專利名稱：G蛋白偶聯(lián)受體激酶的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體激酶的新用途。
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinases，GRKs)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，該家族的一個(gè)基本功能特征就是它專一地磷酸化活化(結(jié)合了信號(hào)分子)的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)。被GRKs磷酸化的G蛋白偶聯(lián)受體對(duì)β-滯留蛋白具有靶向性，β-滯留蛋白與磷酸化受體的結(jié)合阻止了受體再次偶聯(lián)G蛋白并介導(dǎo)了受體進(jìn)一步的內(nèi)吞作用，從而有效地降低了細(xì)胞膜上功能受體的水平，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)減敏。
G蛋白偶聯(lián)受體中腎上腺素能受體和毒蠅堿性膽堿能受體在維持血液循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定平衡過程中具有重要的作用，對(duì)心臟的功能具有特別重要的作用。其中腎上腺素能受體已經(jīng)研究比較透徹，而且已經(jīng)被作為藥物作用的靶點(diǎn)開發(fā)了很多藥物，其中α-和β-阻斷劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高血壓和心肌類疾病的治療。目前已經(jīng)克隆得到的腎上腺素能受體(βAR)至少有九種，包括三種α1型，三種α2型和三種β型受體。在心臟中表達(dá)最多的是β1型受體，它占了β型受體的75～80％，而β型受體的表達(dá)量大約是所有α型受體的十倍。心臟中的βAR可以通過接受兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、去甲腎上腺素和腎上腺素信號(hào)，控制心率、心肌收縮力量(Rockman HA，Koch WJ，Lefkowitz RJ.2002.Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function.Nature 415(6868)206-12)。
GRK2是GRK家族各亞型在心臟中表達(dá)最多的一種。研究發(fā)現(xiàn)在很多種心血管系統(tǒng)紊亂的情況下都伴隨著βAR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著的削弱和GRK2表達(dá)量及活力的提高。在心肌肥大，局部貧血和心力衰竭等心血管疾病的動(dòng)物模型中都觀察到了GRK2表達(dá)量增加。心力衰竭晚期患者心臟中βAR的mRNA、蛋白表達(dá)量和活力都提高到了健康心臟的三倍，而這一現(xiàn)象顯然和衰竭的心臟中βAR信號(hào)通路的機(jī)能障礙及心肌收縮力減弱有關(guān)。GRK2在多種不同病理?xiàng)l件導(dǎo)致的心力衰竭中都存在活力和表達(dá)量的增加的現(xiàn)象。通過采用一種心臟組織特異性的基因啟動(dòng)子——大鼠的αMHC啟動(dòng)子，可以使各種GRK在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的心肌中特異性表達(dá)，從而研究它們?cè)谛牧λソ咧械淖饔?。研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GRK2的轉(zhuǎn)基因老鼠的心室由βAR刺激產(chǎn)生的收縮力大大降低；而過量表達(dá)GRK2的C末端194個(gè)氨基酸肽段(認(rèn)為可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合G蛋白βγ亞基的GRK2的一段抑制肽)的老鼠則相反的表現(xiàn)為收縮力增強(qiáng)。不同亞型的GRK在心臟中具有不同的受體底物選擇性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GRK2對(duì)βAR和血管緊張素II具有脫敏作用，GRK5可以對(duì)βAR脫敏而對(duì)血管緊張素II沒有作用，與GRK2同源性最高的GRK3則只發(fā)現(xiàn)對(duì)α-1BAR起作用。對(duì)以上三種GRK進(jìn)行基因敲除也得到了迥然不同的結(jié)果。完全敲除GRK2導(dǎo)致老鼠在胚胎階段死亡；GRK2基因敲除的雜合老鼠，也就是GRK2表達(dá)量為正常量50％的老鼠表現(xiàn)出類似轉(zhuǎn)基因GRK2C末端194個(gè)氨基酸殘基的老鼠的表型——βAR信號(hào)通路的增強(qiáng)和心臟收縮力增加。相反GRK3和GRK5基因敲除的老鼠在心臟機(jī)能上沒有明顯的影響。這與上文提到的βAR是心臟中最主要的受體，它介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)了心臟的主要功能是一致的。
在心力衰竭產(chǎn)生過程中GRK2水平的提高是一個(gè)早期發(fā)生的過程，對(duì)于這一過程發(fā)生的原因現(xiàn)在認(rèn)為是和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活有關(guān)。交感神經(jīng)激活釋放了大量的βAR激動(dòng)劑，使βAR長(zhǎng)時(shí)間過度活化，從而使心臟提高GRK2水平以減弱βAR作用而做出的一種適應(yīng)性反應(yīng)。然而對(duì)于后來(lái)的心力衰竭的產(chǎn)生，GRK2的提高顯然產(chǎn)生的是一種負(fù)面作用。對(duì)這種現(xiàn)象的一種解釋是細(xì)胞在提高GRK2水平減弱βAR作用后缺少一種機(jī)制來(lái)把GRK2降低到原來(lái)的水平。目前已有的對(duì)心力衰竭有治療效果的經(jīng)典藥物例如βAR阻斷劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制劑都能夠降低GRK2的表達(dá)量。前文已經(jīng)提到GRK2的C末端轉(zhuǎn)基因老鼠可以抑制原有的GRK2活力并增強(qiáng)心臟的βAR信號(hào)和心肌的收縮力。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明在肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白過量表達(dá)等幾種導(dǎo)致心力衰竭的老鼠病理模型中通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入GRK2的C末端都有非常明顯的治愈效果。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)和βAR阻斷劑同時(shí)使用效果更佳。但是通過轉(zhuǎn)基因使βAR過量表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)βAR信號(hào)的增強(qiáng)卻沒有明顯的治療效果，這說明GRK2不僅僅是通過抑制βAR信號(hào)來(lái)導(dǎo)致心力衰竭，而可能還有其它G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)可能也參與了心力衰竭的產(chǎn)生。所以GRK2可能是比βAR更好的藥物作用靶點(diǎn)，降低GRK2的表達(dá)量或者是抑制其活力是一種具有非常好前景的治療方案。篩選GRKs尤其是GRK2的小分子抑制劑將是開發(fā)新型的心血管藥物的重要方向(Iaccarino G，Koch WJ.2003.Transgenic mice targeting the heart unveil G protein-coupled receptor kinases astherapeutic targets.Assay.Drug Dev.Technol.1(2)347-55)。
Iaccarino等的工作充分證明了GRK2可以作為心力衰竭等心肌類疾病的藥物作用靶標(biāo)蛋白質(zhì)，抑制GRKs活性或者降低GRKs(尤其是GRK2)的表達(dá)水平已經(jīng)證明可能是一種新的具有良好前景的治療方案。在Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中，已經(jīng)證明了GRK2的C端結(jié)構(gòu)域，或者更具體地說是其中的保守區(qū)域，在激酶與受體的相互作用中起著重要的作用。然而，仍然需要對(duì)該區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的分析以便尋找到可用于藥物篩選的靶位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者在以前的工作基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步的深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRKs家族C端結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)保守的脯氨酸豐富的結(jié)構(gòu)花色(motif)是GRKs磷酸化受體所需的關(guān)鍵位點(diǎn)，從而為篩選GRK的抑制劑提供了很好的篩選模型和為設(shè)計(jì)分子藥物提供了作用的靶位點(diǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種篩選G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a)提供G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，所述突變體在多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中有突變；b)使所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶分別與候選物混合；c)測(cè)定所述突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶與候選物結(jié)合的能力并進(jìn)行比較；d)選出化合物作為G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑，所述化合物與突變體不結(jié)合但與野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合。
在本發(fā)明中，所述“多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色(motif)”在G蛋白偶聯(lián)受體激酶C端保守區(qū)域中存在的富含脯氨酸的序列內(nèi)(具體是GRK2的466-479位氨基酸或其它GRK亞型中的與之對(duì)應(yīng)的部分(如GRK1的465-478位，GRK5的471-483位)內(nèi))，該多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色的形式為“PP**P”，即連續(xù)兩個(gè)脯氨酸，兩個(gè)任意氨基酸，再接一個(gè)脯氨酸。所述突變宜在GRK2的468、469、472位或其它GRK亞型的對(duì)應(yīng)位置上。更佳的是，所述突變?cè)贕RK2的467、468、469、472位。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述突變是將脯氨酸突變成丙氨酸。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠理解，將所述氨基酸突變成其它氨基酸也是可行的。另外，對(duì)目標(biāo)氨基酸序列進(jìn)行定點(diǎn)突變的手段也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在本發(fā)明的方法中，候選物可以是多肽，也可以是小分子化合物。在候選物是多肽的情況下，可采用例如噬菌體展示技術(shù)對(duì)噬菌體展示隨機(jī)多肽庫(kù)進(jìn)行篩選。測(cè)定候選物與突變型或野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合的試驗(yàn)包括各種常規(guī)技術(shù)，其可根據(jù)具體需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定。由于突變型與野生型的區(qū)別存在于多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中，所以，根據(jù)候選物與突變型或野生型的結(jié)合差異可以確定該候選物與多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色發(fā)生結(jié)合，從而篩選出能抑制G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合的物質(zhì)。
在另一較佳的實(shí)施方案，還可對(duì)篩選出的物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，例如，測(cè)定其對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體激酶介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化是否有抑制作用以及對(duì)小肽底物的磷酸化是否有影響，選出對(duì)GRK2介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化有抑制作用，而對(duì)其磷酸化小肽底物沒有影響的化合物或多肽作為有效的抑制劑。
在另一較佳的實(shí)施方案中，所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶宜為GRK2，所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體宜具有467、468、469、472位突變(如突變成丙氨酸)。
因此，本發(fā)明另一方面還提供了一種分離的G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，所述突變體為多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中有突變的G蛋白偶聯(lián)受體激酶。較佳的是，該突變體在對(duì)應(yīng)于GRK-2中468、469和472位的氨基酸位置上有突變。更佳的是，該突變體為467、468、469、472位突變成丙氨酸的GRK2。
本發(fā)明另一方面還涉及一種改變G蛋白偶聯(lián)受體激酶對(duì)受體磷酸化作用的方法，該方法包括對(duì)所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶的對(duì)應(yīng)于GRK2中468、469和472位的氨基酸進(jìn)行突變。
本發(fā)明另一方面還涉及上述G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體在篩選G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法中用作參照的用途。
本發(fā)明另一方面還涉及一種計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法，該方法是以G蛋白偶聯(lián)受體激酶的多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色為目標(biāo)進(jìn)行篩選。
由于GRK2的晶體結(jié)構(gòu)在2003年已經(jīng)被解析出來(lái)，所以在本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了C端保守區(qū)中多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色起重要作用后，可以以GRK2的三維晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，對(duì)含有大量化合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行模擬篩選，尋找可以和多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色結(jié)合的小分子化合物。這樣的化合物由于結(jié)合了該位點(diǎn)而可能干擾GRK2和受體的相互作用，可能成為GRK2的高效抑制劑。在所述篩選方法，常用的篩選用的常用軟件有DOCK，版本有4.02和5.0，前者可并行計(jì)算。在模擬篩選中，可根據(jù)活性中心的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)確定篩選參數(shù)，先放寬參數(shù)進(jìn)行粗篩，然后再用嚴(yán)格的參數(shù)細(xì)篩。適用于所述方法的常用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)例如有ACD-SC或現(xiàn)有化學(xué)品目錄三維結(jié)構(gòu)(ACD-3D)數(shù)據(jù)庫(kù)。前者是MDL公司專門為高通量篩選而開發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了化學(xué)品供應(yīng)商所能夠提供的近200萬(wàn)個(gè)化合物的相關(guān)信息，其中180多萬(wàn)的化合物有三維結(jié)構(gòu)。后者是將化學(xué)品的三維結(jié)構(gòu)模型加入現(xiàn)有化學(xué)品目錄(ACD)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中。它是著手建立組合庫(kù)的合適數(shù)據(jù)源，使用三維結(jié)構(gòu)查尋搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，相關(guān)的分子三維框架結(jié)構(gòu)和構(gòu)建單元都能被快速地識(shí)別出來(lái)，是一種尋找可供篩選的、具有潛在藥物活性的候選物的有效方法，30萬(wàn)候選物可以隨時(shí)購(gòu)買，無(wú)需合成，極大地縮短了漫長(zhǎng)的化合物合成過程，不僅節(jié)約時(shí)間，而且降低合成費(fèi)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了GRK家族各成員的C端保守區(qū)與視紫紅質(zhì)的相互作用。其中圖A為GRK家族的三個(gè)代表成員GRK1、GRK2和GRK5的C端保守區(qū)對(duì)GRK2介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化的影響。圖B顯示了GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC與視紫紅質(zhì)的直接相互作用(上圖)和三種GST融合蛋白的SDS蛋白電泳膠考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果(下圖)。
圖2顯示對(duì)參與GRK2-CC與視紫紅質(zhì)相互作用的位點(diǎn)進(jìn)行突變分析。其中圖A為GRK2-CC的缺失突變示意圖。圖B為上述突變體的GST融合蛋白的免疫印跡檢測(cè)分析結(jié)果和SDS蛋白電泳膠考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖C中總結(jié)了GRK2-CC各種點(diǎn)突變與活化的視紫紅質(zhì)的相互作用。圖D為多脯氨酸區(qū)的突變對(duì)GRK2-CC與視紫紅質(zhì)相互作用的影響。
圖3顯示了多脯氨酸區(qū)的突變對(duì)GRK家族C端保守區(qū)與視紫紅質(zhì)相互作用的影響。圖A為GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC中的保守脯氨酸位點(diǎn)的序列比較。圖B為牛GRK1-CC-3PA(467，468，471位脯氨酸同時(shí)突變?yōu)楸彼?和人源GRK5-CC-3PA(463，464，467位脯氨酸同時(shí)突變?yōu)楸彼?這兩種突變與活化的視紫紅質(zhì)相互作用的結(jié)果。
圖4顯示了GRK2及其突變體的分析結(jié)果。圖A為野生型和4PA突變型GRK2對(duì)視紫紅質(zhì)的磷酸化結(jié)果。圖B為野生型和4PA突變型GRK2對(duì)小肽底物的磷酸化。圖C為野生型GRK和4PA型突變酶被缺失磷酸化位點(diǎn)的視紫紅質(zhì)329G-Rho活化能力。
圖5顯示了GRK家族的三個(gè)代表成員C端保守區(qū)與非活化或光活化的視紫紅質(zhì)相互作用。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述條件)實(shí)施，或按照制造廠商所建議的條件。另外，Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中的全部?jī)?nèi)容，包括野生型GRK2的表達(dá)和純化、測(cè)活、視紫紅質(zhì)的制備、GRK2及其突變體對(duì)視紫紅質(zhì)的磷酸化試驗(yàn)、對(duì)合成的小肽(RRREEEEESAAA)的磷酸化反應(yīng)試驗(yàn)等內(nèi)容均納入本文作為參考。
實(shí)施例1GRK2的C端結(jié)構(gòu)域和C端保守區(qū)域與視紫紅質(zhì)的相互作用在GRKs家族中的保守性在Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中，已經(jīng)證明了GRK2的CC區(qū)域(C端保守區(qū)域)能夠與視紫紅質(zhì)相互作用。由于這段區(qū)域在GRKs家族中具有較高的保守性，為了研究這一相互作用是否在GRKs家族中也是保守的，選擇GRKs家族另外兩個(gè)亞家族的代表GRK1和GRK5來(lái)檢測(cè)它們的C端保守區(qū)與視紫紅質(zhì)的相互作用。首先，檢測(cè)這兩個(gè)肽段對(duì)GRK2磷酸化視紫紅質(zhì)活性的影響。以GST融合的形式在大腸桿菌中表達(dá)這兩個(gè)肽段，并利用GSH-Sepharose親和柱分離純化得到融合蛋白。三種蛋白分別各以2μM和6μM的濃度與3μM的視紫紅質(zhì)在20μL反應(yīng)體系(20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1mM[γ-32P]ATP(～0.5cpm/fmol)，7.5mM MgCl2和2mMEDTA)中混合，在加入100ng純化的GRK2后開始反應(yīng)，30℃反應(yīng)5分鐘后終止。結(jié)果以GST作為對(duì)照通過放射自顯影分析定量，所示結(jié)果為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值±偏差。結(jié)果如圖1A所示，這兩個(gè)肽段都能夠同GRK2-CC一樣有效地抑制GRK2的活性。
同樣，進(jìn)一步通過將這三種GST融合蛋白及對(duì)照GST結(jié)合在GSH親和樹脂上，與視紫紅質(zhì)進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將1μg活化的視紫紅質(zhì)分別與已預(yù)先結(jié)合GST融合蛋白(GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC大約各1-2μg)的GSH-Sepharose樹脂4℃光照條件下混合1小時(shí)，經(jīng)過結(jié)合、洗滌后，加入SDS電泳樣品緩沖液洗脫，電泳后通過視紫紅質(zhì)特異性抗體用免疫印記檢測(cè)分析結(jié)合在上的視紫紅質(zhì)。結(jié)果如圖1b所示，三種GRK的CC的確都能夠特異性的結(jié)合視紫紅質(zhì)。
實(shí)施例2GRKs的保守區(qū)參與和受體相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)研究在確定了GRK家族的C末端保守區(qū)和受體相互作用的功能后，發(fā)明人進(jìn)一步嘗試尋找CC區(qū)域上與視紫紅質(zhì)的具體結(jié)合位點(diǎn)。首先，選擇GRK2的CC區(qū)域做了如圖2A的幾個(gè)缺失突變體的GST融合蛋白，并且也以GST融合蛋白形式在大腸桿菌中表達(dá)并體外純化。用上文所述方法做這幾個(gè)缺失突變與視紫紅質(zhì)的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。具體是，將上述突變體以GST融合蛋白形式通過GSH樹脂純化，將1μg活化的視紫紅質(zhì)分別與已預(yù)先結(jié)合1-2μg各種突變體的GST融合蛋白的谷胱甘肽樹脂20μL在4℃光照條件下混合1小時(shí)，經(jīng)過結(jié)合、洗滌后，加入SDS電泳樣品緩沖液洗脫，電泳后通過視紫紅質(zhì)特異性抗體用免疫印記檢測(cè)分析結(jié)合在上的視紫紅質(zhì)。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，GRK2-CC的N端缺失466～479位氨基酸以及C端缺失516～531位氨基酸的兩個(gè)突變都喪失結(jié)合視紫紅質(zhì)的能力。因此，推測(cè)負(fù)責(zé)結(jié)合視紫紅質(zhì)的位點(diǎn)就包含在這兩段序列之中。
通過同源比較GRK1、GRK2、GRK5的氨基酸序列，找到了幾個(gè)在GRK家族中保守的位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)及結(jié)果列表如圖2C所示。在GRK2 CC區(qū)域的466～479位氨基酸中，有個(gè)保守的多脯氨酸區(qū)，在將467/468/469/472位脯氨酸突變成丙氨酸后，該片段就喪失了和視紫紅質(zhì)結(jié)合的能力(結(jié)果如圖2D所示)。
為了進(jìn)一步確定這個(gè)多脯氨酸是否在GRKs家族與受體相互作用過程中起相同的作用，通過比較這段脯氨酸豐富區(qū)的同源性(如圖3A)，找到了GRK1和GRK5的對(duì)應(yīng)保守位點(diǎn)，又構(gòu)建了GRK1-CC-3PA(P467A/P468A/P471A)和GRK5-CC-3PA(P463A/P464A/P467A)兩種突變體的GST融合蛋白，并在體外表達(dá)純化，在GSH樹脂上和光激活的視紫紅質(zhì)體外結(jié)合。如圖3B所示，GRK1和GRK5的CC脯氨酸突變型相比野生型也喪失了結(jié)合受體的能力。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色的重要性，發(fā)明人又把這4個(gè)脯氨酸的突變引入到GRK2全酶中進(jìn)行分析。在大腸桿菌中表達(dá)純化GRK2野生型和GRK2-4PA(這四個(gè)脯氨酸突變?yōu)樗膫€(gè)丙氨酸)突變型酶，分別用合成的小肽RRREEEEESAAA和視紫紅質(zhì)作為底物檢測(cè)GRK2野生型和突變型的活力。通過小肽體外磷酸化和對(duì)小肽中摻入的同位素計(jì)數(shù)，隨時(shí)間變化看小肽中摻入的同位素磷的量。如圖4B所示，突變型的GRK2仍有野生型80％的活力，表明這四個(gè)脯氨酸突變并沒有顯著影響GRK2的催化結(jié)構(gòu)域的活力以及整個(gè)酶分子的空間結(jié)構(gòu)。然而，對(duì)比野生型GRK2，突變型完全喪失了磷酸化視紫紅質(zhì)的能力，見圖4A。另外如圖4C所示，4PA突變型的GRK2也能夠被視紫紅質(zhì)缺失C末端磷酸化位點(diǎn)的視紫紅質(zhì)微弱地激活，以上性質(zhì)都和Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中提到的ΔCC一致。以上結(jié)果有力地說明GRK家族C末端保守區(qū)對(duì)于GRKs家族與受體相互作用起了關(guān)鍵作用，其中的多脯氨酸位點(diǎn)是這一相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，甚至可能是直接參與相互作用的關(guān)鍵殘基。
由于GRKs的一個(gè)顯著特性就是它們只特異性地識(shí)別并磷酸化活化形式的GPCR。因此發(fā)明人還進(jìn)一步檢測(cè)了GRKs的C末端保守區(qū)與受體的相互作用是否依賴于受體的活化。通過在微弱紅光下置備得到非活化的視紫紅質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)過程中通過光照與否決定其是活化或非活化狀態(tài)來(lái)進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。如圖5所示三種GRK的C端保守區(qū)都只特異性結(jié)合光活化的視紫紅質(zhì)，從而由有力地證明了該相互作用是負(fù)責(zé)酶與其活化受體底物之間的識(shí)別過程的。
實(shí)施例3篩選模型的建立用噬菌體展示技術(shù)對(duì)噬菌體展示隨機(jī)多肽庫(kù)進(jìn)行篩選。具體是，采用GST融合表達(dá)的野生型GRK2 466～531AA最小功能肽段，將該野生型肽段通過GST結(jié)合在GSH親和樹脂上，然后加入隨機(jī)肽噬菌體庫(kù)充分結(jié)合，洗滌后，對(duì)洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，再以同樣方式進(jìn)行第二輪篩選。同時(shí)，采用如上文實(shí)施例2中所述的GRK2467/468/469/472位脯氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔冃碗亩巫鳛閷?duì)照。經(jīng)過幾輪篩選結(jié)合率上升達(dá)到平臺(tái)后，用對(duì)照的突變型肽段充分結(jié)合，去除兩者都能結(jié)合的噬菌體。最后得到的噬菌體挑單克隆擴(kuò)增后再次檢測(cè)和兩種肽段結(jié)合的差異。如果確實(shí)存在差異，則表明篩選出的多肽可能含有結(jié)合在多脯氨酸位點(diǎn)的肽段，然后通過測(cè)序得到肽段的序列。
以上述類似方法篩選化合物庫(kù)，找到結(jié)合差異的通過質(zhì)譜鑒定為何種化合物，最后再用純的該化合物進(jìn)行驗(yàn)證。
然后，將以上得到的多肽或化合物再加入到GRK2的測(cè)活體系中，按照上文所述方法測(cè)試所得化合物對(duì)GRK2介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化的抑制作用以及對(duì)其小肽底物磷酸化的作用，選出對(duì)GRK2介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化有抑制作用，而對(duì)其磷酸化小肽底物沒有影響的化合物或多肽作為有效的抑制劑，用于進(jìn)一步研究。
實(shí)施例4計(jì)算機(jī)模擬藥物篩選和輔助設(shè)計(jì)根據(jù)C端保守區(qū)中的多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色所起的重要作用，以GRK2的三維晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，用DOCK 4.02版對(duì)含有大量化合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)如ACD-SC、ACD-3D進(jìn)行模擬篩選，以尋找出可以和多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色結(jié)合的小分子化合物。然后，將所得的化合物加入到GRK2的測(cè)活體系中，測(cè)定其抑制GRK2介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化的效果。這樣的化合物由于結(jié)合了該位點(diǎn)而可能干擾GRK2和受體的相互作用，可能成為GRK2的高效抑制劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a)提供G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，所述突變體在多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中有突變；b)使所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶分別與候選物混合；c)測(cè)定所述突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶與候選物結(jié)合的能力并進(jìn)行比較；d)選出化合物作為G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑，所述化合物與突變體不結(jié)合但與野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟e)測(cè)定步驟d)選出的化合物對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體激酶介導(dǎo)的視紫紅質(zhì)磷酸化的抑制作用和對(duì)小肽底物的磷酸化作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶為GRK-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中的突變是將GRK-2的467、468、469和472位、GRK-1的467、468、471位或GRK-5的463、464、467位脯氨酸突變成丙氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述候選物包括多肽和有機(jī)化合物。
6.一種分離的G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，其特征在于，所述突變體在多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中有突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，它在對(duì)應(yīng)于GRK-2中467、468、469和472位的氨基酸位置上有突變。
8.權(quán)利要求6所述的G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體在篩選G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法中用作參照的用途。
9.一種計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法，其特征在于，以G蛋白偶聯(lián)受體激酶的多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色為目標(biāo)進(jìn)行篩選。
10.一種改變G蛋白偶聯(lián)受體激酶對(duì)受體磷酸化作用的方法，其特征在于，對(duì)所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶的對(duì)應(yīng)于GRK-2中468、469和472位的氨基酸進(jìn)行突變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑的方法，該方法包括以下步驟a)提供G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體，所述突變體在多脯氨酸結(jié)構(gòu)花色中有突變；b)使所述G蛋白偶聯(lián)受體激酶突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶分別與候選物混合；c)測(cè)定所述突變體以及野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶與候選物結(jié)合的能力并進(jìn)行比較；d)選出化合物作為G蛋白偶聯(lián)受體激酶抑制劑，所述化合物與突變體不結(jié)合但與野生型G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1724657SQ20041005294
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2004年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月19日
發(fā)明者李林, 甘肖箐, 馬志海, 鄧寧, 王計(jì)勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院