專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板。
背景技術(shù)：
對(duì)于PCR技術(shù)來(lái)說(shuō)，主要包括三個(gè)基本要素用于PCR反應(yīng)的模板、引物以及必要的反應(yīng)條件。而引物設(shè)計(jì)則是其中必不可少的步驟。對(duì)于大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)設(shè)計(jì)引物并不是一件很困難的事情，但要保證每一引物都能工作且具有高的效率則幾無(wú)可能。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，從而產(chǎn)生了許多關(guān)于引物設(shè)計(jì)的新方法、新技術(shù)、新的發(fā)明專(zhuān)利，而且許多私人及大公司已開(kāi)發(fā)了或正在開(kāi)發(fā)用引物設(shè)計(jì)的應(yīng)用軟件，但其效果卻不盡如人意。
一個(gè)PCR反應(yīng)的成敗，其決定因素有三個(gè)方面1)模板的質(zhì)量與數(shù)量；2)引物數(shù)量與質(zhì)量；3)模板與引物是否發(fā)生反應(yīng)及反應(yīng)條件是否適合。究竟是由于模板或引物的數(shù)量和質(zhì)量的欠缺，還是由于引物在反應(yīng)過(guò)程中形成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，而引起的PCR反應(yīng)的失敗則缺乏實(shí)用的評(píng)價(jià)方法。因此開(kāi)發(fā)用于引物評(píng)價(jià)多用途模板，在基礎(chǔ)研究和臨床研究及應(yīng)用方面具有廣泛的前景，包括對(duì)普通PCR、多重PCR等PCR反應(yīng)的引物評(píng)價(jià)，以及在新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及臨床診斷新方法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，對(duì)于各影響因素的分析，特別是在烈性傳染病爆發(fā)流行及某些物種其DNA資源很稀少，無(wú)法保證研究安全性及難以獲得標(biāo)本的情況下，該多用途模板具有更重要的意義。
通常PCR反應(yīng)原模板都是根據(jù)所要檢測(cè)的個(gè)體而選擇的，而引物的設(shè)計(jì)則是根據(jù)各文獻(xiàn)已報(bào)道的各種方法、原理及利用各大公司和個(gè)人所設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)應(yīng)用軟件來(lái)設(shè)計(jì)的。對(duì)于一個(gè)PCR反應(yīng)體系來(lái)說(shuō)，其引物是否參與反應(yīng)，效率如何，都是通過(guò)PCR反應(yīng)的結(jié)果來(lái)判斷的，如果反應(yīng)失敗，通常認(rèn)定為引物不工作，究竟是由于模板引起的還是由于引物引起則難以辨別。
就現(xiàn)在的技術(shù)而言，要在液相的PCR反應(yīng)體系中使用特異性的模板對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)是完全可行的，但是，即便是在液相反應(yīng)體系中，使用長(zhǎng)鏈的模板對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)仍然是很困難的，更別說(shuō)對(duì)基因芯片和其它固態(tài)或半固態(tài)反應(yīng)價(jià)體系用特異性的模板對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)了，而要對(duì)以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行SNP分析的基因芯片的所有引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，則幾乎是不可能的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，利用本發(fā)明，可對(duì)多種實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)用引物進(jìn)行快速檢測(cè)，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，該模板由三部分組成，(1)其五末端為搖擺堿基，(2)中間為含有特定堿基的核苷酸序列，(3)三末端為搖擺堿基。
所述的五末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)，以22個(gè)為宜。
所述的三末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)，以22個(gè)為宜。
所述的中間的含有特定堿基的核苷酸序列的堿基數(shù)為15～500個(gè)，優(yōu)選的是20～100個(gè)，以45個(gè)為最佳。
本多用途模板具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果1.本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板可廣泛用分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，降低了引物設(shè)計(jì)的難度及復(fù)雜性。
2.采用本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板對(duì)實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)用引物進(jìn)行預(yù)先評(píng)價(jià)，可降低實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)性，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)進(jìn)行分析，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
3.采用本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板對(duì)實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)用引物進(jìn)行預(yù)先評(píng)價(jià)，可節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，若測(cè)試結(jié)果顯示引物可用于實(shí)驗(yàn)，則實(shí)驗(yàn)失敗是由于其它原因造成；若測(cè)試結(jié)果顯示引物不能用于實(shí)驗(yàn)或臨床檢測(cè)，則需立即設(shè)計(jì)其他引物。
4.對(duì)于那些難以得到的基因或很稀有的珍貴標(biāo)本，采用本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板預(yù)先對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，可避免標(biāo)本的損耗，節(jié)約原材料。
5.本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板用于引物評(píng)價(jià)時(shí)，所采用的PCR其反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和反應(yīng)原理與普通PCR相同，對(duì)PCR儀器及其它儀器設(shè)備也無(wú)特殊要求，凡能進(jìn)行普通PCR操作的人員均能進(jìn)行操作。
本發(fā)明的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板的最大優(yōu)點(diǎn)可利用單條引物進(jìn)行雙向引物延伸反應(yīng)，這一點(diǎn)是本產(chǎn)品在國(guó)際上的初創(chuàng)。


圖1為實(shí)施例結(jié)果電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
在圖1中M表示MARKER，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13表示不同的反應(yīng)體系，1表示H1+模板，2表示H2+模板，3表示H1+H2+模板，4表示H1+H2，5表示I1+模板，6表示I2+模板，7表示I1+I2+模板，8表示I1+I2，9表示K1+模板，10表示K2+模板，11表示K1+K2+模板，12表示K1+K2，13表示僅有模板。
本發(fā)明所介紹的用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板由三部分組成1)由15個(gè)至50個(gè)的搖擺堿基組成的五末端；2)由15個(gè)至500個(gè)堿基組成的具有確定堿基序列的中間部分；3)由15個(gè)至50個(gè)的搖擺堿基組成的三末端。其通式如下5′(n)a(N)b(n)c3′其中n表示搖擺堿基；(搖擺堿基存在于人工合成的DNA或引物中，在DNA或引物的合成過(guò)程中，對(duì)于同一位點(diǎn)，G、A、T、C四種堿基出現(xiàn)的頻率相同，即含量相等，對(duì)于任意堿基的互補(bǔ)鏈，都可以找到與其配對(duì)的堿基序列，使得聚合反應(yīng)能夠進(jìn)行，故稱(chēng)該位點(diǎn)的堿基為搖擺堿基。)N表示中間部分確定序列的堿基，a、b、c分別表示各部分的堿基數(shù)。其中50≥a≥15；500≥b≥15；50≥c≥15。
本發(fā)明一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，可用于PCR反應(yīng)(PCR指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。)、DNA測(cè)序等的引物評(píng)價(jià)。(引物指與特異模板中一段堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸，長(zhǎng)度一般在10～50個(gè)堿基之間。)(聚合酶指具有合成核酸分子的酶，其反應(yīng)溫度可以是37℃，也可以高于37℃。)實(shí)施例1我們最近在開(kāi)發(fā)SARS早期診斷方法的研究中，無(wú)法獲得SARS病原標(biāo)本，而SARS基因組序列則于4月13號(hào)就在網(wǎng)上公布了，為了檢測(cè)我們所設(shè)計(jì)的幾十條引物的敏感性與可靠性，我們發(fā)明了一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，并已在實(shí)驗(yàn)室成功對(duì)兩組SARS相關(guān)引物，及以前本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行神經(jīng)性耳聾研究時(shí)所設(shè)計(jì)的在理論上應(yīng)該有產(chǎn)物而無(wú)產(chǎn)物產(chǎn)生的引物進(jìn)行了檢測(cè)。
1)設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其具體序列如下5′nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncatctgaact cttctgaagga(g∶t＝1∶1)cctgat cttctggtctaaacgaaa nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn3′其五末端及三末端均為22個(gè)搖擺堿基，中間為45個(gè)序列固定的堿基，其序列與SARS基因組DNA的26307至26452號(hào)堿基序列相同。
2)用于引物評(píng)價(jià)的引物SARS相關(guān)引物H1ct tatgtactca ttcgtttcgg aagH2ata gtt agt tcg ttt aga cca gaa gI1aacta caagcaagtc gagcgtggcaI2cac agt tga gta tac ttt gcg aca tK1a cagtaataaaactgttggcg agctK2t ca cag ctt cta cac ccgttaaggt3)具體實(shí)驗(yàn)操作每一組引物分三管做，第一管反應(yīng)底物為正向引物和多用途模板(H1+模板，I1+模板，K1+模板)，第二管反應(yīng)底物為反向引物和多用途模板(H2+模板，I2+模板，K2+模板)，第三管反應(yīng)底物為正向引物、反向引物和多用途模板(H1+H2+模板，I1+I2+模板，K1+K2+模板)。反應(yīng)條件均為普通PCR的反應(yīng)條件，94℃變性5分鐘，94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)40次。PCR完成后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
4)結(jié)果如圖1、表1所示，引物H1、H2和K1、K2三管均有引物延伸產(chǎn)物，而對(duì)于引物I1、I2，當(dāng)反應(yīng)底物為I1+模板時(shí)有產(chǎn)物，反應(yīng)底物為I1+I2+模板時(shí)有部分產(chǎn)物，反應(yīng)底物為I2+模板時(shí)，沒(méi)有產(chǎn)物。以上結(jié)果說(shuō)明H1、H2和K1、K2兩套引物在反應(yīng)過(guò)程中不會(huì)單獨(dú)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也不會(huì)相互結(jié)合而形成二聚體，可用于實(shí)際操作；I1、I2這套引物中，有I1存在時(shí)，就會(huì)有產(chǎn)物，說(shuō)明I1在反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有單獨(dú)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也不會(huì)與I2形成二聚體；而I2當(dāng)其單獨(dú)存在時(shí)，沒(méi)有產(chǎn)物，并且I1+I2+模板的反應(yīng)體系中，產(chǎn)物與I1+模板反應(yīng)體系相比，產(chǎn)物量并不隨著引物的增加而增加，說(shuō)明I2在反應(yīng)過(guò)程中形成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不參加引物延伸反應(yīng)，因此該套引物不能用于實(shí)際操作。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示引物對(duì)H1和H2、K1和K2可用實(shí)驗(yàn)，而I1和I2因?yàn)镮2在反應(yīng)體系中形成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所以不用于實(shí)驗(yàn)。證明該多用途模板可用于引物效率評(píng)價(jià)。
實(shí)驗(yàn)例2設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其五末端及三末端均為15個(gè)搖擺堿基，中間為45個(gè)序列固定的堿基。
實(shí)驗(yàn)例3
設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其五末端及三末端均為50個(gè)搖擺堿基，中間為15個(gè)序列固定的堿基。
實(shí)驗(yàn)例4設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其五末端及三末端均為25個(gè)搖擺堿基，中間為100個(gè)序列固定的堿基。
實(shí)驗(yàn)例5設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其五末端及三末端均為50個(gè)搖擺堿基，中間為500個(gè)序列固定的堿基。
實(shí)驗(yàn)例6設(shè)計(jì)一條用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其五末端及三末端均為44個(gè)搖擺堿基，中間為200個(gè)序列固定的堿基。
權(quán)利要求
1.一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征在于該模板由三部分組成，(1)五末端為搖擺堿基，(2)中間為含有特定堿基的核苷酸序列，(3)三末端為搖擺堿基。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的五末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的三末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的中間的含有特定堿基的核苷酸序列的堿基數(shù)為15～500個(gè)。
5.如權(quán)利要求2所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的五末端的搖擺堿基數(shù)為22個(gè)。
6.如權(quán)利要求3所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的三末端的搖擺堿基數(shù)為22個(gè)。
7.如權(quán)利要求4所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的中間的含有特定堿基的核苷酸序列的堿基數(shù)為20～100個(gè)。
8.如權(quán)利要求7所述的一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，其特征是所述的中間的含有特定堿基的核苷酸序列的堿基數(shù)為45個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可用于引物評(píng)價(jià)的多用途模板，該模板由三部分組成，(1)五末端為搖擺堿基，(2)中間為含有特定堿基的核苷酸序列，(3)三末端為搖擺堿基，五末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)，三末端的搖擺堿基數(shù)為15～50個(gè)，中間的含有特定堿基的核苷酸序列的堿基數(shù)為15～500個(gè)，本發(fā)明對(duì)實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)用引物進(jìn)行預(yù)先評(píng)價(jià)，可降低實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)性，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)進(jìn)行分析；節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間；對(duì)難以得到的基因或很稀有的珍貴標(biāo)本，可預(yù)先對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，可避免標(biāo)本的損耗，節(jié)約原材料；可利用單條引物進(jìn)行雙向引物延伸反應(yīng)，本發(fā)明廣泛用分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，降低了引物設(shè)計(jì)的難度及復(fù)雜性。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1563403SQ200410018788
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者張佳, 胡應(yīng)和, 廖端芳, 陳琳玲, 張旭, 孟博, 侯賽因·帕丁納斯, 李凱 申請(qǐng)人:南華大學(xué)