專利名稱：：淀粉水解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在低于顆粒狀淀粉的初始凝膠化溫度的溫度，將所述顆粒狀淀粉水解為可溶的淀粉水解產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)描述了大量的方法用于將淀粉轉(zhuǎn)化為淀粉水解產(chǎn)物，諸如麥芽糖、葡萄糖或特制糖漿，用作甜味劑(sweetener)或用作其他糖類(lèi)如果糖的前體。葡萄糖也可以被發(fā)酵變?yōu)橐掖蓟蚱渌l(fā)酵產(chǎn)物，諸如檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸delta內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉(sodiumerythorbate)、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮類(lèi)；氨基酸，谷氨酸(單谷氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，如核黃素、B12、beta-胡蘿卜素或激素。淀粉是高分子量聚合物，其由葡萄糖單元的鏈組成。它通常由大約80％支鏈淀粉和20％直鏈淀粉組成。支鏈淀粉是分枝的多糖，其中alpha-1，4D-葡萄糖殘基的線狀鏈通過(guò)alpha-1，6糖苷鍵連接。直鏈淀粉是線狀的多糖，其由通過(guò)alpha-1，4糖苷鍵連接在一起的D-吡喃型葡萄糖構(gòu)建而成。在將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解產(chǎn)物的情況下，所述的淀粉被解聚(depolymerization)。常規(guī)的解聚方法由凝膠化步驟和兩個(gè)連續(xù)的處理步驟，即液化(liquefaction)處理和糖化(saccharification)處理組成。顆粒狀淀粉由微觀的顆粒組成，其在室溫不溶于水。當(dāng)將水性的淀粉漿體加熱時(shí)，所述的顆粒膨脹并最終脹破，將所述的淀粉分子分散到所述溶液中。在此“凝膠化”(gelatinization)處理過(guò)程中，粘度有顯著的提高。由于在通常的工業(yè)過(guò)程中，所述的固體水平為30-40％，就必須將所述的淀粉變稀薄和“液化”，以使其能被處理。此粘度的降低現(xiàn)今主要通過(guò)酶法降解獲得。在液化步驟中，所述的長(zhǎng)鏈淀粉被alpha-淀粉酶降解為較小的分枝的和線狀的單元(麥芽糖糊精)。所述的液化步驟通常在大約105-110℃進(jìn)行大約5至10分鐘，然后在大約95℃進(jìn)行大約1-2小時(shí)。然后將所述的溫度降低到60℃，加入葡糖淀粉酶或beta-淀粉酶和任選的脫支酶，諸如異淀粉酶或支鏈淀粉酶，而且所述糖化處理進(jìn)行大約24至72小時(shí)。由前面的討論顯然，由于依據(jù)不同的步驟中溫度的不同要求，常規(guī)的淀粉轉(zhuǎn)化方法是非常消耗能量的。因此就需要能夠選出用于此方法的酶，可以進(jìn)行全過(guò)程而無(wú)需將所述淀粉凝膠化。這樣的方法是專利US4591560、US4727026和US4009074和EP0171218的主題。本發(fā)明涉及一步方法，用于在低于所述顆粒狀淀粉的初始凝膠化溫度的溫度，將顆粒狀淀粉轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備可溶的淀粉水解產(chǎn)物的方法，所述方法包括將水性(aqueous)的顆粒狀淀粉漿體(slurry)在低于所述顆粒狀淀粉的初始凝膠化溫度的溫度，與第一種酶作用，其中酶；是所述的糖苷水解酶家族13的成員；具有alpha-1，4-糖苷水解(glucosidichydrolysis)活性，和；包括屬于CBM家族20的功能的糖-結(jié)合組件(CBM)，其中CBM具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少60％同源性；而其中第二種酶選自包括真菌alpha-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、beta-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的列表。本方面的第一個(gè)方面的方法可以作為一步方法和/或作為包含一步或多步的方法實(shí)施。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備基于高果糖淀粉糖漿(highfructosestarch-basedsyrup)(HFSS)的方法，所述的方法包括通過(guò)本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法制備可溶的淀粉水解產(chǎn)物，并進(jìn)一步包括將所述的可溶的淀粉水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為基于高果糖淀粉糖漿(HFSS)的步驟。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備燃料乙醇或飲料(potable)乙醇的方法；其包括通過(guò)本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法制備可溶的淀粉水解產(chǎn)物，并進(jìn)一步包括將所述的可溶的淀粉水解產(chǎn)物發(fā)酵成為乙醇的步驟，其中所述的發(fā)酵步驟同時(shí)或分別地/依次地進(jìn)行所述顆粒狀淀粉的水解。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有alpha-淀粉酶活性的酶在淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含功能的CBM，其具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少60％同源性。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有alpha-淀粉酶活性的酶在顆粒狀淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有alpha-淀粉酶活性和功能的CBM的酶在顆粒狀淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21和SEQIDNO22的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“顆粒狀淀粉”理解為生的未烹調(diào)過(guò)的淀粉，即未經(jīng)過(guò)凝膠化的淀粉。淀粉作為不可溶于水的微小顆粒在植物內(nèi)形成。這些顆粒在低于初始凝膠化溫度的溫度保留在淀粉中，當(dāng)置于冷水中時(shí)，谷物顆?？晌丈倭康囊后w并膨脹。在溫度高達(dá)50℃至70℃時(shí)，所述的膨脹是可逆的?？赡嫘缘某潭纫蕾囉诰唧w的淀粉。在更高的溫度下，開(kāi)始被稱為凝膠化的不可逆膨脹。術(shù)語(yǔ)“初始凝膠化溫度”理解為淀粉的凝膠化開(kāi)始發(fā)生的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50℃-75℃開(kāi)始凝膠化；凝膠化的準(zhǔn)確溫度依賴于具體的淀粉，并能夠由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。這樣，初始凝膠化溫度可根據(jù)植物種類(lèi)、植物種類(lèi)的具體品種以及生長(zhǎng)條件而變化。在本發(fā)明的上下文中，給出的淀粉的初始凝膠化溫度是應(yīng)用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/St_rke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)描述的方法，淀粉顆粒的雙折射(birefringence)損失5％時(shí)的溫度。術(shù)語(yǔ)“可溶的淀粉水解產(chǎn)物”理解為本發(fā)明的方法的可溶的產(chǎn)物，并可以包括單糖、二糖和寡糖，如葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、環(huán)糊精和這些的任意混合物。優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的顆粒狀淀粉的干固體被轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“特制糖漿”(specialitysyrups)，是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中公認(rèn)術(shù)語(yǔ)，并根據(jù)DE和糖譜(carbohydratespectrum)(參見(jiàn)由G.G.Birch和L.F.Green編輯的教科書(shū)“MolecularStructureandFunctionofFoodCarbohydrate”，AppliedSciencePublishersLTD.，London中的文章“NewSpecialityGlucoseSyrups”，p.50+)進(jìn)行表征。通常特制糖漿具有范圍在35至45的DE。所述的“糖苷水解酶家族13”在本發(fā)明的上下文中定義為水解酶的組，其包括具有(beta/alpha)8或TIM筒狀結(jié)構(gòu)的催化組件(module)，并通過(guò)alpha-保留反應(yīng)機(jī)理(alpha-retainingreactingmechanism)作用于淀粉和相關(guān)的物質(zhì)(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc28，416-436)。具有“alpha-1，4-糖苷水解活性”的酶在本發(fā)明的上下文中定義為包括酶的組，所述的酶催化alpha-1，4-糖苷鍵的水解和/或合成，如由Takata(Takataetal，1992，J.Biol.Chem.267，18447-18452)和由Koshland(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc28，416-436)所定義的。所述的“家族20的糖-結(jié)合組件”或CBM-20組件，在本發(fā)明的上下文中定義為大約100個(gè)氨基酸的序列，其與由Joergensenetal.(1997)在Biotechnol.Lett.191027-1031，在圖1中公開(kāi)的多肽的糖-結(jié)合組件(CBM)具有至少45％同源性。所述的CBM包括所述多肽的最后102個(gè)氨基酸，即來(lái)自氨基酸582至氨基酸683的亞序列。此公開(kāi)中應(yīng)用的糖苷水解酶家族的編號(hào)依據(jù)Coutinho，P.M.&Henrissat，B.(1999)CAZy-Carbohydrate-ActiveEnzymesserver在URLhttp//afmb.cnrs-mrs.fr/-cazy/CAZY/index.html或可替換地Coutinho，P.M.&Henrissat，B.1999；纖維素酶和其他糖類(lèi)-活性酶的組件結(jié)構(gòu)綜合的數(shù)據(jù)庫(kù)方法，在“Genetics，BiochemistryandEcologyofCelluloseDegradation”，K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita和T.Kimuraeds.，UniPublishersCo.，Tokyo，pp.15-23，和Bourne，Y.Henrissat，B.2001；糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶家族和功能組件，CurrentOpinioninStructuralBiology11593-600的概念。糖-結(jié)合組件(CBM)是多肽氨基酸序列，其優(yōu)先連接于多糖或寡糖(碳水化合物)，常常-但不一定排他地-連接于其不溶于水(包括晶體)的形式。雖然許多類(lèi)型的CBM已經(jīng)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中描述，其大多數(shù)-源自纖維素分解酶(纖維素酶)的多種-通常被稱作“纖維素-結(jié)合組件”；通常的纖維素-結(jié)合組件由此為出現(xiàn)在纖維素酶中的CBM。同樣地，其他CBM的亞-類(lèi)可包含，例如，殼多糖-結(jié)合組件(通常出現(xiàn)在殼多糖酶(chitinase)中的CBM)、木聚糖-結(jié)合組件(通常出現(xiàn)在木聚糖酶中的CBM)、甘露聚糖-結(jié)合組件(通常出現(xiàn)在甘露聚糖酶中的CBM)、淀粉-結(jié)合組件(通常出現(xiàn)在一些淀粉分解酶，如一些葡糖淀粉酶中，或在如環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的酶中，或在alpha-淀粉酶中的CBM)。發(fā)現(xiàn)CBM作為大多肽或蛋白的組成部分，所述蛋白由兩個(gè)或多個(gè)多肽氨基酸序列區(qū)組成，尤其在水解酶(水解酶)中，其通常包括含有用于底物水解的活性位點(diǎn)的催化組件和用于與所述糖底物結(jié)合的糖-結(jié)合組件(CBM)。這些酶可包括一個(gè)以上的催化組件和一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CBM，并任選的進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)多肽氨基酸序列區(qū)，它將所述的CBM與所述的催化組件相連接，后一種類(lèi)型的區(qū)域通常表示為“接頭”。包括CBM的水解酶的實(shí)例-其中的一些已經(jīng)在前面提及-為纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶(arabinofuranosidases)、乙酰酯酶(acetylesterase)和殼聚糖酶。CBM也在藻類(lèi)，例如在紅藻Porphyrapurpura中以非-水解多糖-結(jié)合蛋白的形式被發(fā)現(xiàn)。在出現(xiàn)CBM的蛋白質(zhì)/多肽中(例如酶，通常為水解酶)，CBM可位于N或C末端或位于內(nèi)部位點(diǎn)。構(gòu)成CBM的那部分多肽或蛋白(例如水解酶)本身，通常由多于大約30個(gè)并且少于大約250個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明優(yōu)選的是包含CBM的酶，所述的CBM包括選自氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列，以及包含CBM的酶，所述的CBM含有氨基酸序列，該氨基酸序列與選自氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少50％同源性。本公開(kāi)中所指的多肽“同源性”理解為指示第一個(gè)序列與第二個(gè)序列差異的兩個(gè)序列之間的同一性(identity)程度。同源性可通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序適合地確定，所述的計(jì)算機(jī)程序如GCG程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，August1994，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.andWunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48，443-453)。在氨基酸序列比較中采用下列設(shè)置GAP產(chǎn)生罰分3.0和GAP延伸罰分0.1。用作本發(fā)明的第一種酶的酶是四組件alpha-淀粉酶，其由三個(gè)組件淀粉酶核心和單獨(dú)的(separate)家族20的糖結(jié)合組件組成。所述的alpha-淀粉酶可為源自細(xì)菌或真菌來(lái)源的野生型alpha-淀粉酶，或它可以為突變體、蛋白質(zhì)工程變體或該野生型的其他變體，或者它可以為變體或野生型的雜合體。所述的alpha-淀粉酶優(yōu)選為野生型酶。所述alpha-淀粉酶更優(yōu)選為上述alpha-淀粉酶的變體和/或雜合體，其包括氨基酸修飾，所述的氨基酸修飾導(dǎo)致活性增加、在低pH和/或高pH蛋白穩(wěn)定性增加、對(duì)于鈣損耗的穩(wěn)定性增加，和/或在高溫下穩(wěn)定性增加。本公開(kāi)中所指的術(shù)語(yǔ)“酶雜合體”理解為修飾的酶，其包括淀粉分解酶的氨基酸序列[所述的淀粉分解酶在本發(fā)明的上下文中可為，例如alpha-淀粉酶(EC3.2.1.1)、異淀粉酶(EC3.2.1.68)或支鏈淀粉酶(EC3.2.1.41)]，所述的淀粉分解酶連接(即共價(jià)結(jié)合)于包括CBM的氨基酸序列。所述的CBM優(yōu)選但不排他地融合于所述的N-末端。所述的雜合體可包含一種以上的CBM。含CBM的酶雜合體，及其制備和純化的詳細(xì)描述是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的[參見(jiàn)，例如，WO90/00609、WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwoodetal.，BiotechnologyandBioengineering44(1994)pp.1295-1305]。它們可，例如通過(guò)將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞來(lái)制備，所述DNA構(gòu)建體包括至少DNA的片段，其編碼所述的纖維素-結(jié)合組件，所述組件用或不用接頭連接于編碼目標(biāo)酶的DNA序列，并使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以表達(dá)所述的融合的基因。構(gòu)建糖-結(jié)合組件(CBM)和alpha-淀粉酶之間的雜合體蛋白需要一個(gè)或多個(gè)下列步驟，以獲得穩(wěn)定的、可以表達(dá)和應(yīng)用的酶。1)應(yīng)用常規(guī)方法，將所述的CBM-供體分子與所述催化組件的供體進(jìn)行比對(duì)，常常需要鑒定可能的交叉點(diǎn)。如果所述的同源性相對(duì)高，則也許有幾個(gè)可能的交叉點(diǎn)。然而如果所述的同源性低或者只能分別得到所述催化組件和所述CBM的序列，可將所述的CBM作為延長(zhǎng)附加于所述催化組件，或在所述序列的開(kāi)始，即在最終的信號(hào)序列之后插入的N-末端中，或在終止信號(hào)之前的C-末端中。無(wú)論所述的CBM是否位于所述的N-末端或C-末端，都有益于缺失幾個(gè)氨基酸或插入幾個(gè)氨基酸作為接頭，以得到可表達(dá)和應(yīng)用的穩(wěn)定的酶。2)根據(jù)1)的考慮，構(gòu)建編碼所述CBM和淀粉分解組件的基因的DNA雜合體，可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。這些方法其中包括，PCR反應(yīng)，其應(yīng)用引物，所述引物設(shè)計(jì)為在得到的DNA雜交(crossing)點(diǎn)雜交，DNA消化，然后是例如通過(guò)酵母實(shí)例的連接或體內(nèi)組合。3)CBM與淀粉分解組件的簡(jiǎn)單連接常常產(chǎn)生雜合體蛋白，所述的雜合體蛋白由于折疊或穩(wěn)定性問(wèn)題，或由于在雜合體蛋白中在設(shè)定的應(yīng)用中缺乏足夠的穩(wěn)定性和/或活性而表達(dá)不足。為了克服上述問(wèn)題，將所述的雜合體蛋白或通過(guò)定點(diǎn)突變方法，或通過(guò)更隨機(jī)的方法經(jīng)受蛋白質(zhì)工程改造。這包括所述CBM的組件中的氨基酸和所述淀粉分解組件中的氨基酸，以及優(yōu)化從淀粉分解組件到CBM的轉(zhuǎn)換，關(guān)于長(zhǎng)度和氨基酸序列。作為本發(fā)明的第一種酶優(yōu)選的是包含CBM的雜合體酶，其包括選自氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列，以及包含氨基酸序列的酶，所述的氨基酸序列與選自氨基酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。作為本發(fā)明的第一種酶還優(yōu)選包含氨基酸序列的雜合體酶，所述的氨基酸序列具有alpha-淀粉酶活性并包含選自氨基酸序列SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的氨基酸序列，以及包含氨基酸序列的酶，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。本發(fā)明的第一種酶優(yōu)選包含CBM和/或alpha-淀粉分解序列，其源自真菌，諸如來(lái)自屬于踝節(jié)菌屬(Talaromycessp.)的菌株，或來(lái)自屬于曲霉屬(Aspergillus)的菌株，如泡盛曲霉(A.awamori)、A.kawachii、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)等，或源自細(xì)菌，諸如來(lái)自屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp)的菌株，如來(lái)自屬于解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefacience)、黃熱芽孢桿菌(B.flavothermus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的菌株。作為本發(fā)明的第一種酶更優(yōu)選四組件alpha-淀粉酶，其由三個(gè)組件淀粉酶核心和單獨(dú)的家族20的糖結(jié)合組件組成。最優(yōu)選四組件alpha-淀粉酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自氨基酸序列SEQIDNO19、SEQIDNQ20、SEQIDNO21或SEQIDNO22的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。本發(fā)明的第一種酶優(yōu)選四組件alpha-淀粉酶，其分離自真菌或細(xì)菌，如來(lái)自芽孢桿菌屬的菌種，如SEQIDNO20和SEQIDNO21中顯示的多肽；或來(lái)自黃熱芽孢桿菌的菌株，如SEQIDNO19中顯示的多肽；或來(lái)自泡盛曲霉，如SEQIDNO22中顯示的多肽。作為本發(fā)明的第一種酶最優(yōu)選alpha-淀粉酶，其包含氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自氨基酸序列SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21或SEQIDNO22的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。上述的alpha-淀粉酶可以以0.001-1.0KNU/gDS的量加入，優(yōu)選0.002-0.5KNU/gDS，優(yōu)選0.02-0.1KNU/gDS。真菌alpha-淀粉酶用作本發(fā)明的方法的第二種酶的具體的酶是真菌alpha-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，如fungamyl-樣alpha-淀粉酶。在本公開(kāi)中，術(shù)語(yǔ)“fungamyl-樣alpha-淀粉酶”表示alpha-淀粉酶，其與WO96/23874的SEQIDNO10所示的氨基酸序列顯示高同源性，即高于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性。真菌alpha-淀粉酶可以0.001-1.0AFAU/gDS的量加入，優(yōu)選0.002-0.5AFAU/gDS，優(yōu)選0.02-0.1AFAU/gDS。beta-淀粉酶用作本發(fā)明的方法的第二種酶的另一種具體的酶可為beta-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。beta-淀粉酶是傳統(tǒng)上給予外-作用(exo-acting)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶的名字，其在直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖聚合物中催化1，4-alpha-糖苷鍵的水解，由此釋放麥芽糖。beta-淀粉酶已經(jīng)從多種植物和微生物中(W.M.FogartyandC.T.Kelly，ProgressinIndustrialMicrobiology，vol.15，pp.112-115，1979)分離。這些beta-淀粉酶以具有在40℃-65℃范圍內(nèi)的最適溫度和在4.5-7.0范圍內(nèi)的最適pH為特征。預(yù)期的beta-淀粉酶包括來(lái)自大麥Spezyme_BBA1500、Spezyme_DBA和來(lái)自GenencorInt.的OptimaltTMME、OptimaltTMBBA以及來(lái)自NovozymesA/S的NOVOZYMTMWBA的beta-淀粉酶。葡糖淀粉酶用作本發(fā)明的方法的第二種酶的又一種具體的酶也可為源自微生物或植物的葡糖淀粉酶(glucoamylase)(E.C.3.2.1.3)。優(yōu)選真菌或細(xì)菌來(lái)源的葡糖淀粉酶選自曲霉屬葡糖淀粉酶，特別為黑曲霉菌G1或G2葡糖淀粉酶(Boeletal.，(1984)，EMBOJ.3(5)，p.1097-1102)，或其變體，如在WO92/00381和WO00/04136中所公開(kāi)的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉菌(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其片段或變體。其他預(yù)期的曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括熱穩(wěn)定性增加的變體G137A和G139A(Chenetal.(1996)，Prof.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chenetal.(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chenetal.(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫化物鍵(disulphidebond)，A246C(Fierobeetal.(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；和在位點(diǎn)A435和S436導(dǎo)入Pro殘基(Lietal.(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204)。其他預(yù)期的葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬葡糖淀粉酶，尤其源自Talaromycesemersonii(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美國(guó)專利no.Re.32，153)、Talaromycesduponti、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)(美國(guó)專利no.4,587,215)。預(yù)期的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來(lái)自梭菌屬(Clostridium)的葡糖淀粉酶，尤其是C.thermoamylolyticum(EP135，138)和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)。優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括源自米曲霉菌的葡糖淀粉酶，如葡糖淀粉酶，其與在WO00/04136的SEQIDNO2中所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性。預(yù)期的也為商業(yè)產(chǎn)品AMG200L、AMG300L、SANTMSUPER和AMGTME(來(lái)自Novozymes)；OPTIDEXTM300(來(lái)自GenencorInt.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(來(lái)自DSM)；G-ZYMETMG900(來(lái)自EnzymeBio-Systems)；G-ZYMETMG990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。葡糖淀粉酶可以0.02-2.0AGU/gDS的量加入，優(yōu)選0.1-1.0AGU/gDS，如0.2AGU/gDS。附加的酶本發(fā)明的方法可以在第三種酶存在的條件下進(jìn)行。具體的第三種酶可為芽孢桿菌alpha-淀粉酶(常常被成作“Termamyl-樣alpha-淀粉酶”)。眾所周知的Termamyl-樣alpha-淀粉酶包括alpha-淀粉酶，其源自地衣芽孢桿菌(可作為T(mén)ermamyl商業(yè)上得到)、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株的alpha-淀粉酶。其他Termamyl-樣alpha-淀粉酶包括源自芽孢桿菌NCIB12289，NCIB12512，NCIB12513或DSM9375的菌株的alpha-淀粉酶，所述的所有菌株在WO95/26397中詳細(xì)描述，而且所述的alpha-淀粉酶由Tsukamotoetal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31描述。在本發(fā)明的上下文中，Termamyl-樣alpha-淀粉酶是如在WO99/19467的第3頁(yè)第18行至第6頁(yè)第27行定義的alpha-淀粉酶。預(yù)期的變體和雜合體在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中描述。尤其預(yù)期的是重組嗜熱脂肪芽孢桿菌alpha-淀粉酶變體，其具有突變I181*+G182*+N193F。芽孢桿菌alpha-淀粉酶可以以本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有效量加入。本發(fā)明的又一種具體的第三種酶可為脫支酶，諸如異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。異淀粉酶水解支鏈淀粉和beta-極限糊精中的alpha-1，6-D-支鏈糖苷鍵，并可通過(guò)異淀粉酶不能攻擊支鏈淀粉，及通過(guò)對(duì)于alpha-極限糊精的有限作用與支鏈淀粉酶相區(qū)別。脫支酶可以以本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有效量加入。本發(fā)明的實(shí)施方案經(jīng)過(guò)本發(fā)明的處理的淀粉漿體可具有20-55％干固體顆粒狀淀粉，優(yōu)選25-40％干固體顆粒狀淀粉，更優(yōu)選30-35％干固體顆粒狀淀粉。經(jīng)過(guò)本發(fā)明的第一個(gè)方面的處理之后，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或優(yōu)選至少99％所述顆粒狀淀粉的干固體被轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，第一和第二方面的處理在低于初始凝膠化溫度的溫度進(jìn)行。優(yōu)選地，進(jìn)行所述處理的溫度為至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或優(yōu)選至少60℃。本發(fā)明的第一個(gè)方面的處理進(jìn)行的pH可為3.0-7.0的范圍，優(yōu)選3.5至6.0，或更優(yōu)選4.0-5.0。本發(fā)明第一個(gè)方面的方法的產(chǎn)物的精確組成，所述可溶的淀粉水解產(chǎn)物，依賴于應(yīng)用的酶的組合以及處理的顆粒狀淀粉的類(lèi)型。優(yōu)選地，所述可溶的淀粉水解產(chǎn)物為麥芽糖，其具有至少85％、至少90％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5％、至少99.0％或至少99.5％的純度。還更優(yōu)選所述可溶的淀粉水解產(chǎn)物為葡萄糖，并最優(yōu)選所述可溶的淀粉水解產(chǎn)物具有至少94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5％、至少99.0％或至少99.5％的DX(總?cè)芙獾母晒腆w中葡萄糖百分比)。然而，同樣地預(yù)期的是所述的方法，其中本發(fā)明的方法的產(chǎn)物，所述可溶的淀粉水解產(chǎn)物，是特制糖漿，諸如含有葡萄糖、麥芽糖、DP3和DPn的混合物的特制糖漿，用于制造冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐頭。在本發(fā)明的處理中加工的顆粒狀淀粉尤其可以從塊莖、根、莖、豆類(lèi)、谷類(lèi)或整粒谷物(wholegrain)中得到。更具體地，所述的顆粒狀淀粉可以從玉米、粗玉米粉(corngrits)、穗軸(cob)、小麥、大麥、黑麥、蜀黍類(lèi)(milo)、西米(sago)、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高梁、稻米、豌豆、大豆、香蕉或馬鈴薯中得到。具體預(yù)期蠟質(zhì)(waxy)和非蠟質(zhì)(non-waxy)類(lèi)型的玉米和大麥。待處理的顆粒狀淀粉可具有高度精制的淀粉質(zhì)量，優(yōu)選至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％純度或其可為含有原料較粗的淀粉，所述的原料包括磨碎的整粒谷物，其包括非-淀粉部分，如胚芽殘余物(germresidue)和纖維。將所述的原料，如整粒谷物磨碎以打開(kāi)其結(jié)構(gòu)并允許進(jìn)一步的處理。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選兩種磨碎方法濕磨(wetmilling)和干磨(drymilling)。進(jìn)行干磨時(shí)，研磨并應(yīng)用所述的整個(gè)谷粒。濕磨使胚芽和粗磨粉(meal)(淀粉顆粒和蛋白)良好的分離，并在所述的淀粉水解產(chǎn)物用于制備糖漿的應(yīng)用中具有少數(shù)例外。干磨和濕磨在淀粉加工的
技術(shù)領(lǐng)域：
中都是熟知的，并同樣預(yù)期用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法在超濾系統(tǒng)中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流(recirculation)條件下保留，而且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。同樣預(yù)期的是本方法在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。也預(yù)期的是本方法在具有微濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。在本發(fā)明的第二個(gè)方面的方法中，將本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化成為基于高果糖淀粉糖漿(HFSS)，諸如高果糖漿(HFCS)。此轉(zhuǎn)化優(yōu)選應(yīng)用葡萄糖異構(gòu)酶完成，并更優(yōu)選通過(guò)在固體支持物支持的固定化的葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行。預(yù)期的葡萄糖異構(gòu)酶包括下列商業(yè)產(chǎn)品，來(lái)自NovozymesA/S的SweetzymeTMIT、來(lái)自Rhodia的G-zymeTMIMGI和G-zymeTMG993、KetomaxTM和G-zymeTMG993、來(lái)自GenencorInt的G-zymeTMG993液體和GenSweetTMIGI。在本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法中，本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物用于制備燃料或飲料乙醇。在第三個(gè)方面的方法中，所述的發(fā)酵可同時(shí)或分別地/依次地進(jìn)行所述顆粒狀淀粉的水解。當(dāng)所述的發(fā)酵與所述的水解同時(shí)進(jìn)行時(shí)，所述的溫度優(yōu)選微30℃-35℃，并更優(yōu)選31℃-34℃。本發(fā)明的第三方面的方法可以在超濾系統(tǒng)中實(shí)施，其中所述的滲余物(retentate)在酶、生淀粉、酵母、酵母營(yíng)養(yǎng)素和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物(permeate)是含有乙醇的液體(ethanolcontainingliquid)。同樣預(yù)期的是所述的方法在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，其中所述的滲余物在酶、生淀粉、酵母、酵母營(yíng)養(yǎng)素和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是含有乙醇的液體。本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物也可用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品，所述的發(fā)酵產(chǎn)品包括將處理過(guò)的淀粉發(fā)酵成為發(fā)酵產(chǎn)品，諸如檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述的淀粉漿體與包含CBM，但無(wú)淀粉分解組件的多肽接觸，即疏松的CBM。所述疏松的CBM可為淀粉結(jié)合組件、纖維素結(jié)合組件、殼多糖結(jié)合組件、木聚糖結(jié)合組件、甘露聚糖結(jié)合組件和其他結(jié)合組件。本上下文中優(yōu)選的CBM是微生物CBM，尤其是細(xì)菌或真菌CBM。尤其優(yōu)選的是在本公開(kāi)中所示的淀粉結(jié)合組件，如SEQIDNO1、SEQIDNO2和SEQIDNO3的多肽序列，或在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/511044中公開(kāi)的淀粉結(jié)合組件，如SEQIDNO12；來(lái)自Hormoconissp.，如來(lái)自Hormoconisresinae(同物異名為木餾油真菌(Creosotefungus)或Amorphothecaresinae)的葡糖淀粉酶的CBM(SWISSPROTQ03045)，SEQIDNO13；來(lái)自Lentinulasp.，如來(lái)自Lentinulaedodes(shiitakemushroom)的CBM(SPTREMBLQ9P4C5)，SEQIDNO14；來(lái)自脈孢菌屬(Neurosporasp.)，如來(lái)自粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的CBM(SWISSPROTP14804)，SEQIDNO15；來(lái)自踝節(jié)菌屬，如來(lái)自Talaromycesbyssochlamydioides的CBM，SEQIDNO16；來(lái)自Geosmithiasp.，如來(lái)自Geosmithiacylindrospora的CBM，SEQIDNO17；來(lái)自Scoriassp.，如來(lái)自Scoriasspongiosa的CBM，SEQIDNO18；來(lái)自Eupenicilliumsp.，如來(lái)自Eupenicilliumludwigii的CBM，SEQIDNO19；來(lái)自曲霉屬，如來(lái)自日本曲霉(Asperigillusjaponicaus)的CBM，SEQIDNO20；來(lái)自青霉屬(Penicilliumsp.)，如來(lái)自Penicilliumcf.miczynskii的CBM，SEQIDNO21；來(lái)自Mzl青霉屬的CBM，SEQIDNO22；來(lái)自Thysanophorasp.的CBM，SEQIDNO23；來(lái)自腐質(zhì)霉屬(Humicolasp.)，如來(lái)自灰腐質(zhì)霉thermoidea變種(Humicolagriseavar.thermoidea)的CBM。最優(yōu)選的CBM包括在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/511044中公開(kāi)的CBM，如SEQIDNO24；來(lái)自曲霉屬，如來(lái)自黑曲霉的葡糖淀粉酶的CBM，而且如SEQIDNO25；來(lái)自Atheliasp.，如來(lái)自Atheliarolfsii的葡糖淀粉酶的CBM。本發(fā)明也優(yōu)選應(yīng)用任意CBM，其與上述提及的CBM氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或甚至至少90％同源性。所述疏松的CBMs可以以有效量應(yīng)用于所述的顆粒狀淀粉。材料和方法alpha-淀粉酶活性(KNU)所述的淀粉分解活性可以應(yīng)用馬鈴薯淀粉作為底物進(jìn)行測(cè)定。此方法基于通過(guò)酶破壞變性的馬鈴薯淀粉，而且所述的反應(yīng)之后將所述的淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合。起初，形成藍(lán)黑色，但是在破壞淀粉的過(guò)程中，藍(lán)色變?nèi)醵抑饾u變?yōu)樽丶t色，其與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)物相比。將1KiloNovoalpha淀粉酶單位(KNU)作為酶量的定義，其在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003MCa2+；和pH5.6)將5.26g淀粉干底物MerckAmylumsolubile轉(zhuǎn)化成糊精。更詳細(xì)地描述此分析方法的文件夾(folder)AF9/6，可根據(jù)要求從NovozymesA/S，Denmark得到，其文件夾在此包括作為參考。葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為其每分鐘在37℃和pH4.3水解1微摩爾麥芽糖的酶量。所述的活性通過(guò)根據(jù)(AEL-SM-0131，可根據(jù)要求從Novozymes得到)修改的方法測(cè)定為AGU/ml，應(yīng)用來(lái)自BoehringerMannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒。標(biāo)準(zhǔn)AMG-標(biāo)準(zhǔn)物，批號(hào)7-1195，195AGU/ml。將375μL底物(50mM乙酸鈉中的1％麥芽糖，pH4.3)在37℃溫育5分鐘。加入25μL稀釋于乙酸鈉中的酶。所述的反應(yīng)10分鐘后通過(guò)加入100μL0.25MNaOH而終止。將20μL轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板，并加入200μLGOD-Perid溶液(124036，BoeringerMannheim)。在室溫30分鐘后，在650nm測(cè)定吸光度，并且從AMG-標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算以AGU/ml表示的活性。更詳細(xì)地描述此分析方法的文件夾(AEL-SM-0131)，可根據(jù)要求從NovozymesA/S，Denmark得到，其文件夾在此包括作為參考。真菌alpha-淀粉酶活性(FAU)真菌alpha-淀粉酶活性可以以FAU(真菌Alpha-淀粉酶單位)測(cè)定。一個(gè)(1)FAU是在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即在37℃和pH4.7)，每小時(shí)破壞5260mg固體淀粉(Amylumsolubile，Merck)的酶量。更詳細(xì)地描述此FAU測(cè)定的文件夾AF9.1/3，可根據(jù)要求從NovozymesA/S，Denmark得到，其文件夾在此包括作為參考。酸性alpha-淀粉酶活性(AFAU)酸性alpha-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌alpha-淀粉酶單位)測(cè)定，其是相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定的。所述的標(biāo)準(zhǔn)物為AMG300L(來(lái)自NovozymesA/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉菌G1，也公開(kāi)于Boeletal.(1984)，EMBOJ.3(5)，p.1097-1102和WO92/00381中)。此AMG中的中性alpha-淀粉酶，在室溫貯藏3個(gè)星期之后，從大約1FAU/ml降低為0.05FAU/ml。此AMG標(biāo)準(zhǔn)物中的酸性alpha-淀粉酶活性根據(jù)如下描述進(jìn)行測(cè)定。此方法中，1AFAU定義為每小時(shí)在下述標(biāo)準(zhǔn)條件下降解5.26mg淀粉干物質(zhì)的酶量。碘與淀粉形成藍(lán)色復(fù)合物，但與淀粉的降解產(chǎn)物則不能形成。因此顏色的強(qiáng)度直接與淀粉的濃度成正比。淀粉酶活性在具體的分析條件下，應(yīng)用淀粉濃度的降低的反向比色法進(jìn)行測(cè)定。藍(lán)/紫t＝23秒脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件(每分鐘)底物可溶性淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M碘(I2)0.03g/LCaCl21.85mMpH2.50-0.05溫育溫度40℃反應(yīng)時(shí)間23秒波長(zhǎng)lambda＝590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更詳細(xì)地描述此分析方法的文件夾EB-SM-0259.02/01，可根據(jù)要求從NovozymesA/S，Denmark得到，而且并入作為參考。beta-淀粉酶活性(DP°)SPEZYME_BBA1500的活性表示為糖化力的程度(DegreeofDiastaticPower)(DP)。它是在0.1ml所述樣品酶制劑的5％溶液中含有的酶量，將所述的樣品與100ml的底物在20℃溫育1小時(shí)，所述樣品酶制劑可產(chǎn)生足夠的還原糖以還原5ml的費(fèi)林溶液(Fehling′ssolution)。支鏈淀粉酶活性(新支鏈淀粉酶單位Novo)(NPUN)支鏈淀粉酶活性可以相對(duì)于支鏈淀粉底物進(jìn)行測(cè)定。支鏈淀粉是線狀的D-葡萄糖聚合物，其主要由麥芽三糖基單位通過(guò)1，6-alpha-鍵連接組成。內(nèi)-支鏈淀粉酶隨機(jī)地水解1，6-alpha-鍵，釋放麥芽三糖、63-alpha-麥芽三糖基-麥芽三糖、63-alpha-(63-alpha-麥芽三糖基-麥芽三糖基)-麥芽三糖。一個(gè)新支鏈淀粉酶單位Novo(NPUN)是內(nèi)-支鏈淀粉酶活性的單位，并相對(duì)于NovozymesA/SPromozymeD標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)條件為在40℃和pH4.5反應(yīng)30分鐘，并以0.7％支鏈淀粉作為底物。紅色底物降解產(chǎn)物的量通過(guò)分光光度法在510nm測(cè)定，并與樣品中的內(nèi)-支鏈淀粉酶活性成比例。更詳細(xì)地描述此分析方法的文件夾(EB-SM.0420.02/01)，可根據(jù)要求從NovozymesA/S，Denmark得到，其文件夾在此包括作為參考。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，一個(gè)NPUN大約與釋放具有相當(dāng)于2.86μmole葡萄糖每分鐘的還原力的還原糖的酶量相等。測(cè)定糖分布(profile)和溶解的干固體所述淀粉水解產(chǎn)物的糖的組成通過(guò)HPLC進(jìn)行測(cè)定，并隨后計(jì)算葡萄糖產(chǎn)量為DX.°BRIX，所述淀粉水解產(chǎn)物的溶解的(可溶的)干固體通過(guò)折射率(refractiveindex)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。原料應(yīng)用如下的酶活性。具有CBD的細(xì)菌alpha-淀粉酶，其具有SEQIDNO19中描述的序列和同樣的但不具有所述CBD組件的細(xì)菌alpha-淀粉酶(SEQIDNO4)。源自黑曲霉菌的葡糖淀粉酶，其具有WO00/04136的SEQIDNO2中所示的氨基酸序列或所公開(kāi)的變體中的一個(gè)。源自黑曲霉菌的酸性真菌alpha-淀粉酶。小麥淀粉(S-5127)從Sigma-Aldrich得到。實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明，應(yīng)用細(xì)菌四組件alpha-淀粉酶和葡糖淀粉酶和酸性真菌淀粉酶，將顆粒狀小麥淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。具有33％干固體(DS)顆粒狀淀粉的漿體，通過(guò)在將247.5g小麥淀粉在攪拌的條件下加入502.5ml水中來(lái)進(jìn)行制備。所述的pH用HCl調(diào)節(jié)到4.5。將所述的顆粒狀淀粉漿體分配到100ml藍(lán)色加蓋搖瓶中，每個(gè)搖瓶中加75g。將所述的搖瓶用磁力攪拌在60℃水浴中保溫。在0小時(shí)，將表1中設(shè)定的酶活性配入所述的搖瓶中。在24、48、72和96小時(shí)后取樣。表1.采用的酶活性水平全部干固體淀粉應(yīng)用如下方法進(jìn)行測(cè)定。所述的淀粉通過(guò)加入過(guò)量的alpha-淀粉酶(300KNU/Kg干固體)并將所述的樣品在95℃油浴中放置45分鐘進(jìn)行完全地水解。隨后將所述的樣品冷卻到60℃，并加入過(guò)量的葡糖淀粉酶(600AGU/kgDS)，然后在60℃溫育2小時(shí)。所述的淀粉水解產(chǎn)物中可溶的干固體，通過(guò)檢測(cè)通過(guò)0.22microM過(guò)濾器過(guò)濾后的樣品的折射率進(jìn)行測(cè)定。所述的糖分布模式通過(guò)HPLC進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算葡萄糖的量為DX。所述的結(jié)果顯示在表2和表3中。表2.alpha-淀粉酶用量為100KNU/kgDS時(shí)，可溶的干固體占全部干物質(zhì)的百分比表3.alpha-淀粉酶用量為100KNU/kgDS時(shí)，所述可溶的水解產(chǎn)物的DX實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明，應(yīng)用葡糖淀粉酶和酸性真菌淀粉酶，將顆粒狀淀粉部分轉(zhuǎn)化為葡萄糖。制備含33％DS顆粒狀淀粉的搖瓶，并如實(shí)施例1中所述進(jìn)行溫育。在0小時(shí)，將表4中設(shè)定的酶活性配入所述的搖瓶中。在24、48、72和96小時(shí)后取樣。所述的樣品如實(shí)施例1中所述進(jìn)行分析。所述的結(jié)果顯示在表5和表6中。表4.采用的酶活性水平表5.可溶的干固體占全部干物質(zhì)的百分比表6.所述水解產(chǎn)物的DX實(shí)施例3在實(shí)施例3中，應(yīng)用葡糖淀粉酶(200AGU/kgDS)，酸性真菌淀粉酶(50AFAU/kgDS)和在實(shí)施例1中采用的完整的細(xì)菌四組件alpha-淀粉酶(SEQIDNO19)或同樣的但不具有所述CBD組件的細(xì)菌四組件alpha-淀粉酶(SEQIDNO4)(100KNU/kgDS)，進(jìn)行顆粒狀小麥淀粉向葡萄糖的轉(zhuǎn)化。制備含33％干固體(DS)顆粒狀淀粉的漿體，并如實(shí)施例1中所述進(jìn)行溫育。在24、46、70和90小時(shí)后取樣。全部干固體淀粉如實(shí)施例1中所述進(jìn)行測(cè)定。所述的淀粉水解產(chǎn)物中可溶的干固體和所述的糖分布如實(shí)施例1中所述進(jìn)行分析。所述的結(jié)果顯示在表7和表8中。表7.可溶的干固體占全部干物質(zhì)的百分比。酶葡糖淀粉酶、真菌酸性淀粉酶和具有所述CBD組件的細(xì)菌alpha-淀粉酶(SEQIDNO19)或不具有所述CBD組件的細(xì)菌alpha-淀粉酶(SEQIDNO4)。表8.所述可溶的水解產(chǎn)物的DX酶葡糖淀粉酶、真菌酸性淀粉酶和具有所述CBD組件的細(xì)菌alpha-淀粉酶(SEQIDNO19)或不具有所述CBD組件的細(xì)菌alpha-淀粉酶(SEQIDNO4)。序列表<110>諾維信公司(NovozymesA/S)<120>四域的alpha淀粉酶的冷液化(coldLiquefactionwithfour-domainalpha-amylase)<130>10473<160>22<170>PatentInversion3.2<210>1<211>102<212>PRT<213>黃熱芽孢桿菌(Bacillusflavothermus)<400>1IleSerThrThrSerGlnIleThrPheThrValAsnAsnAlaThrThr151015ValTrpGlyGlnAsnValTyrValValGlyAsnIleSerGlnLeuGly202530AsnTrpAspProValHisAlaValGlnMetThrProSerSerTyrPro354045ThrTrpThrValThrIleProLeuLeuGlnGlyGlnAsnIleGlnPhe505560LysPheIleLysLysAspSerAlaGlyAsnValIleTrpGluAspIle65707580SerAsnArgThrTyrThrValProThrAlaAlaSerGlyAlaTyrThr859095AlaSerTrpAsnValPro100<210>2<211>99<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)<400>2ThrSerAsnValThrPheThrValAsnAsnAlaThrThrValTyrGly151015GlnAsnValTyrValValGlyAsnIleProGluLeuGlyAsnTrpAsn202530IleAlaAsnAlaIleGlnMetThrProSerSerTyrProThrTrpLys354045ThrThrValSerLeuProGlnGlyLysAlaIleGluPheLysPheIle505560LysLysAspSerAlaGlyAsnValIleTrpGluAsnIleAlaAsnArg65707580ThrTyrThrValProPheSerSerThrGlySerTyrThrAlaAsnTrp859095AsnValPro<210>3<211>102<212>PRT<213>AlcaliphilicBacillus<400>3ThrSerThrThrSerGlnIleThrPheThrValAsnAsnAlaThrThr151015ValTrpGlyGlnAsnValTyrValValGlyAsnIleSerGlnLeuGly202530AsnTrpAspProValAsnAlaValGlnMetThrProSerSerTyrPro354045ThrTrpValValThrValProLeuProGlnSerGlnAsnIleGlnPhe505560LysPheIleLysLysAspGlySerGlyAshValIleTrpGluAsnIle65707580SerAsnArgThrTyrThrValProThrAlaAlaSerGlyAlaTyrThr859095AlaAsnTrpAsnValPro100<210>4<211>484<212>PRT<213>黃熱芽孢桿菌(Bacillusflavothermus)<400>4GlySerValProValAsnGlyThrMetMetGlnTyrPheGluTrpTyr151015LeuProAspAspGlyThrLeuTrpThrLysValAlaAsnAsnAlaGln202530SerLeuAlaAsnLeuGlyIleThrAlaLeuTrpLeuProProAlaTyr354045LysGlyThrSerSerSerAspValGlyTyrGlyValTyrAspLeuTyr505560AspLeuGlyGluPheAsnGlnLysGlyThrValArgThrLysTyrGly65707580ThrLysThrGlnTyrIleGlnAlaIleGlnAlaAlaHisThrAlaGly859095MetGlnValTyrAlaAspValValPheAsnHisLysAlaGlyAlaAsp100105110GlyThrGluLeuValAspAlaValGluValAsnProSerAspArgAsn115120125GlnGluIleSerGlyThrTyrGlnIleGlnAlaTrpThrLysPheAsp130135140PheProGlyArgGlyAsnThrTyrSerSerPheLysTrpArgTrpTyr145150155160HisPheAspGlyThrAspTrpAspGluSerArgLysLeuAsnArgIle165170175TyrLysPheArgGlyThrGlyLysAlaTrpAspTrpGluValAspThr180185190GluAsnGlyAsnTyrAspTyrLeuMetTyrAlaAspLeuAspMetAsp195200205HisProGluValValSerGluLeuLysAsnTrpGlyLysTrpTyrVal210215220ThrThrThrAsnIleAspGlyPheArgLeuAspAlaValLysHisIle225230235240LysTyrSerPhePheProAspTrpLeuSerTyrValArgThrGlnThr245250255GlnLysProLeuPheAlaValGlyGluPheTrpSerTyrAspIleSer260265270LysLeuHisAsnTyrIleThrLysThrAsnGlySerMetSerLeuPhe275280285AspAlaProLeuHisAsnAsnPheTyrIleAlaSerLysSerGlyGly290295300TyrPheAspMetArgThrLeuLeuAsnAsnThrLeuMetLysAspGln305310315320ProThrLeuAlaValThrLeuValAspAsnHisAspThrGluProGly325330335GlnSerLeuGlnSerTrpValGluProTrpPheLysProLeuAlaTyr340345350AlaPheIleLeuThrArgGlnGluGlyTyrProCysValPheTyrGly355360365AspTyrTyrGlyIleProLysTyrAsnIleProAlaLeuLysSerLys370375380LeuAspProLeuLeuIleAlaArgArgAspTyrAlaTyrGlyThrGln385390395400HisAspTyrIleAspSerAlaAspIleIleGlyTrpThrArgGluGly405410415ValAlaGluLysAlaAsnSerGlyLeuAlaAlaLeuIleThrAspGly420425430ProGlyGlySerLysTrpMetTyrValGlyLysGlnHisAlaGlyLys435440445ThrPheTyrAspLeuThrGlyAsnArgSerAspThrValThrIleAsn450455460AlaAspGlyTrpGlyGluPheLysValAsnGlyGlySerValSerIle465470475480TrpValProLys<210>5<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)<400>5AlaAsnThrAlaProValAsnGlyThrMetMetGlnTyrPheGluTrp151015AspLeuProAsnAspGlyThrLeuTrpThrLysValLysAsnGluAla202530SerSerLeuSerAlaLeuGlyIleThrAlaLeuTrpLeuProProAla354045TyrLysGlyThrSerGlnAlaAspValGlyTyrGlyValTyrAspLeu505560TyrAspLeuGlyGluPheAsnGlnLysGlyThrIleArgThrLysTyr65707580GlyThrLysThrGlnTyrLeuGlnAlaIleGlnAlaAlaLysSerAla859095GlyMetGlnValTyrAlaAspValValPheAsnHisLysAlaGlyAla100105110AspSerThrGluTrpValAspAlaValGluValAsnProSerAsnArg115120125AsnGlnGluThrSerGlyThrTyrGlnIleGlnAlaTrpThrLysPhe130135140AspPheProGlyArgGlyAsnThrTyrSerSerPheLysTrpArgTrp145150155160TyrHisPheAspGlyThrAspTrpAspGluSerArgLysLeuAsnArg165170175IleTyrLysPheArgGlyThrGlyLysAlaTrpAspTrpGluValAsp180185190ThrGluAsnGlyAsnTyrAspTyrLeuMetPheAlaAspLeuAspMet195200205AspHisProGluValValAlaGluLeuLysAsnTrpGlyLysTrpTyr210215220ValAsnThrThrAsnValAspGlyPheArgLeuAspAlaValLysHis225230235240IleLysTyrSerPhePheProAspTrpLeuSerTyrValArgAsnGln245250255ThrGlyLysAsnLeuPheAlaValGlyGluPheTrpGlyTyrAspVal260265270AsnLysLeuHisAsnTyrIleThrLysThrAsnGlyAlaMetSerLeu275280285PheAspAlaProLeuHisAsnAsnPheTyrIleAlaSerLysSerSer290295300GlyTyrPheAspMetArgTyrLeuLeuAsnAsnThrLeuMetLysAsp305310315320GlnProAlaLeuAlaValThrLeuValAspAsnHisAspThrGlnPro325330335GlyGlnSerLeuGlnSerTrpValGluProTrpPheLysProLeuAla340345350TyrAlaPheIleLeuThrArgGlnGluGlyTyrProCysValPheTyr355360365GlyAspTyrTyrGlyIleProLysTyrAsnIleProGlyLeuLysSer370375380LysIleAspProLeuLeuIleAlaArgArgAspTyrAlaTyrGlyThr385390395400GlnArgAspTyrIleAspHisGlnAspIleIleGlyTrpThrArgGlu405410415GlyIleAspAlaLysProAsnSerGlyLeuAlaAlaLeuIleThrAsp420425430GlyProGlyGlySerLysTrpMetTyrValGlyLysArgHisAlaGly435440445LysValPheTyrAspLeuThrGlyAsnArgSerAspThrValThrIle450455460AsnAlaAspGlyTrpGlyGluPheLysValAsnGlyGlySerValSer465470475480IleTrpValAlaLys485<210>6<211>484<212>PRT<213>Alkaliphilicbacillus<400>6GlySerValProValAsnGlyThrMetMetGlnTyrPheGluTrpTyr151015LeuProAspAspGlyThrLeuTrpThrLysValAlaAsnAsnAlaGln202530SerLeuAlaAsnLeuGlyIleThrAlaLeuTrpLeuProProAlaTyr354045LysGlyThrSerSerSerAspValGlyTyrGlyValTyrAspLeuTyr505560AspLeuGlyGluPheAsnGlnLysGlyThrValArgThrLysTyrGly65707580ThrLysThrGlnTyrIleGlnAlaIleGlnAlaAlaHisThrAlaGly859095MetGlnValTyrAlaAspValValPheAsnHisLysAlaGlyAlaAsp100105110GlyThrGluLeuValAspAlaValGluValAsnProSerAspArgAsn115120125GlnGluIleSerGlyThrTyrGlnIleGlnAlaTrpThrLysPheAsp130135140PheProGlyArgGlyAsnThrTyrSerSerPheLysTrpArgTrpTyr145150155160HisPheAspGlyThrAspTrpAspGluSerArgLysLeuAsnArgIle165170175TyrLysPheArgGlyThrGlyLysAlaTrpAspTrpGluValAspThr180185190GluAsnGlyAsnTyrAspTyrLeuMetTyrAlaAspLeuAspMetAsp195200205HisProGluValValSerGluLeuLysAsnTrpGlyLysTrpTyrVal210215220IleThrThrAsnIleAspGlyPheArgLeuAspAlaValLysHisIle225230235240LysTyrSerPhePheProAspTrpLeuSerTyrLeuArgThrGlnThr245250255GlnLysProLeuPheAlaValGlyGluPheTrpSerTyrAspIleAsn260265270LysLeuHisAsnTyrIleThrLysThrAsnGlySerMetSerLeuPhe275280285AspAlaProLeuHisAsnAsnPheTyrIleAlaSerLysSerGlyGly290295300TyrPheAspMetArgThrLeuLeuAsnAsnThrLeuMetLysGluGln305310315320ProThrLeuSerValThrLeuValAspAsnHisAspThrGluProGly325330335GlnSerLeuGlnSerTrpValGluProTrpPheLysProLeuAlaTyr340345350AlaPheIleLeuThrArgGlnGluGlyTyrProCysValPheTyrGly355360365AspTyrTyrGlyIleProLysTyrAsnIleProAlaLeuLysSerLys370375380LeuAspProLeuLeuIleAlaArgArgAspTyrAlaTyrGlyThrGln385390395400HisAspTyrIleAspAsnAlaAspIleIleGlyTrpThrArgGluGly405410415ValAlaGluLysAlaAsnSerGlyLeuAlaAlaLeuIleThrAspGly420425430ProGlyGlySerLysTrpMetTyrValGlyLysGlnHisAlaGlyLys435440445ThrPheTyrAspLeuThrGlyAsnArgSerAspThrValThrIleAsn450455460AlaAspGlyTrpGlyGluPheLysValAsnGlyGlySerValSerIle465470475480TrpValProLys<210>7<211>517<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)<400>7MetSerLeuPheLysLysIlePheProTrpIleLeuSerLeuLeuLeu151015LeuPheLeuPheIleAlaProPheSerIleGlnThrGluLysValArg202530AlaGlySerValProValAsnGlyThrMetMetGlnTyrPheGluTrp354045TyrLeuProAspAspGlyThrLeuTrpThrLysValAlaAsnAsnAla505560GlnSerLeuAlaAsnLeuGlyIleThrAlaLeuTrpLeuProProAla65707580TyrLysGlyThrSerSerSerAspValGlyTyrGlyValTyrAspLeu859095TyrAspLeuGlyGluPheAsnGlnLysGlyThrValArgThrLysTyr100105110GlyThrLysThrGlnTyrIleGlnAlaIleGlnAlaAlaHisThrAla115120125GlyMetGlnValTyrAlaAspValValPheAsnHisLysAlaGlyAla130135140AspGlyThrGluLeuValAspAlaValGluValAsnProSerAspArg145150155160AsnGlnGluIleSerGlyThrTyrGlnIleGlnAlaTrpThrLysPhe165170175AspPheProGlyArgGlyAsnThrTyrSerSerPheLysTrpArgTrp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nArgGluTyrThrVal610615620ProGluCysGlySerGlySerGlyGluThrValValAspThrTrpArg625630635640權(quán)利要求1.制備可溶的淀粉水解產(chǎn)物的方法，所述方法包括將水性的顆粒狀淀粉漿體在低于所述顆粒狀淀粉的初始凝膠化溫度的溫度，與第一種酶和第二種酶作用，其中第一種酶；(a)是所述的糖苷水解酶家族13的成員；(b)具有alpha-1，4-糖苷水解活性，和；(c)包括屬于CBM家族20的功能的糖-結(jié)合組件(CBM)，其中CBM具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少60％同源性；而其中第二種酶選自包括真菌alpha-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、beta-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的列表。2.前述權(quán)利要求的方法，其中所述的alpha-淀粉酶包括功能的糖-結(jié)合組件，其與選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。3.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的alpha-淀粉酶包括氨基酸序列，其與選自SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。4.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的alpha-淀粉酶包括氨基酸序列，其與選自SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21或SEQIDNO22的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。5.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的淀粉漿體具有20-55％干固體顆粒狀淀粉，優(yōu)選25-40％干固體顆粒狀淀粉，更優(yōu)選30-35％干固體顆粒狀淀粉，尤其大約33％干固體顆粒狀淀粉。6.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中至少85％、86％、87％、88％、89％、至少90％、91％、92％、93％94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的所述顆粒狀淀粉的干固體被轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解產(chǎn)物。7.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其包括將所述的顆粒狀淀粉漿體與異淀粉酶和/或支鏈淀粉酶反應(yīng)。8.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的溫度至少58℃、59℃或更優(yōu)選至少60℃。9.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的pH在3.0-7.0的范圍，優(yōu)選3.5-6.0，或更優(yōu)選4.0-5.0。10.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的可溶的淀粉水解產(chǎn)物具有至少94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或至少99.5％的DX。11.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的顆粒狀淀粉是從根莖、根、莖或整粒谷物中得到的。12.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的顆粒狀淀粉是從谷類(lèi)得到的。13.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的顆粒狀淀粉是從玉米、穗軸、小麥、大麥、黑麥、蜀黍類(lèi)、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻米或馬鈴薯中得到的。14.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的顆粒狀淀粉是從整粒谷物的干磨物或從整粒谷物的濕磨物或從磨碎的粗玉米粉中得到的。15.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的方法在超濾系統(tǒng)中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。16.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的方法在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流條件下保留，并且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。17.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述的方法在具有微濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，而且其中所述的滲余物在酶、生淀粉和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是可溶的淀粉水解產(chǎn)物。18.制備基于高果糖淀粉糖漿(HFSS)的方法，其中任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化成為基于高果糖淀粉糖漿(HFSS)，諸如高果糖漿(HFCS)。19.制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)發(fā)酵成為發(fā)酵產(chǎn)物，諸如檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸delta內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮類(lèi)；氨基酸，谷氨酸(單谷氨酸鈉)、青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，如核黃素、B12、beta-胡蘿卜素或激素。20.制備燃料乙醇或飲料乙醇的方法，其中權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法的可溶的淀粉水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)發(fā)酵成為乙醇。21.前述權(quán)利要求的方法，其中所述的發(fā)酵步驟同時(shí)或分別地/依次地進(jìn)行所述顆粒狀淀粉的水解。22.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述的過(guò)程在超濾系統(tǒng)中實(shí)施，其中所述的滲余物在酶、生淀粉、酵母、酵母營(yíng)養(yǎng)素和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是含有乙醇的液體。23.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述的過(guò)程在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中實(shí)施，其中所述的滲余物在酶、生淀粉、酵母、酵母營(yíng)養(yǎng)素和水存在的回流條件下保留，而且其中所述的滲透物是含有乙醇的液體。24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法，其中將所述的淀粉漿體與包括CBM但無(wú)催化組件的多肽接觸，即疏松的CBM。25.具有alpha-淀粉酶活性的酶在淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含功能的CBM，其具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少60％同源性。26.具有alpha-淀粉酶活性的酶在顆粒狀淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。27.具有alpha-淀粉酶活性和功能的CBM的酶在顆粒狀淀粉水解的方法中的用途，所述的酶包含氨基酸序列，所述的氨基酸序列與選自SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21或SEQIDNO22的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、如至少99％同源性。全文摘要本發(fā)明涉及將顆粒狀淀粉在低于所述顆粒狀淀粉的初始凝膠化溫度的溫度，酶法水解為可溶的淀粉水解產(chǎn)物的方法。文檔編號(hào)C12P19/16GK1813068SQ200480018005公開(kāi)日2006年8月2日申請(qǐng)日期2004年6月25日優(yōu)先權(quán)日2003年6月25日發(fā)明者安德斯·維克索尼爾森,卡斯滕·安德森,斯文·佩德森,卡斯滕·約爾特申請(qǐng)人:諾維信公司