專利名稱：轉(zhuǎn)錄本的分析方法
相關(guān)申請本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2003年7月2日提交的美國臨時申請60/484，849的優(yōu)先權(quán)。該‘849申請在此處引入作為參考。本申請也是2003年12月19日提交的美國專利申請10/741,193的繼續(xù)并要求其優(yōu)先權(quán)，其也在此處引入作為參考。
本申請得到由國立衛(wèi)生研究院的國家癌癥研究所提供的合同號為N01-CO-12400的政府資助。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及生物檢驗，微陣列以及生物信息學(xué)。
先前獲得全長cDNAs需要利用cDNA克隆或5’以及3’RACE方法的精細(xì)技術(shù)方法。cDNA的產(chǎn)物以及RACE產(chǎn)物任選需要為獨特的分子種類(即凝膠上的單一譜帶或文庫中絕大部分的克隆)。因此，本領(lǐng)域非常需要對全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表征的其它方法。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個方面，高密度陣列與5’以及3’RACE(cDNA末端的快速擴增)或RAGE(基因組DNA的快速擴增)串聯(lián)檢測以及表征轉(zhuǎn)錄本或基因組結(jié)構(gòu)。RACE可以是3’或者5’RACE。RACE或RAGE的產(chǎn)物可以利用寡核苷酸探針進(jìn)行分析，所述探針優(yōu)選地固定在基質(zhì)上形成高密度寡核苷酸探針陣列。陣列可能是基因組嵌合陣列，重排陣列及其他適合的陣列。
本發(fā)明方法的示范性應(yīng)用包括1)鑒定轉(zhuǎn)錄本的5’以及3’末端的位置(檢測以及表征可變的5’以及3’末端)；2)確定全長cDNAs的結(jié)構(gòu)；3)檢測以及表征相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的可變剪接同種型；4)確定轉(zhuǎn)錄本的鏈或起點；5)組合多個(＞2)RACE反應(yīng)發(fā)現(xiàn)基因以及以高通量方式表征的能力；6)由PCR擴增RACE反應(yīng)的產(chǎn)物利用低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄本實施上述5個任務(wù)的能力；7)檢測源自于與另一轉(zhuǎn)錄本較遠(yuǎn)距離開始的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本(外顯子)的結(jié)合的能力；以及8)利用基因組DNA作為模板由RACE-類反應(yīng)鑒定(通過延伸)獨特的缺失，易位以及重排。


說明書中包括的并且作為其一部分的附解了本發(fā)明的實施方案并且連同

用來解釋本發(fā)明的原則圖1顯示了本發(fā)明的示范性的分析方法。
圖2顯示了染色體22上較好表征的基因DGSI的結(jié)構(gòu)。該基因由10個外顯子組成并且從右到左(即，5’末端在右側(cè))轉(zhuǎn)錄。
圖3顯示了染色體22的區(qū)域，其中利用RACE以及陣列實驗表征新的基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明具有許多優(yōu)選的實施方案，并且依賴于許多專利、申請及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它參考文獻(xiàn)。因此，當(dāng)引用或在下面重復(fù)引用專利、申請或其它參考文獻(xiàn)時，應(yīng)該理解為將其全部引入作為通用的參考以及用于提出所列舉的陳述。
I.概要在本申請中，單數(shù)形成的“一，”“一個”以及“這個”包括除上下文清楚限定之外的多個參考文獻(xiàn)。例如，術(shù)語“試劑”包括包含其混合物的多種試劑。
個體不局限于人還可能為其它生物體，包含但不限于哺乳動物、植物、細(xì)菌、或來源于任何上述生物體的細(xì)胞。
貫穿這個公開，本發(fā)明的多個方面可以一個范圍的形式出現(xiàn)。應(yīng)該清楚范圍形式的描述僅僅為了方便以及簡短起見并且將不會被認(rèn)為是死板的限制本發(fā)明的范圍。因此，范圍的說明應(yīng)該被理解為具體地描述了所有可能的子范圍以及在那個范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，諸如從1到6的范圍描述應(yīng)該被理解為具有具體公開的子范圍，諸如從1到3，從1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等等，以及在那個范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如，1、2、3、4、5和6。這種理解適用于無論多么寬泛的范圍。
本發(fā)明的實際應(yīng)用除非另有陳述可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有機化學(xué)、聚合物技術(shù)、分子生物學(xué)(包含重組技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)和描述。這樣的傳統(tǒng)技術(shù)包含聚合物陣列合成、雜交、連接、和利用標(biāo)記檢測雜交。適用技術(shù)的具體說明可以參考下列的實施例。然而，當(dāng)然還可以使用其它等同的常規(guī)程序。這樣的傳統(tǒng)技術(shù)和說明可以在標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊中發(fā)現(xiàn)，諸如GenomeAnalysisA Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using AntibodiesALaboratory Manual，CellsA Laboratory Manual，PCR PrimerALaboratory Manual，and Molecular CloningA Laboratory Manual(所有都來自Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，New York，Gai，“Olignonucleotide SynthesisA Practical Approach”1984，IRL Press，London，Nelson and Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第三版，W.H.Freeman Pub，New York，NY和Berg等人的(2002)Biochemistry，5th Ed.，W H.Freeman Pub.，New York，NY，所有都在此處全部引入作為通用的參考。
本發(fā)明可以使用固體基質(zhì)，包含一些優(yōu)選實施方案中的陣列。適用于聚合物(包含蛋白質(zhì))陣列合成的方法和技術(shù)已經(jīng)描述在下列專利申請中美國專利09/536,841，WO 00/58516，美國專利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,405,783，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555,6,136,269,6,269,846和6,428,752，PCT申請PCT/US99/00730(國際公布號為WO 99/36760)和PCT/US01/04285，其全部引入作為通用的參考。
在具體實施方案中描述合成技術(shù)的專利包含美國專利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸陣列描述在多個上述專利中，但是相同的技術(shù)被用于也被描述的多肽陣列。
用于本發(fā)明的核酸陣列包含從Affymetrix(Santa Clara，CA)以商品名GeneChip市售獲得的產(chǎn)品。示范性陣列顯示在affymetrix.com的網(wǎng)址上。本發(fā)明還涉及附著于固體基質(zhì)的聚合物的多個應(yīng)用。這些應(yīng)用包含基因表達(dá)監(jiān)控，作圖，文庫篩選，基因分型和診斷。基因表達(dá)監(jiān)控，和作圖的方法顯示在下列專利申請中美國專利5,800,992，6,013,449，6,020,135，6,033,860，6,040,138，6,177,248和6,309,822?；蚍中秃推鋺?yīng)用顯示在USSN 60/319,253，10/013,598，和美國專利5,856,092，6,300,063，5,858,659，6,284,460，6,361,947，6,368,799和6,333,179中。其它應(yīng)用概括在美國專利5,871,928,5,902,723,6,045,996，5,541,061和6,197,506中。
本發(fā)明在某些優(yōu)選實施方案中還涉及樣品制備方法。在基因分型之前或者同時，基因組樣品可以通過多種機理進(jìn)行擴增，其中一些可以使用PCR。參見，例如PCR TechnologyPrinciples and Applicationsfor DNA Amplification(Ed.H.A.Erlich，F(xiàn)reeman Press，NY，NY，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Eds Innis，等人，Academic Press，San Diego，CA，1990)；Mattila等人的，Nucleic Acids Res19，4967(1991)；Eckert等人的，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(Eds.McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美國專利4,683,202，4,683,195，4,800,159，4,965,188和5,333,675，并且每個都全部引入作為通用的參考。樣品可以在陣列上擴增。參見，例如美國專利6,300,070以及美國專利申請09/513,300，其在此處引入作為參考。
其它合適的擴增方法包含連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(例如，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等人的，Science 241，1077(1988)和Barringer等人的Gene 89117(1990)，轉(zhuǎn)錄擴增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)，自動維持的序列擴增(Guatelli等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995，靶聚核苷酸序列的選擇性擴增(美國專利6,410,276)，共有序列引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CD-PCR)(美國專利4,437,975)，任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AP-PCR)(美國專利5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列擴增(NABSA)。(參見美國專利5,409,818，5,554,517和6,063,603，每個都在此處引入作為參考)。其它可以使用的擴增方法描述在美國專利5,242,794，5,494,810，4,988,617以及美國專利09/854,317中，其中每個在此處引入作為參考。
其它的樣品制備方法和減少核樣品復(fù)雜性的技術(shù)描述在Dong等人的，Genome Research 11 1418(2001)，美國專利6,361,947，6,391,592和美國專利申請09/916,135，09/920,491，09/910,292，和10/013,598中。進(jìn)行多核苷酸雜交分析的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中得到了很好的發(fā)展。雜交分析程序和條件將依賴于應(yīng)用而改變，并且根據(jù)已知的常規(guī)結(jié)合方法進(jìn)行選擇，所述常規(guī)結(jié)合參考Maniatis等人的分子克隆實驗指南(第二版，Cold Spring Harbor，N.Y，1989)；Berger和Kimmel的Methodsin Enzymology，Vol.152，Guide to Molecular CloningTechniques(Academic Press，Inc.San Diego，CA，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，801194(1983)。進(jìn)行重復(fù)和控制雜交反應(yīng)的方法和裝置描述在wu美國專利5,871,928，5,874,219，6,045,996和6,386,749，6,391,623中，每個都在此處引入作為參考。
在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還涉及檢測配體之間的雜交信號。參見美國專利5,143,854；5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625，美國專利申請60/364,731以及PCT申請PCT/US99/06097(公布為WO 99/47964)，每個都全部引入作為通用的參考。
信號檢測以及處理大量數(shù)據(jù)的方法和裝置公開在，例如美國專利5,143,854，5,547,839，5,578,832，5,631,734，5,800,992，5,834,758；5,856,092，5,902,723，5,936,324，5,981,956，6,025,601，6,090,555，6,141,096，6,185,030，6,201,639；6,218,803；和6,225,625中，美國專利申請60/364,731和PCT申請PCT/US99/06097中(
發(fā)明者托馬斯·R·金杰拉斯, 菲利普·V·卡普拉諾夫 申請人:阿菲梅特里克斯公司