專利名稱：嵌合多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于研究控制DNA修復(fù)活性的細(xì)胞體系和控制細(xì)胞周期的分子和方法。
活的生物的基因組持續(xù)暴露于由自發(fā)的內(nèi)源化學(xué)或生物化學(xué)損害產(chǎn)生的，或由暴露于外源的基因組損害物質(zhì)產(chǎn)生的化學(xué)損害。
為了確保必要的基因組穩(wěn)定率，而且提供所有活的物種不可缺少的進(jìn)化和適應(yīng)所必需的基因組通量，DNA修復(fù)和DNA重組機(jī)制的非常復(fù)雜的體系已經(jīng)在細(xì)胞中進(jìn)化。通過確保準(zhǔn)確度和精確度的控制機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)一方負(fù)責(zé)基因組保真度、一方負(fù)責(zé)分子多樣性產(chǎn)生的2個(gè)系統(tǒng)之間的平衡。用有助于確保任何活生物中的基因組保真度的所謂“限制點(diǎn)(checkpoint)”或“監(jiān)視控制(surveillance control)”來(lái)表示控制的水平。關(guān)于該機(jī)制和相關(guān)的已知基因的綜述，以及權(quán)威的命名法，參見，例如，Zhou B.and S，Elledge，Nature，2000，408433-439。
近年來(lái)，開發(fā)了許多分子工具用于分析與DNA修復(fù)相關(guān)的機(jī)制，以及更重要的，用于這些機(jī)制的控制和調(diào)節(jié)。例如在美國(guó)專利6,307,015中，描述了基于蛋白質(zhì)Chkl的產(chǎn)物和方法，其被認(rèn)為能鑒定對(duì)通過Chkl蛋白來(lái)控制細(xì)胞限制點(diǎn)和DNA修復(fù)而言重要的機(jī)制和基因產(chǎn)物。
此外，還開發(fā)了在細(xì)胞基因組中引入重組的方法例如，Peitz etal.in Proc Natl.Acad Sci.，2002，994489-4494獲得了一種嵌合Cre重組酶的翻譯，該嵌合Cre重組酶能夠以50％的效率重組預(yù)先引入到基因組中的lox-P位點(diǎn)。而且，在WO00/46386中，也描述了結(jié)合使用表達(dá)大范圍核酸酶SceI的載體，在特異性引入的SceI位點(diǎn)處引入染色體重組。
在用基因毒物誘導(dǎo)之后，分析DNA損傷修復(fù)的困難為，所有這些DNA損傷劑同時(shí)引起許多不同類型的DNA損害因此引入以單特異性方式作用于DNA的系統(tǒng)是非常令人感興趣的。這允許高精確度地確定與細(xì)胞周期控制途徑，尤其是與DNA修復(fù)相關(guān)的基因產(chǎn)物。這些途徑的效率是正確的細(xì)胞復(fù)制所必需的，而且對(duì)它們的詳細(xì)了解可以開發(fā)用于更有選擇性的藥物和更具針對(duì)性的治療干預(yù)的篩選系統(tǒng)。
廣泛范圍的身體的和遺傳疾病，與DNA修復(fù)機(jī)制的缺陷有關(guān)，或者更常見地與DNA編碼的遺傳信息的控制的缺陷相關(guān)。這些缺陷中許多是引起腫瘤病理的主要原因(例如，p53、ARF、14-3-3sigma、p16、Rb等基因中的突變)，但是此外，這些缺陷還可能引起許多迄今為止沒有表征，而只是簡(jiǎn)單的分類為“體細(xì)胞突變”或“遺傳傾向性”的病理。在一個(gè)途徑中已經(jīng)定位的，而且其構(gòu)成遺傳疾病的遺傳基礎(chǔ)的突變有共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張(A-T)，與共濟(jì)失調(diào)相關(guān)的紊亂(共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張樣紊亂ATLD，Mrell)，Nijmegen斷裂綜合征(NBS)，凡科尼貧血，Rothmund-Thomson綜合征，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，維爾納氏綜合征，布盧姆氏綜合征，DNA連接酶IV(LIG4)綜合征，著色性干皮病，BRCA1。
DNA雙鏈斷裂(DSB)是最危險(xiǎn)的基因組損害。這些能例如通過電離輻射誘導(dǎo)，通過可能來(lái)自外源的，或者來(lái)自例如通過細(xì)胞應(yīng)激造成的內(nèi)源條件的活性氧類別(ROS)誘導(dǎo)。ROS也可由用于腫瘤治療的化療劑誘導(dǎo)，例如由DNA嵌入劑或DNA交聯(lián)劑誘導(dǎo)。DSB的修復(fù)比其他類型的DNA損傷更困難修復(fù)事件和DSB末端的連接可能引起由于遺傳物質(zhì)的丟失、擴(kuò)增或修飾而致的遺傳不穩(wěn)定性，是潛在致腫瘤的。
由于這些事件誘導(dǎo)了修復(fù)途徑及其細(xì)胞控制的事實(shí)，對(duì)它們的了解具有重要意義，因?yàn)檫@又能提供關(guān)于可能的治療應(yīng)用的暗示。
因此本發(fā)明的目的是提供一種治療這種DNA修復(fù)機(jī)制或遺傳信息控制中的缺陷的有效因子。優(yōu)選地，這些因子必須傳遞到細(xì)胞中，尤其是傳遞到細(xì)胞核中，以在那里發(fā)揮它們的活性。
因此，本發(fā)明提供了一種嵌合多肽，其包含a.一種顯示對(duì)特異性核苷酸序列有親和力的多肽b.一種DNA修飾酶c.一種具有細(xì)胞內(nèi)傳遞活性的區(qū)域。
本發(fā)明提供了一種通過用顯示特異性相關(guān)位點(diǎn)的本發(fā)明嵌合分子向基因組中引入DSB來(lái)修飾細(xì)胞基因組的系統(tǒng)。本發(fā)明的嵌合分子的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，線性的活性動(dòng)力學(xué)，單特異性活性，和這些分子能以不依賴受體的方式穿透全部細(xì)胞群體的事實(shí)。有利地，這些由嵌合分子所引起的事件，可由選擇性試劑無(wú)選擇性地誘導(dǎo)，而且可大大簡(jiǎn)化它們的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及由以下物質(zhì)組成的嵌合分子一種區(qū)域，優(yōu)選多肽性質(zhì)的區(qū)域，其含有特異性的DNA結(jié)合活性，有利地來(lái)源于II類限制性內(nèi)切酶；一種優(yōu)選的多肽性質(zhì)的區(qū)域，其顯示催化DNA修飾活性，有利地包括核酸內(nèi)切(endonucleolytic)活性，和一種具有細(xì)胞膜和/或核膜-交叉?zhèn)鬟f活性的區(qū)域。上面所述的功能區(qū)域優(yōu)選地彼此共價(jià)連接。
本發(fā)明的另一個(gè)重要的實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的嵌合分子的分離的多核苷酸，如果這些嵌合分子全部或部分是多肽性質(zhì)的話。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，從本發(fā)明多肽由于引入DNA雙鏈斷裂而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及其限制點(diǎn)控制的關(guān)鍵點(diǎn)的活性推斷，本發(fā)明包括不同的方法，其特征均在于在體內(nèi)的細(xì)胞中使用本發(fā)明的嵌合分子。特別地，根據(jù)本發(fā)明的這些方法包括診斷方法，用于評(píng)估編碼與細(xì)胞周期控制和DNA修復(fù)相關(guān)的產(chǎn)物的基因的遺傳損害，包括篩選具有能夠調(diào)節(jié)這些控制活性的生物學(xué)活性的組合物的方法。
本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的嵌合分子來(lái)篩選新的傳遞活性或傳遞活性的組合的方法。
本發(fā)明更進(jìn)一步地提供所述組合物作為抗增殖、抗腫瘤、抗生素、抗寄生蟲或抗病毒藥的治療用途。
本發(fā)明的不同方面是基于發(fā)明人提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即可以引入單特異性DNA雙鏈斷裂(DSB)到體內(nèi)細(xì)胞的基因組中，而且這些DSB是足以活化細(xì)胞周期期間的控制點(diǎn)(限制點(diǎn))的信號(hào)。這些活化中的大多數(shù)在從人到酵母的整個(gè)進(jìn)化中是保守的，而且相應(yīng)的機(jī)制也存在于原核生物和古細(xì)菌中。
在真核生物中，通過調(diào)節(jié)如下物質(zhì)來(lái)介導(dǎo)這些活化來(lái)自ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白)、ATR(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張相關(guān)的)、DNA-PKcs(DNA依賴性蛋白激酶-催化亞基)的基因產(chǎn)物，和它們的直接或間接底物例如Chk1(限制點(diǎn)激酶1)，Chk2(限制點(diǎn)激酶2)，Brcal(乳腺癌易感性-1)，Brca2(乳腺癌易感性-2)，Mre11(減數(shù)分裂重組11)，Rad50(放射50雙鏈斷裂修復(fù))，Nbsl(Nijemegen斷裂綜合征)，Rad51(放射51雙鏈斷裂修復(fù))，F(xiàn)ANCD2(凡科尼貧血互補(bǔ)D2)，組蛋白，解旋酶樣BLM(布盧姆氏綜合征突變)，WRN(維爾納氏綜合征突變)，p53，和p53樣的直接或間接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，例如p21和14-3-3sigma，而該列舉不是全部的，還有許多其他的靶標(biāo)是已知的，甚至還沒有發(fā)現(xiàn)。
尤其，發(fā)現(xiàn)這些基因產(chǎn)物中的一些的活化應(yīng)該在DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻斷期間協(xié)調(diào)維持基因組完整性的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
本發(fā)明提供了如下嵌合分子，其能跨過細(xì)胞膜，在真核細(xì)胞的情況下進(jìn)入細(xì)胞核，或進(jìn)入細(xì)胞中的寄生物，并結(jié)合到DNA雙鏈的特異性位點(diǎn)，用一級(jí)動(dòng)力學(xué)理想地修飾DNA。
明顯地，這些發(fā)現(xiàn)和它們的使用模式開啟了用于醫(yī)學(xué)以及科學(xué)目的的許多實(shí)際應(yīng)用的大門，并且申請(qǐng)用于研究DNA修復(fù)機(jī)制、DNA修復(fù)控制和通常細(xì)胞周期控制的獨(dú)特方法，以及能以選擇性方式修飾任何細(xì)胞的基因組的產(chǎn)物。
在一個(gè)主要的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合分子含有3個(gè)功能性組分-一種區(qū)域，其優(yōu)選由顯示與特異性DNA或RNA序列有親和力的多肽組成。該區(qū)域的代表優(yōu)選是II類限制性內(nèi)切酶，能識(shí)別DNA中回文序列的它的亞基或功能性片段；
-一種區(qū)域，其優(yōu)選由顯示DNA或RNA修飾催化活性的多肽組成，僅作為舉例而不是排除，該活性包括，甲基化酶，乙?；福哂谢驔]有CAD抑制劑(ICAD)和激活劑EndoG的胱天蛋白酶(caspase)激活的DNase(CAD)，RNase，DNA或RNA連接酶，DNA或RNA聚合酶，核酸內(nèi)切酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶或它們的亞基或功能性片段，但是優(yōu)選包括酶，優(yōu)選限制性內(nèi)切酶，甚至更優(yōu)選II類限制性內(nèi)切酶的核酸內(nèi)切活性；-一種含有傳遞活性的區(qū)域，其能跨過細(xì)胞膜和/或核膜，并把異源分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞和細(xì)胞器中；這種活性稱為“傳遞體”，而“傳遞體”是指一種化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)選由多肽或肽，和脂類、脂質(zhì)體、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物或納米顆粒組成，能穿透細(xì)胞的生物膜，而對(duì)于真核生物的情況，此外還能穿透細(xì)胞和細(xì)胞核的膜或任何其他的細(xì)胞器包括線粒體或質(zhì)體的膜。特別優(yōu)選能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中的傳遞體。
上面所述的功能域優(yōu)選共價(jià)連接。本發(fā)明的嵌合分子通過化學(xué)合成獲得，或如果功能區(qū)域是肽性質(zhì)的，優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)合成。對(duì)于該實(shí)施方案和對(duì)于本發(fā)明，編碼包含上述3個(gè)功能區(qū)域的嵌合蛋白的核苷酸序列用于在優(yōu)選原核來(lái)源的宿主系統(tǒng)中表達(dá)重組多肽。
本發(fā)明的嵌合分子還可以用通過化學(xué)或重組方法的混合技術(shù)來(lái)制備，而至少一個(gè)區(qū)域使用化學(xué)方法與通過重組DNA技術(shù)制備的另外兩個(gè)產(chǎn)物偶聯(lián)。
在本發(fā)明的嵌合分子的一個(gè)優(yōu)選方案中，具有特異性的DNA結(jié)合活性的區(qū)域來(lái)自于II類核酸內(nèi)切酶。優(yōu)選地選自以下的核酸內(nèi)切酶EcoRV、PvuII、HinfI或它們的亞基或功能性片段。在本發(fā)明的下文中，功能性片段是指這樣一種多肽其包含的氨基酸序列部分來(lái)源于具有天然酶的至少一種功能的這些完整蛋白質(zhì)之一的序列。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA修飾活性的區(qū)域也是II類限制性核酸內(nèi)切酶，也選自含有特異性DNA結(jié)合活性的相同核酸內(nèi)切酶，尤其是EcoRV、PvuII、HinfI或它們的功能性亞基或片段。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，在單個(gè)同型二聚體蛋白質(zhì)中，DNA識(shí)別和DNA修飾活性是相連的。
在該最后的情況中，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，有利地包含限制性內(nèi)切酶作為單鏈分子，而酶的所有亞基共價(jià)連接并表達(dá)為單鏈多肽，如同Simoncsits A.et al.J.Mol.Biol，2001，30989-97中對(duì)于酶PvuII所述，保持與野生型酶相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合和切割特性。
在本發(fā)明中，發(fā)明人還提供了一種嵌合分子，其中包含限制性內(nèi)切酶作為單鏈蛋白質(zhì)，而且其中由于限制性內(nèi)切酶的區(qū)域、亞基或催化結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變、缺失或其他的結(jié)構(gòu)變異而導(dǎo)致修飾活性改變或丟失，而關(guān)連DNA識(shí)別和結(jié)合的親和力保持與天然的酶相當(dāng)。尤其優(yōu)選的突變包括這種突變其基本上保持(或甚至增強(qiáng))它們與核酸的結(jié)合能力，但是失去了(顯著部分(例如＞50％)或大部分(＞80％))它們的酶促(切割)活性。
至于本發(fā)明的最后的方面，還包括如下嵌合分子，其包含至少如上面所述的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞內(nèi)傳遞的區(qū)域或傳遞體和DNA結(jié)合區(qū)域，其特征在于顯示對(duì)特異性DNA序列的親和力的氨基酸序列優(yōu)選具有核酸內(nèi)切性質(zhì)，而且與II類限制性內(nèi)切酶至少有95％序列同源性的事實(shí)。在這些嵌合分子中，酶活性喪失，它們用作傳遞到基因組中的特異性DNA序列的載體，而不使用修飾能力。本發(fā)明的該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括如下獲得的嵌合酶使用如Nastri et al，1997，J.Biol.Chem.27225761-25767中所述通過PvuII酶的位點(diǎn)34的置換突變(Asp34/Gly34)而獲得的催化位點(diǎn)的突變體D34G代替PvuII酶的天然序列(類似于SCPVUTATA中的)。在這種突變的酶(SC34)中，DNA識(shí)別活性與野生型的酶相當(dāng)，但是核酸內(nèi)切活性喪失。這種分子還可用作對(duì)照，與顯示修飾活性的嵌合分子平行使用。
傳遞體或用于傳遞跨過細(xì)胞膜和/或核膜的區(qū)域有利地為肽。其較好地選自HSV的VP22蛋白質(zhì)，觸角蛋白質(zhì)的同源域的第三個(gè)α-螺旋，HIV-1的Tat和Rev蛋白或它們的片段或功能性突變體。功能性突變的例子有Ho et al.2001，Cancer Res.，61474-577中描述的那些。優(yōu)選的實(shí)施方案為來(lái)自Tat的肽，和包含具有肽SYGRKKRRQRRRGGS的序列YGRKKRRQRRR(相當(dāng)于Tat的47-57區(qū)域)的功能域的這些肽。該肽的功能性突變可交換使用HO et al.描述的突變。在其他的實(shí)施方案中，傳遞體序列可能對(duì)任何物種的任何細(xì)胞型和寄生物包括病毒是特異性的。例如，所述序列選自細(xì)菌傳遞體序列，其導(dǎo)致嵌合分子特異性進(jìn)入到原核生物中。用于例證而不是限制性的，細(xì)菌傳遞體可選自Rajarao et al.2002，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters；215267-272中描述的和綜述的寡肽序列。這些肽可包含用于傳遞跨過大腸桿菌的膜的FKDE基序，如序列CFFKDEL和它們的功能性衍生物。例如，對(duì)于金黃色葡萄球菌(S.aureus)，可使用含有PFS的基序例如VLTNENPFSDP，對(duì)于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，可使用含有PFS的基序YKKSNNPFSD。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的分子，其包含本領(lǐng)域已知能穿透入酵母中的序列例如釀酒酵母(S.cerevisiae)α的同系物和/或與核進(jìn)入序列結(jié)合的一種因子，可用于酵母細(xì)胞特異性傳遞。用于傳遞到各種酵母菌株中的序列的例子有Riezman et al.1997；Cell 91，731-738和Rajarao et al.，2002，F(xiàn)EMS Microbiology Letters；215267-272中描述的那些，尤其是包含PFS、YQR、PFR、PMF或DCMD的基序。
本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，使用能跨過細(xì)菌的膜，并能靶向和裂解它們的DNA的II類限制性核酸內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶是在原核生物王國(guó)中最有效的和發(fā)展最高級(jí)的自然進(jìn)化的殺傷體系。酶促核酸酶活性類似于DNA損傷的巨大放大，而且消滅細(xì)菌生長(zhǎng)只需要微量的酶。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些嵌合分子可用于抗生素活性，而且可有利地以高選擇性的方式用于停止細(xì)菌生長(zhǎng)。細(xì)菌傳遞體應(yīng)該不進(jìn)入其他的細(xì)胞型如人細(xì)胞，相反地，傳遞體如TAT序列不進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。
抗生素、抗腫瘤劑(例如，細(xì)胞抑制劑)以及其它活性劑，可通過本發(fā)明的因子，優(yōu)選通過本發(fā)明的多肽與所述其它活性劑共價(jià)偶聯(lián)，來(lái)進(jìn)行特異性傳遞。
在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，傳遞體或用于傳遞跨過細(xì)胞膜和/或核膜和細(xì)胞器膜的區(qū)域，可包含附加的修飾組分或“輔助”結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選多肽或化合物。該結(jié)構(gòu)域可與傳遞體序列連接，或可位于本發(fā)明的嵌合分子的任何其它部分。這些分子的添加可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如重組技術(shù)或化學(xué)偶聯(lián)獲得。用于例證而不是排除，為了使本發(fā)明的嵌合分子具有細(xì)胞型特異性，而添加攜帶細(xì)胞型特異性的結(jié)合位點(diǎn)的附加輔助結(jié)構(gòu)域，以及例如腫瘤特異性擴(kuò)增受體。這些受體為例如，Her2、TGFβ RI或CD20受體。這可通過添加EGF的結(jié)合片段、TGFβ或Fv或單鏈Fv(scFv)免疫球蛋白片段到輔助結(jié)構(gòu)域中而獲得。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，限制性內(nèi)切酶以它的天然二聚體形式使用，而包含功能性CDRL區(qū)域的特異性免疫球蛋白輕鏈片段與第一個(gè)蛋白質(zhì)的N末端連接，而且包含功能性CDR1-3H區(qū)域的可變免疫球蛋白重鏈蛋白質(zhì)與同型二聚體的另一個(gè)蛋白質(zhì)的N末端連接。這種嵌合蛋白能通過輕鏈重鏈二聚作用，和通過限制性內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的二聚作用而二聚化。因此，該嵌合蛋白能靶向與某些細(xì)胞型的特異性選擇性結(jié)合，并導(dǎo)致強(qiáng)烈增加所選擇的細(xì)胞對(duì)本發(fā)明嵌合蛋白的優(yōu)先吸收。顯然這些輔助結(jié)構(gòu)域可以是多重的。例如，可以添加用于特異性靶向細(xì)胞內(nèi)非染色體DNA例如線粒體或寄生物DNA(即病毒、無(wú)脊椎動(dòng)物和細(xì)菌感染的細(xì)胞)的附加序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以添加傳遞體的增強(qiáng)子元件。
在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，嵌合分子由II類限制性內(nèi)切酶組成，其中PvuII、EcoRV或HinfI具有通過肽接頭連接的亞基，該肽接頭優(yōu)選含有兩個(gè)或多個(gè)甘氨酸，更優(yōu)選序列GSGG或GSGGSGSGG。另外，本領(lǐng)域已知的相應(yīng)的肽接頭也可用于共價(jià)連接同型二聚體亞基，使之保持功能性活性。
任選的，嵌合分子包含可用于本領(lǐng)域熟知的純化的多肽序列，例如聚組氨酸標(biāo)簽、GST標(biāo)簽或蛋白質(zhì)A標(biāo)簽、myc-標(biāo)簽、HA-標(biāo)簽、生物素。
本發(fā)明嵌合分子的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案如序列IDN2所示，其中2個(gè)亞基連接為一個(gè)單鏈蛋白質(zhì)(SCPVU)的限制性內(nèi)切酶PvuII為負(fù)責(zé)DNA結(jié)合親和力和核酸內(nèi)切活性所致DNA修飾活性的結(jié)構(gòu)域或區(qū)域，而且Tat的肽SYGRKKRRQRRRGGS包含細(xì)胞質(zhì)間傳遞亞基。
本發(fā)明嵌合蛋白的一個(gè)有利的實(shí)施方案是，在存在血清時(shí)，它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)基中也是穩(wěn)定的。最終可以在本領(lǐng)域技術(shù)上可能的范圍內(nèi)，通過用D氨基酸或用非天然氨基酸置換L構(gòu)型的氨基酸來(lái)增強(qiáng)該穩(wěn)定性。如在點(diǎn)突變的情況中，這些嵌合蛋白的變體顯示與優(yōu)選的限制性內(nèi)切酶相同的酶活性，或失去與用作對(duì)照的分子相同的核溶解活性，并因此包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還包括分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的嵌合分子，而且全部或部分是重組的。這些多核苷酸序列的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案如序列IDN1，序列IDN1編碼PvuII酶的嵌合單鏈型，該P(yáng)vuII酶的蛋白質(zhì)傳遞區(qū)域相應(yīng)于序列IDN4，并由核苷酸序列IDN3編碼。優(yōu)選的實(shí)施方案更進(jìn)一步地包含聚組氨酸標(biāo)簽，其使嵌合蛋白能通過鎳NTA親和層析法容易地純化。
本發(fā)明還包括編碼任何可能的實(shí)現(xiàn)體(realization)的所有多核苷酸序列，其中嵌合分子是多肽，而且能使用重組DNA技術(shù)用例如Sambrook and Maniatis，1989，CSH ed中所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得。根據(jù)這些方法，而且例如對(duì)于其他的限制性內(nèi)切酶、用作合成接頭的肽或用于親和純化的肽所描述的，本領(lǐng)域的技術(shù)能制備與本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)體沒有本質(zhì)差異的實(shí)現(xiàn)體，因此該實(shí)現(xiàn)體包含于本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)體中。
本發(fā)明中還包括本發(fā)明的嵌合分子、尤其是核酸酶活性降低但是具有DNA結(jié)合活性的嵌合分子、以及RNA結(jié)合的嵌合分子的一個(gè)特別有利的實(shí)施方案。在該實(shí)施方案中，嵌合分子的DNA或RNA結(jié)合活性能用作細(xì)胞中的特異性核酸靶向分子。這使化合物能作為貨物(cargo)傳遞到細(xì)胞的DNA或RNA中。為此，特異性化合物通過重組技術(shù)或化學(xué)偶聯(lián)與這些嵌合分子共價(jià)或非共價(jià)連接。用于說(shuō)明而非排除，這些化合物包括納米顆粒，無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物及其組合，用于說(shuō)明而非排除，例如放射性化合物，化療劑如阿霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春新堿、鬼臼亞乙苷、順鉑，及其他擬輻射物質(zhì)和DSB誘導(dǎo)劑，抗體及其片斷，顯色化合物例如熒光分子，天然的和非天然的核酸，含有或不含酶促活性的肽或多肽?；瘜W(xué)偶聯(lián)可用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如順丁烯二酰亞胺激活的化合物與嵌合分子中的還原半胱氨酸偶聯(lián)。對(duì)于本發(fā)明的嵌合分子不包含天然半胱氨酸，如PvuII的情況，可通過本領(lǐng)域熟知的重組或合成技術(shù)進(jìn)入半胱氨酸。作為另外一個(gè)例子，可使用與游離氨基偶聯(lián)的溴-氰基。一種特別有吸引力的偶聯(lián)可通過蛋白質(zhì)剪接和與選擇的化合物的蛋白質(zhì)連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些分子還可以與多種標(biāo)簽偶聯(lián)，該標(biāo)簽與蛋白質(zhì)融合用于純化，例如聚組氨酸標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽或蛋白A標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA-標(biāo)簽、生物素，這些標(biāo)簽允許偶聯(lián)例如但不限于抗體、抗體片段或包含谷胱甘肽的化合物。以這種方式與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的分子，可以或不能使用化學(xué)試劑和UV交聯(lián)。用于例示而不是排除，對(duì)于這些偶聯(lián)方法，嵌合分子中特別有吸引力的位點(diǎn)如N或C末端部分。在單鏈型的情況中，也可有利地使用2個(gè)亞基之間的接頭。
此外，還包括包含如上所述的多核苷酸序列的載體，尤其是用于在通常更適于表達(dá)大量重組蛋白的原核生物中表達(dá)的載體。
本發(fā)明優(yōu)選的嵌合分子(其中DNA修飾酶是II類限制性內(nèi)切酶)的用途使它可應(yīng)用于本發(fā)明的主要方面，包括在回文位點(diǎn)處引起、誘導(dǎo)或產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的方法，該回文位點(diǎn)是給定酶的關(guān)連位點(diǎn)，因此有利地是序列CAG/CTG(PvuII)、GAT/ATC(EcoRV)或G/ANTC(HinfI)，這些序列以大約6000bp(EcoRV和PvuII)或400-600bp(HinfI)的統(tǒng)計(jì)頻率隨機(jī)存在于基因組中。
在用本發(fā)明的嵌合蛋白處理培養(yǎng)中的細(xì)胞之后誘導(dǎo)的作用，通過FACS分析進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析，或通過Southern印跡、TUNEL分析、溴脫氧尿苷標(biāo)記(BrdU)和通過使用特異性抗體或綠色熒光蛋白質(zhì)衍生物及其顯色衍生物的免疫熒光分析直接進(jìn)行基因組分析，所有的方法都可常規(guī)使用。此外，對(duì)用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理的細(xì)胞的產(chǎn)克隆活性和增殖能力的測(cè)定，是增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)功能的指示。
例如通過TUNEL分析所測(cè)定的，本發(fā)明蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方案的活性的動(dòng)力學(xué)是線性的，在0.001nM-100μM，更優(yōu)選0.1nM-1μM，甚至更優(yōu)選1-500nM的范圍內(nèi)。這種線性是除了單特異性活性與它們能穿透所有細(xì)胞的特征以外，本發(fā)明的嵌合分子，尤其是SCPVUTAT的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。而且，嵌合分子引起的事件不必用特異性選擇劑進(jìn)行選擇，從而顯著和有利地簡(jiǎn)化了后者的使用。
用本發(fā)明的嵌合蛋白，尤其是用本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)體處理之后觀察到的作用，再以非限制性模式作如下假定-處于細(xì)胞周期的特定階段，例如G0-G1/S-S-G2-G2/M-M或細(xì)胞凋亡或多倍性的細(xì)胞的百分比增加。這些變化的性質(zhì)是細(xì)胞型特異性的，而且這種特異性表示將來(lái)在診斷上實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述方法，并能檢測(cè)未知樣品與一個(gè)或多個(gè)對(duì)照相比的變化和/或遺傳突變或外遺傳/體細(xì)胞改變，該對(duì)照例如是含有較好描述的遺傳缺陷的細(xì)胞系或是正常細(xì)胞。例如，相對(duì)于用本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行處理后所見的分布，用本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)處理在決定G1/S的細(xì)胞周期控制上包含特異性缺陷的細(xì)胞，如p21CIP/WAF1基因的突變體，顯示G2期細(xì)胞數(shù)目增加。在p21CIP/WAF1的情況中，細(xì)胞不終止于G1/S期，但是仍然顯示部分功能性的G2/M控制點(diǎn)(限制點(diǎn))，從而顯示在G2/M期的峰相對(duì)增加，如在通過FACS對(duì)DNA含量分布進(jìn)行分析，并與正常對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)中所見。使用編碼與DNA修復(fù)限制點(diǎn)控制相關(guān)的基因產(chǎn)物例如ATM和Nb的基因突變體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)可獲得類似的結(jié)果。
如前面所示的，該方法的重要性包括細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞(正?；?qū)φ占?xì)胞)的分布比較或行為比較。
-與細(xì)胞周期和修復(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平改變。如測(cè)定在蛋白質(zhì)含量上蛋白質(zhì)變異的穩(wěn)態(tài)水平的變化，例如，其可能源于表達(dá)水平的變異，或mRNA穩(wěn)定性的變化，或蛋白質(zhì)修飾例如蛋白水解、磷酸化、遍在蛋白化(ubiquitinylation)或其他的翻譯后修飾的變化。
-作為ATM/ATR/DNA-PKcs控制途徑的中心，并在用本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理之后顯示變化的蛋白質(zhì)的磷酸化水平。在磷酸化上顯示變化的蛋白質(zhì)在下面的實(shí)驗(yàn)部分中較好地描述，但是這里以非限制性的方式列舉ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白)，ATR(共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張相關(guān)蛋白質(zhì))，DNA-PKcs(DNA依賴性蛋白激酶催化亞基)，和它們的直接或間接底物例如Chk1(限制點(diǎn)激酶1)、Chk2(限制點(diǎn)激酶2)、Brca-1(乳腺癌敏感性1)，Brca2(乳腺癌敏感性2)、Mre11(減數(shù)分裂重組蛋白11)，Rad50(放射50雙鏈斷裂修復(fù)蛋白)、Nbs(Nijemegen斷裂綜合征)、Rad51(放射51雙鏈斷裂修復(fù)蛋白)、FANC-A，C，D2，E，F(xiàn)和G(凡科尼貧血互補(bǔ)蛋白)、組蛋白、解旋酶、BLM(布盧姆氏綜合征突變)、WRN(維爾納氏綜合征突變)、p53，等等。尤其優(yōu)選的是分子和生物化學(xué)標(biāo)記Nbs、Mre11、Rad51、p53、Chk2、Brca1。
一個(gè)特別的實(shí)施方案是在p53和p53的直接或間接轉(zhuǎn)錄靶例如p21CIP/WAF1、14-3-3sigma上誘導(dǎo)的變異。在用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理之后，對(duì)這些蛋白質(zhì)水平的變化或蛋白質(zhì)的活性和/或磷酸化狀態(tài)的變化的分析，是本發(fā)明的一個(gè)重要方面，對(duì)于診斷而言是特別有意義的。這些測(cè)定可以如本領(lǐng)域熟知的使用，例如，利用例如針對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化形式的特異性抗體，通過免疫學(xué)方法(例如Western印跡分析)進(jìn)行測(cè)定，如利用抗p53-S15P檢測(cè)p53的磷酸化形式的增加。如在下面的實(shí)驗(yàn)部分中更詳細(xì)地證實(shí)的，用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理不同的細(xì)胞系導(dǎo)致p53蛋白質(zhì)和/或磷酸化作用水平增加。
-復(fù)合物的細(xì)胞分布改變，其中包括用于細(xì)胞周期控制或用于在DNA修復(fù)的應(yīng)激應(yīng)答中至關(guān)重要的控制的重要蛋白質(zhì)?？蓮腞ad/Mre11/Nbs復(fù)合物定位的核點(diǎn)(nuclear foci)中的細(xì)胞應(yīng)答中觀察這些變異(Zhong Q.et al.1999，Science 285747-750)，Chk2的Thr68的磷酸化、ATM的磷酸化、組蛋白2AX-Ser135的磷酸化使用免疫學(xué)方法進(jìn)行分析。
-可選擇地，可以通過比較由本發(fā)明蛋白質(zhì)處理引起的突變細(xì)胞對(duì)比正常細(xì)胞的變化，來(lái)跟蹤C(jī)dc2/細(xì)胞周期蛋白B1、Cdc25C、p21CIP/WAF1和14-3-3sigma復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)/核分布的變化。這可如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例12所述，例如通過對(duì)于這些組分之一特異的熒光標(biāo)記和顯微鏡分析來(lái)進(jìn)行；-細(xì)胞凋亡可使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如通過FACS分析，通過細(xì)胞色素C釋放或胱天蛋白酶活性，或通過利用膜聯(lián)蛋白V特異性抗體標(biāo)記。利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理之后，例如可通過FACS分析檢測(cè)成神經(jīng)細(xì)胞瘤中亞G1期DNA含量的增加，作為細(xì)胞凋亡的增加。
-用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理所誘導(dǎo)的作用也可通過用本領(lǐng)域熟知的顯色反應(yīng)測(cè)定產(chǎn)克隆活性或增殖能力來(lái)進(jìn)行分析。可選擇地，蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期作用例如可通過在動(dòng)物模型系統(tǒng)中的致瘤活性或侵入來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
從本發(fā)明的蛋白質(zhì)中篩選能調(diào)節(jié)基因組損傷的組合物可通過姊妹染色單體交換(SCE)、倍性分析、遺傳擴(kuò)增、雜合性(heterozygousity)喪失以及本領(lǐng)域熟知的其它分析來(lái)進(jìn)行分析。
最后，本發(fā)明申請(qǐng)一種方法，其用于對(duì)從未知樣品(例如從活組織檢查)獲得的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定腫瘤發(fā)展的遺傳傾向性或基因毒性敏感性(例如對(duì)放射或嵌入劑的敏感性)，該方法基本上包括利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，優(yōu)選平行使用對(duì)照細(xì)胞，并且使用特異性分析試劑，包括通過免疫酶法，連續(xù)測(cè)定癌基因如myc、ras或者腫瘤抑制基因如ARF、p16、p53、Brca1的表達(dá)或活化水平。
細(xì)胞周期控制系統(tǒng)(限制點(diǎn))中的組分的突變導(dǎo)致腫瘤敏感性增加，而編碼與DNA雙鏈斷裂修復(fù)有關(guān)的因子的基因中的遺傳缺陷顯示較低的穿透性，盡管這些缺陷與其他危險(xiǎn)因子的組合可決定腫瘤的主要(mayor)發(fā)病率，這些危險(xiǎn)因子可以是例如活性氧類別(ROS)水平的增加，來(lái)自慢性炎癥的因子。
綜合地，本發(fā)明涉及某些不同的方法，所有這些方法的特征均在于在體內(nèi)、先體外后體內(nèi)(ex vivo)或在體外在細(xì)胞中使用本發(fā)明的多肽。具體地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括用于評(píng)估與細(xì)胞周期控制和DNA修復(fù)有關(guān)的遺傳損害的診斷方法，以及用于篩選具有能調(diào)節(jié)這些控制活性的生物學(xué)活性的化合物的方法。本發(fā)明的一些完全不同的方面是基于本發(fā)明的嵌合多肽的生物學(xué)活性，由于用上面描述的特異性誘導(dǎo)了DNA雙鏈斷裂，該嵌合多肽可激活細(xì)胞周期和DNA修復(fù)(限制點(diǎn))的控制途徑。
如在實(shí)施例部分中觀察到的和更詳細(xì)地描述的，而且作為誘導(dǎo)單特異性DNA雙鏈斷裂的結(jié)果，本發(fā)明的多肽顯示治療活性，尤其是抗增殖和抗腫瘤發(fā)生活性。該活性因此代表本發(fā)明的另一個(gè)目的。因此，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含如本發(fā)明中所述的多肽或編碼這些多肽的多核苷酸作為活性物質(zhì)。而且，本發(fā)明包括本發(fā)明的嵌合多肽和/或編碼這些多肽的多核苷酸用于制備預(yù)防、治療或診斷腫瘤疾病或該疾病傾向性的藥物的用途。
本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案包括本發(fā)明的多肽或多核苷酸在腫瘤病理診斷中的診斷用途，或用于診斷如在實(shí)施例部分中詳細(xì)描述的這些疾病的傾向性的診斷用途。
作為一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，例如為了在診斷中的應(yīng)用和如上所述使用，用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理細(xì)胞可應(yīng)用于測(cè)試樣品，并平行用于不含有假定的突變的細(xì)胞系(對(duì)照)。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的分析實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)中包括用本發(fā)明的嵌合蛋白進(jìn)行另外的對(duì)照處理，其中在DNA修復(fù)途徑的選擇的步驟中，使用例如含有突變的測(cè)試細(xì)胞系，通過比較其允許對(duì)各個(gè)遺傳變化進(jìn)行精細(xì)作圖。
在較長(zhǎng)的時(shí)間周期之后，例如在施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)24小時(shí)之后，根據(jù)細(xì)胞是否能修復(fù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的遺傳損害(DNA雙鏈斷裂，DSB)，和在這種情況下，細(xì)胞群體在細(xì)胞周期的不同階段中的分布是否恢復(fù)正常，能夠檢測(cè)差異作用。在編碼ATM的基因中具有突變，或例如在編碼NHEJ(非同源的末端連接)DNA修復(fù)途徑相關(guān)產(chǎn)物的其他基因中有突變的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡不能立即觀察到，但是具有低發(fā)生率的間接作用。相反地，在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中，立即而且是以直接的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。總的說(shuō)來(lái)，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括嵌合蛋白和編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸的用途，用于誘導(dǎo)神經(jīng)元來(lái)源的細(xì)胞的凋亡，優(yōu)選用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤，并因此用于制備治療神經(jīng)元來(lái)源的腫瘤的藥物。
成神經(jīng)細(xì)胞瘤中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與1p36缺失以及雙微體(DM)myc-N癌基因擴(kuò)增相關(guān)。這種超敏性與17q15易位的存在無(wú)關(guān)。DMmyc-N擴(kuò)增是游離型myc-N簇，被認(rèn)為是最具攻擊性的形式的myc-N擴(kuò)增的NB，而且其具有極低的預(yù)后。大部分攻擊性惡性NB顯示這種致癌擴(kuò)增。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，還包括包含癌基因的DM擴(kuò)增的其他腫瘤，用于例示而不是排除，例如包含DM的前列腺癌或乳腺癌的治療。通常，與所述化合物偶聯(lián)的嵌合分子可用于制備治療選擇的腫瘤的藥物。
對(duì)用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理的細(xì)胞應(yīng)答不同于在DNA修復(fù)途徑中具有突變的細(xì)胞，或者顯示負(fù)責(zé)控制這些細(xì)胞周期和/或修復(fù)(限制點(diǎn))的途徑的組分改變的細(xì)胞。因此，本發(fā)明包括一系列方法，所有方法的特征基本上在于以下事實(shí)，通過應(yīng)用本發(fā)明嵌合分子的優(yōu)選實(shí)施方案，在測(cè)試細(xì)胞基因組中誘導(dǎo)DSB，并利用如上所述的試驗(yàn)來(lái)分析應(yīng)答，優(yōu)選通過比較測(cè)試樣品與最可能具有等基因性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的結(jié)果。
在存在自由基(ROS)的誘導(dǎo)物，例如H2O2時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞周期和DNA修復(fù)機(jī)制的作用是協(xié)同的。在極低濃度的嵌合蛋白時(shí)，優(yōu)選低于10nM的SCPVUTAT蛋白質(zhì)和低于10μuM的H2O2時(shí)，也可觀察到這種協(xié)同作用。因此，本發(fā)明包括在基因組中誘導(dǎo)DSB的方法，其特征在于本發(fā)明的蛋白質(zhì)與產(chǎn)活性氧物質(zhì)(ROS)，例如H2O2一起使用的事實(shí)。該方法還可用于篩選拮抗或協(xié)同化合物。
在體內(nèi)的細(xì)胞中誘導(dǎo)DSB激活了細(xì)胞和分子應(yīng)答，其類似于經(jīng)常用于抗腫瘤治療的電離輻射所誘導(dǎo)的應(yīng)答；但是與其相比，顯示了降低的副作用。因此，本發(fā)明一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案包括本發(fā)明的嵌合多肽的用途，用于制備具有抗腫瘤活性的藥物，或用于治療、診斷或預(yù)防遺傳疾病，其又限定了個(gè)體發(fā)生疾病的傾向性，所述疾病是由細(xì)胞的增殖活性失調(diào)所引起的，尤其是包括DNA修復(fù)控制機(jī)制的必需基因產(chǎn)物腫瘤疾病。
基于這方面，本發(fā)明包括一種治療方法，其基本上基于在體內(nèi)或先體外后體內(nèi)施用如上所定義的本發(fā)明的嵌合多肽，其中需要抗增殖作用，優(yōu)選抗腫瘤發(fā)生作用。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括一種方法，其用于對(duì)從生物樣品中獲得的分離的細(xì)胞，體外診斷DNA修復(fù)中的遺傳或體細(xì)胞缺陷，或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的缺陷，該方法基本上由以下步驟組成a)在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)分離的細(xì)胞，打算測(cè)定其DNA修復(fù)途徑或細(xì)胞周期途徑中的效率或損害。
b)這些細(xì)胞與本發(fā)明的優(yōu)選分子一起孵育，其中修飾酶是II類核酸內(nèi)切酶，更優(yōu)選PvuII酶的單鏈型(SCPVU)。有利地，也用顯示特異性DNA結(jié)合活性，但是核酸酶活性降低的對(duì)照多肽如SC34平行處理細(xì)胞。任選的，更進(jìn)一步地平行處理合適的細(xì)胞系，該細(xì)胞系是突變的和/或DNA修復(fù)、DNA修復(fù)和/或細(xì)胞周期控制中有缺陷的，而這些細(xì)胞系優(yōu)選是最具等基因性質(zhì)的；c)細(xì)胞應(yīng)答的表征和測(cè)定；d)任選的與對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行比較。
至于等基因的兩個(gè)或更多細(xì)胞系，是指顯示盡可能最相似的遺傳背景的細(xì)胞系，例如以下細(xì)胞系如以下的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中所述和使用的MRC-5和AT-5；CHO-K1和KU70；MO59K和MO59J。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照細(xì)胞系還可以是在細(xì)胞周期和DNA修復(fù)的控制途徑中沒有變化的正常細(xì)胞系，而且應(yīng)該是最可能與測(cè)試樣品等基因的，或者是具有較好表征的遺傳變化的細(xì)胞系。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞在相同條件下一起生長(zhǎng)。因此，它們以直接方式保持并比較培養(yǎng)標(biāo)記中的差異，例如產(chǎn)克隆能力，凋亡或靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞的％，例如通過利用活的細(xì)胞顏色測(cè)定增殖能力，或通過測(cè)定上述生化標(biāo)記來(lái)進(jìn)行測(cè)定。Torrance C.J.et al.，2001，Nature Biotechnology，19，940-945中描述了這種分析的一個(gè)例子。
在用于表征c)中所述的應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了本領(lǐng)域所熟知的產(chǎn)克隆活性的測(cè)定，例如通過細(xì)胞生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中，或通過測(cè)定隨著在軟瓊脂中生長(zhǎng)的產(chǎn)克隆活性，或通過在DNA染色之后進(jìn)行FACS分析。
本發(fā)明中所述的一個(gè)尤其有用的實(shí)施方案尤其可用于診斷和/或預(yù)后，以評(píng)估發(fā)生腫瘤疾病的遺傳傾向性，腫瘤治療的敏感性，尤其是患者對(duì)放療或化療抗腫瘤治療的耐受性，或者由于預(yù)后原因，腫瘤組織相較于健康組織的敏感性。
本發(fā)明此外還包括進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒，因此優(yōu)選診斷試劑盒或用于研究的試劑盒。
該試劑盒的一些優(yōu)選實(shí)施方案包含1)一個(gè)試管，其含有嵌合多肽，優(yōu)選選自EcoRV、PvuII或HinfI作為單鏈型與Tat傳遞肽融合得到的嵌合核酸內(nèi)切酶，或一種包含編碼嵌合蛋白的多核苷酸的表達(dá)載體，以及另一個(gè)試管，該試管包含對(duì)照多肽，即顯示特異性的DNA結(jié)合活性，但是核酸內(nèi)切酶活性降低的嵌合蛋白，或者包含編碼該嵌合蛋白的多核苷酸的表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括包含嵌合蛋白SCPVUTAT的試管，和有利地包含凍干形式或水溶液中的嵌合蛋白SC34的另一個(gè)試管；2)試劑盒，任選地包含一個(gè)試管，其具有抗全部或部分嵌合多肽的抗體，優(yōu)選抗SCPVUTAT抗體；3)試劑盒，任選地包含一個(gè)試管或燒瓶，其中包含如上所限定的對(duì)照細(xì)胞，例如對(duì)DSB超敏的細(xì)胞，或者在編碼與DNA修復(fù)和細(xì)胞周期途徑及其控制(限制點(diǎn))相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因中含有較好表征的突變的細(xì)胞。這種細(xì)胞可能作為冷凍原種包含或包含在適于運(yùn)輸?shù)臒恐校?)試劑盒，任選地包含化療試劑如嵌入劑、擬輻射物質(zhì)，或其他種類的化學(xué)制劑，包括用于測(cè)定和比較定性和定量作用的藥物。
作為基于優(yōu)選嵌合多肽的活性的另一個(gè)重要的實(shí)施方案，本發(fā)明包括一種方法，該方法通過使用基于細(xì)胞的高通量篩選，在細(xì)胞體系中篩選能調(diào)節(jié)、具有協(xié)同、拮抗作用或不改變DNA修復(fù)活性和/或基因組控制和基因組穩(wěn)定性的組合物，該方法基本上包括如下步驟a)使測(cè)試細(xì)胞與本發(fā)明的嵌合蛋白一起孵育，優(yōu)選存在合適的對(duì)照多肽(在包括一種嵌合分子的特殊情況中，該嵌合分子含有特異性DNA結(jié)合活性，但是顯示核酸內(nèi)切酶活性降低，如嵌合多肽SC34)，任選的還存在協(xié)同的物質(zhì)，例如H2O2或其他的產(chǎn)自由基物質(zhì)和/或其他的調(diào)節(jié)或拮抗物質(zhì)；b)任選地還用其他的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行平行孵育，該對(duì)照細(xì)胞盡可能地與測(cè)試細(xì)胞是等基因的，例如包含報(bào)道基因的相同細(xì)胞。各種報(bào)道基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其中例如包括如Torrance et al.，2001，Nature Biotechnology，19，940-945中所描述的EGFP蛋白和它們的突變體；或其它種類的報(bào)道基因，其可以進(jìn)行有效的自動(dòng)分析讀數(shù)；c)添加組合物，其將被測(cè)試為可能有活性或沒有活性，其中包括例如單一分子，或化學(xué)文庫(kù)，或化學(xué)制劑、肽或其它物質(zhì)的集合，或生物樣品的集合；d)細(xì)胞應(yīng)答的讀數(shù)優(yōu)選以自動(dòng)化模式進(jìn)行，而且優(yōu)選使用高通量的篩選(HTS)裝置。其例子是基于測(cè)定形態(tài)學(xué)表型變化的系統(tǒng)，這種變化如作為對(duì)對(duì)照物質(zhì)和在細(xì)胞中顯示生物學(xué)活性的陽(yáng)性測(cè)試物質(zhì)的應(yīng)答而誘導(dǎo)的熒光信號(hào)。細(xì)胞應(yīng)答可包括任何細(xì)胞信號(hào)或來(lái)自包含的生化標(biāo)記的信號(hào)，或原野結(jié)合可以進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)的系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞參數(shù)，例如鈣通量、自由基通通、細(xì)胞色素C的變化。
在本發(fā)明的這種方法中，步驟b)和c)的順序可以顛倒。
該分析可以篩選具有重要生物學(xué)活性的組合物，該活性如控制細(xì)胞周期、DNA修復(fù)途徑、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)衰老、或通過中斷一個(gè)途徑而激活另一個(gè)途徑。
第一輪篩選獲得的分離的化合物在有利地修飾之后，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的篩選循環(huán)，以最終獲得更適合藥用的組合物，或選擇另外的有利的特征，例如生物相容性或產(chǎn)物穩(wěn)定性。
除了以上所述的更進(jìn)一步的方面之外，本發(fā)明還包括一種方法，該方法用于誘導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)阻斷，或者可選擇地優(yōu)選在神經(jīng)元起源的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者可選擇地在分離的細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA修復(fù)，該方法基于使用本發(fā)明的嵌合分子，優(yōu)選為II類限制性核酸內(nèi)切酶，甚至更優(yōu)選作為單鏈型，或甚至更優(yōu)選為酶SCPVUTAT，以及編碼這些分子的多核苷酸，其中在存在如產(chǎn)自由基劑的組合物時(shí)，這種作用是協(xié)同的。這些方法基本上是基于用本發(fā)明的嵌合多肽誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的原則。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括一種用于篩選新的穿透序列和篩選輔助序列的方法。在該實(shí)施方案中，穿透或輔助序列不是由單一化合物組成的，而是使用化合物文庫(kù)分子篩選推斷的穿透或輔助結(jié)構(gòu)域。這些方法是非常適用于能分析許多不同樣品的高通量篩選。本發(fā)明中描述的用于診斷的原則也是篩選方法的基礎(chǔ)，該篩選方法可發(fā)現(xiàn)基本上可用于任何細(xì)胞型或生物的新的穿透序列和輔助序列。自動(dòng)化的和機(jī)器人裝置可執(zhí)行下面的步驟，具有高通量能力。這可用本領(lǐng)域已知的移液和讀數(shù)單元進(jìn)行。用于舉例而不是排除，對(duì)特異性輔助或穿透序列的篩選基本上包括以下步驟1.對(duì)于特異性輔助序列，穿透序列是恒定的，而且用本領(lǐng)域的方法構(gòu)建本發(fā)明的嵌合蛋白的文庫(kù)。舉一個(gè)例子，不同的輕鏈和功能性CDRL片段融合到本發(fā)明的嵌合蛋白的N末端，然后與融合到包含功能性CDR1-3H區(qū)域的可變重鏈免疫球蛋白的本發(fā)明相同蛋白質(zhì)混合。這可通過重組技術(shù)在2個(gè)質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選在大腸桿菌中獲得。通常，免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或受體結(jié)合蛋白質(zhì)的文庫(kù)，或從合成或天然來(lái)源產(chǎn)生的隨機(jī)文庫(kù)，可通過重組技術(shù)或如上所述的其他偶聯(lián)方法與本發(fā)明的蛋白質(zhì)連接。例如，抗體片段文庫(kù)可通過結(jié)合于本發(fā)明分子中包含的蛋白質(zhì)A而與本發(fā)明的蛋白質(zhì)連接。
2.對(duì)于穿透序列篩選的情況，可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)獲得文庫(kù)。例如，這些文庫(kù)可獲自天然來(lái)源或合成來(lái)源，包括任何種類的化合物。一個(gè)尤其有利的實(shí)施方案，從來(lái)自相同或來(lái)自不同物種的隨機(jī)DNA片段篩選細(xì)菌穿透序列。
3.培養(yǎng)表達(dá)文庫(kù)蛋白質(zhì)的細(xì)菌，并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生?？蓮姆置谙到y(tǒng)以及細(xì)胞裂解的上清液中分離這些蛋白質(zhì)，接著使用例如不同的親和標(biāo)簽高通量親和制備嵌合蛋白，這些親和標(biāo)簽如聚組氨酸標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽、蛋白質(zhì)A標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA-標(biāo)簽或生物素。
4.這些蛋白質(zhì)用于分析來(lái)自文庫(kù)的給定分子的功能或差示功能。如果序列是功能性的，則嵌合蛋白是功能性的。當(dāng)它們能跨過細(xì)胞膜并最終跨過核膜，而且與DNA結(jié)合，并偶爾引入DSB時(shí)，情況是這樣。或者對(duì)于輔助篩選，當(dāng)可在選擇的細(xì)胞中檢測(cè)到功能時(shí)，情況是這樣。檢測(cè)可如上所述進(jìn)行。
5.測(cè)試細(xì)胞或組織可以是任何來(lái)源的，包括原核細(xì)胞，其中本發(fā)明的嵌合蛋白的功能可以按照如上所述的模式進(jìn)行檢測(cè)。
6.在一個(gè)尤其有用的實(shí)施方案中，為了容易讀數(shù)，測(cè)試細(xì)胞用EGFP(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染；7.在另一個(gè)特別有用的實(shí)施方案中，對(duì)照細(xì)胞例如用EYFP(增強(qiáng)的黃色熒光蛋白)進(jìn)行區(qū)別地穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；8.測(cè)試和對(duì)照細(xì)胞或者分開生長(zhǎng)，或者在多孔的裝置中或在特異性膜上混合生長(zhǎng)。細(xì)胞可能很類似，只具有一個(gè)改變(即，用于發(fā)現(xiàn)輔助序列，如來(lái)自相同來(lái)源的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞)或非常不同(即，測(cè)試細(xì)胞是應(yīng)當(dāng)發(fā)生傳遞的細(xì)胞，而對(duì)照細(xì)胞不一定發(fā)生傳遞；這還包括來(lái)自不同種的細(xì)胞，如測(cè)試細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，而對(duì)照細(xì)胞是人類來(lái)源的)。細(xì)胞的選擇可以是任何技術(shù)上可能的組合。
9.添加蛋白質(zhì)到細(xì)胞的上清液，并進(jìn)行孵育；10.將對(duì)如上面例子中所述的嵌合分子的功能讀數(shù)。在一個(gè)特別有利的例子中，對(duì)如上制備的綠色和黃色細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。利用本領(lǐng)域熟知的重組和質(zhì)譜方法，通過反向篩選(back-screening)和分析，進(jìn)一步分離能產(chǎn)生顯著多于綠色細(xì)胞的黃色細(xì)胞的蛋白質(zhì)作為單克隆。在嵌合分子進(jìn)入細(xì)胞后引入DNA損傷的優(yōu)選應(yīng)用中，這種分析甚至更靈敏。通過基因破壞或基因沉默或引入顯性陰性或顯性增加的功能突變體，使測(cè)試細(xì)胞(即腫瘤細(xì)胞)和對(duì)照細(xì)胞(即相應(yīng)的非致瘤的)對(duì)DSB引入具有超敏性。這可通過本領(lǐng)域熟知的方法獲得，例如通過用siRNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過使用表達(dá)siRNA的載體，用于基因破壞或誘變的靶向載體，用于表達(dá)突變體或過量產(chǎn)生能抑制DNA修復(fù)中的重要功能并顯示對(duì)DSB、化學(xué)抑制劑或活化劑有超敏性的蛋白質(zhì)的載體。這允許在低濃度時(shí)更快地和更差示地讀數(shù)。例如，Ku70、Ku80、DNAPKcs、ATM、XRCC4和連接酶IV、Bcl2的siRNA抑制。以及化合物例如咖啡因?qū)TM的抑制。也可引入P53或其他的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子。
11.為了再次更進(jìn)一步地最后確認(rèn)篩選獲得的序列，優(yōu)選使用自動(dòng)化步驟-確認(rèn)含有純蛋白質(zhì)的克隆-滴定濃度；-以核酸酶致死模式測(cè)試選擇的序列；-測(cè)試其他的細(xì)胞；-在小鼠中測(cè)試毒性。
本發(fā)明更進(jìn)一步地通過以下的實(shí)施例和附圖進(jìn)行描述，但是它們不是對(duì)本發(fā)明的限制。


圖1.從大腸桿菌中純化SCPVUTATSCPVUTAT的表達(dá)和純化誘導(dǎo)包含用于SCPVUTAT的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)并如實(shí)驗(yàn)部分中所述的進(jìn)行純化。NI和I分別表示從未誘導(dǎo)或誘導(dǎo)的大腸桿菌中提取的總細(xì)胞提取物。H1和H2是在Hi Trap螯合Ni++瓊脂糖柱上進(jìn)行純化所獲得的峰級(jí)分；S1和S2是在SP-Sepharose柱上進(jìn)行純化所獲得的峰級(jí)分；M表示分子量標(biāo)記(，從上到下以kDa為單位94，67，43，33，20，14)；SCPVU表示不含有TAT序列，并以類似方式進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)。
圖2.在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，對(duì)來(lái)自U2OS細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物的免疫學(xué)分析。
分析的蛋白質(zhì)為濃度逐漸增加的SCPVUTAT(1，19，50，100，200nM；泳道2-6)，SCPVU(200nM，不含有TAT序列，泳道7)，SC34(200nM，不顯示酶活性的SCPVUTAT衍生物，泳道8)，對(duì)照(沒有向細(xì)胞中添加蛋白質(zhì)，泳道1)。添加蛋白質(zhì)到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中10分鐘之后，用PBS進(jìn)行充分洗滌后制備提取物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并利用PvuII的單特異性抗體通過免疫印跡進(jìn)行分析(下圖，進(jìn)入)。為了進(jìn)行比較，在分析中也包括在提取物制備之前取的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的等分試樣(上圖，上清液)。
圖3.通過共焦顯微術(shù)進(jìn)行的免疫熒光分析用SCPVUTAT進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)30分鐘之后，洗滌細(xì)胞，用3％PFA進(jìn)行固定，用PvuII單特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記，并用FITC偶聯(lián)的第二抗體進(jìn)行染色，用于共焦免疫熒光分析(綠色，下圖)。另外，在RNAse A消化之后，用丙錠J-獲得DNA共染色(紅色，上圖)。
圖4.為在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DSB而進(jìn)行的TUNEL分析用SCPVUTAT處理U2OS細(xì)胞，在存在dUTP-FITC (TUNEL)時(shí)用TdT進(jìn)行標(biāo)記之后，利用共焦免疫熒光顯微術(shù)分析DSB。用100nM SCPVUTAT進(jìn)行指定時(shí)間的處理。
圖5.SCPVUTAT誘導(dǎo)的核酸酶依賴的細(xì)胞周期延遲通過FACS分析，分析蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的不同細(xì)胞周期階段的分布。檢測(cè)細(xì)胞群體的DNA含量的分布。2n表示二倍體DNA等同物(非復(fù)制的；G1期)，4n表示四倍體DNA等同物(復(fù)制的；G2/M期)。為了進(jìn)行FACS分析，使用可評(píng)估單細(xì)胞的DNA含量的DDM模式來(lái)分離細(xì)胞。在指定的含量逐漸增加的SCPVUTAT(10nM，50nM，100nM)存在下，U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)(上排)或48小時(shí)(下排)，只添加蛋白質(zhì)；未處理的細(xì)胞(對(duì)照)；用核酸酶處理的SCPVUTAT衍生物(SC34，100nM)處理的細(xì)胞。所示的所有直方圖表示相對(duì)于只在右上圖所示的細(xì)胞數(shù)的DNA含量。
圖6.SCPVUTAT誘導(dǎo)的激酶活性。
使用組蛋白H1作為底物，和細(xì)胞周期蛋白B1特異性免疫沉淀物，來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期蛋白B1激酶活性，該免疫沉淀物來(lái)自于從不用或用SCPVUTAT(100nM)處理或用諾考達(dá)唑(0.2μg/ml)處理30小時(shí)的生長(zhǎng)的U2OS細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)提取物。在存在γ32P-ATP的情況下，使細(xì)胞周期蛋白B1特異性免疫沉淀物與組蛋白H1一起孵育，反應(yīng)混合物在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并通過放射自顯影術(shù)進(jìn)行分析。底下的數(shù)字表示通過磷成象儀分析所測(cè)定的相對(duì)活性。
圖7.SCPVUTAT處理之后細(xì)胞周期停滯的生化標(biāo)記。
A)用含有平末端DSB的3′-OH和5′-磷酸誘導(dǎo)p53。U2OS細(xì)胞(泳道1-7)和HCT116(泳道8-14)用SCPVUTAT(100nM，SC)或用阿霉素(多柔比星，0.02μg/ml，AD)處理指定的時(shí)限；未處理的細(xì)胞用作對(duì)照(泳道0)。制備提取物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并利用p53的特異性抗體(上圖，p53)或PARP的特異性抗體(下圖，PARP)，通過免疫印跡進(jìn)行分析。
B)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(ATM)蛋白對(duì)SCPVUTAT的修復(fù)應(yīng)答。p53的SCPVUTAT依賴的Ser15磷酸化。用SCPVUTAT(100nM，SC)或用羥基脲(ImM，HU)處理ATM陽(yáng)性細(xì)胞系MRC5指定的時(shí)間；未處理的細(xì)胞用作對(duì)照(0)。制備提取物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并利用p53 Ser15的特異性抗體(上圖，Ser15，p53)或肌動(dòng)蛋白的特異性抗體(下圖，肌動(dòng)蛋白)，通過免疫印跡進(jìn)行分析。
C)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(ATM)蛋白對(duì)SCPVUTAT的修復(fù)應(yīng)答。
p53的SCPVUTAT依賴的Ser15磷酸化的咖啡因敏感性。在存在咖啡因(2mm)時(shí)，ATM陰性的AT-5細(xì)胞在咖啡因(2mM)存在下用SCPVUTAT(100nM，SC)或用羥基脲(1mM，HU)處理4小時(shí)；未處理的細(xì)胞和只用咖啡因處理的細(xì)胞用作對(duì)照。制備提取物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并利用p53，p53 Ser15的特異性抗體(上圖，Ser15，p53)或肌動(dòng)蛋白的特異性抗體(下圖，肌動(dòng)蛋白)，通過免疫印跡進(jìn)行分析。
圖8.與未突變的細(xì)胞(MRC-5)相比，用SCPVUTAT誘導(dǎo)ATM突變的細(xì)胞(AT-5)的細(xì)胞周期阻斷和產(chǎn)克隆(clonogenic)活性。
A)SCPVUTAT處理(25nM，100nM)，或用阿霉素(0.02μg/ml；阿霉素)，或用SC34(100nM)處理36小時(shí)之后，通過對(duì)AT-5細(xì)胞的FACS分析來(lái)檢測(cè)細(xì)胞周期期間DNA含量的分布，用未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。直方圖表示相對(duì)于細(xì)胞數(shù)量的DNA含量；在右方的表格表示用MODFITTM程序包計(jì)算的不同細(xì)胞周期階段的相應(yīng)分布的百分比。
B)用ATM突變的，并通過SCPVUTAT誘導(dǎo)DNA損傷的細(xì)胞系進(jìn)行集落形成試驗(yàn)。不同稀釋度的AT-5或MRC-5(用作ATM陽(yáng)性對(duì)照)用SCPVUTAT(25nM，灰色條；100nM，黑色條)處理60分鐘或不進(jìn)行處理(白色條)；洗滌細(xì)胞，然后生長(zhǎng)7-10天，用姬姆薩染料染色，并計(jì)算集落。通過直方圖顯示概括的結(jié)果，其表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值以及在所示10％-15％范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。未處理的細(xì)胞設(shè)為100％，表示AT-5細(xì)胞的黑色條接近0％，因此沒有標(biāo)明。
圖9.在與NHEJ途徑有關(guān)的單個(gè)蛋白質(zhì)中具有所選突變的細(xì)胞的產(chǎn)克隆活性的比較。
對(duì)用SCPVUTAT處理的與NHEJ修復(fù)途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)突變的CHO細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)克隆分析。使用的細(xì)胞系為AA8(親本系)，V3(DNA-PCCs(-/))，xrss5(KU80(-/-))和XR-1(XRCC4(-/-))，HIS P1.13-11(KU70(-/-))，以及相應(yīng)的親本細(xì)胞系CHO-K1。不同稀釋度的包含指定的NHEJ突變的CHO細(xì)胞用SCPVUTAT(25nM，灰色條；100nM，黑色條)處理24小時(shí)或不進(jìn)行處理(白色條)；洗滌細(xì)胞，然后生長(zhǎng)7-10天，用姬姆薩染料染色，并計(jì)算集落。通過直方圖顯示概括的結(jié)果，其表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值以及在所示10％-15％范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。未處理的細(xì)胞設(shè)為100％，表示V3細(xì)胞(DNA-PCcs(-/-))的黑色條低于1％，因此沒有標(biāo)明。
圖10.SCPVUTAT處理之后，成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的差示誘導(dǎo)。
SCPVUTAT處理(10nM，圖C；100nM，圖B)之后，對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的丙錠J-染色的DNA含量進(jìn)行FACS分析。樣品處理30小時(shí)。用SC34處理的樣品(100nM，圖D)或未處理(圖A)的樣品作為對(duì)照。在每個(gè)圖的底部標(biāo)明了獲得的細(xì)胞周期階段分布的代表性百分比(G1/S/G2-M)。(A)表示凋亡的細(xì)胞。
圖11.低濃度的SCPVUTAT和亞致死濃度的H2O2的協(xié)同作用。
U2OS細(xì)胞與SCPVUTAT(10nM，圖B)，或與H2O2(10μM，圖C)，或與兩者(SCPVUTAT，10nM；H2O2，10μM；圖D)一起孵育，或者不添加試劑作為對(duì)照(圖A)。更進(jìn)一步地，利用FACS分析處理細(xì)胞的DNA含量；在每個(gè)直方圖的底部標(biāo)明了不同細(xì)胞周期階段的百分比。
圖12.組蛋白2AXSer-139磷酸化的顯微分析，和PI3/ATM激酶抑制劑渥曼青霉素對(duì)這種磷酸化作用的抑制。
U2OS細(xì)胞用SCPVUTAT(100nM，中間一列)處理60分鐘，而且用渥曼青霉素(50μM，WM，右邊一列)進(jìn)行處理，或者不添加試劑作為對(duì)照(左邊一列)。處理之后，細(xì)胞用磷酸化的H2AX-Ser-139(紅色)或組蛋白2B(用作對(duì)照，綠色)的特異性抗體進(jìn)行染色，并通過熒光顯微術(shù)在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析。
圖13.通過自動(dòng)分析，測(cè)定DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PKCS)催化亞基突變的細(xì)胞的超敏性。
A)利用Versadoc 4(BioRad)成象裝置，使用顯色的細(xì)胞，來(lái)評(píng)估突變細(xì)胞和相應(yīng)的正常細(xì)胞的增殖能力。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并表示為直方圖。SCPVUTAT處理之后，用人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系MO59J(DNA-PKCS(-/-)，與MO59K細(xì)胞(DNA-PKcs(+/+))相比，進(jìn)行集落形成試驗(yàn)。顯示了集落形成試驗(yàn)的一個(gè)例子。使用不同濃度的細(xì)胞，以3個(gè)數(shù)量級(jí)(從上到下行，1×104，2×103，4×102，8×10)進(jìn)行分析。在右邊的B)中，顯示了與MO59K相比，細(xì)胞系MO59J的集落形成試驗(yàn)結(jié)果的直方圖。如圖9所示進(jìn)行分析，但是利用Versadoc 4(BioRad)系統(tǒng)進(jìn)行分析。白色條未處理的樣品；灰色條25nM SCPVUTAT；黑色條100nM SCPVUTAT。
圖14.用SCPVUTAT處理之后，細(xì)胞周期控制蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。
未處理的，或用SCPVUTAT(100nM)處理30小時(shí)，或用紫杉醇(0.2μg/ml)處理的HCT116(p53(+/+))細(xì)胞的顯微分析。使用細(xì)胞周期蛋白B1特異性的或Cdc25C特異性的第一抗體，并用FITC(綠色，細(xì)胞周期蛋白B1)或TRITC(紅色，Cdc25C)的第二偶聯(lián)物進(jìn)行顯色，來(lái)進(jìn)行免疫熒光分析。
實(shí)施例實(shí)施例1用于表達(dá)重組蛋白的載體的構(gòu)建為了下面實(shí)施例中所述的試驗(yàn)，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法制備下列重組蛋白SCPVU，同型二聚體核酸內(nèi)切酶PvuII的單鏈變體，Simoncsits et al.2001中已經(jīng)描述。向該構(gòu)建體的C末端添加編碼GSYGRKKRRQRRRGGSHHHHHH的序列，該序列包含HIVTat蛋白部分，接著是一個(gè)六組氨酸標(biāo)簽。以這種方法獲得的重組融合蛋白被稱為SCPVUTAT。這形成了一種多肽，其包含酶PvuII的氨基酸1-157，接著是連接酶PvuII的第一個(gè)亞基與第二亞基(氨基酸2-157)的含有序列GSGG的接頭，接著為序列GSYGRKKRRQRRRGGS-HHHHHH(tat-肽+六組氨酸標(biāo)簽)。更進(jìn)一步地，核酸內(nèi)切酶PvuII的變體SC34(Simoncsits et al.，2001)制備為單鏈多肽。該衍生物顯示PvuII的特異性DNA結(jié)合活性，但是由于在PvuII酶的兩個(gè)亞基的位點(diǎn)34處的突變(Asp34/Gly34)，其核酸內(nèi)切酶活性降低。
實(shí)施例2
重組蛋白的表達(dá)及純化。
在大腸桿菌菌株XL1MRF’(Simoncsits et al.，2001)中表達(dá)SCPVUTAT，該蛋白質(zhì)首先在HiTrap螯合親和柱(5ml，AmershamPharmacia Biotech)上進(jìn)行純化，然后在SP-Sepharose(5ml HiTrap SPHP，Amersham Pharmacia Biotech)上進(jìn)一步純化。在SP-Sepharose上，在0.63M與0.67M NaCl之間洗脫蛋白質(zhì)。產(chǎn)量為1.5升培養(yǎng)基大約10mg純化的蛋白質(zhì)。以同樣的方法制備與TAT序列融合的天然PvuII蛋白質(zhì)(不作為單鏈型)。在該情況下，在0.81M與0.85MNaCl之間從SP-Sepharose上洗脫蛋白質(zhì)。根據(jù)在15％SDS-PAGE上進(jìn)行的凝膠電泳判斷，把所有表達(dá)的蛋白質(zhì)純化成均一性的，而且用API 150EX(Perkin Elmer)進(jìn)行質(zhì)譜分析，來(lái)確定理論質(zhì)量。經(jīng)使用λDNA作為底物測(cè)定，獲得的核酸內(nèi)切酶衍生物的酶活性與天然酶的酶活性相當(dāng)。
實(shí)施例3抗體的產(chǎn)生和免疫學(xué)分析。
抗重組蛋白的抗體通過例如以下所述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備和使用″Using AntibodiesA Laboratory Manual″，Ed Harlow，and David Lane；CSH press New York，1999，ISBN 0-87969-544-7，″CellsA LaboratoryManual″，David L Spector，Robert D.Goldman；Leslie A.Leinwand；CSH press New York，1998，ISBN 0-87969-521-8。用適當(dāng)?shù)目乖庖咝挛魈m白兔獲得抗體，用固定于BrCN-Sepharose(AmershamPharmacia Biotech)上的相應(yīng)的抗原純化血清。用于免疫印跡法的細(xì)胞提取物如下獲得將細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑例如20μM TPCK、20μM TLCK、磷酸酶抑制劑60mM 4-硝基苯磷酸鹽的20mM Tris HClpH8.0，5mM EDTA，150mM NaCl中裂解，或直接在SDS加樣緩沖液中裂解。例如在將細(xì)胞在3％低聚甲醛中固定或在丙酮和甲醇的1∶1混合物中固定之后，通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行免疫熒光分析?？贵w染色之后，使用與LSM510共焦單元連接的Zeiss Axiovert 100M顯微鏡進(jìn)行分析。
實(shí)施例4嵌合蛋白向真核細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
以下細(xì)胞系用于實(shí)施例4-11NHEJ修復(fù)途徑缺陷細(xì)胞系CHO系Xrss5(KU80(-/-))，Xr-1(XRCC4(-/-))，V3(DNA-PKcs(-/-))和相應(yīng)的親本細(xì)胞系A(chǔ)A8(ATCCCRL1859)以及細(xì)胞系HIS P1.13-11(KU70(-/-))和相應(yīng)的親本細(xì)胞系CHO-K1(ATCC CCL61)。這些細(xì)胞系生長(zhǎng)于含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中。還使用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系MO59J(DNA-PKcs(-/-))，和相應(yīng)的親本系MO59K(DNA-PKcs的野生型)(Lees-MillerSP，et a1.Science 1995，267(5201)1183-5)，其生長(zhǎng)于含有10％FCS的DMEM/NUT.MIX-F121:1培養(yǎng)基中。
AT-5系源自于具有缺陷的ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白)的個(gè)體，而且使用MRC-5作為相應(yīng)的親本細(xì)胞系(Raj K，et al.Nature.2001，412(6850)914-7)，二者都培養(yǎng)于含有10％FCS的DMEM中。
成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32(ATCC CCL-127)、GI-LIN和LAN-5(Panarello C.et al.Cancer Genet.Cytogenet.，2000，116124-132)生長(zhǎng)于包含必需氨基酸和10％FCS的RPMI培養(yǎng)基+25mM Hepes中。
人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS(ATCC HTB96)、初級(jí)成纖維細(xì)胞IMR90(早代)生長(zhǎng)于含有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中。
結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116(錯(cuò)配修復(fù)基因人MLH1蛋白缺陷(Raj K，et al.Nature.2001，412(6850)914-7))生長(zhǎng)于含有10％FCS的McCoy′s培養(yǎng)基中。
在U2OS骨肉瘤細(xì)胞和IMR90初級(jí)成纖維細(xì)胞中測(cè)定嵌合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。這些細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10％FCS的DMEM中，并通常在抗生素的存在下，用處于相同培養(yǎng)基中的本發(fā)明蛋白質(zhì)進(jìn)行處理。細(xì)胞與逐漸增加量的融合蛋白SCPVUTAT(1，10，50，100，200nM)，與蛋白質(zhì)SCPVU(沒有TAT的單鏈PvuII)，與作為對(duì)照的SC34(除了酶PvuII在位點(diǎn)34含有突變以外，如對(duì)于SCPVUTAT所述制備)一起孵育10分鐘之后，制備細(xì)胞提取物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并利用PvuII的單特異性抗體，通過免疫印跡分析來(lái)進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)一步在孵育30分鐘之后，通過使用PvuII特異性抗體的免疫熒光分析，和利用碘化丙錠的核共染色，，來(lái)分析吸收。數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)證明，蛋白質(zhì)SCPVUTAT富集于細(xì)胞中，尤其是細(xì)胞核中，如圖2所示，分析的細(xì)胞的吸收率接近100％。相反，不含tat序列的融合蛋白(SCPVU)沒有進(jìn)入。這些富集不依賴于蛋白質(zhì)的變性，因?yàn)槭褂玫牡鞍踪|(zhì)是可溶的，而且是在天然的非變性條件下制備的。實(shí)際上，通過描述的方法并在天然條件下制備的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面更有效，而且優(yōu)于最近在Dowdy USP6,221,335專利中描述的用于其他蛋白質(zhì)的變性方法。
實(shí)施例5用本發(fā)明的重組蛋白體內(nèi)處理之后，通過TUNEL分析證實(shí)DSB誘導(dǎo)。
用SCPVUTAT對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短暫處理之后，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)dUTP-FITC，在體內(nèi)標(biāo)記DSB的TUNEL反應(yīng)(原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒，Roche Diagnostic，Mannheim Germany)中分析蛋白質(zhì)的功能。在溶于PBS中的4％低聚甲醛，0.1％Triton中固定細(xì)胞之后，進(jìn)行該分析。TUNEL反應(yīng)之后，用丙錠J-對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。核酸酶活性降低的衍生物如構(gòu)建體SC34用作陰性對(duì)照，可以評(píng)估背景活性。用融合蛋白SCPVUTAT處理短暫的10分鐘之后，所有測(cè)試的細(xì)胞都顯示(90-100％)TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)。測(cè)試的細(xì)胞包括人或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系，包括上皮細(xì)胞(HEK-293、MCF-7、HCT116，后者是顯示錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1缺陷的一種結(jié)腸癌細(xì)胞系)、初級(jí)成纖維細(xì)胞(WI83、IMR90、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、MEF)。除了本發(fā)明的融合蛋白有效地傳遞到細(xì)胞的細(xì)胞核中之外，這還證實(shí)了在迄今分析的所有細(xì)胞型中都顯示體內(nèi)核酸內(nèi)切活性。實(shí)際上，用SCPVUTAT處理幾分鐘和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中低至10nM的蛋白質(zhì)濃度，在大多數(shù)細(xì)胞中產(chǎn)生顯著的TUNEL活性，從而證明該嵌合蛋白在體內(nèi)直接和迅速的功能。這方面使本發(fā)明中所述的系統(tǒng)比從轉(zhuǎn)錄單元誘導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，或比任何其它蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染類型如電穿孔法或磷酸鈣沉淀法或脂質(zhì)衍生物即脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法更有效。該活性是不依賴于細(xì)胞周期階段的，而且在大多數(shù)細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)，這是通過丟失的細(xì)胞凋亡陽(yáng)性標(biāo)記(即細(xì)胞色素C釋放或陽(yáng)性膜聯(lián)蛋白(Anexin)V染色)所證明的。
圖4中，顯示了U2OS細(xì)胞用SCPVUTAT或SC34處理30分鐘之后進(jìn)行的TUNEL分析所獲得的結(jié)果，這類分析證明了SCPVUTAT構(gòu)建體的功能。
實(shí)施例6用本發(fā)明的蛋白質(zhì)處理對(duì)細(xì)胞周期的影響的評(píng)估。
最后，為了證實(shí)體內(nèi)產(chǎn)生的DSB還誘導(dǎo)了細(xì)胞周期的擾動(dòng)，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)對(duì)細(xì)胞周期不同階段的DNA含量進(jìn)行分析。在不同時(shí)間點(diǎn)用不同濃度的不同蛋白質(zhì)進(jìn)行處理之后，細(xì)胞在70％乙醇中固定，用RNAse A進(jìn)行處理，并用丙錠J-進(jìn)行染色。
使用FACSCaliburTM(Becton Dickinson)儀器進(jìn)行FACS分析。獲得的數(shù)據(jù)用CellQuestTM軟件程序包進(jìn)行評(píng)價(jià)。每個(gè)樣品以DDM模式分析至少3×104單一事件。用MODFIT LTTM軟件程序包進(jìn)行細(xì)胞周期期間DNA含量分布的統(tǒng)計(jì)分析。2N二倍體DNA含量對(duì)應(yīng)于細(xì)胞周期的G1期的細(xì)胞，4N表示相對(duì)的四倍體DNA含量，對(duì)應(yīng)于細(xì)胞周期的G2和/或M期。中間DNA含量表示S期，對(duì)應(yīng)于細(xì)胞周期期間主動(dòng)復(fù)制DNA的群體，低于二倍體2N的含量表示細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。
圖5中顯示，與10nM的蛋白質(zhì)SCPVUTAT孵育24小時(shí)足以誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞四倍體群體的增加。用新鮮培養(yǎng)基稀釋SCPVUTAT蛋白質(zhì)使細(xì)胞在24小時(shí)重新進(jìn)入正常循環(huán)群體，而連續(xù)添加SCPVUTAT(即每12小時(shí))在所分析的大多數(shù)細(xì)胞中導(dǎo)致穩(wěn)定誘導(dǎo)的細(xì)胞周期延遲，而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用蛋白質(zhì)SC34和SCPVU(不含TAT結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行類似的處理未顯示細(xì)胞周期分布有任何改變。
其他的方法可能有助于最后鑒別在FACS分析中檢測(cè)為四倍體(4N)群體的G2與M期；即，在用100nM SCPVUTAT處理的包含4NDNA的HCT116和U2OS細(xì)胞中，細(xì)胞核仍然很大，而且不顯示任何有絲分裂結(jié)構(gòu)或沒有核被膜破裂，這表示細(xì)胞仍然處于G2期，而且不顯示任何向細(xì)胞周期的M期的進(jìn)展，因此顯示G2細(xì)胞周期阻斷?？墒褂闷渌治鰜?lái)證明Cdc2-細(xì)胞周期蛋白B復(fù)合物的激酶活性。而且，有絲分裂的啟動(dòng)，即用微管阻斷劑諾考達(dá)唑或紫杉醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)，可通過Cdc2激酶的核活性，以及通過Cdc25C的核定位來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這些分析可以詳細(xì)分析SCPVUTAT處理之后精確的細(xì)胞周期停滯點(diǎn)，而且這更進(jìn)一步地可以檢測(cè)細(xì)胞周期的該階段相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照的擾動(dòng)。本領(lǐng)域熟知也可用于細(xì)胞周期的其他階段的類似實(shí)驗(yàn)。圖7A中所示的分析和圖14中所示的免疫熒光分析顯示了這類實(shí)驗(yàn)的實(shí)例。所示的實(shí)驗(yàn)顯示，在用融合蛋白SCPVUTAT處理的細(xì)胞系HCT116中，誘導(dǎo)了DSB和隨后的對(duì)應(yīng)于S/G2晚期的細(xì)胞周期階段中的可逆阻斷。
實(shí)施例7蛋白質(zhì)對(duì)具有ATM/ATR突變的細(xì)胞的影響。
共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ATM)和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張相關(guān)突變蛋白(ATR)是在響應(yīng)DNA損傷的限制點(diǎn)活化期間的主要信號(hào)成分。這些途徑協(xié)調(diào)細(xì)胞周期進(jìn)展和DNA修復(fù)機(jī)制。這些控制確保了在細(xì)胞損傷情況下事件的合適順序，即，在DNA修復(fù)之前，細(xì)胞不進(jìn)展到細(xì)胞周期的后續(xù)階段。這暗示可通過抑制細(xì)胞周期激酶和伴隨的負(fù)調(diào)節(jié)物誘導(dǎo)來(lái)控制細(xì)胞周期機(jī)制，所述負(fù)調(diào)節(jié)物包括腫瘤抑制劑如p53和它們的已知轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)(即p21、14-3-3sigma)，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻斷的蛋白質(zhì)，這對(duì)于負(fù)責(zé)DNA修復(fù)的效應(yīng)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確功能或精確保真度是重要的。重要的是要注意，許多這些調(diào)節(jié)蛋白的突變顯示了強(qiáng)烈的癌癥傾向性。
用2mM咖啡因，一種甲基黃嘌呤(metylxantin)衍生物(IC50＜1mM)，處理U2OS細(xì)胞，誘導(dǎo)了細(xì)胞周期G1期的中度延遲，而且這種抑制作用使細(xì)胞對(duì)DNA損傷敏感(Sarkaria et al.，1999)?？梢员砻骺Х纫蛞种屏肆姿峒〈?激酶(PI3)類別中至少3個(gè)成員的催化活性，這些成員全都包含同源的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)域(PIKK)ATM、ATR和TOR。在含有100nM SCPVUTAT以及2mM咖啡因的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了30小時(shí)的U2OS細(xì)胞不顯示SCPVUTAT的特有的細(xì)胞周期停止，但是誘導(dǎo)了中度的G1延遲。這證明了咖啡因是SCPVUTAT體內(nèi)作用的拮抗物。最后的實(shí)驗(yàn)證明，咖啡因在體外既不抑制SCPVUTAT，也不影響該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。用于這些實(shí)驗(yàn)的同樣理論可用于篩選SCPVUTAT的拮抗組合物，該組合物在“體內(nèi)”具有活性，而且組成一般的組合物或先導(dǎo)化合物，其具有作為ATM和/或ATM/ATR途徑抑制劑的活性。然后可使用合適的突變細(xì)胞系最終詳細(xì)分析對(duì)ATM/ATR或?qū)εc該途徑相關(guān)的任何其他蛋白質(zhì)的特異性。由于SCPVUTAT的直接較好表征的和單特異性的活性，這些分子可有利地用于該分析。本發(fā)明的易用性使其還可大規(guī)模地例如高通量地用于這類分析中，有利地聯(lián)合應(yīng)用組合化學(xué)和/或組合分子生物學(xué)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用SCPVUTAT監(jiān)控取決于ATM/ATR激活的事件。對(duì)于與DNA損傷激活的限制點(diǎn)相關(guān)的許多底物，ATM用作絲氨酸/蘇氨酸激酶。底物的磷酸化作用能或不能影響限制點(diǎn)應(yīng)答的激活。體內(nèi)已知的ATM或ATM依賴性激酶的底物包括Nbsl、SMC1(染色體結(jié)構(gòu)維持)、MDC1(DNA損傷的介質(zhì))、H2AX(組蛋白2Ax)、p53。
分析了ATM/ATR響應(yīng)SCPVUTAT對(duì)p53-Ser15底物的體內(nèi)誘導(dǎo)。Ser15上p53的磷酸化作用調(diào)節(jié)p53的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，因此是p53的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答所必不可少的。
在ATM陽(yáng)性或陰性細(xì)胞系(分別為MRC-5和AT-5)中，分析了響應(yīng)SCPVUTAT處理產(chǎn)生的Ser15上的P53磷酸化作用。用羥基脲(HU)進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn)用于比較。HU用作核糖核苷酸還原酶的抑制劑，并在S期引起了DNA復(fù)制叉的停頓，而且引起DSB。為此，用處理之后的提取物進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)，其中使用針對(duì)p53中磷酸化Ser15的特異性抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)。如圖7所示，用SCPVUTAT處理之后，在ATM+細(xì)胞系MRC-5(圖7B)以及用于ATM-細(xì)胞系A(chǔ)T-5中獲得了p53-Ser15的特異性磷酸化作用。用HU處理有同樣的發(fā)現(xiàn)，其以相當(dāng)?shù)氐鞘冀K較高的方式誘導(dǎo)了p53-Ser15磷酸化作用。這種體內(nèi)磷酸化作用對(duì)ATM/ATR抑制劑咖啡因敏感；與2mM咖啡因孵育且用SCPVUTAT或HU處理的AT-5細(xì)胞不顯示顯著的p53-Ser15磷酸化作用(圖7C)。作為適應(yīng)本發(fā)明目標(biāo)的ATM底物磷酸化作用的另一個(gè)實(shí)施例，分析了組蛋白H2AX Ser139的磷酸化作用。表明在細(xì)胞周期的S和G2期期間，ATM將組蛋白H2AX Ser139磷酸化，作為對(duì)輻射所誘導(dǎo)的DNA損傷的速發(fā)型應(yīng)答。U2OS細(xì)胞用SCPVUTAT處理60分鐘，固定并分析組蛋白H2AX Ser139的磷酸化作用。用針對(duì)組蛋白H2AX上的磷酸Ser139的特異性抗血清對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，并在顯微鏡下以單細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。作為對(duì)照，對(duì)組蛋白2B進(jìn)行了分析。結(jié)果證明，用SCPVUTAT處理迅速地誘導(dǎo)了組蛋白H2AX Ser139磷酸化作用，而且可在位于處理細(xì)胞而不是未處理細(xì)胞的細(xì)胞核中的特異位置處檢測(cè)到這種活性(圖12)。而且，ATM激酶抑制劑渥曼青霉素(50uM)是該反應(yīng)的拮抗劑。使用的渥曼青霉素的濃度是ATM特異性的，但是不抑制ATR，因此是用于區(qū)分這2種激酶的一種簡(jiǎn)單試驗(yàn)。分析ATM途徑的底物的這類實(shí)驗(yàn)有助于確定由SCPVUTAT誘導(dǎo)的DSB所誘導(dǎo)的生化和分子靶標(biāo)。通過Western印跡、免疫熒光分析或酶分析，對(duì)本發(fā)明處理的細(xì)胞或細(xì)胞提取物中ATM激酶的底物進(jìn)行的生化和/或免疫學(xué)分析，可用于闡明與各個(gè)途徑的正常誘導(dǎo)相比，特定細(xì)胞中體內(nèi)限制點(diǎn)應(yīng)答的狀態(tài)。
而且，這些分析可有利地與本發(fā)明一起用于自動(dòng)篩選。本發(fā)明誘導(dǎo)的DNA損傷的精確和明確性質(zhì)，使本發(fā)明優(yōu)于以前在類似分析類型中使用的任何其他化合物。本發(fā)明在單一分析或高通量篩選中的應(yīng)用很少需要考慮繼發(fā)的或雜亂的(pleotropic)效果，這是成功進(jìn)行復(fù)合物篩選的必要先決條件。這類實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)可被認(rèn)為相當(dāng)于DSB誘導(dǎo)的效果。而且，不顯示核酸酶活性的突變蛋白衍生物如SC34的可獲得性保證了對(duì)這些分析的重要控制。
實(shí)施例8SCPVUTAT誘導(dǎo)的作用對(duì)于ATM和p53的依賴性。
通常，在DNA損傷的情況中，相應(yīng)控制機(jī)制(限制點(diǎn))的組分的突變顯示細(xì)胞周期停滯特征的改變，而且這些突變中許多確定了癌癥的傾向性。
相反，涉及作為DNA修復(fù)的效應(yīng)分子的蛋白質(zhì)通常顯示正常的細(xì)胞周期停滯特征，而且主要只在結(jié)合限制點(diǎn)組分缺陷時(shí)誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展，并在腫瘤傾向性中常常顯示協(xié)同作用。效應(yīng)分子中的突變顯示對(duì)DSB的特別超敏性，這是在限制點(diǎn)突變的情況下極少出現(xiàn)的特征。由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是單特異性的，可能將對(duì)DSB的敏感性和對(duì)細(xì)胞周期的影響解釋為誘導(dǎo)損傷的簡(jiǎn)單結(jié)果。事實(shí)上，評(píng)估缺陷是否存在于控制機(jī)制(限制點(diǎn))的組分中或修復(fù)機(jī)制中是可能的。
在p53陽(yáng)性或陰性細(xì)胞中，分析對(duì)SCPVUTAT處理誘導(dǎo)的DSB的細(xì)胞周期應(yīng)答。p53陽(yáng)性細(xì)胞在G1和G2期顯示細(xì)胞周期停滯行為和低S期值，而p53陰性細(xì)胞不顯示細(xì)胞周期停滯特征。而且，還獲得了p53下游元件的這類結(jié)果，p21中的突變顯示了與p53-細(xì)胞類似的行為，14-3-3sigma中的突變顯示了G1停滯，這證實(shí)了該蛋白質(zhì)與p53部分交迭，而且它只在細(xì)胞周期的G2期控制中具有作用。如在圖8A中最后證明的，用SCPVUTAT處理之后，對(duì)突變體AT-5進(jìn)行分析。ATM突變的細(xì)胞系(AT-5)與SCPVUTAT一起孵育36小時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞周期的瞬時(shí)停滯，如通過DNA含量FACS分析所測(cè)定的。AT-5細(xì)胞顯示了4N G2DNA含量的強(qiáng)烈增加，不顯示任何G1延遲，而且這表明了G1限制點(diǎn)中的復(fù)合缺陷(圖8)。顯著地，與ATM陽(yáng)性細(xì)胞系不同，24小時(shí)之后G2的延遲未解除，而且沒有觀察到重新進(jìn)入細(xì)胞周期(參見圖5)。單一添加SCPVUTAT到AT-5細(xì)胞中60分鐘足以在24小時(shí)之后誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止(圖8A)，而且最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這是由不正確連接的DNA獲得的，因此在用SCPVUTAT單一處理60分鐘之后，AT-5細(xì)胞的產(chǎn)克隆活性低于0.02％。在這些分析中，ATM陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞系MRC-5對(duì)SCPVUTAT處理較不敏感(圖8B)。另外，細(xì)胞與阿霉素一起孵育作為對(duì)照。這種作用應(yīng)歸于SCPVUTAT的核酸內(nèi)切酶活性，因?yàn)橛猛蛔兊暮怂崦割愋吞幚砗蟮募湫纬尚逝c未處理的相當(dāng)。這些實(shí)施例證明了，不同的突變細(xì)胞響應(yīng)SCPVUTAT處理顯示了不同的細(xì)胞周期分布，而且這種特征可用于診斷由于DSB的細(xì)胞周期缺陷。
實(shí)施例9用NHEJ(非同源末端連接)修復(fù)途徑缺陷細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)SCPVUTAT的診斷能力的評(píng)估。
NHEJ代表高等真核生物中雙鏈DNA斷裂修復(fù)的主要機(jī)制，不同于更多存在通過同源重組的修復(fù)的低等真核生物。涉及該體系的蛋白質(zhì)還與V(D)J免疫球蛋白重組的最后階段相關(guān)。為了證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)是否還以特異性方式激活NHEJ的酶，分析了在該途徑的一種必要因子中包含多種突變的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系。
在圖9和圖13中概括的集落形成試驗(yàn)中證實(shí)了用本發(fā)明的蛋白質(zhì)SCPVUTAT單一處理足以在分析的所有NHEJ突變細(xì)胞系中強(qiáng)烈降低集落形成活性。
為了證明本發(fā)明的DSB修復(fù)的特異性，使用在下述與DSB的NHEJ修復(fù)有關(guān)的必要因子之一中含有純合功能喪失性突變的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含DNA依賴性蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基(DNA-PKcs；V3細(xì)胞系，相應(yīng)的親本細(xì)胞系A(chǔ)A8)、DNA依賴性蛋白激酶Ku70的調(diào)節(jié)亞基(HIS P1.13-11；相應(yīng)的親本細(xì)胞系CHO-K1)、亞基Ku80(xrss5；相應(yīng)的親本細(xì)胞系A(chǔ)A8)和DNA連接酶IV調(diào)節(jié)亞基XRCC4(XR-1細(xì)胞系；相應(yīng)的親本細(xì)胞系A(chǔ)A8)的PIKK亞基催化結(jié)構(gòu)域。在用SCPVUTAT在體內(nèi)進(jìn)行的核酸酶活性試驗(yàn)中分析了這些細(xì)胞系，并與指定的親本細(xì)胞系進(jìn)行比較。而且，在以10nM的濃度(灰色條)或以75nM的濃度(黑色條)單一添加SCPVUTAT 12小時(shí)之后，或不進(jìn)行蛋白質(zhì)處理(未處理，白色條)，在產(chǎn)克隆集落生長(zhǎng)試驗(yàn)中用SCPVUTAT檢測(cè)這些NHEJ突變細(xì)胞。添加7到10天后，通過用姬姆薩藍(lán)染色和不同細(xì)胞濃度的定量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行分析。從代表性實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果概括于圖9中。DNA連接酶IV亞基XRCC4突變的細(xì)胞對(duì)SCPVUTAT誘導(dǎo)的平末端DSB敏感，而且更有趣的是，在分析的DNA-PK中包含突變包括催化亞基突變的所有細(xì)胞在集落形成試驗(yàn)中也顯示強(qiáng)烈的降低。與親本細(xì)胞相反，在錯(cuò)配修復(fù)途徑中包含已知缺陷的細(xì)胞，如在編碼hMLH1蛋白的基因中顯示純合突變的HCT116，在類似分析中不顯示對(duì)SCPVUTAT處理敏感性有任何增加。在另一個(gè)例子中，DNA-PKcs(MO059J)缺陷的人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系用SCPVUTAT進(jìn)行處理，并與親本細(xì)胞系MO59K進(jìn)行比較。類似地，在用SCPVUTAT單一處理12小時(shí)(10nM，灰色條；75nM，黑色條；未處理的，白色條)之后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行定量。此外，人DNA-PKcs突變細(xì)胞還顯示了SCPVUTAT處理引起的敏感性的顯著差示增加(圖13A，B)。把這些細(xì)胞以不同的濃度置于多孔微量滴定平板中，用指定的SCPVUTAT進(jìn)行處理，并用姬姆薩藍(lán)染色。多孔微量滴定平板(例子參見圖13A)使用VersaDOCR(BioRad)成像系統(tǒng)掃描，使用軟件包Quantify OneR對(duì)生長(zhǎng)進(jìn)行自動(dòng)定量，以分析微量滴定平板(微量滴定平板掃描軟件)。獲得的數(shù)據(jù)更進(jìn)一步地概括成如圖13所示的直方圖。與從DNA-PKcs突變的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系獲得的結(jié)果一致，人細(xì)胞系也證明了對(duì)SCPVUTAT處理的超敏性，這證實(shí)了SCPVUTAT對(duì)DSB引入的高特異性。這些實(shí)驗(yàn)證明了使用的體系的可行性，包括在半自動(dòng)或全自動(dòng)分析中的應(yīng)用。
實(shí)施例10用于篩選候選化合物作為DSB誘導(dǎo)的應(yīng)激的增效劑或拮抗劑的試驗(yàn)。
U2OS細(xì)胞與單獨(dú)的或組合的10nM SCPVUTAT和10μM H2O2一起孵育，而且通過FACS分析細(xì)胞周期分布。細(xì)胞與2種化合物一起同時(shí)孵育引起差示的、高度增加的細(xì)胞周期分布變化，相應(yīng)的G2期峰從20％強(qiáng)烈增加到45％(圖11A，比較圖11D)，與之相比，單獨(dú)與10μM H2O2一起孵育時(shí)G2期沒有增加(圖11C)，在單獨(dú)與10nMSCPVUTAT孵育的情況下，G2期從20％微弱增加到28％(圖11A，比較圖11B)。根據(jù)與單一組分一起孵育的結(jié)果，與兩個(gè)組分一起同時(shí)孵育明顯地顯示了對(duì)細(xì)胞周期干擾的協(xié)同作用。
在一個(gè)后續(xù)的類似實(shí)驗(yàn)中，SCPVUTAT蛋白質(zhì)與蚜棲菌素(一種DNA嵌入劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑)一起孵育，沒有觀察到協(xié)同作用，而且兩個(gè)組分只顯示累加行為。這個(gè)實(shí)施例再次證明了該試驗(yàn)的簡(jiǎn)單性，其可用于檢測(cè)對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)所致平末端DSB所誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激的協(xié)同作用或拮抗作用。如上所述，該試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)來(lái)自于誘導(dǎo)的單特異性DNA損傷，用核酸酶處理的蛋白質(zhì)SC34測(cè)定系統(tǒng)背景的可能性，和該試驗(yàn)在實(shí)際上任何細(xì)胞和細(xì)胞周期的任何階段中的極快速且容易的應(yīng)用。這之前對(duì)能在體內(nèi)誘導(dǎo)DSB的任何其他試劑沒有描述過。因此顯示用于自由基和咖啡因(圖7C)的這類試驗(yàn)可用于對(duì)干擾DNA修復(fù)途徑及其控制的組合物的每種類型的篩選。
實(shí)施例11用SCPVUTAT處理誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤中的細(xì)胞凋亡許多分析的上皮以及間質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞在SCPVUTAT處理后不顯示凋亡，而在一些成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(IMR32、LAN5、GI-LIN)和來(lái)自臨床的多種初級(jí)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞分離物中，誘導(dǎo)了顯著量的細(xì)胞凋亡。圖10證明了本發(fā)明的蛋白質(zhì)在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)實(shí)例。為了該分析，用丙錠J-對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色之后，用FACS測(cè)定DNA含量。凋亡細(xì)胞(A)檢測(cè)為顯示DNA含量低于2N的細(xì)胞。計(jì)算的區(qū)域在對(duì)應(yīng)于相應(yīng)區(qū)域的每個(gè)直方圖的上方標(biāo)出。10nM的SCPVUTAT在30小時(shí)內(nèi)迅速地誘導(dǎo)了18％的凋亡(圖10B)，而添加100nM的SCPVUTAT在相同的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)了超過29％的凋亡細(xì)胞(圖10C)，相反地，核酸酶處理的SC34不誘導(dǎo)這種作用。這些實(shí)驗(yàn)證明了成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的高特異性誘導(dǎo)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用作治療這些腫瘤類型的主要候選物。
而且，聯(lián)合組織特異性傳遞系統(tǒng)，作為本發(fā)明的目標(biāo)的序列可包含作為治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤的候選物質(zhì)的足夠特異性。事實(shí)上，這又合理地暗示了本發(fā)明可用作篩選組織特異性傳遞序列的平臺(tái)技術(shù)。
另外，如同在前面的實(shí)施例(實(shí)施例8)中已經(jīng)預(yù)期的，本發(fā)明還可以用于尋找特異性的先導(dǎo)化合物，或?qū)ふ夷茉诎屑?xì)胞中，有利地在來(lái)自腫瘤的惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性、差示細(xì)胞凋亡，但是在同一個(gè)體的正常細(xì)胞中不誘導(dǎo)或相當(dāng)?shù)统潭鹊卣T導(dǎo)這種凋亡的特異性分子組合。
實(shí)施例12用SCPVUTAT處理之后，通過免疫顯微分析對(duì)細(xì)胞周期蛋白的細(xì)胞定位。
未處理的，或用SCPVUTAT(100nM)處理30小時(shí)，或用紫杉醇(0.2μg/ml)處理30小時(shí)的HCT116(p53(+/+))，用3％PFA固定，并用細(xì)胞周期蛋白B1或Cdc25C的特異性抗體進(jìn)行處理。利用與FITC標(biāo)記的第二抗體偶聯(lián)的抗細(xì)胞周期蛋白B1的特異性第一抗體(綠色)，或利用與TRITC標(biāo)記的第二抗體偶聯(lián)的抗Cdc25C的特異性第一抗體(紅色)，用顯微鏡進(jìn)行免疫熒光分析(參見圖14)。用SCPVUTAT處理之后，從具有4N DNA含量的細(xì)胞獲得的細(xì)胞周期標(biāo)記Cdc25C和細(xì)胞周期蛋白B的胞質(zhì)分布證明G2期停止，而且處理的細(xì)胞不進(jìn)展到細(xì)胞周期的M期。
該結(jié)果不同于用紫杉醇獲得的結(jié)果，在后者中普遍的核定位表明停止于細(xì)胞周期的M期。
兩種標(biāo)記蛋白質(zhì)的特異性分布的變化組成了G2/M過渡的標(biāo)志，-即，胞質(zhì)分布，其對(duì)應(yīng)于失活的細(xì)胞周期蛋白B激酶，與對(duì)應(yīng)于活性細(xì)胞周期蛋白B激酶的核定位形成對(duì)照，細(xì)胞周期隨后進(jìn)展到后期，-而且利用磷酸酶Cdc25C進(jìn)行脫磷酸化相繼激活cdc2/細(xì)胞周期蛋白B激酶(從Cdc25C釋放14-3-3蛋白質(zhì)并隨后激活磷酸酶之后)。事實(shí)上，這種途徑取代了細(xì)胞周期該階段中的限速步驟。
序列表<110>國(guó)際遺傳工程和生物技術(shù)中心<120>嵌合多肽及其用途<130>3916<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1020<212>DNA<213>普通變形菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1020)<223>1…471PvuII 472…483接頭484…951PvuII952…999TAT 1000…10206his<400>1atg agc cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 48Met Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile1 5 10 15cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 96Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Lsn Asp Ile Phe20 25 30caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 144Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu35 40 45aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 192Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly50 55 60caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 240Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe65 70 75 80tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 288Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln85 90 95gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 336Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile100 105 110
tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 384Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu115 120 125agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 432Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile130 135 140cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tcc gga 480Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Gly145 150 155 160gga agt cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 528Gly Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile165 170 175cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 576Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe180 185 190caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 624Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu195 200 205aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 672Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly210 215 220caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 720Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe225 230 235 240tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 768Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln245 250 255gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 816Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile260 265 270tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 864Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu275 280 285agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 912Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile290 295 300cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tct tac 960Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Tyr305 310 315 320ggc cgc aag aaa cgt cgc cag cgt cgc cgt ggt gga tca cac cat cat 1008Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser His His His325 330 335
cat cac cac taa 1020His His His<210>2<211>339<212>PRT<213>普通變形菌<400>2Met Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile1 5 10 15Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe20 25 30Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu35 40 45Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Ash Ala Gly50 55 60Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe65 70 75 80Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln85 90 95Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile100 105 110Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu115 120 125Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile130 135 140Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Gly145 150 155 160
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<213>人免疫缺陷病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(48)<223>4..36對(duì)應(yīng)于Tat蛋白的殘基47-57的傳遞體<400>3gga tct tac ggc cgc aag aaa cgt cgc cag cgt cgc cgt ggt gga tca 48Gly ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>4Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly ser1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種嵌合多肽，其包含a.一種顯示對(duì)特異性核苷酸序列的親和力的多肽；b.一種DNA修飾酶；和c.一個(gè)具有胞內(nèi)傳遞活性的區(qū)域。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中a.、b.和c.區(qū)域彼此共價(jià)連接。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中胞內(nèi)傳遞活性選自肽、多肽、脂類和碳水化合物。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中DNA修飾酶選自甲基化酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、核酸內(nèi)切酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中DNA修飾酶是限制性核酸內(nèi)切酶。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中限制性核酸內(nèi)切酶是II類限制性核酸內(nèi)切酶或它們的亞基或功能性片斷。
7.權(quán)利要求5或6的多肽，其中多肽a.和多肽b.的活性包含于同一個(gè)分子中。
8.權(quán)利要求6或7的多肽，其中具有特異性核苷酸結(jié)合活性的多肽和含有酶促DNA修飾活性的多肽是限制性核酸內(nèi)切酶或它們的亞基或功能性片段。
9.權(quán)利要求5到8中任一項(xiàng)的多肽，其中限制性核酸內(nèi)切酶選自EcoRV、PvuII、HinfI和它們的亞基和功能性片段。
10.權(quán)利要求5到9中任一項(xiàng)的多肽，其中核酸內(nèi)切酶活性被修飾，但是核酸結(jié)合特異性與天然酶相當(dāng)。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的多肽，其中用于胞內(nèi)傳遞的區(qū)域包含至少一個(gè)選自單純皰疹病毒的VP22、HIV-1的Tat、Hiv-1的Rev、觸角同源域及其片斷的肽。
12.權(quán)利要求11的來(lái)源于HIV-1 Tat蛋白的多肽，其包含肽YGRKKRRQRRR或其點(diǎn)突變或功能性突變。
13.權(quán)利要求8到12中任一項(xiàng)的多肽，其中具有特異性核苷酸結(jié)合親和力和DNA修飾酶的多肽為編碼選自EcoRV、PvuII和HinfI或其亞基或功能性片段的II類限制性核酸內(nèi)切酶的單個(gè)多肽，而且胞內(nèi)傳遞功能是包含于HIV-1tat的氨基酸序列中的肽。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中限制性核酸內(nèi)切酶的亞基共價(jià)連接為單鏈蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的多肽，其包含序列IDN2(SCPVUTAT)。
16.權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的嵌合多肽，其包含非天然氨基酸。
17.編碼權(quán)利要求5到15中任一項(xiàng)包含的多肽的分離的多核苷酸。
18.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其包含序列IDN1。
19.一種包含權(quán)利要求17或18的多核苷酸序列的載體。
20.用權(quán)利要求19的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的多肽，權(quán)利要求17或18的多核苷酸，權(quán)利要求19的載體，權(quán)利要求20的細(xì)胞用于治療用途。
22.包含權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的多肽作為活性成分，并包含合適的賦形劑、乳化劑或稀釋劑的藥物組合物。
23.權(quán)利要求21的嵌合分子、多核苷酸、載體、細(xì)胞用于制備預(yù)防、治療或診斷腫瘤疾病或該疾病傾向性的藥物的用途。
24.一種在分離的細(xì)胞的基因組中的特異性位點(diǎn)處進(jìn)行修飾的方法，其包括基本上用權(quán)利要求1到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理。
25.權(quán)利要求24的方法，其基于使用權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽，而且其中在分離的細(xì)胞的基因組中的特異性位點(diǎn)處引入的修飾為DNA雙鏈斷裂。
26.一種用于篩選能在細(xì)胞系統(tǒng)中調(diào)節(jié)基因組修復(fù)活性或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期控制和限制點(diǎn)活性的組合物的方法，其基本上包括以下步驟i)把分離的細(xì)胞與權(quán)利要求6到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽一起孵育，ii)任選的在產(chǎn)自由基物質(zhì)的存在下，添加組合物或組合物的集合(文庫(kù))，iii)細(xì)胞應(yīng)答的表征和/或測(cè)定。
27.一種使用權(quán)利要求24或25的方法，或使用權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽，體外激活DNA修復(fù)和限制點(diǎn)機(jī)制的方法。
28.一種用于體外診斷DNA修復(fù)和細(xì)胞周期控制和限制點(diǎn)途徑中的遺傳缺陷的方法，其基本上包括以下步驟a)任選的培養(yǎng)測(cè)試樣品的分離的細(xì)胞，b)把這些細(xì)胞與權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽一起孵育，任選的與合適的參照細(xì)胞系平行孵育，c)細(xì)胞應(yīng)答的表征和/或測(cè)定。
29.權(quán)利要求26或28的方法，其中iii)和c)中的細(xì)胞應(yīng)答分別選自產(chǎn)克隆活性、由胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的生化標(biāo)記的磷酸化狀態(tài)或表達(dá)水平、那些蛋白質(zhì)在核或胞質(zhì)水平的定位、細(xì)胞群體的總DNA含量、細(xì)胞增殖。
30.權(quán)利要求29的方法，其中那些胞內(nèi)蛋白質(zhì)選自p53、ATM、Chk1、Chk2、BRCA-1、BRCA-2、Nbs1、Mre11、Rad50、Rad51和組蛋白。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其用于體外診斷腫瘤的遺傳傾向性或診斷放射敏感性。
32.權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合分子用于引入細(xì)胞周期阻斷到分離的細(xì)胞中的用途。
33.權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合分子用于在成神經(jīng)細(xì)胞瘤來(lái)源的分離細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的用途。
34.一種用于診斷分離細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)中或細(xì)胞周期控制系統(tǒng)(限制點(diǎn))中的遺傳缺陷的試劑盒，其包含權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽，以及包含用于控制的嵌合多肽的試管，其中該多肽顯示特異性DNA結(jié)合活性但是核酸酶活性降低。
35.權(quán)利要求34的試劑盒，其中權(quán)利要求5到16中任一項(xiàng)的嵌合多肽具有序列IDN2，而且用于控制的多肽為多肽SC34。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其用于在分離的細(xì)胞中體外診斷決定腫瘤傾向性的遺傳缺陷。
37.權(quán)利要求35的試劑盒，其用于診斷腫瘤的放射敏感性。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下嵌合分子其包含對(duì)結(jié)合特異性DNA序列具有特異性親和力的優(yōu)選多肽區(qū)域，和具有DNA修飾活性的優(yōu)選多肽區(qū)域，而且由于存在包含傳遞活性的區(qū)域，該嵌合分子能跨過生物膜。本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼本發(fā)明的嵌合分子的分離的多肽，如果這些嵌合分子全部或部分是多肽性質(zhì)的話。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于本發(fā)明包括的多肽由于引入DNA雙鏈斷裂而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞限制點(diǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)的活性，本發(fā)明包括多種方法，其特征在于把本發(fā)明所述的多肽在體內(nèi)用于細(xì)胞，并提供對(duì)細(xì)胞中所含DNA的特異性位點(diǎn)的修飾活性。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的嵌合分子篩選新的傳遞活性或傳遞活性組合的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的組合物作為抗增殖、抗腫瘤、抗生素、抗寄生蟲或抗病毒劑的治療用途。
文檔編號(hào)C12N9/22GK1768142SQ200480009095
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月18日
發(fā)明者克里斯蒂娜·庫(kù)恩, 安德拉斯·西蒙克西特斯 申請(qǐng)人:國(guó)際遺傳工程和生物技術(shù)中心