專利名稱：L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵制造L-甲硫氨酸的方法。
背景技術(shù)：
氨基酸甲硫氨酸在動(dòng)物飼養(yǎng)方面扮演著極重要的角色。甲硫氨酸是脊椎動(dòng)物新陳代謝中不能以生物合成方式制造的若干必需氨基酸之一。因此，在動(dòng)物飼養(yǎng)方面，必須確保飼料內(nèi)攝入足量的甲硫氨酸。但，傳統(tǒng)飼料植物(例如大豆或谷物植物)內(nèi)的甲硫氨酸含量經(jīng)常太低(尤其對(duì)飼養(yǎng)豬和家禽而言)，為確保最佳動(dòng)物飼養(yǎng)，動(dòng)物飼料內(nèi)最好摻以甲硫氨酸作為添加物。甲硫氨酸對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)的特別重要性亦可歸諸于一項(xiàng)事實(shí)除L-半胱氨酸(或L-胱氨酸)之外，甲硫氨酸是新陳代謝中的重要硫源。雖然動(dòng)物新陳代謝可將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成半胱氨酸，但該新陳代謝不能將半胱氨酸轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸。
在現(xiàn)有技術(shù)中，以化學(xué)合成法制造的甲硫氨酸，年產(chǎn)量＞100,000噸。在此方法中，首先由丙烯醛與甲基硫醇反應(yīng)生成3-甲基硫丙醛，繼之該3-甲基硫丙醛再與氰化物、氨及一氧化碳反應(yīng)生成乙內(nèi)酰脲，該乙內(nèi)酰脲最后可水解生成一消旋物(兩種異構(gòu)體D-及L-甲硫氨酸的等摩爾混合物)。因該分子的生物活性型僅代表L-型，飼料內(nèi)所含的D-型者必須通過代謝脫氨作用及氨基轉(zhuǎn)移作用首先轉(zhuǎn)化成活性L-型者。
通過將消旋物分開或通過乙內(nèi)酰脲酶以制造對(duì)映體純L-甲硫氨酸的方法雖然已經(jīng)公開，但由于其成本高，截至目前為止，該方法尚未應(yīng)用于動(dòng)物飼料工業(yè)。
與甲硫氨酸形成明顯對(duì)比的是，目前絕大多數(shù)其他天然蛋白原氨基酸主要是通過微生物發(fā)酵制得。此處，是利用在微生物內(nèi)以合成該天然氨基酸所用適當(dāng)生物合成途徑的可用性。再者，利用葡萄糖及礦物質(zhì)鹽類等廉價(jià)反應(yīng)物，許多發(fā)酵法可將制造成本降至極低且可進(jìn)一步制得有關(guān)具有生物活性的L-型氨基酸。
但，野生型菌株內(nèi)氨基酸的生物合成途徑受到嚴(yán)格的代謝控制以確保氨基酸的制造僅是供細(xì)胞自己使用。所以，有效制造方法的重要條件是能夠獲得在制造預(yù)期氨基酸方面產(chǎn)量大幅增加(與野生型微生物相比較)的適當(dāng)微生物。
此類超量生產(chǎn)氨基酸的微生物可用傳統(tǒng)突變/選擇法及/或用新的特異性重組技術(shù)(代謝工程)制得。在重組技術(shù)中，由于其修飾、激活作用或失活作用，首先將可引起氨基酸超量生產(chǎn)的基因或等位基因加以識(shí)別。之后將該基因/等位基因引入一微生物菌株內(nèi)或利用分子生物學(xué)技術(shù)將其加以失活，以便可實(shí)現(xiàn)最佳超量生產(chǎn)。但，經(jīng)常僅結(jié)合數(shù)種不同方法才可實(shí)現(xiàn)真正有效生產(chǎn)。
在微生物內(nèi)實(shí)施L-甲硫氨酸生物合成非常復(fù)雜。該分子的氨基酸本體(amino acid body)是衍生自L-天冬氨酸，該L-天冬氨酸是經(jīng)由天冬氨酰半醛/天冬氨酰磷酸轉(zhuǎn)化為L-高絲氨酸。繼之以三個(gè)酶作用步驟，該步驟包括(經(jīng)由O-琥珀酰高絲氨酸及胱硫醚)用一巰基(該巰基是來自一半胱氨酸分子)替代該分子上的羥基，而形成一高(同型)絲氨酸。在生物合成的最后步驟內(nèi)，通過將該巰基加以甲基化最后制得L-甲硫氨酸。該甲基是衍生自絲氨酸代謝作用。
表面上，就其本身而言，甲硫氨酸是在微生物代謝作用中由天冬氨酸、絲氨酸及半胱氨酸等氨基酸合成，所以需要的生物合成遠(yuǎn)較其他氨基酸復(fù)雜。除主要合成途徑(天冬氨酸-高絲氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸生物合成及(因此)無機(jī)硫的繁復(fù)固定以及Cl代謝作用亦必須加以最佳協(xié)調(diào)。
基于這些理由，過去對(duì)L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造法尚未非常深入地加以研究。但，近年來在絲氨酸及半胱氨酸代謝作用的最適化作用方面業(yè)已獲得決定性的進(jìn)步，因此L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造目前亦顯示務(wù)實(shí)狀況。所以，在現(xiàn)有技術(shù)中最近亦曾述及朝此方向的初步研究工作。
有關(guān)L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造方法，利用下列基因/等位基因可達(dá)成L-甲硫氨酸的超量生產(chǎn)，已經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)予以公開-如同一專利申請(qǐng)人于2002年10月11日所提專利申請(qǐng)內(nèi)或日本專利JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。此類metA等位基因編碼O-高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，該O-高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶受控于L-甲硫氨酸的減低的反饋抑制作用(reduced feedback inhibition)。如此可導(dǎo)致O-琥珀酰高絲氨酸的產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)的甲硫氨酸水平的廣泛去偶聯(lián)現(xiàn)象。
-如日本專利JP 2000139471A中所述的metJ缺失。metJ基因編碼甲硫氨酸代謝作用的中央基因調(diào)節(jié)子，因此在甲硫氨酸生物合成基因表達(dá)的控制方面擔(dān)任一重要角色。
現(xiàn)有技術(shù)同樣提示確保L-絲氨酸及L-半胱氨酸的合成增加的已知方法對(duì)L-甲硫氨酸的制造具有正面影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可使L-甲硫氨酸超量生產(chǎn)的微生物菌株。另一目的是提供一種通過本發(fā)明的微生物菌株以制造L-甲硫氨酸的方法。
前一個(gè)目的可通過由一起始菌株制得的、具有(與該起始菌株相比)增強(qiáng)的yjeH基因產(chǎn)物的活性或yjeH同系物基因產(chǎn)物的活性的微生物菌株而實(shí)現(xiàn)。
依照本發(fā)明，雖然該基因產(chǎn)物的比活性保持不變，若由于該細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的量增加而使該細(xì)胞的總活性增加則yjeH基因產(chǎn)物的活性亦增加，而且每個(gè)細(xì)胞yjeH基因產(chǎn)物的活性亦增加。
在基因組測序過程中經(jīng)識(shí)別大腸桿菌yjeH基因是開放閱讀框(布萊特納等人，1997，科學(xué)雜志2771453至1462)并編碼一包括418個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。截至目前為止，尚不能確定該yjeH基因具有何種生理功能。以資料庫搜尋具有序列同源性的蛋白質(zhì)(GCG威斯康辛軟件包FASTA演算法，遺傳學(xué)電腦組(GCG)麥迪遜、威斯康辛)也僅能提供極少線索，這是由于其僅與功能同樣未定的蛋白質(zhì)才具有重要的相似之處。
yjeH基因及yjeH基因產(chǎn)物(yjeH蛋白質(zhì))的特征是分別具有SEQ ID NO1及SEQ ID NO2的序列。就本發(fā)明的范圍而言，tjeH同系物應(yīng)理解為序列相同性大于30％(優(yōu)選大于53％)的基因，利用最佳擬合(BESTFIT)演算法分析(GCG威斯康辛軟件包，遺傳學(xué)電腦組(GCG)麥迪遜，威斯康辛)。特別優(yōu)選為相同性大于70％的序列。
同樣地，應(yīng)該理解的是，yjeH-同源蛋白質(zhì)是指序列相同性大于30％(優(yōu)選大于53％)的蛋白質(zhì)(最佳擬合演算法分析(GCG威斯康辛軟件包，遺傳學(xué)電腦組(GCG麥迪遜，威斯康辛)。特別優(yōu)選為相同性大于70％的序列。
因此，yjeH同系物亦指yjeH基因的等位基因變體，尤其功能性變體，該變體是通過核苷酸的缺失、插入或取代自SEQ ID NO1內(nèi)所描述的序列衍生者，但該特定基因產(chǎn)物的的活性保持不變。
yjeH基因產(chǎn)物活性較起始菌株增強(qiáng)的本發(fā)明的微生物可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。
原則上，具有L-甲硫氨酸生物合成途徑、可使用重組物方法及可通過發(fā)酵培養(yǎng)的任何微生物均可作為適當(dāng)?shù)钠鹗季?。此類微生物可以是真菌、酵母或?xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌是真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育群(phylogenetic group of eubacteria)的細(xì)菌。特別優(yōu)選的是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，尤其優(yōu)選為大腸桿菌。
舉例而言，通過yjeE基因的增強(qiáng)表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明微生物內(nèi)yjeH基因產(chǎn)物活性的增加。由于適當(dāng)啟動(dòng)子的作用，此種情形可涉及微生物內(nèi)該yjeH基因的拷貝數(shù)增加及/或該yjeE基因的表達(dá)增強(qiáng)。優(yōu)選地，表達(dá)增強(qiáng)是指該yjeH基因的表達(dá)強(qiáng)度至少是起始菌株內(nèi)的兩倍。
微生物內(nèi)該yjeH基因的拷貝數(shù)可利用本領(lǐng)域人員已知的方法予以增加。因此，舉例而言，可將該yjeH基因克隆入每個(gè)細(xì)胞具有多拷貝的質(zhì)粒載體內(nèi)(例如大腸桿菌的pUC19、pBR322、pACYC184)并送入該微生物內(nèi)。變通的方式是，該yjeH基因的多拷貝可整合在一微生物內(nèi)的染色體中。可使用的整合方法是附有溫和噬菌體的已知系統(tǒng)、整合性質(zhì)?；蚪?jīng)由同源重組的整合(例如漢彌爾頓等人，細(xì)菌學(xué)報(bào)1714617至4622)。
以在啟動(dòng)子控制下將yjeH基因克隆入質(zhì)粒載體內(nèi)以增加拷貝數(shù)為佳。優(yōu)選地，將一yjeH基因克隆在一pACYC衍生物例如pACYC184-LH(依照布達(dá)佩斯公約保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，不倫瑞克，德國，1995年8月18日，編號(hào)為DSM 10172)內(nèi)以增加大腸桿菌內(nèi)拷貝數(shù)。
用以表達(dá)可以使用的質(zhì)粒-編碼yjeH基因的控制區(qū)是天然啟動(dòng)子及操縱子區(qū)域。
但，yjeH基因的增強(qiáng)表達(dá)尤其亦可通過其他啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子系統(tǒng)，例如gapA基因的組成型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子或大腸桿菌內(nèi)的誘導(dǎo)型lac、tac、trc、λ、ara或tet啟動(dòng)子均是本領(lǐng)域已知者(麥克立德斯，1996，微生物評(píng)論，60512至538)。該構(gòu)建體可依照已知的方式用于質(zhì)粒上或染色體上。
再者，增強(qiáng)表達(dá)可通過特定構(gòu)建體上最適化序列內(nèi)所含基固的起始信號(hào)(例如核糖體結(jié)合部位)或起始密碼子的翻譯或者是通過用更經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子替代依照“密碼子用途”中稀少的密碼子。
具有所述修飾的微生物菌株是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
舉例而言，利用覆蓋整個(gè)yjeH基因的特定引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)以特異性擴(kuò)增作用及隨后與載體DNA片段的連接作用將一yjeH基因克隆入質(zhì)粒載體內(nèi)。
用以克隆一yjeH基因的合適載體是已經(jīng)含有用以增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子，例如大腸桿菌gapA基因的組成型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動(dòng)子。
因此本發(fā)明還涉及一包括一附有啟動(dòng)子的yjeH基因的質(zhì)粒。
進(jìn)一步地，特別優(yōu)選的是已經(jīng)含有可造成對(duì)L-甲硫氨酸代謝的反饋抑制作用減弱的基因/等位基因的載體，例如一突變的metA等位基因(德國專利申請(qǐng)DE-A-10247437中曾述及)。使用該載體可由任何微生物菌株直接制備具有高氨基酸超量生產(chǎn)的本發(fā)明的微生物菌株，原因在于該質(zhì)粒亦可減弱微生物內(nèi)甲硫氨酸代謝的反饋抑制作用。
因此本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括一用以去調(diào)節(jié)(deregulate)該甲硫氨酸代謝作用的遺傳元件和一附有啟動(dòng)子的yjex基因。
利用一常用轉(zhuǎn)化方法(例如電穿孔作用)將含有yjeH的質(zhì)粒送入微生物內(nèi)，并通過對(duì)含有質(zhì)粒的克隆的抗生素抗性加以選擇。
因此本發(fā)明的另一內(nèi)容涉及制備本發(fā)明微生物菌株的方法，該方法包括將本發(fā)明的質(zhì)粒送入一起始菌株內(nèi)。
用本發(fā)明質(zhì)粒實(shí)施轉(zhuǎn)化作用的特別優(yōu)選的菌株的染色體具有可同樣有利于L-甲硫氨酸制造的等位基因，例如-一metJ缺失(如日本專利JP 2000139471A中所述)或-實(shí)現(xiàn)絲氨酸增產(chǎn)的等位基因，例如反饋抗性(feedback-resistant)serA變體(例如歐洲專利EP 0620853B1或EP 0931833 A2中所述)-或?qū)崿F(xiàn)半胱氨酸增產(chǎn)的基因，例如反饋抗性cysE變體(例如專利WO 97/15673中所述)。
L-甲硫氨酸的制造是通過本發(fā)明的微生物菌株、于一發(fā)酵罐內(nèi)、依照已知方法實(shí)施。
因此本發(fā)明的另一內(nèi)容是一種用以制造L-甲硫氨酸的方法，該方法包括將本發(fā)明的微生物菌株用于發(fā)酵并將所制得的L-甲硫氨酸自發(fā)酵混合物內(nèi)取出。
該微生物菌株在發(fā)酵罐中生長是采用連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)、分批培養(yǎng)(batch culture)或優(yōu)選地為補(bǔ)料-分批培養(yǎng)(fed-batchculture)。最好在發(fā)酵過程中將碳源連續(xù)計(jì)量加入。
所用合適碳源是糖類、糖醇類或有機(jī)酸類。在本發(fā)明的方法中尤以使用葡萄糖、乳糖或甘油作為碳源更佳。
碳源以用適當(dāng)速率計(jì)量加入，以使得發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)的碳含量保持在0.1至50克/升范圍內(nèi)為佳，尤以保持在0.5至10克/升范圍內(nèi)更佳。
本發(fā)明方法中所用合適氮源是氨、銨鹽類及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。若用氨校正pH恒定器，在發(fā)酵過程中此氦源是以規(guī)律間隔計(jì)量加入。
可添加的其他培養(yǎng)基添加物是磷、氮、鈉、鎂、氮、鉀、鈣、鐵等元素的鹽類，及微量(亦即微摩爾濃度)鋁、硼、鈷、錳、鋅及鎳等元素的鹽類。
該培養(yǎng)基內(nèi)亦可添加有機(jī)酸類(例如乙酸、檸檬酸)、氨基酸(例如亮氨酸)及維生素(例如，B1、B12)。
舉例而言，可用的復(fù)合營養(yǎng)物源是酵母萃取液、玉米漿、大豆粉或麥芽萃取液。
嗜常溫微生物的保溫溫度以15至45℃為佳，尤以30至37℃更佳。
發(fā)酵以在需氧生長情況下實(shí)施為佳。氧氣是通過壓縮空氣或通過純氧送入發(fā)酵罐內(nèi)。
在發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH以5.0至8.5為佳，尤以7.0更佳。
在制造L-甲硫氨酸的發(fā)酵過程中可補(bǔ)入一硫源。優(yōu)選使用硫酸鹽類或硫代硫酸鹽類。
依照所述方法發(fā)酵的微生物，在生長階段后，會(huì)以分批方式或補(bǔ)料-分批方式分泌L-甲硫氨酸至培養(yǎng)基內(nèi)，歷時(shí)10至150小時(shí)。
所制L-甲硫氨酸可通過分離氨基酸的適當(dāng)方法自發(fā)酵液內(nèi)獲得(例如離子交換法、結(jié)晶法等)。
茲利用下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。該菌株W3110ΔJ/pKP450是依照布達(dá)佩斯公約，以編號(hào)DSM 15421、作為具有一附有yjeH基因的質(zhì)粒、并適合于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行L-甲硫氨酸的制造的細(xì)菌菌株寄存在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，D-38142不倫瑞克，德國。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1基本載體pKP228的克隆為將yjeH基因置于組成型啟動(dòng)子控制之下，首先構(gòu)建一含有大腸桿菌甘油醛3-脫氫酶所用gapA基因組成型GAPDH啟動(dòng)子的基本載體，為達(dá)成此目的，使用引物GAPDHfw(SEQ ID NO3)5’GTC GAC GCG TGA GGC GAG TCA GTC GCG TAA TGC 3’Mlu IGAPDHrev1(SEQ ID NO4)5’GAC CTT AAT TAA GAT CTC ATA TAT TCC ACC AGC TAT TTG TTA G 3’Pac IBgl II
及大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)的染色體DNA聚合酶鏈反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳將所制DNA片段加以純化并隨后予以分離出來(奇亞快速凝膠萃取試劑盒，奇亞根公司出品，希爾頓，德國)。之后，用限制酶PacI及MluI將該片段加以處理并克隆入載體pACYCl84-LH內(nèi)，同樣地用PacI/NluI(1995年8月18日以編號(hào)DSM10172，依照布達(dá)佩斯公約保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，不倫瑞克)進(jìn)行裂解。該新構(gòu)建體定名為pKP228。實(shí)施例2yjeH基因的克隆通過聚合酶鏈反應(yīng)將來自大腸桿菌W3100菌株的yjeH基因加以擴(kuò)增。使用寡核苷酸yjeH-fw(SEQ ID NO5)5’-ATT GCT GGT TTG CTG CTT-3’yjeH-rev(SEQ ID NO6)5’-AGC ACAAAATCG GGT GAA-3’作為特異性引物及使用大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)的染色體DNA作為模板。所制DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳法(奇亞快速凝膠提取試劑盒，奇亞根公司出品，希爾頓，德國)加以純化及分離?？寺〉膶?shí)施是通過與一BglII-裂解的pKP228載體(其5’-突出端是利用Klenow酶補(bǔ)平)的鈍端連接作用。所述過程是以適當(dāng)方式將該yjeH基因置于該GAPDH啟動(dòng)子的下游，以使得轉(zhuǎn)錄作用自該處引發(fā)。所制載體是定名為pKP450。
實(shí)施例3yjeH基因與一反饋抗性metA等位基因的組合通過聚合酶鏈反應(yīng)利用模板pKP466(在專利申請(qǐng)DE-A-10247437述及)及引物metA-fw(SEQ ID NO7)
5”-CGCCCA TGGCTC CTT TTA GTC ATT CTT-3’NcoImetA-rev(SEQ ID NO8)5’-CGCGAG CTCAGT ACT ATT AAT CCA GCG-3’SacI將2002年10月11日同一專利申請(qǐng)人的專利申請(qǐng)DE-A-10247437曾述及的編碼一反饋抗性O(shè)-高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的metA等位基因加以擴(kuò)增。
在該程序中產(chǎn)生限制核酸內(nèi)切酶NcoI及SacI的末端裂解部位。所得DNA片段是用相同的核酸內(nèi)切酶加以消化、純化及克隆入該NcoI/SacI裂解的pKP450載體內(nèi)。所制質(zhì)粒定名為pKP451。
為制備一含有metA等位基因但不含yjeH基因的對(duì)照質(zhì)粒，將該yjeH基因自pKP451缺失。為達(dá)成此目的，用Ecl1 36II及PacI將pKP451加以裂解，突出端用Klenow酶加以消化掉并將該載體再連接起來。如此制得的質(zhì)粒定名為pKP446AC。實(shí)施例4染色體metJ突變的產(chǎn)生通過聚合酶鏈反應(yīng)利用引物metJ-fw(SEQ ID NO9)5’-GAT CGC GGC CGC TGC AAC GCG GCA TCA TTAAAT TCG A-3’metJ-rev(SEQ ID NO10)5’-GAT CGC GGC CGC AGT TTC AAC CAG TTAATC AAC TGG-3’及來自大腸桿菌W3110(ATCC27325)的染色體DNA將基因metJ/B加以擴(kuò)增。用限制核酸內(nèi)切酶NotI將該包括3.73kb的片段加以純化、消化并克隆入該NotI-裂解的pACYC184-LH載體內(nèi)(請(qǐng)參閱實(shí)施例1)。繼之在內(nèi)部的AflIII-裂解部位將一卡那霉素抗性盒插入metJ基因內(nèi)。為達(dá)成此目的，繼之利用Klenow酶通過產(chǎn)生鈍端用AflIII實(shí)施消化作用。進(jìn)而通過PvuII限制作用自載體PUK4K(亞美夏姆藥物生物技術(shù)公司出品，佛萊堡，德國)制得卡那霉素抗性盒并經(jīng)由連接作用將其插入該metJ基因。之后通過NotI限制作用自如此所制的pKP440載體制得呈直線型片段的metJkan盒并依照威南斯等人的方法(細(xì)菌學(xué)報(bào)1985，1611219至1221)以染色體的方式整合在recBC/sbcB菌株JC7623(大腸桿菌基因儲(chǔ)存中心CGSC5188)內(nèi)。在一最后步驟內(nèi)，通過Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(米勒，1972，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，第201至205頁)最后將該metJkan突變轉(zhuǎn)導(dǎo)入W3110(ATCC27325)野生型菌株，因而產(chǎn)生菌株W3110ΔJ。
驗(yàn)證該metJkan插入作用之后，總是用載有yjeH的質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒將W3110ΔJ菌株加以轉(zhuǎn)化，繼之用四環(huán)素選擇對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化株。實(shí)施例5用于發(fā)酵的生產(chǎn)菌株(producer strain)的預(yù)培養(yǎng)物將20毫升LB培養(yǎng)基(10克/升胰蛋白胨、5克/升酵母萃取液、10克/升NaCl)(其中另含有15毫克/升四環(huán)素)與該生產(chǎn)菌株接種并于一振蕩器內(nèi)在150轉(zhuǎn)/分鐘及溫度30℃的情況下加以保溫以制得發(fā)酵用的預(yù)培養(yǎng)物。7小時(shí)之后將該整個(gè)混合物轉(zhuǎn)移至100毫升SM1培養(yǎng)基(12克/升K2HPO4；3克/升KH2PO4；5克/升(NH4)2SO4；0.3克/升MgSO4×7H2O，0.015克/升CaCl2×2H2O；0.002克/升FeSO4×7H2O；1克/升檸檬酸鈉×2H2O；0.1克/升NaCl；1毫升/升微量元素溶液，其中包括0.15克/升Na2MoO4×2H2O；2.5克/升Na3BO3；0.7克/升CoCl2×6H2O；0.25克/升CuSO4×5H2O；1.6克/升MnCl2×4H2O；0.3克/升ZnSO4×7H2O)，補(bǔ)充以5克/升葡萄糖；0.5毫克/升維生素B1及15毫克/升四環(huán)素。繼之在溫度30℃及150轉(zhuǎn)/分鐘的情況下實(shí)施保溫17小時(shí)。
實(shí)施例6L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造所用發(fā)酵罐是德國梅爾松根市勃朗生物技術(shù)公司出品的BiostatB儀器，其最大培養(yǎng)物體積容量為2升。將含有900毫升SM1培養(yǎng)基(補(bǔ)充以15克/升葡萄糖，10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母萃取液，3克/升Na2S2SO3×5H2O，0.5毫克/升維生素B1，30毫克/升維生素B12及15毫克/升四環(huán)素)的發(fā)酵罐與實(shí)施例5內(nèi)所述預(yù)培養(yǎng)物接種(在600nm處的光密度約為3)。在發(fā)酵過程中，將溫度調(diào)節(jié)至32℃并通過計(jì)量加入25％氨水將pH保持在7.0恒定不變。用消毒過的壓縮空氣、在5體積/體積/分鐘速率下將該培養(yǎng)物通以氣體并在轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分鐘的情況下加以攪拌。待氧飽和度減至50％之后，經(jīng)由一控制裝置將轉(zhuǎn)速增至高速1500轉(zhuǎn)/分鐘以保持50％氧飽和度(用在900轉(zhuǎn)/分鐘情況下校正至100％飽和度的PO2探針測定的)。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖含量由初始的15克/升降至約5至10克/升時(shí)，立即計(jì)量加入56％葡萄糖溶液。實(shí)施補(bǔ)料的流速為6至12毫升/小時(shí)，且發(fā)酵罐內(nèi)的葡萄糖濃度是保持在0.5至10克/升恒常不變。葡萄糖是利用YSI(黃泉公司，俄亥俄州，美國)出品的葡萄糖分析儀測定。發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)，的后將試樣取出，并通過離心作用將該細(xì)胞自培養(yǎng)基中分離出來。通過反相高壓液相色譜法、在一LUNA 5μ C18(2)柱上(費(fèi)諾門奈克斯公司，阿夏芬堡，德國)，以流速0.5毫升/分鐘，將所得培養(yǎng)物上清液加以分析。用稀釋的磷酸(0.1毫升濃磷酸/升)作為洗脫液。培養(yǎng)物上清液內(nèi)所得L-甲硫氨酸的含量如表1所示。
表1

fbr反饋抗性序列表<110>電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)<120>L-甲硫氨酸的發(fā)酵制造方法<130>yjeH<140>
<141>
<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1652<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(141)..(1394)<400>1agcacaaaat cgggtgaaaa ccctgattca cctcacattt catcgcaatt tcttcatcgc 60cgtcataagc gaatctgatt gtgctaccat cgaaaatcta cgcagttgcc caaaatttgg 120gcgcaatcgg acatcaaccc atg agt gga ctc aaa caa gaa ctg ggg ctg gcc 173Met Ser Gly Leu Lys Gln Glu Leu Gly Leu Ala1 5 10cag ggc att ggc ctg cta tcg acg tca tta tta ggc act ggc gtg ttt 221Gln Gly Ile Gly Leu Leu Ser Thr Ser Leu Leu Gly Thr Gly Val Phe15 20 25gcc gtt cct gcg tta gct gcg ctg gta gcg ggc aat aac agc ctg tgg 269Ala Val Pro Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Asn Asn Ser Leu Trp30 35 40gcg tgg ccc gtt ttg att atc tta gtg ttc ccg att gcg att gtg ttt 317Ala Trp Pro Val Leu Ile Ile Leu Val Phe Pro Ile Ala Ile Val Phe45 50 55gcg att ctg ggt cgc cac tat ccc agc gca ggc ggc gtc gcg cac ttc 365Ala Ile Leu Gly Arg His Tyr Pro Ser Ala Gly Gly Val Ala His Phe60 65 70 75gtc ggt atg gcg ttt ggt tcg cgg ctt gag cga gtc acc ggc tgg ctg 413Val Gly Met Ala Phe Gly Ser Arg Leu Glu Arg Val Thr Gly Trp Leu80 85 90ttt tta tcg gtc att ccc gtg ggt ttg cct gcc gca cta caa att gcc 461Phe Leu Ser Val Ile Pro Val Gly Leu Pro Ala Ala Leu Gln Ile Ala95 100 105gcc ggg ttc ggc cag gcg atg ttt ggc tgg cat agc tgg caa ctg ttg 509Ala Gly Phe Gly Gln Ala Met Phe Gly Trp His Ser Trp Gln Leu Leu110 115 120ttg gca gaa ctc ggt acg ctg gcg ctg gtg tgg tat atc ggt act cgc 557Leu Ala Glu Leu Gly Thr Leu Ala Leu Val Trp Tyr Ile Gly Thr Arg125 130 135ggt gcc agt tcc agt gct aat cta caa acc gtt att gcc gga ctt atc 605
Gly Ala Ser Ser Ser Ala Asn Leu Gln Thr Val Ile Ala Gly Leu Ile140 145 150 155gtc gcg ctg att gtc gct atc tgg tgg gcg ggc gat atc aaa cct gcg 653Val Ala Leu Ile Val Ala Ile Trp Trp Ala Gly Asp Ile Lys Pro Ala160 165 170aat atc ccc ttt ccg gca cct ggt aat atc gaa ctt acc ggg tta ttt 701Asn Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Asn Ile Glu Leu Thr Gly Leu Phe175 180 185gct gcg tta tca gtg atg ttc tgg tgt ttt gtc ggt ctg gag gca ttt 749Ala Ala Leu Ser Val Met Phe Trp Cys Phe Val Gly Leu Glu Ala Phe190 195 200gcc cat ctc gcc tcg gaa ttt aaa aat cca gag cgt gat ttt cct cgt 797Ala His Leu Ala Ser Glu Phe Lys Asn Pro Glu Arg Asp Phe Pro Arg205 210 215gct ttg atg att ggt ctg ctg ctg gca gga tta gtc tac tgg ggc tgt 845Ala Leu Met Ile Gly Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Tyr Trp Gly Cys220 225 230 235acg gta gtc gtc tta cac ttc gac gcc tat ggt gaa aaa atg gcg gcg 893Thr Val Val Val Leu His Phe Asp Ala Tyr Gly Glu Lys Met Ala Ala240 245 250gca gca tcg crt cca aaa att gta gtg cag ttg ttc ggt gta gga gcg 941Ala Ala Ser Leu Pro Lys Ile Val Val Gln Leu Phe Gly Val Gly Ala255 260 265tta tgg att gcc tgc gtg att ggc tat ctg gcc tgc ttt gcc agt crc 989Leu Trp Ile Ala Cys Val Ile Gly Tyr Leu Ala Cys Phe Ala Ser Leu270 275 280aac att tat ara cag agc ttc gcc cgc ctg gtc tgg tcg cag gcg caa 1037Asn Ile Tyr Ile Gln Ser Phe Ala Arg Leu Val Trp Ser Gln Ala Gln285 290 295cat aat cct gac cac tac ctg gca cgc ctc tct tct cgc cat atc ccg 1085His Asn Pro Asp His Tyr Leu Ala Arg Leu Ser Ser Arg His Ile Pro300 305 310 315aat aat gcc ctc aat gcg gtg ctc ggc tgc tgt gtg gtg agc act ttg 1133Asn Asn Ala Leu Asn Ala Val Leu Gly Cys Cys Val Val Ser Thr Leu320 325 330gtg att cat gct tta gag atc aat ctg gac gct ctt att att tat gcc 1181Val Ile His Ala Leu Glu Ile Asn Leu Asp Ala Leu Ile Ile Tyr Ala335 340 345aat ggc atc ttt att atg att tat ctg tta tgc atg ctg gca ggc tgt 1229Asn Gly Ile Phe Ile Met Ile Tyr Leu Leu Cys Met Leu Ala Gly Cys350 355 360aaa tta ttg caa gga cgt tat cga cta ctg gcg gtg gtt ggc ggg ctg 1277Lys Leu Leu Gln Gly Arg Tyr Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Leu365 370 375tta tgc gtt ctg tta ctg gca atg gtc ggc tgg aaa agt ctc tat gcg 1325Leu Cys Val Leu Leu Leu Ala Met Val Gly Trp Lys Ser Leu Tyr Ala380 385 390 395ctg atc atg ctg gcg ggg tta tgg ctg ttg ctg cca aaa cga aaa acg 1373Leu Ile Met Leu Ala Gly Leu Trp Leu Leu Leu Pro Lys Arg Lys Thr400 405 410
ccg gaa aat ggc ata acc aca taatccggcg tttcgacatt aatcctggcg 1424Pro Glu Asn Gly Ile Thr Thr415atcgtcttta tgatcaaggc ggtcgcgctc atcatccttt cgctggtact caccatcaaa 1484agtattaccg ccaccggtcc cggcgctaaa accgccgcca ggcatgcgag aaaagcgcaa 1544atgcggcatc aacttcactg tcagatgctt ttgcaccggc ggcaataaaa gtagaagacc 1604gaggaagtcg gtaaaaaagc ccggtaataa aagcagcaaa ccagcaat 1652<210>2<211>418<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Ser Gly Leu Lys Gln Glu Leu Gly Leu Ala Gln Gly Ile Gly Leu1 5 10 15Leu Ser Thr Ser Leu Leu Gly Thr Gly Val Phe Ala Val Pro Ala Leu20 25 30Ala Ala Leu Val Ala Gly Asn Asn Ser Leu Trp Ala Trp Pro Val Leu35 40 45Ile Ile Leu Val Phe Pro Ile Ala Ile Val Phe Ala Ile Leu Gly Arg50 55 60His Tyr Pro Ser Ala Gly Gly Val Ala His Phe Val Gly Met Ala Phe65 70 75 80Gly Ser Arg Leu Glu Arg Val Thr Gly Trp Leu Phe Leu Ser Val Ile85 90 95Pro Val Gly Leu Pro Ala Ala Leu Gln Ile Ala Ala Gly Phe Gly Gln100 105 110Ala Met Phe Gly Trp His Ser Trp Gln Leu Leu Leu Ala Glu Leu Gly115 120 125Thr Leu Ala Leu Val Trp Tyr Ile Gly Thr Arg Gly Ala Ser Ser Ser130 135 140Ala Asn Leu Gln Thr Val Ile Ala Gly Leu Ile Val Ala Leu Ile Val145 150 155 160Ala Ile Trp Trp Ala Gly Asp Ile Lys Pro Ala Asn Ile Pro Phe Pro165 170 175Ala Pro Gly Asn Ile Glu Leu Thr Gly Leu Phe Ala Ala Leu Ser Val180 185 190Met Phe Trp Cys Phe Val Gly Leu Glu Ala Phe Ala His Leu Ala Ser195 200 205Glu Phe Lys Asn Pro Glu Arg Asp Phe Pro Arg Ala Leu Met Ile Gly210 215 220Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Tyr Trp Gly Cys Thr Val Val Val Leu225 230 235 240
His Phe Asp Ala Tyr Gly Glu Lys Met Ala Ala Ala Ala Ser Leu Pro245 250 255Lys Ile Val Val Gln Leu Phe Gly Val Gly Ala Leu Trp Ile Ala Cys260 265 270Val Ile Gly Tyr Leu Ala Cys Phe Ala Ser Leu Asn Ile Tyr Ile Gln275 280 285Ser Phe Ala Arg Leu Val Trp Ser Gln Ala Gln His Asn Pro Asp His290 295 300Tyr Leu Ala Arg Leu Ser Ser Arg His Ile Pro Asn Asn Ala Leu Asn305 310 315 320Ala Val Leu Gly Cys Cys Val Val Ser Thr Leu Val Ile His Ala Leu325 330 335Glu Ile Asn Leu Asp Ala Leu Ile Ile Tyr Ala Asn Gly Ile Phe Ile340 345 350Met Ile Tyr Leu Leu Cys Met Leu Ala Gly Cys Lys Leu Leu Gln Gly355 360 365Arg Tyr Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Leu Leu Cys Val Leu Leu370 375 380Leu Ala Met Val Gly Trp Lys Ser Leu Tyr Ala Leu Ile Met Leu Ala385 390 395 400Gly Leu Trp Leu Leu Leu Pro Lys Arg Lys Thr Pro Glu Asn Gly Ile405 410 415Thr Thr<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gtcgacgcgt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgc 33<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gaccttaatt aagatctcat atattccacc agctatttgt tag43<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5attgctggtt tgctgctt 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6agcacaaaat cgggtgaa 18<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7cgcccatggc tccttttagt cattctt 27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8cgcgagctca gtactattaa tccagcg 27<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9gatcgcggcc gctgcaacgc ggcatcatta aattcga 37<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10gatcgcggcc gcagtttcaa ccagttaatc aactgg 3權(quán)利要求
1.一種適用于發(fā)酵制造L-甲硫氨酸且可由一起始菌株制得的微生物菌株，該微生物菌株的yjeH基因產(chǎn)物的活性或yjeH同系物基因產(chǎn)物的活性與該起始菌株相比是增強(qiáng)的。
2.如權(quán)利要求1的微生物菌株，其是真菌、酵母或細(xì)菌，優(yōu)選為腸桿菌科的細(xì)菌，特別優(yōu)選為大腸桿菌。
3.如權(quán)利要求1或2的微生物菌株，其中通過適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或翻譯信號(hào)使該微生物內(nèi)yjeH基因的拷貝數(shù)增加或使該yjeH基因的表達(dá)增強(qiáng)。
4.如權(quán)利要求3的微生物菌株，其中所述的啟動(dòng)子選自gapA基因的組成型GAPDH啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型lac、tac、trc、λ、ara和tet啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的微生物菌株，其中所述的微生物菌株是一種大腸桿菌菌株，所述的大腸桿菌菌株中yjeH基因產(chǎn)物活性的增強(qiáng)是基于pACYC衍生物內(nèi)yjeH基因的拷貝數(shù)的增加。
6.一種質(zhì)粒，其包括一附有啟動(dòng)子的yjeH基因。
7.如權(quán)利要求6的質(zhì)粒，該質(zhì)粒另外補(bǔ)充了一種對(duì)甲硫氨酸代謝進(jìn)行去調(diào)節(jié)作用的遺傳元件。
8.一種用以制備如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的微生物菌株的方法，該方法包括將如權(quán)利要求6或7的質(zhì)粒引入一起始菌株。
9.一種用以制備L-甲硫氨酸的方法，該方法包括將如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的微生物菌株用于發(fā)酵并將L-甲硫氨酸自發(fā)酵混合物中取出。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中該微生物菌株在一發(fā)酵罐內(nèi)作為連續(xù)培養(yǎng)物、分批培養(yǎng)物或優(yōu)選地作為補(bǔ)料分批培養(yǎng)物的形式生長。
11.如權(quán)利要求9或10的方法，其中在發(fā)酵過程中連續(xù)計(jì)量加入一種碳源。
12.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)的方法，其中所用的碳源是糖、糖醇或有機(jī)酸。
13.如權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)的方法，其中將碳源計(jì)量加入以確保在發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)碳源含量保持在0.1至50克/升的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選為保持在0.5至10克/升的范圍內(nèi)。
14.如權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)的方法，其中所用的氮源是氨、銨鹽或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述的發(fā)酵在需氧生長條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于發(fā)酵制造L－甲硫氨酸且可由一起始菌株制得的微生物菌株，該微生物菌株的yjeH基因產(chǎn)物的活性或yjeH同系物基因產(chǎn)物的活性與該起始菌株相比是增強(qiáng)的。
文檔編號(hào)C12P13/12GK1539983SQ20041000383
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者托馬斯·邁爾, 克里斯托夫·溫特哈爾特, 克斯廷·普法伊費(fèi)爾, 普法伊費(fèi)爾, 托夫 溫特哈爾特, 托馬斯 邁爾 申請(qǐng)人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)