專利名稱：通過麥芽糖改進(jìn)花旗松的胚胎發(fā)生培養(yǎng)的起始的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法。
背景技術(shù)：
對于諸如松樹和樅樹的針葉樹制造木材產(chǎn)品的需要持續(xù)增加。這個問題的一種建議的解決方式就是鑒定具有諸如生長快速的需要特征的單個樹，并且通過體細(xì)胞克隆產(chǎn)生優(yōu)良樹的大量遺傳一致的克隆。
體細(xì)胞克隆就是從樹的組織而非雌雄配子產(chǎn)生遺傳一致的樹的過程。在體細(xì)胞克隆的一種方法中，植物組織培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包括諸如植物生長素和/或細(xì)胞因子的激素以起始諸如胚柄團(tuán)的胚胎發(fā)生細(xì)胞，所述胚胎發(fā)生細(xì)胞能夠發(fā)育形成體細(xì)胞胚。胚胎發(fā)生細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中以促進(jìn)胚胎發(fā)生細(xì)胞的建立和增殖。隨后增殖的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中以促進(jìn)針葉樹體細(xì)胞胚的發(fā)育，所述發(fā)育的體細(xì)胞胚例如可以放入人工種子中并播種在土壤中，在土壤中它們發(fā)芽產(chǎn)生針葉樹苗。樹苗可以移植到生長地進(jìn)行隨后的生長并最終收獲獲得木材或者木材來源的產(chǎn)品。
體細(xì)胞克隆花旗松(Douglas-fir)胚的一個持續(xù)存在的問題是刺激有效的起始和建立能夠生成體細(xì)胞胚的花旗松胚胎發(fā)生細(xì)胞。本發(fā)明提供了滿足這種需要的方法。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法。一方面，本發(fā)明的方法包括如下步驟將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)。起始培養(yǎng)基中麥芽糖或者葡萄糖或者其混合物的濃度可以從大約5g/L到大約60g/L，諸如從大約20g/L到大約50g/L或者從大約30g/L到大約40g/L。在一些實(shí)施方案中，花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上從大約4星期到大約12星期，諸如從大約5星期到大約10星期，諸如大約6星期的時間段。
在另一方面，本發(fā)明的方法另外包括如下步驟將花旗松胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源從而形成包括早期體細(xì)胞胚的成形的胚柄團(tuán)。成形的胚柄團(tuán)進(jìn)行生長和增殖。未成形的胚柄團(tuán)變成褐色并死亡。維持培養(yǎng)基中麥芽糖或者葡萄糖或者其混合物的濃度可以從大約5g/L到大約60g/L，諸如從大約20g/L到大約50g/L或者從大約30g/L到大約40g/L。在一些實(shí)施方案中，花旗松外植體培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或者之上直到大約6個月的時間段。
在一些方法實(shí)施方案中，至少27％的花旗松外植體形成胚柄團(tuán)。本發(fā)明的方法與起始培養(yǎng)基不含麥芽糖或葡萄糖或其組合物作為主要糖源的方法相比增加了起始的花旗松外植體的數(shù)目。例如，利用本發(fā)明的起始培養(yǎng)基產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目至少比利用相同的起始培養(yǎng)基但是用蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目多大約51％。
在一些實(shí)施方案中，至少18％的花旗松胚柄團(tuán)形成成形的胚柄團(tuán)。本發(fā)明的方法與維持培養(yǎng)基不含麥芽糖或葡萄糖或其組合物作為主要糖源的方法相比增加了成形的花旗松胚柄團(tuán)的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的成形的花旗松胚柄團(tuán)的數(shù)目至少比利用相同的維持培養(yǎng)基但是用蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的成形胚柄團(tuán)的數(shù)目多大約65％。
本發(fā)明的方法可用于例如制備花旗松體細(xì)胞胚，所述體細(xì)胞胚可通過例如遺傳或者生化方法進(jìn)行鑒定，或者如果需要可進(jìn)行發(fā)芽從而獲得可以長成成熟的花旗松樹的花旗松外植體。因此，例如本發(fā)明的方法可被用于產(chǎn)生單個花旗松樹的克隆，所述單個花旗松樹具有諸如生長快速或者樹質(zhì)改良的一種或者多種的需要特征。例如，本發(fā)明的花旗松體細(xì)胞胚群可用于產(chǎn)生花旗松樹的林分或者森林，所述的花旗松樹具有諸如生長快速或者樹質(zhì)改良的一種或者多種需要的特征。這些樹可用于生產(chǎn)木制品。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述除非本文具體限制，此處所用的所有術(shù)語具有對于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言相同的含義。
此處所用的術(shù)語“外植體”是指來自供體植物的一塊組織。通常根據(jù)本發(fā)明的方法使用的外植體是來自未成熟種子的受精胚。
此處所用的術(shù)語“胚柄團(tuán)”或者“ESM”是指白色透明的粘質(zhì)團(tuán)，包括各個早期發(fā)育階段的胚，每種胚都含有胚頭和胚柄系統(tǒng)。
此處所用的術(shù)語“成形的胚柄系統(tǒng)”是指正在生長和增殖的胚胎細(xì)胞團(tuán)。沒有成形的胚柄團(tuán)變成褐色并死亡。成形的胚柄團(tuán)通常重達(dá)250mg和500mg之間或者多次繼代培養(yǎng)以后測定的直徑為1-2cm。
此處所用的術(shù)語“早期體細(xì)胞胚”是指在發(fā)育的前圓形細(xì)胞階段的胚。術(shù)語“子葉體細(xì)胞胚”是指具有至少一個子葉的胚。
此處所用的術(shù)語“主要的糖源”是指以最高濃度存在的糖源。
除非另有說明，所有以百分比表示的濃度值為每體積的重量百分比。
在一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法，所述方法包括如下步驟將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)。
本發(fā)明實(shí)施中使用的外植體的一個例子是描述于實(shí)施例1中的來自花旗松圓錐種子的前圓形細(xì)胞和圓形細(xì)胞階段的胚。通常，在除去胚之前對種子進(jìn)行表面消毒，然后將胚培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上。根據(jù)本發(fā)明，起始培養(yǎng)基含有麥芽糖或者葡萄糖或者其組合作為唯一，或者主要的可代謝的糖源?；ㄆ焖赏庵搀w的起始培養(yǎng)基的現(xiàn)有技術(shù)使用蔗糖作為糖源。蔗糖是由葡萄糖和果糖分子通過共價連接組成的二糖。相比于果糖，葡萄糖是生物合成較好的糖源。麥芽糖是有兩個葡萄糖單元組成的二糖。因此，使用麥芽糖作為主要的糖源，提供的每糖單元的葡萄糖的量是由蔗糖提供的兩倍。起始培養(yǎng)基中主要糖源的濃度可以從大約5g/L到大約60g/L，諸如從大約20g/L到大約50g/L或者從大約30g/L到大約40g/L。
起始培養(yǎng)基可以是半固體培養(yǎng)基或者固體培養(yǎng)基。起始培養(yǎng)基通常包括無機(jī)鹽和有機(jī)營養(yǎng)物。起始培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度通常為大約160mM/kg甚至更低，但是也可以高達(dá)170mM/kg。起始培養(yǎng)基通常包括生長激素。可以包括在起始培養(yǎng)基中的激素的例子為植物生長素(例如，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和細(xì)胞因子(例如，6-芐氨基嘌呤(BAP))。植物生長素可以使用，例如從大約1mg/L到大約200mg/L的濃度。細(xì)胞因子可以使用，例如從大約0.1mg/L到大約50mg/L的濃度。
起始培養(yǎng)基可含有吉蘭糖膠，通常存在的濃度為大約1g/L到大約2g/L。起始培養(yǎng)基可含有吸收性組分，尤其是當(dāng)使用非常高水平的生長激素時。吸收性組分可以任意組分，條件是在本發(fā)明的使用濃度下對于細(xì)胞無毒并且能夠吸收培養(yǎng)基中存在的促進(jìn)生長的激素和在胚胎發(fā)育期間由植物細(xì)胞產(chǎn)生的毒性化合物。使用的吸收性組分的非限制性的例子包括活性炭，可溶性聚(乙烯吡咯烷酮)，不溶性聚(乙烯吡咯烷酮)，活性氧化鋁，和硅膠。吸收性組分的存在量為例如，從大約0.1g/L到大約5g/L。
本發(fā)明實(shí)施中使用的起始培養(yǎng)基的例子為列舉在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基BM1。
花旗松外植體通常培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或之上從4周到12周，諸如從5周到10周，或者諸如大約6周的時間段，培養(yǎng)溫度為從10℃到30℃，諸如從15℃到25℃，或者諸如從20℃到23℃。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法，所述方法包括如下步驟(a)將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述起始培養(yǎng)基含有選自包括麥芽糖，葡萄糖及其組合的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)，和(b)將胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或者之上，所述維持培養(yǎng)基含有選自包括麥芽糖，葡萄糖及其組合的主要糖源，從而形成成形的胚柄團(tuán)。成形的胚柄團(tuán)正在生長和增殖。沒有成形的胚柄團(tuán)變成褐色并死亡。
起始培養(yǎng)基的組分描述如上。通常，麥芽糖或者葡萄糖或者其組合是維持培養(yǎng)基中唯一，或者主要的可代謝的糖源。維持培養(yǎng)基中麥芽糖或者葡萄糖或者其組合的濃度可以從大約5g/L到大約60g/L，諸如從大約20g/L到大約50g/L或者從大約30g/L到大約40g/L。
維持培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基，或者可以是液體培養(yǎng)基，可以振蕩培養(yǎng)基以促進(jìn)ESM的生長和增殖。維持培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度通常高于起始培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度，通常的范圍是180-400mM/kg。維持培養(yǎng)基可以含有維持胚胎發(fā)生組織的養(yǎng)分，并且可能包括激素，諸如一種或者多種植物生長素和/或細(xì)胞因子以促進(jìn)胚胎發(fā)生組織的細(xì)胞分裂和生長。通常，維持培養(yǎng)基中激素的濃度低于其起始培養(yǎng)基的濃度。合適的維持培養(yǎng)基的例子為列舉在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基BM2。
花旗松ESM通常培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或者之上達(dá)6個月的時間，培養(yǎng)溫度為從10℃到30℃，諸如從15℃到25℃，或者諸如從20℃到23℃。當(dāng)使用固體維持培養(yǎng)基時，大約每兩周對ESM進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，當(dāng)使用液體維持培養(yǎng)基時，通常每周對ESM進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法，所述方法包括如下步驟(a)將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述起始培養(yǎng)基含有選自包括麥芽糖，葡萄糖及其組合的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)，(b)將胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或者之上，所述維持培養(yǎng)基含有選自包括麥芽糖，葡萄糖及其組合的主要糖源，從而形成成形的包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)；(c)將來自成形的胚柄團(tuán)的早期體細(xì)胞胚培養(yǎng)單獨(dú)(Singulation)培養(yǎng)基中或者之上形成單獨(dú)(singulatecl)的早期體細(xì)胞胚；和(d)將早期體細(xì)胞胚培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中或者之上形成子葉體細(xì)胞胚。
根據(jù)這個實(shí)施方案，含有早期體細(xì)胞胚的成形的ESM可以進(jìn)一步培養(yǎng)在單獨(dú)培養(yǎng)基中或之上以形成單獨(dú)的胚。合適的單獨(dú)培養(yǎng)基通常不包括促進(jìn)生長的激素，諸如植物生長素和細(xì)胞因子，但是通常包括激素脫落酸。脫落酸是一種倍半萜烯類化合物植物激素，參與植物的多種生理過程(例如參見，Milborrow(2001)J.Exp.Botany 521145-1164；Leung和Giraudat(1998)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.49199-123)。當(dāng)脫落酸用于發(fā)育培養(yǎng)基時，使用濃度一般為從大約1mg/L到大約200mg/L的范圍。通常，單獨(dú)培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基并且含有維持胚胎發(fā)生組織的養(yǎng)分。單獨(dú)培養(yǎng)基可含有麥芽糖，葡萄糖或者其組合作為主要的可代謝糖源。單獨(dú)培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度可以調(diào)整到需要范圍內(nèi)的值，諸如從大約150mM/kg到大約250mM/kg。通常200mM/kg或者更高的重量摩爾滲透濃度是優(yōu)選的。合適的發(fā)育培養(yǎng)基的例子為列舉在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基BM3。
花旗松早期階段的體細(xì)胞胚可以培養(yǎng)在單獨(dú)培養(yǎng)基中或者之上，每周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為從1周到3周的時間，培養(yǎng)溫度為從10℃到30℃，諸如從15℃到25℃，或者諸如從20℃到23℃。
單獨(dú)培養(yǎng)后，早期階段的體細(xì)胞胚可以培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基上從而形成子葉體細(xì)胞胚。發(fā)育培養(yǎng)基通常為固體培養(yǎng)基，雖然發(fā)育培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基。發(fā)育培養(yǎng)基通常含有維持胚胎發(fā)生組織的養(yǎng)分。麥芽糖可以包含在發(fā)育培養(yǎng)基中作為用于胚胎發(fā)生組織的主要或者唯一糖源。麥芽糖的合適濃度的范圍是從大約1％到大約2.5％。
合適的發(fā)育培養(yǎng)基通常不包括促進(jìn)生長的激素，諸如植物生長素和細(xì)胞因子，但是可包括激素脫落酸。當(dāng)脫落酸用于發(fā)育培養(yǎng)基時，通常的使用濃度為從大約1mg/L到大約200mg/L的范圍。
發(fā)育培養(yǎng)基可含有吉蘭糖膠，其存在濃度通?？筛哌_(dá)大約0.35％。發(fā)育培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度可以調(diào)整到需要范圍內(nèi)的值，諸如從大約250mM/kg到大約450mM/kg。通常，350mM/kg或者更高的重量摩爾滲透濃度是優(yōu)選的。合適的發(fā)育培養(yǎng)基的例子為列舉在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基BM3。
花旗松單獨(dú)的早期胚可以培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中或者之上，從而形成子葉體細(xì)胞胚，培養(yǎng)時間為從4周到14周，諸如從8周到12周，或者諸如大約12周，培養(yǎng)溫度為從10℃到30℃，諸如從15℃到25℃，或者諸如從20℃到23℃。
利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的子葉體細(xì)胞胚如果需要可任選進(jìn)行發(fā)芽形成可以長成花旗松樹的花旗松植物體?；蛘?，成熟的胚可放入人工種子中進(jìn)行隨后的發(fā)芽。子葉花旗松體細(xì)胞胚可以例如發(fā)芽在固體發(fā)芽培養(yǎng)基上，諸如列舉在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基BM5。
在一些實(shí)施方案中，花旗松子葉體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化到成層培養(yǎng)基以在發(fā)芽之前進(jìn)行冷處理。通常，成層培養(yǎng)基類似于發(fā)芽培養(yǎng)基，但缺乏瓊脂。子葉體細(xì)胞胚通常在黑暗中培養(yǎng)在成層培養(yǎng)基中或之上，培養(yǎng)時間為從3周到6周，諸如大約4周，培養(yǎng)溫度為從1℃到10℃，諸如從1℃到8℃。
發(fā)芽的植物體可以轉(zhuǎn)移到土壤中進(jìn)行進(jìn)一步生長。例如，發(fā)芽的植物體可以種植在溫室的土壤中，并且在移植到室外以前進(jìn)行生長。通常，成熟花旗松體細(xì)胞胚加以照明來刺激發(fā)芽。通常，本發(fā)明的方法的所有步驟除了發(fā)芽都在黑暗中進(jìn)行。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，至少27％(諸如至少40％或者至少60％)的花旗松外植體形成胚柄團(tuán)。本發(fā)明的方法與起始培養(yǎng)基不含麥芽糖或葡萄糖或其組合物作為主要糖源的方法相比增加了從花旗松外植體起始的胚柄團(tuán)的數(shù)目。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目至少比利用相同的起始培養(yǎng)基但是用蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目多大約51％(諸如多大約60％或多大約80％)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，至少18％(諸如至少25％或者至少40％)的花旗松胚柄團(tuán)形成成形的胚柄團(tuán)。本發(fā)明的方法與維持培養(yǎng)基中不含麥芽糖或葡萄糖或其組合物作為主要糖源的方法相比增加了成形的花旗松胚柄團(tuán)的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的成形的花旗松胚柄團(tuán)的數(shù)目至少比利用相同的維持培養(yǎng)基但是用蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的成形花旗松胚柄團(tuán)的數(shù)目多大約65％(諸如多大約75％或多大約90％)。
本發(fā)明的方法可用于，例如產(chǎn)生單個花旗松樹的克隆，所述的花旗松樹具有一種或者多種需要的特性，諸如快速生長率。因此，一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一群遺傳相同的成熟花旗松胚的方法。此處描述的任意方法可用于產(chǎn)生遺傳相同的成熟的花旗松胚群。
下列實(shí)施例僅僅列舉了現(xiàn)在考慮到的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式，但是不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1這個實(shí)施例顯示了利用含有麥芽糖或者蔗糖作為主要糖源的起始和維持培養(yǎng)基獲得的花旗松胚柄團(tuán)的起始和形成概率的比較。
錐體細(xì)胞收集自四株雜交母樹(全同科)，此時胚為發(fā)育階段的前圓形細(xì)胞和圓形細(xì)胞階段。錐體細(xì)胞轉(zhuǎn)移在藍(lán)冰上并在0-4℃保存在冷室的塑料袋中直到需要解剖。在同一天從錐體細(xì)胞去處種子并進(jìn)行解剖。去除種子后，放入到含有預(yù)先滅菌的水的燒杯中。
將種子分成每等分60到80顆種子。在進(jìn)行隨后的程序之前，每份放置在分離的預(yù)先滅菌的濾茶網(wǎng)中。首先，種子在10％的Liqui-nox(每升加入2滴的全吐溫-20)中攪動10分鐘。在去離子水(18兆歐)中沖洗種子30分鐘后，在通風(fēng)櫥中旋轉(zhuǎn)振蕩器(175rpm)上濾茶網(wǎng)暴露于20％(v/v)H2O210分鐘。在正好使用之前用無菌去離子水稀釋H2O2。在使用H2O2后，每個濾茶網(wǎng)放置在滅菌去離子水的單獨(dú)的燒杯中，用金箔紙蓋住并移入層流凈化罩中。所有隨后的步驟都在層流凈化罩中進(jìn)行。每個濾茶網(wǎng)在5個單獨(dú)部分的每一個無菌去離子水中振蕩4到8次進(jìn)行清洗。每個濾茶網(wǎng)中的物質(zhì)倒入含有無菌濾紙和幾毫米無菌水(有助于防止種子干燥)的大培養(yǎng)皿中。種子放入每個含有0.2ml無菌去離子水的60×15mm的無菌培養(yǎng)皿中。在滅菌后沒有解剖的那些種子在當(dāng)天結(jié)束時扔掉。
在潔凈的層流凈化罩中進(jìn)行解剖。在整個制備步驟和解剖的過程中戴上干凈的手套。利用無菌鑷子和解剖刀仔細(xì)的切開種子，去除雌配子體和珠心并切開雌配子體。拉出胚柄但是保持附著到(或者接觸)雌配子體。胚和雌配子體放置在起始培養(yǎng)基BM1上這樣通過培養(yǎng)皿蓋可以看見胚。
表1和2列舉了用于產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基的組成。
表1.用于花旗松胚胎發(fā)生培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(BM)的組成
表2.花旗松胚胎發(fā)生培養(yǎng)基的組成組分 BM1BM2BM3BM4BM5起始 維持 單獨(dú) 發(fā)育 發(fā)芽KNO31250 1250 1050 2500 1170Ca(NO3)2·2H2O - - 200 - 220肌醇 1000 5000 100 100 100L-谷氨酰胺 450 1000 1000 750 -L-脯氨酸 - - - 100 -L-天冬酰胺 - - - 100 -L-精氨酸 - - - 50-L-丙氨酸 - - - 20-L-絲氨酸 - - - 20-麥芽糖 15,00030,00020,00025,000-蔗糖 - - - - 20,000PEG 8000 - - - 190,000 -2，4-D 110 1.1 - - -N6-450.22 - - -芐基腺嘌呤激動素 430.22 - - -脫落酸 - - 10/5/510-赤霉素4/7 - - - 7.5 -活化的 2500 - - 1000 2500活性炭瓊脂 - 5000*- - 8000Gelrite1800 - - - -所有培養(yǎng)基的pH被調(diào)整到5.7*不用于液體培養(yǎng)基**組織培養(yǎng)瓊脂起始從每次雜交獲得的胚和雌配子體中的一半(第一組)放置在半固體BM1起始培養(yǎng)基(表2)上，另一半(第二組)放置在半固體BM1起始培養(yǎng)基上，其中用蔗糖(15000mg/L)代替麥芽糖。外植體保持在22到25℃，24小時暗光周期的環(huán)境下，時間為5到6周。時間的長短依賴于培養(yǎng)的特定基因型。在接種后2到3周開始觀察到胚柄團(tuán)(ESM)(白色，半透明和粘質(zhì))。顯微檢測通常顯示大量的早期胚與胚柄團(tuán)相連。
每組從外植體起始的ESM培養(yǎng)物的數(shù)目顯示在表3。起始被限定為從外植體生長胚柄團(tuán)。總之，從外植體起始的ESM的百分比對于A組而言為27％，而對于B組而言為18％。當(dāng)外植體培養(yǎng)在含麥芽糖的起始培養(yǎng)基(A組)上時檢測4個雜交中每個的起始的提高?？傊?，與培養(yǎng)在含蔗糖的起始培養(yǎng)基上的外植體相比在含有麥芽糖的起始培養(yǎng)基上的外植體的數(shù)目增加51％起始的外植體。
表3.A組和B組的起始概率雜交組 外植體(#)起始(#) 起始(％)1 A 136 63 46B 138 42 302 A 108 30 28B 108 20 193 A 110 21 19B 108 14 134 A 112 13 12B 111 8 7總 A 466 127 27B 465 84 18維持5到6周以后，來自A組的ESM繼代培養(yǎng)到固體BM2維持培養(yǎng)基(表2)上，而來自B組的ESM繼代培養(yǎng)到BM2維持培養(yǎng)基上，其中麥芽糖用蔗糖(30000mg/L)代替。維持培養(yǎng)基與起始培養(yǎng)基的區(qū)別在于生長激素(植物生長素和細(xì)胞因子)減少至少一個完整的數(shù)量級。這個培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度通常從起始培養(yǎng)基的重量摩爾滲透濃度升高到大約180mM/kg或者更高(通常在大約180-400mM/kg的范圍內(nèi))，其途經(jīng)是增加肌醇的濃度到0.5％w/v。溫度和光周期仍然是在22到25℃，24小時的黑暗中。每12天將ESM繼代培養(yǎng)在新鮮的維持培養(yǎng)基上。
總共12到15次繼代培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基上后，每組外植體形成的ESM的數(shù)量顯示在表4中。如果多次繼代培養(yǎng)后重量在250mg和500mg(鮮重)或者如果測定到的直徑為1到2cm就認(rèn)為形成了ESM。獲得的成形的EMS的比例對于A組的外植體為18％，而對于B組的外植體為11％。當(dāng)外植體培養(yǎng)在含麥芽糖(A組)的維持培養(yǎng)基上時檢測到4個雜交中每個的ESM成形概率提高?？傊瑢τ谂囵B(yǎng)在含麥芽糖的維持培養(yǎng)基上的外植體與培養(yǎng)在含蔗糖的維持培養(yǎng)基上的外植體相比成形的ESM數(shù)量增加51％。
表4.A組和B組的成形概率雜交組 外植體(#)起始(#)起始(％)1 A 136 36 26B 138 20 142 A 108 11 10B 108 6 63 A 110 20 18B 108 12 114 A 112 17 15B 111 13 12總 A 466 84 18B 465 51 11雖然已經(jīng)列舉和描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，應(yīng)該認(rèn)識到在不離開本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進(jìn)行多種改變。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法，所述方法包括如下步驟將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述起始培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中起始培養(yǎng)基中主要糖源的濃度為從大約5g/L到大約60g/L之間。
3.權(quán)利要求1的方法，其中主要糖源為麥芽糖。
4.權(quán)利要求1的方法，其中外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，培養(yǎng)時間為大約4周到大約12周之間。
5.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括如下步驟將胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，所述維持培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的成形的胚柄團(tuán)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中維持培養(yǎng)基中主要糖源的濃度為從大約5g/L到大約60g/L之間。
7.權(quán)利要求5的方法，其中糖源為麥芽糖。
8.權(quán)利要求5的方法，其中胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或者之上，培養(yǎng)時間為大約6周到大約12周之間。
9.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括如下步驟(a)將來自成形的胚柄團(tuán)的早期體細(xì)胞胚培養(yǎng)在單獨(dú)培養(yǎng)基中或者之上，從而形成單獨(dú)的早期體細(xì)胞胚，和(b)將單獨(dú)的早期體細(xì)胞胚培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中或者之上，從而形成子葉體細(xì)胞胚。
10.權(quán)利要求1的方法，其中至少27％的外植體產(chǎn)生胚柄團(tuán)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目比用相同的起始培養(yǎng)基但是包含蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的胚柄團(tuán)的數(shù)目至少多大約50％。
12.權(quán)利要求5的方法，其中至少18％的胚柄團(tuán)形成成形的胚柄團(tuán)。
13.權(quán)利要求5的方法，其中成形的胚柄團(tuán)的數(shù)目比用相同的維持培養(yǎng)基但是包含蔗糖作為主要糖源所產(chǎn)生的成形的胚柄團(tuán)的數(shù)目至少多大約65％。
全文摘要
一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生花旗松體細(xì)胞胚的方法。一方面，本發(fā)明的方法包括如下步驟將花旗松外植體培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中或者之上，所述起始培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的胚柄團(tuán)。在另一方面，本發(fā)明的方法還另外包括如下步驟將花旗松胚柄團(tuán)培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，所述維持培養(yǎng)基包括選自麥芽糖，葡萄糖，及其組合物的主要糖源，從而形成包括早期體細(xì)胞胚的成形的胚柄團(tuán)。
文檔編號C12N5/02GK1550547SQ20041003859
公開日2004年12月1日 申請日期2004年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月5日
發(fā)明者巴莫德·K·古普塔, 戴安娜·G·霍爾姆斯特倫, 多麗絲·布德沃思, G 霍爾姆斯特倫, 布德沃思, 巴莫德 K 古普塔 申請人:韋爾豪澤公司