專利名稱：用于精子染色的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明總體上涉及能分離精子用于產(chǎn)生性別富集的精子的染色方法。
通過人工授精(AI)的動(dòng)物受精及體外受精后的胚胎移植是已經(jīng)建立的方法。在家畜生產(chǎn)工業(yè)中，影響具有一種或多種目的特征的后代的繁殖結(jié)果具有明顯益處。以舉例方式，在乳品工業(yè)中預(yù)選擇雌性后代以保證乳牛的產(chǎn)生是有經(jīng)濟(jì)利益的。將精子分離為攜帶X及Y染色體細(xì)胞的富集群，也稱為性別富集的精液或性別富集的精子，是獲得預(yù)選擇后代的一種方法。
Johnson等人(美國(guó)專利號(hào)5,135,759)描述了根據(jù)DNA含量，用流式細(xì)胞儀/細(xì)胞分選器將攜帶完全X及Y染色體的精子群分離為攜帶X染色體的精子的富集群及攜帶Y染色體的精子富集群。如描述的，將精子與DNA選擇性染料于30至39℃的溫度混合1小時(shí)(39℃)至1.5小時(shí)(30℃)。然后當(dāng)精子通過激光束時(shí)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)出的熒光量。由于根據(jù)物種的不同，攜帶X染色體的精子包含的DNA多于攜帶Y染色體的精子大約3至5％，攜帶X染色體的精子產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高于攜帶Y染色體的精子。包含預(yù)定熒光強(qiáng)度的單種精子的小滴帶電荷并通過靜電作用偏轉(zhuǎn)到收集容器中，然后將收集的性別富集精子群用于顯微注射或人工授精。
Seidel等人(WO 02/43574)也描述了用流式細(xì)胞儀將精子分離為攜帶X及Y染色體細(xì)胞的性別富集群。Seidel等人描述了在30℃及40℃之間的溫度對(duì)細(xì)胞染色。
Didion等人(WO 02/41906)描述了在約17℃至30℃的溫度對(duì)精細(xì)胞染色。根據(jù)Didion等人的描述，這些染色溫度避免了在較高溫度染色可導(dǎo)致的某些作用，如降低精子活力及功效。此外，認(rèn)為在分選期間，較低溫度染色對(duì)精子定向具有有益作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的多個(gè)方面提供了對(duì)精細(xì)胞染色的相對(duì)快速及有效的方法，并且提供了攝取染料所需時(shí)間減少的方法，因此減少了收集精液及產(chǎn)生攜帶X及Y染色體的精細(xì)胞的性別富集群之間消耗的時(shí)間。
簡(jiǎn)而言之，因此本發(fā)明涉及用于精細(xì)胞染色的方法，此方法包括形成包含完整活精細(xì)胞及DNA選擇性熒光染料的染色混合物，以及將染色混合物置于至少約40℃的溫度。
本發(fā)明的其它方面部分是顯然的，且部分在下文中指出。
附圖簡(jiǎn)述
圖1A-1D圖示了實(shí)施例1中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及41℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖2A-2D圖示了實(shí)施例2中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及41℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖3A-3D圖示了實(shí)施例3中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及43℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖4A及4B圖示了實(shí)施例4中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及43℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖5A及5B圖示了實(shí)施例5中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及45℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖6A及6B圖示了實(shí)施例6中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了對(duì)精子在39℃及47℃用不同濃度Hoechst 33342染料染色的熒光強(qiáng)度。
圖7A及7B圖示了實(shí)施例7中研究的結(jié)果，其中測(cè)定了于39℃及43℃對(duì)未染色或用60μM Hoechst 33342染料染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)(％motility)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)(％progressive motility)。
圖8A及8B圖示了實(shí)施例8中研究的結(jié)果，其中于39℃及45℃對(duì)未染色或用60μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖9A-9C圖示了實(shí)施例9中研究的結(jié)果，其中于41℃、43℃及45℃對(duì)未染色或用80μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖10A-10C圖示了實(shí)施例10中研究的結(jié)果，其中于41℃、43℃及45℃對(duì)未染色或用100μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖11圖示了實(shí)施例11中研究的結(jié)果，其中于47℃對(duì)未染色或用100μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖12圖示了實(shí)施例12中研究的結(jié)果，其中于49℃對(duì)未染色或用100μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖13A及13B圖示了實(shí)施例13中研究的結(jié)果，其中于43℃對(duì)未染色、用125μM Hoechst 33342染料或用150μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖14A及14B圖示了實(shí)施例14中研究的結(jié)果，其中于43℃對(duì)未染色、用200μM Hoechst 33342染料或用250μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖15A及15B圖示了實(shí)施例15中研究的結(jié)果，其中于45℃對(duì)未染色、用125μM Hoechst 33342染料或用150μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖16A-16C圖示了實(shí)施例16中研究的結(jié)果，其中于45℃對(duì)未染色、用200μM Hoechst 33342或用250μM Hoechst 33342對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖17A-17C圖示了實(shí)施例17中研究的結(jié)果，其中于43℃對(duì)未染色、用300μM Hoechst 33342、用350μM Hoechst 33342或用400μM Hoechst33342對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖18A-18C圖示了實(shí)施例18中研究的結(jié)果，其中于43℃對(duì)未染色、用0.6μM SYBR 14、用6.0μM SYBR 14或用60μM SYBR 14對(duì)精子染色的精子活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)及前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖19A-19B圖示了實(shí)施例19中研究的結(jié)果，其中于39℃和45℃對(duì)用100μM雙苯甲亞胺(bisbenzimide)-BODIPY綴合物(BBC)或6μM SYBR14對(duì)精子染色的精子熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。
圖20圖示了實(shí)施例20中研究的結(jié)果，其中于41℃用在TCA緩沖液或在含10mM丙酮酸的TCA緩沖液中的400μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖21圖示了實(shí)施例21中研究的結(jié)果，其中于41℃用在TCA緩沖液或在含10μM維生素K的TCA緩沖液中的400μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖22圖示了實(shí)施例22中研究的結(jié)果，其中于41℃用在TCA緩沖液或在含100μM維生素K的TCA緩沖液中的400μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖23圖示了實(shí)施例23中研究的結(jié)果，其中于41℃用在TCA緩沖液或在含1mM硫辛酸的TCA緩沖液中的400μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色的精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖24圖示了實(shí)施例24中研究的結(jié)果，其中于41℃用在包含10mM丙酮酸的TCA中的300μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色且然后用含10mM丙酮酸的TCA或pH 6.2的基于碳酸鹽的抑制劑稀釋3倍后，對(duì)精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖25圖示了實(shí)施例24中研究的結(jié)果，其中于41℃用在(1)包含10mM丙酮酸的TCA中的300μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色且然后用相同緩沖液稀釋3倍的TCA或(2)用在pH7.3的基于碳酸鹽的緩沖液中的300μM Hoechst 33342染料對(duì)精子染色且然后用pH 6.2的基于碳酸鹽的抑制劑稀釋3倍后，對(duì)精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
圖26圖示了實(shí)施例24中研究的結(jié)果，其中于41℃用在包含10mM丙酮酸的TCA中或pH 6.2的基于碳酸鹽的抑制劑中的300μM Hoechst33342染料對(duì)精子染色的精子前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述令人驚訝的是，已經(jīng)確定了在較高溫度即在40℃以上的溫度對(duì)細(xì)胞染色所需的時(shí)間低于在較低溫度對(duì)細(xì)胞染色所需的時(shí)間，可用染料對(duì)精細(xì)胞染色用于流式細(xì)胞儀方法，而對(duì)精細(xì)胞的活力沒有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少41℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少42℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少43℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少44℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少45℃的溫度暴露于染料。然而，通常將精細(xì)胞暴露于遠(yuǎn)高于45℃以上的溫度并經(jīng)歷一段有效時(shí)間段可有害地影響細(xì)胞成活力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少41℃但不超過50℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少41℃但不超過48℃的溫度暴露于染料。在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少41℃但不超過47℃的溫度暴露于染料。例如，在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少42℃但不超過47℃的溫度暴露于染料。通過進(jìn)一步舉例的方式，在另一目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，精細(xì)胞于至少43℃但不超過45℃的溫度暴露于染料。
本發(fā)明的方法可用于對(duì)牛、豬、馬或其它哺乳動(dòng)物的完整、活精細(xì)胞染色，所述精細(xì)胞來自新鮮獲得精子樣本或來自解凍的深低溫保藏精子樣本。多種收集活精子的方法是已知的并且包括例如人造陰道法或帶手套法。取決于物種及物種內(nèi)的具體動(dòng)物，一般每毫升牛精子樣本包含約5億至約50億個(gè)精細(xì)胞。
大體上，根據(jù)本發(fā)明的一方面，通過形成包含精細(xì)胞及DNA選擇性染料的染色混合物對(duì)精細(xì)胞染色。精細(xì)胞對(duì)滲透壓及pH的顯著變化有些敏感。為降低對(duì)精子成活力的影響，因此，一般優(yōu)選考慮此類因素而形成的染色混合物。與此類考慮因素一致，染色混合物可以多種方式形成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，純精子與DNA選擇性染料組合。因此例如以純固體形式的染料，包括自由流動(dòng)粉末或液體組合物可與純精子組合。備選地，染料溶解或分散的非經(jīng)緩沖液體可與純精子組合。然而，在每種此類方法中，一般優(yōu)選對(duì)于純精子不引起精子受到足可本質(zhì)上有害影響它們成活力的滲透壓或pH顯著改變的染色混合物。
在另一實(shí)施方案中，純精子與緩沖液體組合，染料在所述緩沖液體中溶解或分散以形成染色混合物。有益地，對(duì)于純精子而言，緩沖液有助于避免任何足可本質(zhì)上有害影響它們成活力的作為形成混合物后果的滲透壓或pH顯著變化。
在另一實(shí)施方案中，精子源與緩沖液組合以形成精子懸液且精子懸液其后與染料組合以形成染色混合物。在與染料接觸前將精細(xì)胞懸浮在經(jīng)緩沖液體中可有益地保護(hù)精細(xì)胞免于受加入染料而導(dǎo)致的pH及滲透壓的顯著變化。在本實(shí)施方案中，精子源可為純精子。備選地，精子源可為通過離心獲得或應(yīng)用其它將精子分離為級(jí)分的方法獲得的包含精子的精液衍生物。
在另一實(shí)施方案中，DNA選擇性染料與緩沖液組合或作為緩沖液配方的一部分而包括，從而形成緩沖的染料溶液。因此，例如，純固體形式的染料(包括自由流動(dòng)粉劑)或液體組合物可與緩沖液或緩沖液配方的任何組分組合，然后再將各組分組合，以形成緩沖的染料溶液，所述緩沖的溶液然后可與純精液或精子懸液組合。
可單一應(yīng)用或組合應(yīng)用多種生物學(xué)緩沖液以保護(hù)精細(xì)胞免受pH及滲透壓的顯著變化。一般地，此類緩沖液濃度約為0.001M至約1.0M且pH在約4.5至約8.5之間。常見的生物學(xué)緩沖液包括例如磷酸鹽、二磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及乳酸鹽。此類緩沖液也可包含營(yíng)養(yǎng)源，例如糖和/或抗生素，如鏈霉素。優(yōu)選的緩沖液包括TCA、TEST、檸檬酸鈉、TL及HEPES。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將精液樣本用表I中描述的一種或多種緩沖溶液稀釋。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I所述組分的TCA#1緩沖液稀釋。在另一實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I所述組分的TCA#2緩沖液稀釋。在另一實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I中所述組分的TEST緩沖液稀釋。在另一實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I所述組分的檸檬酸鈉緩沖溶液稀釋。又在另一實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I所述組分的TL緩沖溶液稀釋。在另一實(shí)施方案中，精液樣本用具有表I所述組分的HEPES緩沖溶液稀釋。又在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞可用每25mL純水中包含0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3及0.473g C6H8O7·H2O的緩沖溶液稀釋(水中含0.097摩爾/升NaHCO3、0.173摩爾/升KHCO3、0.090摩爾/升C6H8O7·H2O)以形成精子懸液。
表I
應(yīng)用的緩沖液的量一般取決于幾個(gè)因素，例如，染色混合物中的特定緩沖液及目的精子濃度(個(gè)精子/毫升)。因此，應(yīng)用足量的緩沖液以獲得個(gè)精子/毫升的目的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含低于純精液樣本中精子濃度的精子懸液。在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約1×106個(gè)精子/毫升至約5×109個(gè)精子/毫升的精子懸液。在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含約200×106個(gè)精子/毫升以下的精子懸液。又在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約1×106個(gè)精子/毫升至約200×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。又在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約20×106個(gè)精子/毫升至約200×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約30×106個(gè)精子/毫升至約175×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。又在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約50×106個(gè)精子/毫升至約150×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。又在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含自約100×106個(gè)精子/毫升至約150×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。又在另一實(shí)施方案中，加入緩沖液以獲得包含約150×106個(gè)精子/毫升的精子懸液。
對(duì)染色混合物中染料濃度進(jìn)行選擇以使足量染料與DNA結(jié)合以將攜帶X及Y染色體的精子分選為性別富集群。此外，優(yōu)選在合理短時(shí)期中足可提供對(duì)精子定量染色而不會(huì)有意影響細(xì)胞成活力的染料濃度。對(duì)特定應(yīng)用而言，影響目的濃度的因素包括染料性質(zhì)、染色混合物中精子濃度、染色混合物的pH、允許精細(xì)胞攝入染料的時(shí)間及在攝入期間的溫度。但是通常染色混合物中的染料濃度一般為任何濃度范圍，一般約0.1μM至約1000μM之間。例如，染料的濃度可維持“相對(duì)低”的濃度范圍，即約0.1μM至約250μM濃度；在本實(shí)施方案中，濃度優(yōu)選自約100μM至約200μM，更優(yōu)選約100μM，又更優(yōu)選約200μM，且甚至更優(yōu)選約150μM。備選地，染料濃度維持在“中間”濃度范圍，即約250μM至約700μM的濃度；在本實(shí)施方案中，濃度優(yōu)選自約300μM至約700μM，更優(yōu)選約300μM，又更優(yōu)選約400μM，且甚至更優(yōu)選約600μM。此外，染料的濃度可維持在“相對(duì)高”濃度范圍，即濃度約700μM至約1000μM；在本實(shí)施方案中，濃度優(yōu)選自約800μM至約1000μM，更優(yōu)選約800μM，又更優(yōu)選約900μM，且甚至更優(yōu)選約1000μM。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，染料濃度為約100μM至約200μM。在另一實(shí)施方案中，染料濃度為約10μM至約100μM。在另一實(shí)施方案中，染料濃度為約20μM至約80μM。又在另一實(shí)施方案中，染色混合物中染料濃度為約20μM至約60μM。此外，已報(bào)道對(duì)大部分物種染色的最佳濃度報(bào)道為約每150×106個(gè)精子為約40μg，即大約為70μM。參見，例如L.A.Johnson和Glenn Welch，Theriogenology(1999)。
染色混合物的pH優(yōu)選維持在約6.0至約8.0的范圍。更優(yōu)選地，染色混合物的pH保持在約7.1至約7.6的范圍。又更優(yōu)選地，染色混合物的pH保持在約7.3至7.4的范圍。又更優(yōu)選地，染色混合物的pH保持在約7.35。
某些染料能通透精細(xì)胞并特異結(jié)合DNA而不需進(jìn)一步干涉以增加細(xì)胞的通透性。然而，對(duì)另一些染料，在染色前處理精子以增加通透速率而不會(huì)令人不能接受地使成活力或活動(dòng)能力降低是令人希望的。可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法。此類方法包括電穿孔、應(yīng)用細(xì)胞通透增強(qiáng)溶液，例如溫和表面活性劑或化學(xué)沖擊。當(dāng)應(yīng)用其它或更嚴(yán)格技術(shù)是令人希望的或有益的時(shí)，此類處理可包括應(yīng)用脂質(zhì)體或以本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用的許多技術(shù)將染色劑、染料、基因或載體導(dǎo)入到活細(xì)胞中。這些方法包括但不限于如通過Gordon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，1980)應(yīng)用并自此之后擴(kuò)展到兔、綿羊、牛及豬的顯微注射；DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移；磷酸鈣共沉淀及其它技術(shù)，所有所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。又在其它情況下，離心精子并在其它培養(yǎng)基中重新懸浮經(jīng)離心精子可是令人希望的，然而可基于相同或基本上相同的緩沖液系統(tǒng)以去除某些可干擾以后加工步驟的某些組分(所述某些組分之前可能已加至精子懸液)。
允許染色混合物中精細(xì)胞攝取染料持續(xù)足可獲得目的程度DNA染色的一段時(shí)間。大體上，攝入期在約1分鐘至160分鐘之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，攝入期低于90分鐘。在另一實(shí)施方案中，攝入期低于60分鐘。在另一實(shí)施方案中，攝入期低于40分鐘。在另一實(shí)施方案中，攝入期低于25分鐘。如以前談及的，攝入期多少取決于一系列其它參數(shù)，包括攝取溫度、染料性質(zhì)及染料濃度。在某些實(shí)施方案中，攝入期為約2分鐘至約25分鐘。又在其它實(shí)施方案中，攝入期為約5分鐘至20分鐘。又在其它實(shí)施方案中，攝入期為約2分鐘至約10分鐘。在其它實(shí)施方案中，攝入期為約2分鐘以下。
在整個(gè)攝入期或部分?jǐn)z入期，染色混合物處于本發(fā)明的升高溫度。因此，例如染色混合物可在40℃以上維持約攝入期的至少1％、5％、10％、20％或甚至更高百分率。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色混合物的溫度在攝入期升高。在另一實(shí)施方案中，染色混合物的溫度在攝入期降低。然而，在每一這些實(shí)施方案中，對(duì)溫度變化的速率進(jìn)行控制以優(yōu)選避免對(duì)精細(xì)胞成活力的任何顯著負(fù)面影響。
在任何情況下，攝入期足可使染料與DNA結(jié)合以致可基于攜帶X及Y染色體的精子之間不同及可測(cè)定的熒光強(qiáng)度對(duì)攜帶X及Y染色體的精細(xì)胞進(jìn)行分選。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色程度足可允許基于攜帶X及Y染色體的精子各自的熒光而對(duì)攜帶X及Y染色體的精子區(qū)別分選為至少約60％純度的X及Y群。染色程度優(yōu)選足可允許基于攜帶X及Y染色體的精子各自的熒光而將攜帶X及Y染色體的精子區(qū)別分選為至少約70％純度的攜帶X及Y染色體的精子群，更優(yōu)選至少約80％純度，甚至更優(yōu)選至少約85％純度，且又更優(yōu)選至少約90％純度。
一旦與DNA結(jié)合并用UV或可見光激發(fā)，本發(fā)明所述染料發(fā)出熒光。在一個(gè)實(shí)施方案中，染料為用紫外線輻射激發(fā)發(fā)出熒光的染料。此類染料包括例如雙苯甲亞胺如Hoechst 33342及Hoechst 33258，每種所述染料可自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商品化獲得。有益地，例如，Hoechst 33342具有低毒性，足夠的細(xì)胞通透性，對(duì)DNA特異，與DNA結(jié)合后可大大增強(qiáng)熒光，且在熒光強(qiáng)度和給定細(xì)胞或樣本中存在的DNA量之間表現(xiàn)出線性關(guān)系。
在另一實(shí)施方案中，染料為用可見光激發(fā)后發(fā)出熒光的染料。此類染料包括例如可見光可激發(fā)染料，自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)可商業(yè)獲得的SYBR-14及在WO 02/41906中描述的雙苯甲亞胺-BODIPY綴合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙?；鵠氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-雙苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙?；?氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，染料可通過與另一部分結(jié)合進(jìn)行修飾。例如，根據(jù)本發(fā)明的特定方面，雙苯甲亞胺(雙苯并咪唑)可通過加入熒光團(tuán)進(jìn)行修飾，通過可見光激活綴合物導(dǎo)致熒光反應(yīng)。由于與DNA結(jié)合增強(qiáng)它們的熒光，優(yōu)選這些綴合物與雙苯甲亞胺分子相似。并且由于綴合物對(duì)可見光反應(yīng)發(fā)出熒光而優(yōu)于雙苯甲亞胺分子。
特別優(yōu)選的熒光團(tuán)為可見光可激發(fā)的二吡咯甲烷二氟化硼衍生物。二吡咯甲烷二氟化硼染料為如美國(guó)專利號(hào)5,338,854及4,774,339(文中引用作為參考)中所描述、可自Molecular Probes Inc的商品名BODIPYO獲得。示例的雙苯甲亞胺-二吡咯甲烷二氟化硼綴合物的制備在WO 02/41906中描述。也可應(yīng)用以前段落中描述的本類其它熒光團(tuán)例如熒光素及其衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解此類經(jīng)熒光團(tuán)修飾染料可通過修飾或官能化而制備，從而使所述綴合物具有染色的其它適宜特性，這樣使它們?cè)谀康膒H及溫度范圍具有足夠細(xì)胞通透性。例如，通過(1)改變DNA染料的pKa，(2)通過加入適當(dāng)接頭連接的陽離子或陰離子的離子型增強(qiáng)通透的基團(tuán)，或(3)加入非離子型增強(qiáng)通透的基團(tuán)如乙二醇或聚乙二醇部分，可進(jìn)行化學(xué)修飾以增強(qiáng)適當(dāng)細(xì)胞通透性。
在本發(fā)明范圍中，雙苯甲亞胺及可見波長(zhǎng)熒光團(tuán)可以許多不同方式連接。WO 02/41906示例了它們可進(jìn)行連接的一種方式；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于選擇許多其它熒光團(tuán)及連接方法。協(xié)助此類選擇的供應(yīng)者及咨詢機(jī)構(gòu)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是易于自從事制備及出售熒光團(tuán)的商業(yè)實(shí)體例如Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)獲得的。
優(yōu)選地，選擇不會(huì)對(duì)成活力、通透性、穩(wěn)定性、攝取、細(xì)胞保存、流式細(xì)胞術(shù)、制劑或熒光特性導(dǎo)致顯著負(fù)面作用的連接雙苯甲亞胺及可見波長(zhǎng)熒光團(tuán)的化學(xué)物。優(yōu)選地對(duì)連接物的化學(xué)官能性進(jìn)行選擇以增強(qiáng)特性如穩(wěn)定性、通透性、成活力、攝取、細(xì)胞保存、流式細(xì)胞術(shù)、制劑或熒光特性。
文中公開的方法可應(yīng)用于最近獲自特定來源的精子(即，在染色前幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)獲得自牛、豬或其它哺乳動(dòng)物來源)或可應(yīng)用于深低溫保存并接著融化的精子。在每種情況下，細(xì)胞計(jì)數(shù)分選的結(jié)果可通過向染色溶液中加入猝滅劑以降低死精子熒光而改善。多種猝滅劑以及猝滅劑的用途是本領(lǐng)域公知的，如對(duì)于碘化丙錠(Garner等人，Bio.of Reprod.，53276-84(1995))及FD&C # 40(Johnson等人，Theriogenology，521323-1341(1999))所證實(shí)的那樣。FD&C # 40在本方法中特別有用，因?yàn)槠湓诘蜐舛葢?yīng)用是無毒的。同樣，SYBR-14與碘化丙錠的組合是有益的，由于這使活精子與瀕死細(xì)胞及死細(xì)胞可見并可使活精子自瀕死細(xì)胞及死細(xì)胞分離。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，精細(xì)胞與染料及猝滅劑兩者組合以形成染色混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，精細(xì)胞與Hoechst33342及FD&C # 40組合。又在另一實(shí)施方案中，精細(xì)胞與SYBR-14及碘化丙錠組合。當(dāng)分選融化的深低溫保藏精子樣本時(shí)，猝滅劑是有用的，應(yīng)當(dāng)理解它們的用途不僅僅限于此，且它們可有益地用于新近獲得的精子樣本。
除了緩沖劑外，染色混合物中也可包括其它添加劑以增強(qiáng)精子的成活力或活動(dòng)能力；這些添加劑可作為精子源、染料源的一部分提供或單獨(dú)提供給染色混合物。此類添加劑包括能源、抗生素、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物、活動(dòng)能力抑制劑及精漿。
一般而言，活動(dòng)能力抑制劑通過刺激哺乳動(dòng)物附睪或附睪管的流體環(huán)境，引起染色混合物中的細(xì)胞模仿哺乳動(dòng)物例如公牛附睪中的精細(xì)胞；因此例如抑制劑抑制精子的代謝活性和/或活動(dòng)能力。抑制劑可為對(duì)精子活動(dòng)能力具有抑制作用的任何組合物，例如染色混合物中相對(duì)高鉀離子的濃度趨于抑制精子活動(dòng)能力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選染色混合物包含鉀離子源并且染色混合物中鉀濃度至少為約0.05摩爾/升是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，鉀濃度至少為約0.05摩爾/升至約0.5摩爾/升。又更優(yōu)選地，鉀濃度至少約0.1摩爾/升至約0.3摩爾/升。最優(yōu)選地，鉀濃度為約0.173摩爾/升。此類染色混合物一般但不必要也包含鈉離子源。當(dāng)鈉存在時(shí)，鉀與鈉的摩爾比值分別大于1∶1。優(yōu)選地，鉀與鈉的摩爾比值為至少約1.25∶1。又更優(yōu)選地，鉀與鈉的摩爾比值為至少約1.5∶1。又更優(yōu)選地，鉀與鈉的摩爾比值為至少約1.75∶1。又更優(yōu)選地，鉀與鈉的摩爾比值為至少約1.78∶1。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，鉀與鈉的摩爾比值為至少約2∶1。
染色混合物又可包含能下調(diào)碳水化合物攝取的離子或二氧化碳源。在本實(shí)施方案中，二氧化碳源可為例如一種或多種碳酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色混合物包含NaHCO3及KHCO3，因此提供了鉀離子及鈉離子源以及部分二氧化碳的壓力。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，染色混合物包含在水溶液中的NaHCO3及KHCO3，優(yōu)選水中包含NaHCO3、KHCO3及C6H8O7.H2O；通過進(jìn)一步舉例方式，染色混合物可用如Salisbury &Graves，J.Reprod.Fertil.，6351-359(1963)中公開的水中包含0.097摩爾/升NaHCO3、0.173摩爾/升KHCO3、0.090摩爾/升C6H8O7.H2O的抑制緩沖液形成。只要精細(xì)胞暴露于活動(dòng)能力抑制劑，它們一般保持靜止。
此種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物的實(shí)例包括例如丙酮酸、維生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黃素、醌、超氧化物歧化酶(SOD)及SOD模擬物。如果包括在染色混合物中，此種組合物可以足可實(shí)施保護(hù)作用而不有害影響精子健康的濃度存在。取決于以下因素，如所應(yīng)用的特定組合物或染色混合物中精子的濃度，示例的濃度范圍包括自約10μM至約50mM。例如，如果組合物中包括丙酮酸，它可在染色混合物中以自約0.5μM至約50mM的濃度存在，優(yōu)選自約1mM至約40mM，更優(yōu)選自約2.5mM至約25mM，又更優(yōu)選自約10mM至約20mM，甚至又更優(yōu)選約15mM，且最優(yōu)選約10mM。如果組合物中包括維生素K，它可在染色混合物中以自約1μM至約100μM的濃度存在，優(yōu)選自約10μM至約100μM，優(yōu)選自約50μM至約100μM的濃度存在，且最優(yōu)選約100μM。如果組合物中包括硫辛酸，它可在染色混合物中以自0.1mM至約1mM的濃度存在，優(yōu)選自約0.5mM至約1mM，更優(yōu)選約0.5mM，且最優(yōu)選約1mM。染色混合物可包含任一以上實(shí)施方案的組合物或?yàn)橐陨狭谐鰸舛鹊娜我饨M合。例如，染色混合物可包含調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物，所述組合物包含濃度約10mM的丙酮酸及濃度約100μM的維生素K。備選地，染色混合物可包含這樣的組合物，所述組合物包含濃度約10mM的丙酮酸及濃度約1mM的硫辛酸。又另一實(shí)例包括包含這樣組合物的染色混合物，所述組合物包含濃度約10mM的丙酮酸、濃度約100μM的維生素K及濃度約1mM的硫辛酸。
一旦根據(jù)本發(fā)明對(duì)精子進(jìn)行染色，可對(duì)它們進(jìn)行制備用于分選且然后使用允許根據(jù)基于熒光分離的任何已知方法進(jìn)行分選。一般應(yīng)用且公知的方法包括如在美國(guó)專利號(hào)5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867及6,263,745以及WO 99/33956及WO 01/37655中示例及描述的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，在本發(fā)明的升高溫度維持時(shí)，經(jīng)染色細(xì)胞可與鞘液組合或制備用于分選。在另一實(shí)施方案中，例如，經(jīng)染色細(xì)胞自升高溫度冷卻，其中染料攝取在較低溫度如室溫進(jìn)行，其中后續(xù)加工步驟也在室溫進(jìn)行，以能在這個(gè)實(shí)施方案中達(dá)到目的程度的分離，然而，一般優(yōu)選在本發(fā)明升高溫度的溫度以下沒有顯著染料攝入量發(fā)生。
實(shí)施例實(shí)施例1用人工陰道自性成熟公牛收集公牛精液，并將樣本在經(jīng)溫度控制容器中于37℃運(yùn)輸?shù)饺旧b置中。收到樣本后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))對(duì)精液濃度、視覺活動(dòng)能力、pH及膜完整性、活動(dòng)能力及前進(jìn)活動(dòng)能力通過Hamilton-Thorn活動(dòng)能力分析儀(IVOS)進(jìn)行分析?；诰簼舛龋苽?×5mL精子懸液。在pH 7.35的41℃ TCA緩沖液中懸浮精子而制備四個(gè)5mL 150×106個(gè)精子/毫升樣本。再在pH 7.35的39℃ TCA緩沖液中懸浮精子而制備另外四個(gè)5mL 150×106個(gè)精子/毫升樣本。對(duì)于精子懸液，加入水溶解的10mM的Hoechst溶液以產(chǎn)生如在表1中看到的染料濃度(“Hoechst的目標(biāo)濃度(μM))。將精子懸液在41℃及39℃水浴中維持。通過自精子懸液樣本中取出500μL并通過流式細(xì)胞儀測(cè)定染料的攝取(即確定熒光強(qiáng)度)對(duì)精子懸液進(jìn)行分析。
表1
分析結(jié)果在圖1A-1D中總結(jié)。
實(shí)施例2除了用于對(duì)精子染色的Hoechst 33342濃度外，如實(shí)施例1相同方式獲得并制備精子樣本。表2列出了實(shí)施例2中應(yīng)用的濃度。將懸液在41℃及39℃水浴中維持。定時(shí)自每個(gè)樣本中取出500μL樣本并通過流式細(xì)胞儀以確定熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。
表2
分析結(jié)果在圖2A-2D中總結(jié)。
實(shí)施例3除了用于對(duì)精子染色的Hoechst 33342濃度及染色溫度外，如實(shí)施例1相同的方式獲得、制備、染色及分析精子樣本。表3列出了實(shí)施例3中應(yīng)用的濃度及溫度。
表3
分析結(jié)果在圖3A-3D中總結(jié)。
實(shí)施例4除了用于對(duì)精子染色的Hoechst 33342濃度及染色溫度外，如實(shí)施例1相同的方式獲得、制備、染色及分析精子樣本。表4列出了實(shí)施例4中應(yīng)用的濃度及溫度。
表4
分析結(jié)果在圖4A及4B中總結(jié)。
實(shí)施例5除了用于對(duì)精子染色的Hoechst 33342濃度及染色溫度外，如實(shí)施例1相同的方式獲得、制備、染色及分析精子樣本。表5列出了實(shí)施例5中應(yīng)用的濃度及溫度。
表5
分析結(jié)果在圖5A及5B中總結(jié)。
實(shí)施例6除了用于對(duì)精子染色的Hoechst 33342濃度及染色溫度外，如實(shí)施例1相同的方式獲得、制備、染色及分析精子樣本。表6列出了實(shí)施例6中應(yīng)用的濃度及溫度。
表6
分析結(jié)果在圖6A及6B中總結(jié)。
實(shí)施例7用人工陰道自性成熟公牛收集公牛精子，并將樣本在經(jīng)溫度控制容器中于25℃運(yùn)輸?shù)饺旧b置中。收到樣本后，通過已知分析方法對(duì)精液的濃度、視覺活動(dòng)能力、IVOS活動(dòng)能力及前進(jìn)活動(dòng)能力、pH及膜完整性進(jìn)行分析?；诰簼舛龋苽?×1mL的150×106個(gè)精子/毫升的懸液。在pH 7.35的41℃ TCA緩沖液中懸浮精液而制備兩個(gè)1mL 150×106個(gè)精子/毫升樣本。再在pH 7.35的43℃ TCA緩沖液中懸浮精液而制備另外兩個(gè)1mL 150×106個(gè)精子/毫升樣本。向每個(gè)溫度的一個(gè)樣本中加入6μL 10mM Hoechst溶液以產(chǎn)生60μM的染料濃度。懸液在41℃及43℃水浴中維持。定時(shí)自精子懸液樣本中取出50μL，轉(zhuǎn)移到錐形管并加入200μL適當(dāng)溫度的TCA緩沖液，以產(chǎn)生濃度為30×106個(gè)精子/毫升的最終精子懸液。將30×106個(gè)精子/毫升精子懸液樣本立即通過IVOS進(jìn)行分析。對(duì)活動(dòng)能力百分率及前進(jìn)活動(dòng)能力(Prog Mot)百分率的IVOS結(jié)果在圖7A及7B顯示。
實(shí)施例8除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在60μM濃度染色并在39℃及45℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖8A及8B中顯示。
實(shí)施例9除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精子進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在80μM濃度染色并在41℃、43℃及45℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖9A-9C中顯示。
實(shí)施例10除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在100μM濃度染色并在41℃、43℃及45℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖10A-10C中顯示。
實(shí)施例11除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在100μM濃度染色并在47℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖11中顯示。
實(shí)施例12
除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在100μM濃度染色并在49℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖12中顯示。
實(shí)施例13除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在濃度125μM及150μM染色，且每個(gè)樣本在水浴43℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖13A及13B中顯示。
實(shí)施例14除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在200μM及250μM濃度染色，且每個(gè)樣本在水浴43℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖14A及14B中顯示。
實(shí)施例15除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在125μM及150μM濃度染色，且每個(gè)樣本在水浴45℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖15A及15B中顯示。
實(shí)施例16除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在200μM、250μM及300μM濃度染色，且每個(gè)樣本在水浴45℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖16A-16C中顯示。
實(shí)施例17除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例7對(duì)公牛精液進(jìn)行收集、分析、在緩沖液中懸浮、用Hoechst 33342染色以及通過IVOS分析。將樣本在300μM、350μM及400μM濃度染色，且每個(gè)樣本在水浴43℃的溫度維持。IVOS分析結(jié)果在圖17A-17C中顯示。
實(shí)施例18用人工陰道自性成熟公牛收集公牛精液，并將樣本在經(jīng)溫度控制容器中于25℃運(yùn)輸?shù)饺旧b置中。收到樣本后，通過已知分析方法對(duì)精液的濃度、視覺活動(dòng)能力、IVOS活動(dòng)能力及前進(jìn)活動(dòng)能力、pH及膜完整性進(jìn)行分析?；诰簼舛?，通過將精液在pH 7.35的43℃ TCA緩沖液中懸浮制備4×1mL的150×106個(gè)精子/毫升的懸液。向三個(gè)樣本中加入SYBR14染料溶液以產(chǎn)生0.6μM、6μM及60μM的染料濃度。懸液在43℃水浴中維持。定時(shí)將50μL樣本轉(zhuǎn)移到錐形管并加入200μL適當(dāng)溫度的TCA緩沖液，以產(chǎn)生30×106個(gè)精子/毫升的最終精子濃度。將樣本立即在IVOS上進(jìn)行分析。對(duì)活動(dòng)能力百分率及前進(jìn)活動(dòng)能力(Prog Mot)百分率的IVOS結(jié)果在圖18A-18C中顯示。
實(shí)施例19除了應(yīng)用的染料及濃度外，如實(shí)施例1相同的方式獲得、制備、染色及分析精子樣本。濃度100μM的BBC及濃度為6μM的SYBE 14用于染色精子懸液并將溫度在45℃水浴中維持。表7列出了實(shí)施例19中應(yīng)用的濃度及溫度。
表7
分析結(jié)果在圖19A及19B中總結(jié)。
實(shí)施例20用人工陰道自性成熟公牛收集公牛精液并將樣本用2份碳酸鹽緩沖液稀釋用于在經(jīng)溫度控制容器中于25℃運(yùn)輸?shù)饺旧b置中。收到樣本后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))對(duì)精液的濃度、活動(dòng)能力及前進(jìn)活動(dòng)能力通過Hamilton-Thorn活動(dòng)能力分析儀(IVOS)進(jìn)行分析?；诰簼舛?，取出一份碳酸鹽精子懸液，對(duì)精子懸液于500×g離心5分鐘，棄去上清液并用pH 7.3的41℃TCA緩沖液重新懸浮沉淀物，從而制備1mL 150×106個(gè)精子/毫升的懸液。再在pH 7.3的包含10mM丙酮酸的41℃ TCA緩沖液中懸浮精液制備另一1mL 150×106個(gè)精子/毫升的懸液。對(duì)于精子懸液，加入水溶解的10mM的Hoechst溶液以產(chǎn)生400μM Hoechst的染料濃度。染色期間將精子懸液在41℃水浴中維持。通過自染色精子懸液中取出50μL，在相同溫度加入200μL相同緩沖液并通過IVOS分析以測(cè)定前進(jìn)活動(dòng)能力百分率(％Prog Mot)對(duì)精子懸液進(jìn)行分析。IVOS分析結(jié)果在圖20中總結(jié)。
實(shí)施例21除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例20中相同的方式獲得并制備精子樣本。懸浮精子并用于染色及IVOS分析的緩沖液為TCA及包含10μM維生素K的TCA。IVOS分析結(jié)果在圖21中總結(jié)。
實(shí)施例22除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例20中相同的方式獲得并制備精子樣本。懸浮精子并染色及IVOS分析的緩沖液為TCA及包含100μM維生素K的TCA。IVOS分析結(jié)果在圖22中總結(jié)。
實(shí)施例23除了以下各項(xiàng)不同外，如實(shí)施例20中相同的方式獲得并制備精子樣本。懸浮精子并染色及IVOS分析的緩沖液為TCA及包含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析結(jié)果在圖23中總結(jié)。
實(shí)施例24用人工陰道自性成熟公牛收集公牛精液并將樣本在經(jīng)溫度控制容器中于25℃運(yùn)輸?shù)饺旧b置中。收到樣本后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))對(duì)精液的濃度、活動(dòng)能力及前進(jìn)活動(dòng)能力通過Hamilton-Thorn活動(dòng)能力分析儀(IVOS)進(jìn)行分析。基于精液濃度，通過在TCA緩沖液或在基于碳酸鹽的抑制劑中懸浮精液而制備幾管450×106個(gè)精子/毫升懸液。以下表III圖示了應(yīng)用的組分及染色條件。
表III
對(duì)于精子懸液，加入水溶解的10mM Hoechst溶液以產(chǎn)生300μMHoechst的濃度。精子懸液在41℃水浴中維持30分鐘，然后如每個(gè)圖中特別指出稀釋到一般用于分選的濃度，用含10mM丙酮酸的TCA或pH6.2的基于碳酸鹽的抑制劑稀釋到150×106個(gè)精子/毫升。通過在每個(gè)圖中指定的時(shí)間期限自經(jīng)染色且經(jīng)稀釋懸液中取出50μL并加入200μL 25℃pH7.3的含10mM丙酮酸TCA以啟動(dòng)靜止期的逆轉(zhuǎn)，允許至少5分鐘的平衡期且通過IVOS分析以測(cè)定前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)，對(duì)精子懸液進(jìn)行分析。IVOS前進(jìn)活動(dòng)能力百分?jǐn)?shù)的比較參見圖24-26。
權(quán)利要求
1.用于染色精細(xì)胞的方法，所述方法包括形成含有完整的活精細(xì)胞和DNA選擇性熒光染料的染色混合物，以及使染色混合物處于40℃以上的溫度。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中染料為UV可激發(fā)或可見光可激發(fā)的染料。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中染料選自雙苯甲亞胺、SYBR-14及其綴合物、類似物或衍生物。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中染料選自Hoechst 33342、Hoechst33258、SYBR-14和6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-雙苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中染色混合物處于所述溫度一段時(shí)間，足可允許染料結(jié)合DNA，從而基于熒光可對(duì)攜帶X和Y的精細(xì)胞差異分選。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中時(shí)間期間為自約1分鐘至約160分鐘。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中時(shí)間期間為小于約60分鐘。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中時(shí)間期間為小于約30分鐘。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中染料濃度為自約0.1μM至約1000μM。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中染料濃度為自約100μM至約600μM。
11.權(quán)利要求5所述的方法，其中染色混合物處于約41℃以上的溫度。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中染色混合物處于約41℃與約50℃之間的溫度。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中染色混合物處于約41℃與約47℃之間的溫度。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中染色混合物處于約42℃與約45℃之間的溫度。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中染色混合物處于約43℃的溫度。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步驟包括將緩沖液與精細(xì)胞組合。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中將緩沖液與精細(xì)胞組合以形成精子懸液，以及將精子懸液與DNA選擇性染料組合以形成染色混合物。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步驟包括將緩沖液與DNA選擇性染料組合以形成緩沖的染料溶液，以及將緩沖的染料溶液與精細(xì)胞組合以形成染色混合物。
19.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將猝滅劑與染色混合物組合的步驟。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中猝滅劑選自FD&C#40和碘化丙錠。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中猝滅劑為FD&C#40。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中猝滅劑為FD&C#40且染料為Hoechst 33342。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中猝滅劑為碘化丙錠且染料為SYBR-14。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中染色混合物還包含活動(dòng)能力抑制劑。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步驟包括將活動(dòng)能力抑制劑與精細(xì)胞組合以形成受抑制的精子懸液，以及將受抑制的精子懸液與DNA選擇性染料組合以形成染色混合物。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中活動(dòng)能力抑制劑包含基于碳酸鹽的活動(dòng)能力抑制劑。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中基于碳酸鹽的活動(dòng)能力抑制劑包含NaHCO3、KHCO3和C6H8O7·H2O。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中基于碳酸鹽的活動(dòng)能力抑制劑包含水溶解的0.097摩爾/升NaHCO3、0.173摩爾/升KHCO3和0.090摩爾/升C6H8O7·H2O。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中染色混合物還包含調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物選自丙酮酸、維生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黃素、醌、超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶模擬物。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物選自丙酮酸、維生素K和硫辛酸。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度自約0.5μM至約50mM的丙酮酸。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度自約10mM至約15mM的丙酮酸。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度約10mM的丙酮酸。
35.權(quán)利要求31所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度約1μM至約100μM的維生素K。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度約100μM的維生素K。
37.權(quán)利要求31所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度自約0.1mM至約1.0mM的硫辛酸。
38.權(quán)利要求31所述的方法，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物包含濃度約1.0mM的硫辛酸。
全文摘要
根據(jù)將精細(xì)胞與DNA選擇性熒光染料在約40℃以上升高的溫度組合的方法，對(duì)精細(xì)胞進(jìn)行染色。此方法允許染色時(shí)間減少。此后根據(jù)常規(guī)分離方法包括流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效分選。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1795004SQ200480014519
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者M·安扎爾, C·L·路德維格, J·A·格雷厄姆, J·A·格倫策爾 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司