本發(fā)明可用于擴(kuò)增雙鏈靶核酸分子。以下實(shí)施例說明了擴(kuò)增整個靶分子而無需知道靶分子序列的方法。這樣，本方法即適合于擴(kuò)增整個基因組或雙鏈核發(fā)酸分子的其它大樣品。
在10mM Bis Tris丙烷-HCL、10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(pH7.0@25℃)、100μg/ml BSA、100μM dNTP中37℃培育1小時，用Pml I消化總基因組DNA。
在5’端具有CreI依賴性重組LoxP位點(diǎn)和3’端具有隨機(jī)六聚序列的過量接頭寡核苷酸混合液中，加入T4DNA聚合酶。反應(yīng)物于37℃培育過夜。得到的產(chǎn)物是核酸任一末端具有LoxP位點(diǎn)的基因組片段。
然后在樣本中加入CreI，37℃培育1小時。得到的產(chǎn)物是整個基因組的環(huán)化片段，適合滾環(huán)擴(kuò)增。
實(shí)施例6通過重組進(jìn)行環(huán)化 可用Cre-重組酶環(huán)化cDNA的第一鏈。如實(shí)施例2所述，合成3’端和5’端都含有LoxP位點(diǎn)的cDNA第一鏈。將cDNA第一鏈與CreI重組酶在培養(yǎng)基中進(jìn)行培育，使cDNA第一鏈環(huán)化。
將合成的3’端和5’端都含有LoxP序列的cDNA第一鏈與Cre重組酶37℃培育4小時。提高溫度至75℃30分鐘滅活此重組酶。然后在上述溶液中加入0.5U內(nèi)切酶V(Amersham)和0.5mM ATP再培育1.5小時。用Qiagen試劑盒純化環(huán)化的cDNA，測定吸光值(0.6μg)。
實(shí)施例7擴(kuò)增環(huán)形cDNA 將mRNAcDNA第一鏈復(fù)合物進(jìn)行限制性RNA酶H消化，用滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增環(huán)化的cDNA。所產(chǎn)生的缺口mRNA可用作引物，憑借其游離3’端進(jìn)行RCA擴(kuò)增。此法只在一條鏈中產(chǎn)生RCA需要的游離3’端。
將具有RNADNA雙鏈體的環(huán)化cDNA與0.5U RNA酶H，37℃培育30分鐘。取4μl上述反應(yīng)液，在含有20mM Tris-HCL(pH＝8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5％v/v DMSO、0.1％Triton X-100、各400μM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及900nM引物5(指數(shù)擴(kuò)增引物；見美國專利No.60/506218)的體積為35μl的反應(yīng)液中培育。存在的噬菌體T4基因-32蛋白(Amersham)濃度為38μg/μl(約1085μM)。室溫混合所有物質(zhì)后，將反應(yīng)物置于冰上，加入終濃度0.32單位/μl的Vent(外切)DNA聚合酶(New England Biolabs)，75℃培育反應(yīng)物3分鐘，然后65.5℃ 90分鐘。所得混合物作凝膠電泳。染色后在凝膠上部(不是整個凝膠)觀察到滾環(huán)產(chǎn)物。
實(shí)施例8用隨機(jī)引物擴(kuò)增cDNA 用隨機(jī)六聚體作引物滾環(huán)擴(kuò)增環(huán)化的cDNA。該隨機(jī)六聚體只能擴(kuò)增環(huán)形核酸分子。用RNA消化或加熱變性使mRNA與環(huán)形cDNA的第一鏈解離。也可用加熱變性解離用于擴(kuò)增的制備中的dsDNA。然后可分離ssDNA，用作其它生物應(yīng)用的試劑。在ssDNA中可加入隨機(jī)六聚體與標(biāo)準(zhǔn)的置換性聚合酶，如噬菌體29、vent和BST。在該標(biāo)準(zhǔn)置換聚合酶適合的溫度下將此混合物培育所需的一定時間。
取4μl單鏈環(huán)化DNA，在含有20mM Tris-HCL(pH＝8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5％v/v DMSO、0.1％Triton X-100、各400μM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及900nM隨機(jī)六聚體(Amersham)的35μl體積混合物中進(jìn)行培育。存在的噬菌體T4基因-32蛋白(Amersham)濃度為38μg/μl(約1085μM)。室溫混合所有物質(zhì)后，將反應(yīng)物置于冰上，加入終濃度0.32單位/μl的Vent(外切)DNA聚合酶(New England Biolabs)，75℃培育反應(yīng)物3分鐘，然后65.5℃90分鐘。所得混合物作凝膠電泳。染色后在凝膠上部(不是整個凝膠)觀察到滾環(huán)產(chǎn)物。
實(shí)施例9RNA體外轉(zhuǎn)錄 采用上述環(huán)形cDNA作為模板可進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄。加入T7聚合酶和rNTP，T7聚合酶將根據(jù)所選的T7啟動子取向轉(zhuǎn)錄cDNA的有義或反義鏈。
用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所生成的雙鏈RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。各次反應(yīng)可轉(zhuǎn)錄3ng的cDNA。反應(yīng)條件是40mM Tris(pH7.5)，6mM MgCl2，10mM NaCl，2mM亞精胺，10mM DTT，各500μM ATP、GTP和UTP-cy3，12.5μM CTP，10單位RNA酶阻斷劑和80單位T7RNA聚合酶，體積為20μl。將反應(yīng)物37℃培育2小時。用Qiagen試劑盒純化所得混合物。用乙醇洗脫合成的染料標(biāo)記的aRNA，用Nanodrop測定。
實(shí)施例10檢測環(huán)的環(huán)化 用模板序列，如美國專利No.60/506218所述，環(huán)化5’端磷?；娜L線性GAPDH(Integrated DNA Technologies，Skokie，IL)。待擴(kuò)增和檢測GAPDH的核酸序列見本申請人的美國專利No.60/506218。環(huán)化反應(yīng)物包括50μM環(huán)形前體、50μM模板、100mM NiCl2、200咪唑-HCL(pH＝7.0)和125mM BrCN，反應(yīng)于23℃進(jìn)行10小時。透析和凍干后，產(chǎn)物用制備級變性20％聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，切割分離產(chǎn)物條帶，研碎，洗脫到0.2NaCl中。用雙蒸去離子水透析除鹽，測260nm吸光值進(jìn)行定量，用最近鄰域計(jì)算法計(jì)算出摩爾消光系數(shù)。
實(shí)施例11mRNA擴(kuò)增和檢測 從Clontech獲得總RNA。總RNA是預(yù)先經(jīng)核酶切割GAPDH mRNA的3’端序列加工而成，見美國專利No.60/506218中所述。取0.5μg經(jīng)加工的總RNA，與實(shí)施例9制備的環(huán)形寡核苷酸在含有20mM Tris-HCL(pH＝8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5％v/v DMSO、0.1％Triton X-100、各400μMdATP、dGTP、dCTP和dTTP的溶液中混合。75℃加熱該混合物5分鐘。將此混合物緩慢冷卻至室溫。在上述反應(yīng)物中加入1U噬菌體29(Amersham)，1U RNA酶H和濃度為38μg/μl的噬菌體T4基因-32蛋白(Amersham)，所得混合物于37℃培育4小時。然后95℃培育該反應(yīng)混合物10分鐘滅活所有酶。用酚氯仿沉淀雙鏈cDNA。取沉淀的DNA作凝膠電泳和染色。凝膠染色顯示長的雙鏈cDNA位于孔上部。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行檢測。為增強(qiáng)擴(kuò)增，可將擴(kuò)增引物(美國專利No.60/506218中所述)加入上述反應(yīng)物中，加入此引物將導(dǎo)致階乘(n！)擴(kuò)增。
實(shí)施例12多重檢測反應(yīng) 為在一個試管中檢測多個基因，在同一反應(yīng)物中混合多個基因特異性或mRNA特異性環(huán)形模板，進(jìn)行實(shí)施例11所述的相同反應(yīng)。
本發(fā)明可提供方法和方案，也提供用于實(shí)施所述方法的含有所述試劑和組分的試劑盒，商業(yè)措施包括實(shí)施、銷售、示教、展覽和/或營銷上述方法和組分。
應(yīng)理解，本說明書描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅為了說明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可據(jù)此作出各種修飾和變化，但都包括在本申請的思路范圍內(nèi)。為此目的將本說明書引用的所有出版物、專利和專利申請的內(nèi)容整體納入本文作參考，如同各出版物、專利和專利申請各自單獨(dú)納入作參考那樣。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增和檢測靶核酸分子的方法，該方法包括
a)在靶核酸分子上連接第一接頭核酸分子或第二接頭核酸分子或第一接頭和第二接頭核酸分子的組合；
b)環(huán)化靶核酸分子；
c)擴(kuò)增該環(huán)化的核酸分子產(chǎn)生重復(fù)的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述環(huán)化用選自以下組的方法進(jìn)行平端連接、退火相互補(bǔ)的兩端然后連接、互補(bǔ)區(qū)域之間的連接、自身引發(fā)連接、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸分子選自mRNA，rRNA，RNAi，異核RNA，基因組DNA和cDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一接頭核酸分子用選自以下組的方法進(jìn)行連接連接、雜交連接、雜交然后聚合酶延伸、酶反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一接頭核酸分子還含有選自以下組的序列檢測序列、位點(diǎn)特異性重組序列、同源重組序列、限制性內(nèi)切酶序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、核糖體結(jié)合序列、核酶序列、復(fù)制起始序列、基因序列和發(fā)夾環(huán)序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在環(huán)化前連接第二接頭核酸分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二接頭核酸分子用選自以下組的方法進(jìn)行連接連接、雜交連接、雜交然后聚合酶延伸、酶反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第二接頭核酸分子還含有選自以下組的序列檢測序列、位點(diǎn)特異性重組序列、同源重組序列、限制性內(nèi)切酶序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、核糖體結(jié)合序列、核酶序列、復(fù)制起始序列、基因序列和發(fā)夾環(huán)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一接頭或第二接頭核酸分子通過核酸的隨機(jī)雜交和短暫延伸而連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增包括加入至少一種引物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述擴(kuò)增是在不加入引物的情況下進(jìn)行的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述引物在其3’端還包含隨機(jī)序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述引物還包含啟動子序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述引物是RNADNA嵌合體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述引物還包含啟動子序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述環(huán)化的靶核酸分子包含蛋白質(zhì)表達(dá)序列。
17.一種檢測靶核酸分子的方法，該方法包括
a)在樣品中加入環(huán)形核酸分子，其中所述環(huán)形核酸分子包含能與該靶核酸分子至少一部分雜交的第一核酸序列；
b)使環(huán)形核酸分子與靶核酸分子的該部分雜交；和
c)通過與所述靶核酸分子中至少一個游離3’端聚合合成至少一種新的核酸，其至少與環(huán)形核酸的第二部分相互補(bǔ)，其中，所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在靶核酸分子上能與第一核酸序列雜交的部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述靶核酸分子選自mRNA、rRNA、RNAi、異核RNA、基因組DNA和cDNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述游離3’端在引物與靶核酸雜交之前產(chǎn)生。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述游離3’端在引物與靶核酸雜交之后產(chǎn)生。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述游離3’端用選自以下組的方法產(chǎn)生用RNA酶H切割產(chǎn)生缺口、用RNA酶H總體消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化限制位點(diǎn)、用限制性酶切割產(chǎn)生缺口、用化學(xué)試劑切割產(chǎn)生缺口。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述游離3’端只產(chǎn)生在含有突變或不含有突變的靶核酸中。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸還含有用于(n！)階乘擴(kuò)增的第二核酸序列，其中所述引物具有與擴(kuò)增步驟所含第二核酸序列相同的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子通過自身連接進(jìn)行構(gòu)建。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子含有隨機(jī)序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子是全長cDNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述環(huán)形全長cDNA構(gòu)建自全長cDNA克隆文庫。
28.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子還含有選自以下組的序列檢測序列、位點(diǎn)特異性重組序列、同源重組序列、限制性內(nèi)切酶序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、核糖體結(jié)合序列、核酶序列、復(fù)制起始序列、基因序列和發(fā)夾環(huán)序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述全長cDNA含有體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)表達(dá)所需組分。
30.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子含有用于多重反應(yīng)和檢測的特異性標(biāo)簽。
31.一種擴(kuò)增RNA分子的方法，該方法包括
a)在RNA分子上連接第一接頭核酸分子以產(chǎn)生第一構(gòu)建物，其中所述第一接頭核酸分子含有RNA聚合酶啟動位點(diǎn)；
b)環(huán)化第一構(gòu)建物產(chǎn)生環(huán)化的核酸分子；
c)通過滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增該環(huán)形核酸分子形成串聯(lián)序列DNA，和
d)加入能在RNA聚合酶啟動位點(diǎn)啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶來擴(kuò)增此RNA分子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述第一接頭核酸分子還包含能與聚-A尾雜交的3’端。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述步驟a)是通過如下進(jìn)行連接的使第一接頭核酸分子與RNA分子雜交并用聚合酶從3’端延伸該第一接頭核酸分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述聚合酶能將至少兩個核苷酸通過末端轉(zhuǎn)移酶作用連接到該鏈的新末端上。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第一接頭核酸分子還含有能夠與至少兩個核苷酸雜交的單鏈序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，在環(huán)化前，將所述第二接頭核酸分子連接到第一構(gòu)建物中。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述第一接頭核酸分子還含有與第二接頭核酸分子中第二區(qū)域同源的第一區(qū)域。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述環(huán)化通過上述第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的同源重組而進(jìn)行。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述環(huán)化的進(jìn)行是通過使上述第一區(qū)域與第二區(qū)域退火，并將第一接頭核酸分子連接于第二接頭核酸分子而進(jìn)行的。
40.一種檢測樣品中RNA分子的方法，該方法包括
a)在樣品中加入環(huán)形核酸分子，其中所述環(huán)形核酸分子包含能與該RNA分子至少一部分雜交的第一核酸序列；
b)使環(huán)形核酸分子與RNA分子的該部分雜交；和
c)通過與所述RNA分子中的至少一個游離3’端聚合，合成至少一種新的核酸，其至少與環(huán)形核酸的第二部分相互補(bǔ)，其中，所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在RNA分子上能與第一核酸序列雜交的部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在步驟a)之前。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在步驟a)之后。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在步驟b)之后。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述至少一個游離3’端由RNA酶H、核酶或切割RNA產(chǎn)生缺口的化學(xué)試劑所產(chǎn)生。
45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子含有用于多重反應(yīng)和檢測的特異性標(biāo)記。
46.一種檢測樣品中DNA分子的方法，該方法包括
a)在樣品中加入短的多核苷酸片段，該多核苷酸片段能與DNA靶核酸的至少一部分雜交，并且該多核苷酸的3’端被封閉；
b)用酶切割上述混合物中的多核苷酸片段產(chǎn)生游離3’端；
c)在樣品中加入環(huán)形核酸分子，該環(huán)形核酸分子含有能與帶切口的多核苷酸的至少一部分雜交的第一核酸序列；和
d)通過與所述多核苷酸中的至少一個游離3’端聚合，合成至少一種新的核酸，其至少與該環(huán)形核酸的第二部分相互補(bǔ)，其中所述至少一個游離3’端產(chǎn)生在多核苷酸上能與第一核酸序列雜交的部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述至少一個3’端產(chǎn)生在步驟a)之前。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述至少一個3’端產(chǎn)生在步驟a)之后。
49.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述至少一個3’端產(chǎn)生在步驟b)之后。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述至少一個3’端由RHA酶H、核酶、或切割RNA產(chǎn)生缺口的化學(xué)試劑所產(chǎn)生。
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述多核苷酸片段是RNA。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述多核苷酸片段是DNA-RNA嵌合物。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述環(huán)形核酸分子含有用于多重反應(yīng)和檢測的特異性標(biāo)記。
54.一種擴(kuò)增多核苷酸的方法，該方法包括
a)形成具有3’和5’端發(fā)夾的線性多核苷酸；
b)連接該線性靶分子的3’和5’端形成環(huán)化的多核苷酸；和
c)通過滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增此環(huán)化的多核苷酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，還包括在該形成步驟之前
a)使第一發(fā)夾與靶核酸的3’端部分雜交；然后
b)利用此靶分子作為模板，從第一發(fā)夾的3’端聚合DNA拷貝；和
c)將第二發(fā)夾連接到該靶分子的5’端部分或DNA拷貝的3’端部分形成線性多核苷酸。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述連接步驟通過自身引發(fā)進(jìn)行。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，采用模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸自身引發(fā)進(jìn)行所述連接步驟而延伸該靶核酸。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中，所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸包含一限制性位點(diǎn)，通過在限制性位點(diǎn)切割靶DNA的雙鏈DNA和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸形成切口端，此切口端連接于一發(fā)夾的相應(yīng)切口端，形成第一發(fā)夾。
59.根據(jù)權(quán)利要求83所述的制備環(huán)形DNA拷貝的方法，其特征在于包括
a)使第一引物與靶鏈模板區(qū)的3’部分雜交；
b)從該引物聚合模板區(qū)第一拷貝DNA；
c)從模板區(qū)置換第一拷貝DNA；
d)在第一拷貝DNA的3’部分形成發(fā)夾第二引物；
e)從該發(fā)夾引物聚合第一拷貝DNA一部分的第二拷貝DNA；和
f)連接第一拷貝DNA的5’端與第二拷貝的3’端形成環(huán)形拷貝DNA。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述置換步驟用核酸酶、堿基或鏈置換進(jìn)行。
61.一種擴(kuò)增DNA的方法，該方法包括
a)聚合DNA靶分子模板區(qū)的DNA拷貝，以形成在第一和第二末端分別具有第一和第二發(fā)夾雙鏈DNA；
b)以單分子反應(yīng)連接該雙鏈DNA，形成環(huán)化的DNA；和
c)通過滾環(huán)擴(kuò)增法擴(kuò)增此環(huán)化的DNA。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子轉(zhuǎn)錄自mRNA。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子轉(zhuǎn)錄自mRNA，所述第一發(fā)夾通過靶分子的自身引發(fā)而形成。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子轉(zhuǎn)錄自具有至少一個模板轉(zhuǎn)換發(fā)夾寡核苷酸的mRNA，通過使所述模板轉(zhuǎn)換發(fā)夾寡核苷酸與該靶分子的3’端共價結(jié)合形成第一發(fā)夾，可選擇地以模板轉(zhuǎn)換發(fā)夾寡核苷酸作為靶分子3’端延伸的模板。
65.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子轉(zhuǎn)錄自mRNA，通過引發(fā)所述靶分子與發(fā)夾引物的聚合形成第二發(fā)夾，其中發(fā)夾形成于靶分子聚合之前或之后。
66.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，用含有限制性位點(diǎn)的引物啟動靶分子的聚合從mRNA形成此靶分子，通過在該限制性位點(diǎn)切割雙鏈DNA形成切端，并將此切端與發(fā)夾的相應(yīng)切端連接形成第二發(fā)夾。
67.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子是基因組DNA，通過將該基因組DNA的第一和第二末端與相應(yīng)發(fā)夾的相應(yīng)兩個切端連接形成所述第一和第二發(fā)夾。
68.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子是基因組DNA或cDNA文庫拷貝的單鏈DNA，或轉(zhuǎn)錄自mRNA，通過該靶DNA相鄰位置的3’和5’兩端的自身雜交形成第一和第二發(fā)夾，所述連接步驟包括共價連接此3’端和5’端形成環(huán)化的DNA。
69.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述靶分子轉(zhuǎn)錄自含有模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸的mRNA，該寡核苷酸的3’端含有至少一個與RNA-DNA中間體靶鏈的3’端核苷酸堿基配對的核苷酸，該中間體含有mRNA和靶鏈，其中所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸作為靶鏈延伸的模板，其5’端含有預(yù)選的任意核苷酸序列，延伸靶鏈的3’端可產(chǎn)生與該mRNA分子和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸相互補(bǔ)的DNA。
70.一種擴(kuò)增線性靶核酸的方法，包括以下步驟
a)將含有發(fā)夾的第一寡核苷酸接頭連接到靶核酸的一端；
b)在靶核酸的另一端形成一發(fā)夾；
b)環(huán)化靶核酸；
c)在靶核酸上產(chǎn)生游離3’端；
d)通過滾環(huán)擴(kuò)增從此游離3’端擴(kuò)增靶核酸。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述環(huán)化步驟用以下方法進(jìn)行退火互補(bǔ)的二末端然后連接、或自身引發(fā)然后連接。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述靶核酸分子是cDNA的第一鏈。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，通過雜交連接、雜交然后聚合酶延伸、酶反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)連接第一接頭。
74.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中還包括在環(huán)化前連接第二接頭。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述連接第二接頭的方法選自雜交連接、雜交然后聚合酶延伸、自身引發(fā)連接、酶反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)和光反應(yīng)。
76.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，通過隨機(jī)雜交和從核酸短暫延伸連接第一接頭。
77.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述產(chǎn)生步驟包括加入一種或多種含有游離3’端的引物。
78.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述產(chǎn)生步驟包括切割靶核酸的一條鏈，其中所述靶核酸是雙鏈。
79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，所述一種或多種引物的3’端還含有隨機(jī)序列。
80.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，所述一種或多種引物還含有啟動子序列。
81.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，所述一種或多種引物是RNADNA嵌合體。
82.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述環(huán)化靶核酸含有體內(nèi)外表達(dá)蛋白質(zhì)的序列。
83.一種檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟
a)將環(huán)形核酸探針與樣品混合，混合在該探針的第一部分可與靶核酸的第一部分雜交的條件下進(jìn)行；
b)在靶核酸的第一部分產(chǎn)生游離3’端；
c)用滾環(huán)擴(kuò)增法從該游離3’端合成與該探針第二部分互補(bǔ)的新核酸；
d)檢測該新核酸作為靶核酸存在的指標(biāo)。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述靶核酸選自mRNA，rRNA，RNAi，異核RNA，基因組DNA和cDNA。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，在所述探針的第一部分與靶核酸的第一部分雜交之前產(chǎn)生所述游離3’端。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，在所述探針的第一部分與靶核酸的第一部分雜交之后產(chǎn)生所述游離3’端。
87.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述產(chǎn)生步驟包括選自以下組的方法雜交、轉(zhuǎn)錄、聚合、用RNA酶H切割缺口、用RNA酶H總體消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化的限制位點(diǎn)、用限制性酶切割缺口和用化學(xué)試劑切割缺口。
59.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述游離3’端選擇性產(chǎn)生在含有突變的靶核酸中。
88.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述游離3’端選擇性地產(chǎn)生在不含有突變的靶核酸中。
89.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針還含有用于(n！)階乘擴(kuò)增的第三部分，合成步驟中包含具有與探針第三部分相同的序列的引物。
90.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，還包括在混合步驟之前通過自身連接構(gòu)建探針的步驟。
91.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針還包含隨機(jī)序列。
92.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針還包含從全長cDNA文庫構(gòu)建全長cDNA。
93.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針包含選自以下組的序列檢測序列、位點(diǎn)特異性重組序列、同源重組序列、限制性內(nèi)切酶序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、核糖體結(jié)合序列、核酶序列、復(fù)制起始序列、基因序列和發(fā)夾環(huán)序列。
94.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針還包含蛋白質(zhì)體內(nèi)外表達(dá)所需的序列。
95.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述探針包含多重反應(yīng)和檢測用的標(biāo)記序列。
96.一種制備RNA的方法，包括以下步驟
a)將含有RNA聚合酶啟動子的環(huán)形核酸探針與含有靶核酸的樣品混合，混合在該探針的第一部分可與靶核酸的第一部分雜交的條件下進(jìn)行；
b)在靶核酸的第一部分中產(chǎn)生游離3’端；
c)通過滾環(huán)擴(kuò)增從該游離3’端合成與探針第二部分互補(bǔ)并含有啟動子的DNA；
d)用RNA聚合酶從該啟動子轉(zhuǎn)錄此DNA制得RNA。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中，所述RNA酶是T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶。
98.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中，所述探針和產(chǎn)生的DNA拷貝還含有限制性酶識別序列，以及在轉(zhuǎn)錄前用相應(yīng)的限制性酶處理DNA拷貝。
99.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中，所述探針和產(chǎn)生的DNA拷貝還含有RNA聚合酶終止序列。
100.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)錄步驟d)還包括用一種或多種直接或間接可檢測的核苷酸同類物標(biāo)記該RNA。
根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中，采用微陣列檢測所述新的核酸。
一種制備RNA的方法，包括以下步驟
a)將核酸片段與含有靶核酸的樣品混合，其中所述片段的第一部分可與靶核酸的第一部分雜交；
b)在該片段中產(chǎn)生游離3’端；
c)使靶-雜交片段與含有RNA聚合酶啟動子序列的環(huán)形核酸探針在該探針的第一部分可與所述片段的第二部分雜交的條件下接觸；
d)通過滾環(huán)擴(kuò)增從游離3’端合成與探針第二部分互補(bǔ)并含有啟動子的DNA；和
e)用RNA聚合酶從該啟動子轉(zhuǎn)錄此DNA制得RNA。
根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)錄步驟d)還包括用一種或多種直接或間接可檢測的核苷酸同類物標(biāo)記該RNA。
根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中，所述產(chǎn)生步驟依賴于所述靶核酸是否含有預(yù)先確定的突變。
一種檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟
a)將含有可選擇地被封閉的3’端、能與靶核酸第一部分雜交的核酸片段與樣品混合；
b)在該片段中產(chǎn)生游離3’端；
c)將環(huán)形核酸探針與樣品在該探針的第一部分可與所述片段的第一部分雜交的條件下混合；
d)從該游離3’端合成與該探針第二部分互補(bǔ)的新核酸，和
e)檢測該新核酸作為靶核酸存在的指標(biāo)。
根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述靶核酸選自mRNA，rRNA，RNAi，異核RNA，基因組DNA和cDNA。
根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中，在該片段與靶核酸的第一部分雜交之前或之后產(chǎn)生所述游離3’端。
根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述產(chǎn)生步驟的方法選自雜交、轉(zhuǎn)錄、聚合、用RNA酶H切割缺口、用RNA酶H總體消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化的限制位點(diǎn)、用限制性酶切割缺口和用化學(xué)試劑切割缺口。
根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中，所述片段是RNA或DNA-RNA嵌合體。
全文摘要
利用滾環(huán)擴(kuò)增來擴(kuò)增和檢測靶核酸分子，其通過在靶核酸分子上連接第一和/或第二接頭核酸分子或第二接頭核酸分子，然后環(huán)化靶核酸分子，再擴(kuò)增該環(huán)化的核酸分子以產(chǎn)生重復(fù)的核酸序列?？衫么朔椒〝U(kuò)增核酸，特別是RNA，以進(jìn)行檢測和克隆。
文檔編號C12P19/34GK101415838SQ200480027696
公開日2009年4月22日 申請日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者王友祥, 宗亞平 申請人:首科安普有限公司