專利名稱：對大腸桿菌o132的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O132(Escherichia coli O132)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O132中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測人體及環(huán)境中的大腸桿菌O132并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術(shù)：
位于大腸桿菌表面的脂多糖是大腸桿菌致病的誘因，而O-抗原是脂多糖最外層結(jié)構(gòu)，是免疫系統(tǒng)識別的目標(biāo)和噬菌體吸附的位點(diǎn)。O-抗原的缺失會(huì)造成許多病原體的血清敏感，或者嚴(yán)重削弱病原體的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18K1Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42907-913]。大腸桿菌是一個(gè)種，種內(nèi)的菌株一般通過O-抗原和H-抗原(有時(shí)通過K-抗原)來鑒定。其中O-抗原具有高度多樣性，大腸桿菌有166種不同的O-抗原，O-抗原的變化可能是大腸桿菌的起源和維持其多樣性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因及糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的次一目的是提供了構(gòu)成大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因；糖合成路徑基因，包括rm1B、rm1D、rm1C、rm1A。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對大腸桿菌O132的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它們對大腸桿菌O132的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對大腸桿菌O132的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法來檢測和鑒定大腸桿菌O132的O-抗原及檢測和鑒定大腸桿菌O132。
本發(fā)明的再一目的是提供了分離大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長13965個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其包括命名為rm1B，rm1D，rm1A，rm1C，wzx，glf，orf7、orf8、orf9、wzy、orf11、orf12的12個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因是SEQ ID NO1中的4621至5895堿基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的9553至10752堿基的核苷酸；所述的orf7基因是SEQ ID NO1中的6987至7793堿基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7795至9006堿基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的10745至11605堿基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的11598至12590堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其還包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原高度特異的核苷酸，其特征在于，SEQ IDNO1中的4671至4688堿基的核苷酸和5406至5423堿基的核苷酸，SEQ IDNO1中的5494至5511堿基的核苷酸和5840至5860堿基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的10039至10057堿基的核苷酸和10448至10466堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9893至9911堿基的核苷酸和10245至10263堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O132的O-抗原，以及在制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，可用這些方法檢測人體和環(huán)境中的細(xì)菌。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O132型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O132型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O132型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O132型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O132型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O132，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細(xì)菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測其對大腸桿菌O132的靈敏度。
前述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O132，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4MEDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O132的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCCTGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand LongTemplate PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘，然后94℃變性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)；合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾，此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，再通過將相聯(lián)系的序列進(jìn)行反向測序及測通得到剩余20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O132的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到12個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在大腸桿菌O132中得到陽性結(jié)果，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O132及其O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O132的凍存菌液接種到有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至飽和，取培養(yǎng)好的菌液稀釋，取稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入LB培養(yǎng)基，過濾，過濾液于30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)ml于6,000g離心數(shù)分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100℃沸水中煮數(shù)分鐘，裂解液于12,000g離心數(shù)分鐘，取上清做為PCR模板；用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的4671至4688堿基的核苷酸和5406至5423堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5494至5511堿基的核苷酸和5840至5860堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10039至10057堿基的核苷酸和10448至10466堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9893至9911堿基的核苷酸和10245至10263堿基的核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95 ℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O132的檢測靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
也就是，本發(fā)明第一個(gè)方面，提供大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長13965個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所述，其12個(gè)基因都位于galF基因和gnd基因間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因；細(xì)菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括rm1B、rm1D、rm1A、rm1C。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。本發(fā)明尤其涉及到o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細(xì)菌的O-抗原并不是特異的，而本發(fā)明涉及到的o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)Υ竽c桿菌O132的O-抗原是特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的wzy基因或與wzy有相似功能的基因和wzx基因或與wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中源于大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸對。在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物只在以大腸桿菌O132為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中得到預(yù)期大小的產(chǎn)物，而在以表2所列的其它菌為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中都未得到預(yù)期大小的產(chǎn)物。更詳細(xì)地說，以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應(yīng)在大多數(shù)細(xì)菌中均未得到任何產(chǎn)物，所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對大腸桿菌O132及它們的O-抗原是高度特異的。
所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提取；2)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文庫的構(gòu)建；4)對文庫中的克隆測序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最終獲得O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度的檢測。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所述，“寡核苷酸”主要是指來源于O-抗原基因簇中的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因、編碼聚合酶的基因和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的4621至5895堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的9553至10752堿基)內(nèi)的寡核苷酸對大腸桿菌O132都是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。這些基因的混合物對一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因。(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O132?？捎肞CR方法檢測，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測無效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，該特殊的細(xì)菌O-抗原是由大腸桿菌O132表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是大腸桿菌O132?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測本發(fā)明方法的多對寡核苷酸，在這里多對寡核苷酸是源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。這套寡核苷酸對一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O132?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來源于wzx基因或與wzx有相似功能的基因及wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，可選擇寡核苷酸混合物來檢測混合的基因以提供檢測特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)大腸桿菌O132的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實(shí)施例1基因組的提取。
在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O132，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O132的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。
首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清液，用冷的冰預(yù)冷去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清液，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇文庫。
實(shí)施例4對文庫中的克隆測序。
從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再通過反向測序及將有些序列測通得到，最后獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O132的基因組作6個(gè)LongPCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到12個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶在361個(gè)氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶由rm1B基因編碼，高度的相同性表明orf1也是rm1B基因，命名為rm1B。 Orf2與Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖脫氫酶在299個(gè)氨基酸中有96％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖脫氫酶由rm1D基因編碼，高度的相同性表明orf2也是rm1D基因，命名為rm1D。orf3與Shigella boydii的葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶在292個(gè)氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶由rm1A基因編碼，高度的相同性表明orf3也是rm1A基因，命名為rm1A。Orf4與Shigella boydii的dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3，5-變位酶在170個(gè)氨基酸中有84％的相同性，87％的相似性。dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3，5-變位酶由rm1C基因編碼，較高的相同性表明orf4也是rm1C基因，命名為rm1C。這四個(gè)基因共同合成鼠李糖。說明在大腸桿菌O132的O-抗原中有鼠李糖。Orf5與Escherichia coli K12的的O-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶Wzx在412個(gè)氨基酸的序列中有43％的相同性，66％的相似性。并且通過Eisenberg等人的算法發(fā)現(xiàn)orf5有11個(gè)潛在的穿膜區(qū)，Wzx蛋白的氨基端有一個(gè)大約40個(gè)氨基酸的保守基序，所以可以確定orf5是wzx基因，命名為wzx。 Orf6與Escherichia coli K12的UDP-吡喃(型)半乳糖變位酶在360個(gè)氨基酸中有70％的相同性，83％的相似性。UDP-吡喃(型)半乳糖變位酶由glf基因編碼，高度的相同性表明orf1也是glf基因，命名為glf。Orf7與Vibriovulnificus的糖基轉(zhuǎn)移酶在149個(gè)氨基酸中有40％的相同性，62％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf7與糖基轉(zhuǎn)移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue為6.8×e-5，推測orf7也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，將orf7暫命名為orf7。Orf8與Sinorhizobium meliloti的糖基轉(zhuǎn)移酶在365個(gè)氨基酸中有25％的相同性，47％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf8與糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的保守的功能域PF00534的E value為3.2×e-7，推測orf8也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，暫命名為orf8。Orf9與Bacteroidesfragilis的乙酰轉(zhuǎn)移酶和Escherichia coli K12的O-乙酰轉(zhuǎn)移酶在183個(gè)氨基酸中有40％的相同性，56％的相似性，與Escherichia coli K12的O-乙酰轉(zhuǎn)移酶在146個(gè)氨基酸中有43％的相同性，58％的相似性，暫命名為orf9。Orf10與Streptococcus pneumoniae的O-抗原聚合酶在342個(gè)氨基酸的序列中有22％的相同性，47％的相似性。并且通過Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and Surface protein sequences withthe hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發(fā)現(xiàn)orf10有9個(gè)潛在的穿膜區(qū)，它與許多Wzy蛋白有相似的二級結(jié)構(gòu)，有一個(gè)大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以確定orf10是wzy基因，命名為wzy。Orf11與Enterococcus faecalis的糖基轉(zhuǎn)移酶在244個(gè)氨基酸中有28％的相同性，48％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf11與糖基轉(zhuǎn)移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue為1.3×e-3，因此推測orf11也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，暫命名為orf11。Orf12與Clostridium tetani E88的糖基轉(zhuǎn)移酶在192個(gè)氨基酸的序列中有27％的相同性，50％的相似性。在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf12與糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue為1.8×e-2，推測orf12也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，暫命名為orf12。
實(shí)施例6特異基因的篩選針對大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
在表1中列出了大腸桿菌O132的O抗原基因簇的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個(gè)基因，所以我們根據(jù)mdh基因設(shè)計(jì)了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后從166種血清型的大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對引物從166種血清型的大腸桿菌的基因組中PCR以鑒定大腸桿菌并檢測其基因組的質(zhì)量。
表2是用于篩選特異基因的166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每12-19個(gè)菌分為一組，總共13組。它們的來源都列于表中。
在第7組中含有大腸桿菌O132的基因組DNA作為陽性對照。第13組中是不含有大腸桿菌O132的基因組DNA，作為陰性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在95℃預(yù)變性2分鐘后，95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時(shí)間是50秒，72℃延伸2分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸10分鐘，反應(yīng)體系是25ul。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出的片段。
對于wzx、wzy基因，每個(gè)基因都有兩對引物被檢測，每對引物除了在第7組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶。所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O132及其O-抗原都是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O132中篩選到對大腸桿菌O132的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對大腸桿菌O132的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對經(jīng)PCR檢測后證實(shí)對大腸桿菌O132是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測人體和環(huán)境中的大腸桿菌O132，并能鑒定它們的O-抗原。
通過對O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達(dá)，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實(shí)驗(yàn)室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明可以引起兔子的免疫反應(yīng)(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的小組也在從事與Viret實(shí)驗(yàn)室類似的工作。王磊實(shí)驗(yàn)室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達(dá)，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(yīng)(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O51的O抗原特異基因序列可以應(yīng)用于組建重組疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的對大腸桿菌O51型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ ID NO1所示)，構(gòu)造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測的樣品適當(dāng)處理后，與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后利用生物芯片信號分析設(shè)備就可以得到樣品中相應(yīng)的細(xì)菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗(yàn)場所(如食品加工和生產(chǎn)行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關(guān)檢疫等的微生物檢驗(yàn))。這種芯片只需要擴(kuò)大產(chǎn)量，在完全相同的條件下就可以產(chǎn)業(yè)化。
表3是大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由12個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在細(xì)菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個(gè)ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸<130>對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>13965<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaatgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120caactgcttg cggaagtgca gtccatttgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ccttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240aacccatttg tcgtggtatt gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcga ttcaacgaaa cgggtcgtag ccaggtgctg 360gcaaagcgta tgccgggtga cctctctgaa tactcggtca tccagaccaa agaaccactg 420gaccgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag 480acgttggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcacgcagcc aggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccatcgct 600gaactggcga aaaaacagtc tgttgacgcc atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactgcgtaa cctaaaagaa 720ggggcgaagt tccggaaagg aattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt 840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960agcgtttgaa tttttcggat ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc 1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa 1080tcaaactaag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaagagtga 1140agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa 1200ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat 1260cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atatttttga acatgcggat atttgcgatg 1320ctgctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgca tgcagtgatg cacctggctg 1380
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ttaaaacatc tactaacttt agtcttacag gtgagaaaat ttatgacgct ttaatgattt 12120tacgtgatgg agattataaa aattataatc taactttaag tgagttttat agactgaata 12180acaacggatt tacagttgca ttagtaaatg cgtctcgaaa tagcttacca tttaatccat 12240tgatattctc taatttgtgt agggatgatt ttattaaagt gcttatgatg tcaaaaaggt 12300ttatatgttt gtcaaagtgg gaaggacttg gtcttcctaa tttagaagca tattccttag 12360gattagaaat catatcaaca aaaatacctt cagcacaaat aatagaggag atagatccta 12420atgctattac tattatagat agtattgaac aagttgaaaa ggccattatc agtaatagag 12480ttcaaatctc tgataataaa atgtacttaa gatccgaatc attgactgac ttggattcgc 12540tgtggaaaga acacatattc agcacaatcc gatattatat gggccaatag tgttcttaag 12600tctataaaat cctattaact atgaatcaac aaaatgttga taaatataat gaatacattc 12660aaactgcact ttgttgtgcg ttgcgccact gataggagta aacaatgtca aagcaacaga 12720tcggcgtagt cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc gaaagccgtg 12780gttataccgt ctctattttc aaccgttccc gtgagaagac agaagaggtg attgccgaaa 12840atccaggcaa gaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa tctctggaaa 12900cgcctcgtcg catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct gctattgatt 12960ccctcaagcc gtacctcgat aaaggtgaca tcatcattga tggtggtaac accttcttcc 13020aggataccat ccgtcgtaac cgcgagcttt ctgcagaagg ttttaacttt ataggtaccg 13080gtgtctccgg tggtgaagaa ggtgcgctga aaggtccttc cattatgcct ggtggccaga 13140aagaagccta tgagctggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt gctgaagatg 13200gcgaaccgtg cgttacatat attggtgccg atggcgcagg tcactatgtg aagatggttc 13260acaacggtat tgaatacggt gatatgcaac tgattgctga agcctattct ctcctgaaag 13320gcggcctgaa tctttctaac gaagaactgg cacagacctt taccgagtgg aataacggtg 13380aactgagcag ctacctgatc gacatcacca aagacatctt cactaaaaaa gatgaagacg 13440gtaactacct ggttgatgtg atcctggatg aagcggctaa caaaggtacc ggtaaatgga 13500ccagccagag cgcgctggat ctcggcgaac cgctgtcgct gattaccgag tctgtgtttg 13560cacgttatat ctcttctctg aaagagcagc gtgttgccgc atctaaagtt ctctctggcc 13620cgcaagcgca gccagctggc gacaaaggtg agttcatcga gaaagttcgt cgtgcgctgt 13680atctgggtaa aatcgtttct tacgctcagg gtttctctca gctgcgcgca gcgtctgaag 13740agtacaactg ggatctgaac tacggcgaaa tcgcgaagat tttccgtgct ggctgcatca 13800tccgtgcgca gttcctgcag aaaatcaccg atgcttatgc cgaaaatccg cagatcgcta 13860acctgctgct ggctccgtac ttcaagcaaa ttgccgatga ctaccagcag gcgctgcgtg 13920atgtcgttgc ttatgcagta cagaacggta tcccggttcc gacct 13965表1大腸桿菌O132的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)產(chǎn)生正 PCR的基 基因的正向引物位置 反向引物位置 PCR產(chǎn)物 確大小 退火溫功能因 堿基位置長度電泳帶 度的組數(shù) (℃)wzx O-抗原4621-5895 4671-4688 5406-5423 752bp 2 60轉(zhuǎn)運(yùn)酶5494-5511 5840-5860 366bp 2 60wzy O-抗原9553-1075210039-1005710448-10466428bp 2 60聚合酶9893-9911 10245-10263371bp 2 60表2 166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大腸桿菌O4，O1O，O25，O26，O27，O28，O29，O3O，O32，O33，O34，O35，IMVSaO36，O37，O38，O4O，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌O6，O44，O45，O46，O48，O49，O5O，O51，O52，O54，O55，O56，IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，6、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137， IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O1 54，O156，O157，O158，IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173，c痢疾志賀氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鮑氏志賀氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志賀氏菌 F1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v4)，F(xiàn)5(v7)，F(xiàn)6， dDS，DR12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大腸桿菌 去除大腸桿菌O5132第7組菌為了檢測的方便，每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，第13組作為陰性對照a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173來自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余來自于IMVSd.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3是大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表E.coliO132 O-antigen gene cluster orf galFrmlBrmlDrmlArmlC wzxglf orf7orf8 orf9 wzyorf11 orf12gndG+C％ 43.246.643.3 39.233.5 34.027.632.3 34.3 28.628.0 29.7content表4是大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAATGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATTTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180CAGGGCGAAC CCTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240AACCCATTTG TCGTGGTATT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG 300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGA TTCAACGAAA CGGGTCGTAG CCAGGTGCTG 360GCAAAGCGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCGGTCA TCCAGACCAA AGAACCACTG 420GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGTTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540GAACTTGAAC GCACGCAGCC AGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT 600GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGACGCC ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC 660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGTAA CCTAAAAGAA 720GGGGCGAAGT TCCGGAAAGG AATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960AGCGTTTGAA TTTTTCGGAT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC 1020ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA 1080Orf1的起始TCAAACTAAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAGAGTGA1140AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA 1200ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT 1260CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATATTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG 1320CTGCTGCAAT GGCACGGATT TTTGCTCAGC ATCAGCCGCA TGCAGTGATG CACCTGGCTG 1380CTGAAAGCCA TGTTGACCGT TCAATTACAG GTCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG 1440TTGGTACTTA TGTCCTTTTG GAAGCCGCTC GCAATTACTG GTCTGCTCTT GATAGCGACA 1500AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGT GATTTGCCTC 1560ATCCTGACGA GGTAAATAAT ACAGAAGAAT TACCCTTATT TACTGAGACA ACAGCTTACG 1620CGCCAAGCAG CCCTTATTCC GCATCCAAAG CATCCAGCGA TCATTTAGTC CGCGCGTGGA 1680AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAATTGCTC TAACAATTAT GGTCCTTATC 1740ATTTCCCGGA AAAATTGATT CCATTGGTTA TTCTCAATGC TCTGGAAGGT AAAGCATTAC 1800CTATTTATGG TAAAGGGGAT CAAATTCGCG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG 1860CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGAAAC TTATAATATT GGTGGACACA 1920ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC 1980CGAAAGAGAA ATCTTACCGC GAGCAAATTA CTTATGTTGC CGATCGTCCG GGACACGATC 2040GCCGTTATGC GATTGATGCT GAGAAGATTG GTCGCGAATT GGGATGGAAA CCACAGGAAA 2100CGTTTGAGAG CGGGATTCGG AAGACAGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG 2160ATAATGTGAA AAGTGGTGCC TATCAATCGT GGATTGAACA GAACTATGAG GGCCGCCAGT 2220orf1的終止orf2的起始AATGAATATT CTCCTTTTCG GCAAAACAGG GCAGGTAGGT TGGGAACTAC AGCGTGCTCT 2280GGCACCTTTG GGTAATTTGA TTGCTCTTGA TGTTCACTCC ACTGATTATT GTGGTGATTT 2340TAGTAATCCT GAAGGTGTGG CTGAAACCGT CAAAAAAATT CGCCCTGATG TTATTGTTAA 2400TGCCGCGGCT CATACCGCAG TAGATAAGGC TGAGTCAGAA CCCAAATTTG CACAATTACT 2460CAATGCGACC AGCGTTGAAT CAATTGCAAA AGCGGCTAAT GAAGTTGGGG CCTGGGTAAT 2520TCATTACTCA ACTGACTACG TATTTCCGGG AACCGGTGAA ATACCATGGC TGGAGACGGA 2580TGCAACCGCA CCGCTAAATG TTTACGGTGT AACCAAGTTA GCTGGAGAAA AAGCATTACA 2640AGAGCATTGT GCGAAGCACC TTATTTTCCG GACCAGCTGG GTCTATGCAG GTAAAGGAAA 2700TAACTTCGCC AAAACGATGT TACGTCTGGC AAAAGAGCGT GAAGAATTAG CGGTTATTAA 2760CGATCAGTTT GGTGCACCAA CAGGTGCTGA GCTGCTGGCT GATTGTACGG CGCATGCCAT 2820
TCGTGTGGCA TTGAATAAGC CAGAAGTCGC AGGTTTGTAC CATCTGGTAG CCAGTGGTAC 2880CACAACCTGG CACGATTATG CTGCGCTTGT TTTTGAAGAG GCGCGCAAAG CAGGCATTCC 2940CCTTGCGCTC AACAAGCTCA ACGCAGTACC AACATCAGCC TATCCTACAC CAGCTCGTCG 3000TCCACATAAC TCTCGCCTTA ATACAGAAAA ATTTCAACAG AACTTTGCGC TTGTCTTGCC 3060Orf2的終止TGACTGGCAG GTTGGCGTGA AACGAATGCT CAACGAATTA TTTACGACTA CAGCAATTTA3120Orf3的起始ATAGTTTTTG CATCTTGTTC GTGATGGTGG AGCAAGATGA ATTAAAAGGA ATGATGAAAT3180GAAAACGCGT AAAGGTATTA TTTTAGCGGG TGGTTCTGGT ACACGTCTTT ATCCTGTGAC3240TATGGCTGTC AGTAAACAGC TGTTACCGAT TTATGATAAA CCGATGATCT ATTACCCGCT 3300CTCTACACTG ATGTTGGCGG GTATTCGCGA TATTCTGATT ATCAGTACGC CACAGGATAC 3360TCCTCGTTTT CAACAACTGC TGGGTGACGG GAGCCAGTGG GGGCTAAATC TTCAGTACAA 3420AGTGCAACCG AGTCCAGATG GTCTTGCGCA GGCATTTATC ATCGGTGAAG AGTTTATCGG 3480TGGTGATGAT TGTGCTTTGG TTCTAGGTGA TAATATCTTT TACGGTCACG ATCTGCCGAA 3540GTTAATGGAT GTCGCTGTTA ACAAAGAAAG TGGTGCAACG GTATTTGCCT ATCACGTTAA 3600TGATCCTGAA CGCTACGGTG TCGTTGAGTT TGATAAAAAC GGTACGGCAA TAAGCCTGGA 3660AGAAAAACCG TTACAACCAA AAAGTAATTA TGCGGTAACC GGGCTTTATT TCTATGATAA 3720CGACGTTGTC GAAATGGCGA AAAATCTTAA GCCTTCTGCC CGCGGTGAAC TGGAAATTAC 3780CGATATTAAC CGTATTTATA TGGAACAGGG GCGTTTATCC GTTGCCATGA TGGGGCGTGG 3840ATATGCATGG CTGGACACGG GAACACATCA AAGTCTTATT GAAGCAAGCA ACTTTATTGC 3900AACAATTGAA GAACGTCAGG GACTGAAAGT TTCCTGTCCG GAAGAAATTG CTTACCGTAA 3960ACGGTTTATT GATGCTGAGC AGGTGAAAGT ATTAGCCGAA CCGCTGAAGA AAAATGCTTA 4020Orf3的終止 orf4的起始TGGTCAGTAT CTGCTCAAAA TGATTAACGG TTATTAATAA AATGAACGTA TTTAAAACTG 4080AAATTCCACA CGTACTGATT TTTGAACCGA AAGTTTTTGG TGATGAGCGT GGCTTCGTTT 4140TTGAGAGCTT TAACCAGAAG GTTTTTGAGG AAGCTGTAGG CCGCAAAGTT GAATTTGTCC 4200AAGATAACCA TTCGAAGTCT TGTAAAGGTG TTTTACGCGG GCTGCATTAT CAGTTAGAAC 4260CTTATGCACA AGGGAAATTG GTGCGGTGCG TTGTTGGTGA AGTTTTTGAC GTAGCTGTTG 4320ATATTCGTAA ATCGTCACCA ACTTTTGGCA AATGGGTTGG GGTGAATTTA TCTGCAGAGA 4380ATAAGCGCCA GTTATGGATC CCTGAAGGAT TTGCACATGG ATTTTTGGTG CTGAGTGAGA 4440CGGCAGAGTT TTTGTATAAG ACGACGAATT ACTATGCACC GATATATGAA AAAAGTATTC 4500TTTGGTCTGA TAATAAAATT AATATTGCTT GGCCTCTTCA AGGTGGTTTT ATTCTATCCG 4560Orf4的終止ATAAAGATCG TAATGCATCG TGTTTAGAAT AATGTATAAG CGAGTCATAC CTTGATTTAT 4620orf5的起始ATGAATGTAA TTAAGAGTAG AGTGTTCCTA AATGCTGTAT ATCTATTTGT TGTACAGGGC4680GTAACATATT TAGTTCCCTT AATTACTCTA CCCTATTTAG TTCGGGTATT AGGAGCGCAA 4740AGTTACGGAG TATTAAGTTT TTCACTGGCA ATCATACAGT ATTTTATACT TTTGACCGAT 4800TATGGTTTTA ACCTATCTGC AACACAAAAA ATTTCAGTTA TATGTGGTGA TATAAATAAA 4860ATCAGCAATG TATTTTGGTC GGTAACATGT TGTAAGATTT TGCTGATGAT AATTTCAGCT 4920ATACTAGTTT ATACTGTTAC CAAAGTATTT GATGTGATGA ATGGTCATGA ATTAGTAATA 4980TTTTCATGCT TTGGACTTGT ATTAGGAAAT ATTCTGTTTC CAGTATGGTT TTTTCAAGGG 5040AAGGAGCAAA TGGGGTTGAG CTCGATCTCG AATATAATAT CGAAGCTATT GGCAATCCCT 5100CTGATCTTCT TATTGGTCAA TAATCCTAAT GATGCATGGA TTGCTGCAAT AATAACATCT 5160TTTACTTCGA TATCTGGTGG ATTAATTTCA CTAACTATAA TTTACCATAA AAAATGGGTA 5220CATTGGGTTG GTATAAGAGA TCTAAAAATT ATTCAGGAAT TTAAAGATGG ATGGCATTTG 5280TTTATTTCAA CTGCGGCAAT AAGCATGTAT ACCACAAGTA TTGTTGTAGT TTTAGGAATT 5340TTTTCTGGAC CAATTTCCGT CGGTTATTTT ACTGCTGCAG ATCGTATTAG GCAAGCAGTT 5400CAGGGGTTAA TTACCCCTAT TACGCAGGCA TGCTATCCAA GGATTAATTA TCTTTACAGA 5460ACTTCTCCAG AAAAGGGCTT TGAGCTAGTC AGAAAATTAT TATATTTTCA GGGAGGTATA 5520ACCTTAACGT TAAGTATAAT ACTCATGATG TTCGCAAGTG TTATCGTTAA AATCTTATTT 5580GGAAACGGTT TCGAAAGATC AGATTCTGTA CTAACCATTA TGGCATTTTG CCCATTCATA 5640GTAGGGATAA GTAATGTGTT AGGAATTCAG ATATTAGTTG CATTAGGATA TAAAAAAGTA 5700TTCAGTAAAA TACTTTTATG CTCAGGCGGG TTATGTTTGA TATTGATTGG CCCGTCTACA 5760TATCTCTATA GTGAGAATGG TGCAGCATTA AGTGTGCTAA TAACTGAGGT TCTTGTGACG 5820ATTGCAATGC TTATTGTTGT GCTTGCAAAA AAAGTCCCTA TTTTTAAAAG AGAGAATTTG 5880orf6的起始 Orf5的終止AATAATGAAG TATGATTACA TTATTGTTGG AGCTAGTCTC TACGGCGCTG TCCTGGCCTG 5940TGAACTTCAT AAGGCTGGAA AAAAAGTTAT GGTTATTGAG AGACGTGAGC ATATTGGTGG 6000TAATATTTAC ACTGAAAATG TTGAAGGAAT ACATGTTCAC AAGTATGGCG CTCATATATT 6060TCATACGAAT GATAAAATAA TTTGGGATTA TGTCAATTCA TTCGTGGAAT TTAATCGCTT 6120TACTAACTCA CCTTTAGCAA ATTACAAAGG TGCATTATAT AATCTCCCAT TTAATATGAA 6180TACATTTTAT CAATTATGGG GAGTGCGGAC GCCTGATGAA GCAATTAAGA AAATTAATGA 6240ACAAAAACAA GAAATCAATG CTAAAACACC GTCTAATCTT GAGGAGCAAG CAATATCATT 6300AGTTGGTAGA GATATATATG AGAGGTTCAT TAAAGGTTAT ACAGAAAAAC AGTGGGGGCG 6360AAAAGCTACA GAACTTCCCG CTTTTATTGT TAAACGCATA CCAGTAAGGT TTACCTTTGA 6420TAATAACTAT TTCTCTGATC GCTATCAAGG CATTCCGATC GGTGGATATT CTGGATTAGT 6480AGAAAAGATG CTTGATGGTG TTGATGTTCA TTTAAATGTT GATTATCTAG AAAACCGTGA 6540TTATTTTGAC TCTATTGCTG ATAGGATAAT TTACACGGGA CCAATCGATG CCTTTTATAA 6600TTATTGCTTT GGATATCTTG AATATCGGAC GTTATTATTT AAAACAGAAA TTATAAAACG 6660GCCAAACTTC CAAGGTAATG CGGTTATCAA CTATACAGAA CGCGATATTC CGTTTACGCG 6720
TATAATTGAA CATAAGCATT TTGATTATAT AGATTCGCAA CTTACAGTTA TAACAAAAGA 6780GTTTCCCGGC GAATGGAAAC CTGGTGATGA ACCGTACTAT CCAGTAAATG ATGACAAAAA 6840CATGACGATT TATAAGAAAT ATCGGGAATT GTCTAAGAAA AATACCAAGT TTGTATTTGG 6900AGGCAGATTG GCTGAGTATA AGTATTATGA TATGCATCAG GTTATTAGAT CAGCTTTAAA 6960Orf6的終止 orf7的起始TCAAGTAAAA TTGGAAATAA ATTGATATGC TGTATTGTAT AATAGTAAGC CATAATCATG 7020AACAACATGT CAAAAATCTA CTAAGTTTTG CTGATTATAA CCCCTGCTCA GATGTAAAAA 7080TCTTGGTAAA AGACAACATC GGAAATGATG AGTTAAAGAG AGTCTGTGAA AAATATGAGG 7140TTGAATATTT TTGTAACTAT AAAAAAATGG GGTTTGGTCA AAATAATAAT GAAATGGTAA 7200GCAAAATAAT TAATAAACAT AAAATAAACG ATAATTTGGA TTATGTTTTA TTTCTTAATC 7260CTGACGTTTT AATTAAGCAT GAAGTATTGG TTAGTTTTTA TAAGTACATT ATTTCTAAAA 7320ATATAAAGGC AAGTACAATT GACCTTTTTA AAAATGAAGA TTTTACTAAA CGCGATGAGT 7380TTATCAGGAA ATTTCCTACT CTTACTGATT TTGTAAGTTC GATCATATTT AACATCAACA 7440AGACAAAAAT TGACAGGTCA AAAATTATTG AACCATGTGA AATCGATTGG TGTGCTGGTT 7500CATTTTTATG TATTAATTTG GCTATTTTTC GCGATATAAT GGGATTCGAT GAACGCTACT 7560ATATGTATTG TGAAGACATA GATCTTTGTT ATAGATTAAA ATTAAAAAAA ATCAAATTAG 7620TTTATCTCCC TCAGTTTAAA GCAATACATT TAGCAATGCA TGAGAATCGT AAGATTTTAT 7680CTAAGGCTTT CCGCTGGCAT GTAAGTAATG CAATATATTT TATTATTAAA AAATCTATTT 7740Orf7的終止 orf8的起始TCAAAAGCTT TGATTCTTAT TCCAATTCAG TAAAAACCAT CTTCAGAGGATGAAATGAAA 7800GTATTACATG TAGCTACGGG GTTTCCTTTT TTATATGTTG GTGGTATTAC AAACTATGTC 7860AGATCTCTAG TTATTTCTCA ACGTAATGCC GGACACGAAG TTCATGTCTT GTCTGGTGGA 7920TGTTCATCAG AAAATCTTGA GTATGTAACT AATATTTATT CAAAAAAAAT TAAACCTTTC 7980TCACTAAAGC TGAGCATTGA AGATGAAAAA TATGCAAAAG AAGTATTAAA TATATGCCGA 8040GAGTATGATA TCGTCCATTT TCATATGGTG TTAGACTTTC CTTCTTCATT ATTAAGTCGC 8100TTATCAAAAG AGATTCCCAA ATATGTAGTG AGCCTGCATG ACTACTTTTT GATTTGTCCT 8160CGTATATTTA TGAGTGATTA TAAAAACAAC ATTTGTCATG AGGTGAATAT TGATAAGTGT 8220AATGTCTGCT GTGGTTATTT TGATTCTATT GATATTGCAC GTAAAATAAG TTCTAAATTA 8280TCTATTCCAC TACCACGAAT TAAAACTAAT GAACCTGCAA GAAGAATTGA AAATGTTAAA 8340ACATTTCTAG AGGGTGCAAG TTTATTGCTG CCTGTTTCTG AAAAAGTTAA AGAGATATAC 8400AGTAAACTCG TACCTAATGC TTCTTACAAG GTTCTTCATA TTGGTAATAT CACTGCAACG 8460GAATTGCCCT TGCCTAAAGA AGAAAACGGA AAGATAATTA TTGGTATATT AGGAACTCTT 8520TCTTATATTA AGGGGAGTGA TATTATTTTG AAAATAATAA AACAAACTAC CAATAAAAAT 8580ATTGAATTTC ACTTCTATGG AAGAGCTGAT AAGAAATGGC TGACTAGATT AGAAAAATAT 8640GGACTTATAA ACAAGGGGAC ATATGTACAA GAAAATTTGA AAGAAATAAT ATCTACTATC 8700AATTTAGGCC TCGTCGTTCC GATATGGGAA GATAATGCCC CTCAGGTTGT TATGGAGTTT 8760CTCAACCTAA AAACTCCTGT TTTAGCGACA AGTAGAGGTG GTATACCAGA TTTCATACAA 8820CATTTGGTAA ATGGATATCT TTTTGATCCG GATGATCAAT GCTCCTTCCA GGCGTTTATT 8880GCTTGGATAA ATAATCTAAA TAGAAAAACT ATAGTACAGT TGAATGCTGG TGTGAAAAAG 8940orf9的起始CTTAAAACAC CTGAGCAACA TGAGAAAGAA ATCGATAGGG TTTATCATGT TATCAAAAAT 9000Orf8的終止ATATAAATAT GGACTGGTAG CTTCAATAAT AATTTTTTTT TCTAAATTAA AGAACTCTAT 9060TATAAATTCA TCATATAAAC GGCGCTTTGG TATCAAAAAT ATATCAATTG GGCCGGGGGG 9120ATTTATATCA AACTCTTCCA GAATATATTT TTCAGATAAC TTTTATGCTG GGACAAATTT 9180ATGGATTGAG AATGTAAAAA ACAAAGGAAT AATTGTAATA GGCTCTAATT GTAGGTTTAG 9240TAATAATGTT CATATAGCGT GCATAAACCG AATAACAATT GGCAAAGGGG TGCTAATAGG 9300TAGTAATGTA TTAATTACGG ATCATAGTCA TGGGAAACTT GTCGCTGAAG AAAAATTTAT 9360TAGCCCTTAT GAGCGTACTC TCTTTTCTAA GGGAGAGGTC ATTATTGGTG ACAATGTATG 9420GATATGCGAT GGTGTTATGA TCTTGCCAGG AGTTACGATT GGCTCTGGAG CTATTATAGC 9480TGCTAATTCC GTTGTTGTTA GCAACATACC ATCGTTTACT GTTGCGGCAG GAACACCTGC 9540orf10的起始 Orf9的終止TAAGGTTATT AAATGCATTG GGGCGTGAGA ACCACTTCAA TAATACTTAT TTTATTAACT 9600GTTTTTTTCC CTGGAATTGT GCTTTGGGGA GGAAATTTTA AAATAGAGTT GATTGTATTA 9660TGTATTATGT CATTATGCTT AATATTAAGG ATAAATCAGG TACTACTTTG CATAAAACCT 9720ATTTCTATTA TTATATTCTC CTATATGCTT TATGTATTGT TGGGTGGAAC TGGTTTATTT 9780TCTGGAACAT TTGATTTTTT TTCGTTAAGA AATATTCTTT ATCCCTTTAT TAAAGCATTG 9840GTTTTAGTGA TTTTTCTGTT TTTATTTTTG TTAAAAAAAA CACAAACACC CTTGTATGAT 9900ATTAATAGGC TTATTTTATT ATGTTTCTTT ATAGATTCAA TTTTCAAAGT TATAGAAATA 9960ATGTTTCCTT CAGTTGTTAG TGCTTGGCTA AATATAATTA GTATAGATGA TTGGTGGAAA 10020GATACCCTAG GTATGAGAAA TCTTGGGTTC AGAGGTGTGT CGATATACGA TTACTCAGTA 10080GCAGCTACGT TGGCTGTTTT AATTGATTTC TCTTTACGAA GCAGAAAAAA AATAAATTTT 10140ATAATTTACC CATTAGTATT ACTCTCTGCT TTATCATCCG GTAGAACAGG TTTAGTAGTT 10200ATATTTATAT TTACATTGGT TTATTTTTAT CGTTATGCAC CTAAAATTAT AATATCAGGT 10260TTTATATTTA TAATACTAAT AATGTATTTG TCACTATTTC ACTCTAATGA GCTTATACAT 10320AATCAGCAAC TATCATGGAT GTTCGAGCCT TTGTTAAACA TTCTTAATGG AAATATTGAG 10380ACCGAGTCGA CAGATGATCT TTTAGAGAAT CATCTGTTTA TGCCGGATAA TATCTTAGGA 10440TATGGTCTAT GGGGGCAATA TGGAGATATG CTTGGAAGCA CTATTAGAGG ATCAGACTCT 10500GGTTATATTC TGATTATCCT ATATGGTGGT TGGGTAGGTT TTATTTTCTT TCTTATTTGT 10560TCATTTTCCT ATTTATTGTA TGCATATATT AAAAGTCAGG ATAAAAAATT ATCTATTGCA 10620ATATTTTTTA CTTTTATGCT GATTATGATA AAAGGTCCAA TAATTTATAG CGATTATAAT 10680
GCATTCATTT TAATGTCTTT ATTGATTGCA CCATCGTTCT ATATTTTTTT TAAGGCTAAA 10740orf11的起始 orf10的終止GAAAATGAGT AACAATTATT ATATTGTTTG TCTTGTAGTA ATATATAAAG AAAAAATCTT 10800CGCGTCTGGA ACTATTAGAT CTCTCCTTCA TTCTTTTTCT GAATTAAAAG ACACTAATAA 10860AAAAATACTC GTTAAGTTAT GGGATAACTC CCCCGACTCA CAGAGTTCCA CTGACTTAAA 10920TAGACTTAAA GAATTGTTTT TACAAAATGA TATATTATTA AGTTATCAGC ATCAAAAGAA 10980TAATTATCCG TTATCGATTG TGTATAATCA TTTTTTTCAA GAATTTATAC ATCAAGCTCG 11040CTTTCTAATG TTGTTGGATC AAGATTCAAT ATTTGGTCCT GAGTATTTTC AAGAGTTTTA 11100TAATGCTGAG AAGAGAAGTA ATGTAGATCT ATTTTTGCCC AAAATCATGC ATAAAGGCAG 11160AATAATCAGT CCTACAAAGA TATATTATGC AAAAGGTTTT TATTACAAGG AAATTGCATC 11220TGGTTTTATT TCATCAAAAA AACTAGGTGC TATAAATAGT GGTATGATTA TTTCTTCTAA 11280ATATCTTATC CGAACGCGTT TTTCTTATGA TATAAGACTT GGCAATTACT GTACAGATGA 11340CTTTTTTATG AAGAAATTCC GGGAAAATAA AGGTATTGCA TATATTCTAG ATTATTCATT 11400CGATCATGAC TTAACATTGT CCACCTTAAA TGATAATAGT GACTCCTTGA GAAGACGCTA 11460TGAGGAAATG ATCAAAGGTA AAAGGTTAGT ATATAGCAAT AATATATTTG AGATGATATT 11520TATCAGGCTA TATATTATTC TAAATAGATG TTATATATCA TTGAAATATA AAGATCTGAA 11580orf12的起始 Orf11的終止ATATTTGAAA GGATTTTATGAATAAGTTAA TCATTTCTAT CCCACAATTT AATCTCTCTG 11640GTGGAAATTT GGTGTCATTG GAGCTAGGTC TTTTCCTAAA GAAAAAAGGA TTAGATGTAT 11700ACGGGCATTC TGGATTTAGG TTAAAAAAAA TTGATGAGAT TGAGCTTAAT ATTCCTAAAA 11760GAGGTCTATG TAACACTATC ATAAATATAA TAAGTTTCTT TTGTTCTTCT TTTTATTCTT 11820TATTTTCTAA ATATTATATA GCTACACACC ATTTGACGTC ATTATTTAAT TTTATAAAAC 11880CTGCAAAATT CTCACTTATC CAAGACATTG AATCATTGTT TTACCCTAAG CGTCTGAGTT 11940GGTTTGGAAC TATATTATGG AGAAATTATC TAAAATCTGA CACTCTGTTA TATACAAGTA 12000AGTATCTTGA ACAAAGAATA CATAACAATA ATAACCCTAA AACAATTGGC TTTCCATTTA 12060TTAAAACATC TACTAACTTT AGTCTTACAG GTGAGAAAAT TTATGACGCT TTAATGATTT 12120TACGTGATGG AGATTATAAA AATTATAATC TAACTTTAAG TGAGTTTTAT AGACTGAATA 12180ACAACGGATT TACAGTTGCA TTAGTAAATG CGTCTCGAAA TAGCTTACCA TTTAATCCAT 12240TGATATTCTC TAATTTGTGT AGGGATGATT TTATTAAAGT GCTTATGATG TCAAAAAGGT 12300TTATATGTTT GTCAAAGTGG GAAGGACTTG GTCTTCCTAA TTTAGAAGCA TATTCCTTAG 12360GATTAGAAAT CATATCAACA AAAATACCTT CAGCACAAAT AATAGAGGAG ATAGATCCTA 12420ATGCTATTAC TATTATAGAT AGTATTGAAC AAGTTGAAAA GGCCATTATC AGTAATAGAG 12480TTCAAATCTC TGATAATAAA ATGTACTTAA GATCCGAATC ATTGACTGAC TTGGATTCGC 12540orf12的終止TGTGGAAAGA ACACATATTC AGCACAATCC GATATTATAT GGGCCAATAGTGTTCTTAAG 12600TCTATAAAAT CCTATTAACT ATGAATCAAC AAAATGTTGA TAAATATAAT GAATACATTC 12660AAACTGCACT TTGTTGTGCG TTGCGCCACT GATAGGAGTA AACAATGTCA AAGCAACAGA 12720TCGGCGTAGT CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC GCTCAACATC GAAAGCCGTG 12780GTTATACCGT CTCTATTTTC AACCGTTCCC GTGAGAAGAC AGAAGAGGTG ATTGCCGAAA 12840ATCCAGGCAA GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTGAAAGA GTTTGTTGAA TCTCTGGAAA 12900CGCCTCGTCG CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG CACGGATGCT GCTATTGATT 12960CCCTCAAGCC GTACCTCGAT AAAGGTGACA TCATCATTGA TGGTGGTAAC ACCTTCTTCC 13020AGGATACCAT CCGTCGTAAC CGCGAGCTTT CTGCAGAAGG TTTTAACTTT ATAGGTACCG 13080GTGTCTCCGG TGGTGAAGAA GGTGCGCTGA AAGGTCCTTC CATTATGCCT GGTGGCCAGA 13140AAGAAGCCTA TGAGCTGGTT GCGCCGATCC TGACCAAAAT CGCCGCCGTT GCTGAAGATG 13200GCGAACCGTG CGTTACATAT ATTGGTGCCG ATGGCGCAGG TCACTATGTG AAGATGGTTC 13260ACAACGGTAT TGAATACGGT GATATGCAAC TGATTGCTGA AGCCTATTCT CTCCTGAAAG 13320GCGGCCTGAA TCTTTCTAAC GAAGAACTGG CACAGACCTT TACCGAGTGG AATAACGGTG 13380AACTGAGCAG CTACCTGATC GACATCACCA AAGACATCTT CACTAAAAAA GATGAAGACG 13440GTAACTACCT GGTTGATGTG ATCCTGGATG AAGCGGCTAA CAAAGGTACC GGTAAATGGA 13500CCAGCCAGAG CGCGCTGGAT CTCGGCGAAC CGCTGTCGCT GATTACCGAG TCTGTGTTTG 13560CACGTTATAT CTCTTCTCTG AAAGAGCAGC GTGTTGCCGC ATCTAAAGTT CTCTCTGGCC 13620CGCAAGCGCA GCCAGCTGGC GACAAAGGTG AGTTCATCGA GAAAGTTCGT CGTGCGCTGT 13680ATCTGGGTAA AATCGTTTCT TACGCTCAGG GTTTCTCTCA GCTGCGCGCA GCGTCTGAAG 13740AGTACAACTG GGATCTGAAC TACGGCGAAA TCGCGAAGAT TTTCCGTGCT GGCTGCATCA 13800TCCGTGCGCA GTTCCTGCAG AAAATCACCG ATGCTTATGC CGAAAATCCG CAGATCGCTA 13860ACCTGCTGCT GGCTCCGTAC TTCAAGCAAA TTGCCGATGA CTACCAGCAG GCGCTGCGTG 13920ATGTCGTTGC TTATGCAGTA CAGAACGGTA TCCCGGTTCC GACCT 13965以上僅是本發(fā)明較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡依本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例作修改、等同變化與修飾，均屬本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長13965個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其包括命名為rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，glf，orf7、orf8、orf9、wzy、orf11、orf12的12個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因是SEQ ID NO1中的4621至5895堿基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的9553至10752堿基的核苷酸；所述的orf7基因是SEQ ID NO1中的6987至7793堿基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO1中的7795至9006磁基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的10745至11605堿基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的11598至12590堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其還包括源于所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基轉(zhuǎn)移酶基因，以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對大腸桿菌O132的O-抗原高度特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的4671至4688堿基的核苷酸和5406至5423堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5494至5511堿基的核苷酸和5840至5860堿基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的10039至10057堿基的核苷酸和10448至10466堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的9893至9911堿基的核苷酸和10245至10263堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，而且通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O132的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測細(xì)菌。
9.權(quán)利要求1所述的對大腸桿菌O132型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O132型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O132型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測序儀對克隆中的插入片段進(jìn)行測序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O132型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O132型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O132型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O132，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細(xì)菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測其對大腸桿菌O132的靈敏度。
10.權(quán)利要求9所述的對大腸桿菌O132的O-抗原特異的核苷酸的分離和鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O132，離心收集細(xì)胞。用500u1 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O132中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O132的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAGTCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘，然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)；合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O132的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測序儀對克隆中的插入片段單向進(jìn)行測序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，再通過將相聯(lián)系的序列進(jìn)行反向測序及測通得到剩余20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對大腸桿菌O132的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到12個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O132的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因篩選針對大腸桿菌O132的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)兩對引物，每對引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物在大腸桿菌O132中得到陽性結(jié)果，在其他組中沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O132及其O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O132的凍存菌液接種到有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至飽和，取培養(yǎng)好的菌液稀釋，取稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入LB培養(yǎng)基，過濾，過濾液于30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)ml于6,000g離心數(shù)分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100℃沸水中煮數(shù)分鐘，裂解液于12,000g離心數(shù)分鐘，取上清做為PCR模板；用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μ1，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O132的檢測靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對大腸桿菌O132(Escherichiacoli O132)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌O132中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長13965個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O132的O－抗原基因簇中的寡糖單位處理基因(包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實(shí)寡核苷酸對大腸桿菌O132的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測和鑒定人體及環(huán)境中的大腸桿菌O132的方法。
文檔編號C12P19/34GK1563055SQ200410019040
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者王磊, 程劍松, 彭霞 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司