專利名稱：薄型分析用具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在分析血液等試料液中的特定成分(例如葡萄糖、膽固醇)的濃度時(shí)所使用的分析用具。
背景技術(shù)：
對于糖尿病患者來說，為了管理血糖值而在平日掌握自己的血糖值是很重要的。但由于頻繁地到醫(yī)院去是非常麻煩的，所以一種患者可以自己進(jìn)行簡單血糖值測定且在外出時(shí)也可以輕松進(jìn)行血糖值測定的、能夠放在手掌里那樣大小的便攜式簡易血糖值測定裝置就得到了應(yīng)用。對于使用這種血糖值測定裝置進(jìn)行的血糖測定，是將提供酶反應(yīng)場的葡萄糖傳感器安裝在血糖值測定裝置上、并通過向葡萄糖傳感器提供血液(檢體)來進(jìn)行的。
作為葡萄糖傳感器，構(gòu)成為使用安培法或者庫侖法為代表的電化學(xué)方法來在簡易血糖值測定裝置中測定葡萄糖濃度。這種葡萄糖傳感器例如構(gòu)成為包括一對電極(作用極以及對極)、試藥層、以及將該試藥層收容在內(nèi)部的毛細(xì)管。
在采用安培法的情況下，作用極以及對極例如橫向排列在同一平面，或者互相相對配置；在采用庫侖法的情況下，作用極以及對極一般以相對的方式配置。試藥層構(gòu)成為含有氧化還原酶以及電子傳導(dǎo)物質(zhì)，通常，采用GOD作為氧化還原酶，采用鐵氰化鉀作為電子傳導(dǎo)物質(zhì)。在這種葡萄糖傳感器中，當(dāng)利用毛細(xì)管向試藥層供給檢體時(shí)，通過氧化還原酶，例如使葡萄糖的氧化反應(yīng)被得到催化，而電子傳導(dǎo)物質(zhì)的還原反應(yīng)得到催化。
對于向葡萄糖傳感器的血液供給，一般是通過切開測定者的皮膚使血液流出，并將該血液導(dǎo)入葡萄糖傳感器來進(jìn)行的。在該方法中，從減小血液采取對測定者的負(fù)擔(dān)的角度出發(fā)，優(yōu)選應(yīng)采取的血液量較少。因此，為了降低檢體量而進(jìn)行了各種改良研究(例如參照日本國特表2000-509507號(hào)公報(bào)以及美國專利申請公開第2002/0092612號(hào)說明書)。
在日本國特表2000-509507號(hào)公報(bào)中，揭示有一種相對配置作用極以及對極、并使電極間的距離在50μm以下的葡萄糖傳感器，使得能夠利用庫侖法以較少的樣本量來測定葡萄糖濃度。在該葡萄糖傳感器中，雖然能夠減少應(yīng)使用的血液量，但是因?yàn)閹靵龇ㄊ鞘箮缀跛械钠咸烟欠磻?yīng)的方法，所以存在測定時(shí)間明顯變長的問題。
與其相對，在美國專利申請公開第2002/0092612號(hào)說明書中，揭示有一種將樣本量減少至1.5μm以下、并將測定時(shí)間縮短為十秒的葡萄糖傳感器。在該葡萄糖傳感器中，在基板和蓋體之間形成有配置了作用極、對極以及試藥層的毛細(xì)管，使基板和蓋體之間的距離在200μm以下。在該葡萄糖傳感器中，試藥層例如以包含葡萄糖氧化酶以及鐵氰化物的狀態(tài)而被固定在作用極的表面，并呈非水溶性。
然而，即使對于美國專利申請公開第2002/0092612號(hào)說明書所揭示的葡萄糖傳感器，也很難就判斷已經(jīng)充分縮短了測定時(shí)間，此外，在測定精度上仍有改進(jìn)的余地。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于能夠縮短測定時(shí)間、并能夠通過微量的試料液高精度地進(jìn)行濃度測定。
本發(fā)明者為了實(shí)現(xiàn)上述目的而進(jìn)行了仔細(xì)研究的結(jié)果是，注意到現(xiàn)有葡萄糖傳感器不能縮短測定時(shí)間的原因之一在于試藥層的結(jié)構(gòu)上這一點(diǎn)，從而完成了本發(fā)明。
即，在現(xiàn)有葡萄糖傳感器的試藥層上，由于將試藥層固定在作用極的表面，所以葡萄糖與葡萄糖氧化酶的反應(yīng)僅僅發(fā)生在作用極的表面，葡萄糖與葡萄糖氧化酶的反應(yīng)需要時(shí)間，所以測定時(shí)間變長。為了消除這種不良情況，可以考慮通過試料液(血液)而易于溶解試藥層的結(jié)構(gòu)。在這種情況下，由于電子傳導(dǎo)物質(zhì)在試料液(血液)中擴(kuò)散，所以有必要排除影響電子傳導(dǎo)物質(zhì)擴(kuò)散的因子，例如試料液中的固體成分(血液中的血球成分等)的比例的影響，或者排除試料液溫度的影響。此外，如果使用鐵氰化物那種對血液的溶解性較小的物質(zhì)，則溶解時(shí)間變長，從而測定時(shí)間變長。
本發(fā)明者還得到了改善以下說明的幾點(diǎn)會(huì)有利于提高測定精度這樣的結(jié)論。即，第一，如果使用鐵氰化物那種對血液的溶解性較小的物質(zhì)，則會(huì)因?yàn)槿芙庑云疃斐蓽y定精度惡化。另外，鐵氰化物的保存性差，在保存時(shí)容易轉(zhuǎn)化為還原體，在這一點(diǎn)上也存在測定精度下降的問題。第二，由于葡萄糖氧化酶與葡萄糖的反應(yīng)速度較小(Km(米氏常數(shù))大)，所以，使用葡萄糖氧化酶對縮短測定時(shí)間是不理想的。
鑒于以上的情況，在本發(fā)明中，提供了一種薄型分析用具，它是具備用于保持試料液的反應(yīng)空間的分析用具，其中，在所述反應(yīng)空間配置有當(dāng)保持有試料液時(shí)便溶解的試藥部，上述反應(yīng)空間的一部分由互相相對的第一以及第二面所規(guī)定，而且將上述第一以及第二面的相對距離設(shè)定為45μm以下。相對距離優(yōu)選在25～45μm的范圍。
本發(fā)明的薄型分析用具，例如構(gòu)成為具有以互相相對的狀態(tài)隔開間隔而配置的、并規(guī)定上述反應(yīng)空間的第一以及第二板材。在這種情況下，第一以及第二面是沿著例如與第一以及第二板材的厚度方向垂直的方向而擴(kuò)展的面。
本發(fā)明的薄型分析用具，構(gòu)成為例如還具有第一以及第二電極，被設(shè)置在第一板材的一面上、并且至少一部分鄰接反應(yīng)空間，同時(shí)，用于向試料液施加電壓而被利用。在這種情況下，相對距離被定義為從第一或者第二電極的上面(例如相當(dāng)于第一面)，到第二板材的與該電極的上面相對的部分(例如相當(dāng)于第二面)的最小距離。
本發(fā)明的薄型分析用具，可以構(gòu)成為還具有設(shè)置在第一板材上的第一電極，以及以與第一電極相對的方式而被設(shè)置在第二板材上、并用于與第一電極一起向試料液施加電壓而被利用的第二電極。在這種情況下，相對距離被定義為第一電極的上面(例如相當(dāng)于第一面)與第二電極的上面(例如相當(dāng)于第二面)之間的最小距離。
反應(yīng)空間構(gòu)成為例如可以通過毛細(xì)管力而使試藥移動(dòng)。優(yōu)選使用Ru化合物作為電子傳導(dǎo)物質(zhì)。能夠使用下述化學(xué)式(1)所表示的物質(zhì)作為Ru化合物，[Ru(NH3)5X]n+…… (1)，
在化學(xué)式(1)中，X為NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺、或者H2O?；瘜W(xué)式(1)的n+表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)絡(luò)合體的價(jià)數(shù)。
在分析對象成分是葡萄糖的情況下，優(yōu)選使用具有葡萄糖脫氫活性的的GDH作為氧化還原酶。優(yōu)選使用以FAD作為補(bǔ)缺因子的葡萄糖脫氫酶(αGDH)作為GDH。另外，優(yōu)選使用細(xì)胞色素C與αGDH接合的GDH(CyGDH)作為GDH。作為CyGDH以及αGDH可以列舉出在國際公開第WO02/36779號(hào)小冊子中公開的物質(zhì)。雖然優(yōu)選使用來源于屬于伯克霍爾德菌屬的微生物的GDH作為GDH，但是也可以使用來源于與CyGDH以及αGDH相同具有FAD以及細(xì)胞色素C的其他類的微生物的GDH作為GDH。作為其他類的例子，可以舉出Ralstonia類或者Pseudomonas類中具有病原性的革蘭(Gram)陰性菌。
例如αGDH是包含作為具有葡萄糖脫氫活性的輔助單元，而在還原條件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝膠電泳的分子量約為60kDa的GDH活性蛋白質(zhì)(α輔助單元)。另外，CyGDH是包含α輔助單元以及在還原條件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝膠電泳的分子量約為43kDa的電子傳遞蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素C)而作為輔助單元的?？梢允褂眠€具有α輔助單元和細(xì)胞色素C以外的輔助單元作為αGDH或者CyGDH。
CyGDH可以通過精制例如屬于洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)的微生物分泌到菌體外的酶，或者精制該菌體的菌體內(nèi)酶而得到。另外，αGDH可以通過形成植入將從屬于洋蔥伯克霍爾德菌的微生物中采取的αGDH編碼的遺傳基因形質(zhì)轉(zhuǎn)換體，精制從形質(zhì)轉(zhuǎn)換體向外部分泌的酶，或者精制該形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的菌體內(nèi)酶而得到。
作為屬于洋蔥伯克霍爾德菌的微生物，例如可以使用洋蔥伯克霍爾德菌KSI株。該KSI株以微生物受托號(hào)第FERM BP-7306號(hào)而于平成12年9月25日被寄托在獨(dú)立專利法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利寄托中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)。
作為試料液，可以舉出例如血液、尿、唾液以及其他調(diào)整液等的生化試料液，作為分析對象成分可以舉出葡萄糖、膽固醇、乳酸以及抗壞血酸。


圖1是本發(fā)明的生物傳感器的整體立體圖。
圖2是沿著圖1的II-II線的截面圖。
圖3是圖1所示生物傳感器的分解立體圖。
圖4是表示將圖1至圖3所示的生物傳感器安裝到濃度測定裝置的狀態(tài)的圖，對于生物傳感器是用平面圖表示，而對于濃度測定裝置是用框圖表示。
圖5A以及圖5B是用于說明生物傳感器的作用的圖，是生物傳感器的主要部分的截面圖。
圖6A以及圖6B表示的是生物傳感器的其他例子的圖。
圖7表示的是血液的血細(xì)胞比容值對本方案的生物傳感器1的影響的圖。
圖8表示的是血液的血細(xì)胞比容值對本方案的生物傳感器2的影響的圖。
圖9表示的是血液的血細(xì)胞比容值對比較生物傳感器1的影響的圖。
圖10表示的是血液的溫度對本方案的生物傳感器1的影響的圖。
圖11表示的是血液的溫度對本方案的生物傳感器2的影響的圖。
圖12表示的是血液的溫度對比較生物傳感器1的影響的圖。
圖13表示的是對本方案的生物傳感器1的測定范圍的評價(jià)結(jié)果的14表示的是將對本方案的生物傳感器3的再現(xiàn)性作為響應(yīng)電流的時(shí)間變化曲線來評價(jià)的結(jié)果的圖。
圖15表示的是將對本方案的生物傳感器4的再現(xiàn)性作為響應(yīng)電流的時(shí)間變化曲線來評價(jià)的結(jié)果的圖。
圖16表示的是將對比較生物傳感器1的再現(xiàn)性作為響應(yīng)電流的時(shí)間變化曲線來評價(jià)的結(jié)果的圖。
圖17表示的是將對本方案的生物傳感器3、生物傳感器4以及比較生物傳感器2的再現(xiàn)性作為C.V.的時(shí)間變化曲線來評價(jià)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
以下，參照附圖對用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式進(jìn)行具體說明。在本實(shí)施方式中，雖然以構(gòu)成為測定血糖值的葡萄糖傳感器為例進(jìn)行說明，但是本發(fā)明并不局限于測定血糖值的情況，也能夠適用于分析血液中的其他成分或者血液以外的試料液的分析用具。
圖1至圖3所示的葡萄糖傳感器1是安裝在濃度測定裝置2上來使用的(參照圖4)，具有介于隔板4而在矩形的基板3上層疊有蓋體5的形態(tài)。在該葡萄糖傳感器1中，由各要素3～5規(guī)定反應(yīng)空間6。該反應(yīng)空間6被規(guī)定為具有矩形截面的柱形空間，能夠利用毛細(xì)管力使從開口部(導(dǎo)入口)61導(dǎo)入的試料液移動(dòng)，并保持導(dǎo)入的試料液。
隔板4用于規(guī)定從基板3的上面30到蓋體5的下面5a的距離，即反應(yīng)空間6的高度尺寸。在該隔板4上形成有前端部開放的切口41。切口41用于規(guī)定反應(yīng)空間6的寬度尺寸，切口41的前端的開放部用于構(gòu)成使試料液導(dǎo)入反應(yīng)空間6的內(nèi)部的導(dǎo)入口61。
蓋體5具有排氣口51。排氣口51用于將反應(yīng)空間6的內(nèi)部氣體排出到外部，其與反應(yīng)空間6的內(nèi)部連通。因此，當(dāng)經(jīng)由導(dǎo)入口61向反應(yīng)空間6內(nèi)導(dǎo)入試料液時(shí)，依靠在反應(yīng)空間6內(nèi)產(chǎn)生的毛細(xì)管力，使試料液在反應(yīng)空間6的內(nèi)部向著在蓋體5上形成的排氣口51移動(dòng)。
如圖3所清楚地表示那樣，在基板3的上面30形成有作用極31、對極32以及試藥部33。作用極31以及對極32作為整體而沿著基板3的長度方向延伸。作用極31以及對極32的端部31a、32a沿著基板3的寬度方向延伸且并列于長度方向。另一方面，作用極31以及對極32的端部31b、32b構(gòu)成用于與后述濃度測定裝置2的第一以及第二端子20a、20b(參照圖4)接觸的端子部。
作用極31以及對極32例如通過絲網(wǎng)印刷、鍍、或者濺射而使得厚度尺寸D(參照圖2)在20μm以下。優(yōu)選將作用極31以及對極32的厚度尺寸D設(shè)定在1～10μm。將從作用極31的上面31c到蓋體5的下面5a的相對距離H1(參照圖2)設(shè)定在45μm以下，優(yōu)選在25～45μm。這是因?yàn)槿粝鄬嚯xH1不合適地過大，則如后述那樣容易受到血液溫度和血細(xì)胞比容值的影響，相反，若相對距離H1不合適地過小，則不能使血液在反應(yīng)空間6的內(nèi)部適當(dāng)移動(dòng)。
試藥部33形成為例如含有媒介物(電子傳遞物質(zhì))以及相對較少的氧化還原酶的固體狀態(tài)，如圖2以及圖3清楚地表示那樣，以搭橋作用極31以及對極32的端部31a、32a的方式來設(shè)置。該試藥部33采用容易溶解于血液的物質(zhì)。因此，在將血液導(dǎo)入到反應(yīng)空間6內(nèi)的情況下，構(gòu)筑成包含媒介物、氧化還原酶以及葡萄糖的液相反應(yīng)體系。在該液相反應(yīng)體系中，不僅在作用極31的上面31c，而且在反應(yīng)空間6的大范圍內(nèi)均發(fā)生葡萄糖的氧化反應(yīng)以及電子傳遞物質(zhì)的還原反應(yīng)。因此，與在作用極的表面固定媒介物和氧化還原酶的情況相比，能夠以更短的時(shí)間使更多的葡萄糖氧化。從而能夠縮短測定時(shí)間。
優(yōu)選使用Ru化合物作為媒介物。作為Ru化合物，例如列舉有Ru絡(luò)合體。作為Ru絡(luò)合體，雖然只要是能夠作為電子傳遞物質(zhì)而起作用即可，對其配位子的種類沒有特別的限定，但是優(yōu)選以氧化型的狀態(tài)而被包含于試藥部33，例如氧化型使用下述化學(xué)式(2)所示的物質(zhì)，[Ru(NH3)5X]n+…… (2)。
作為在化學(xué)式(2)中的X，雖然列舉出NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺或者H2O，但是優(yōu)選NH3或者鹵離子。另一方面，在化學(xué)式中的n+表示由X的種類所決定的氧化型(III)絡(luò)合體的價(jià)數(shù)。
因?yàn)檫€原型(II)不穩(wěn)定，所以Ru絡(luò)合體通常以氧化型(III)而存在著。因此，即使在葡萄糖傳感器1的試藥部33上使Ru絡(luò)合體混合存在的狀態(tài)下而暴露在光或者水中，媒介物也不會(huì)簡單還原。因此能夠抑制因媒介物的暴露而產(chǎn)生的測定誤差。此外，Ru絡(luò)合體還具有不容易結(jié)晶而能夠適當(dāng)?shù)鼐S持在微粉末狀態(tài)的特性。因此，若使用Ru絡(luò)合體，則在保存時(shí)試藥部33的溶解性不會(huì)惡化。而且，對于Ru絡(luò)合體和αGDH或者CyGDH的組合來說，由于Ru絡(luò)合體的電子傳遞速度高，所以具有能夠縮短測定時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。
如圖4所示的那樣，濃度測定裝置2包括第一以及第二端子20a、20b，電壓施加部21，電流值測定部22，檢測部23，控制部24，計(jì)算部25，以及顯示部26。
第一以及第二端子20a、20b在將葡萄糖傳感器1安裝在濃度測定裝置2上時(shí)，用于與葡萄糖傳感器1的作用極31以及對極32的端部31b、32b接觸。
電壓施加部21使用在經(jīng)由第一以及第二端子20a、20b向葡萄糖傳感器1的作用極31以及對極32之間施加電壓時(shí)。作為電壓施加部21例如可以采用干電池或者蓄電池等直流電源。
電流值測定部22用于將在向作用極31以及對極32之間施加電壓時(shí)的作用極31和電子傳遞物質(zhì)之間的電子授受量作為響應(yīng)電流值來測定。
檢測部23在將葡萄糖傳感器1安裝在濃度測定裝置2上后，用于基于電流值測定部22所測定的電流值來確認(rèn)是否向試藥部33(參照圖1到圖3)供給有試料液。
控制部24控制電壓施加部21，選擇在作用極31以及對極32之間施加電壓的狀態(tài)(閉回路)和不施加電壓的狀態(tài)。
計(jì)算部25根據(jù)由電流值測定部22測定的響應(yīng)電流值來進(jìn)行葡萄糖濃度的計(jì)算。計(jì)算部25構(gòu)成為例如能夠通過安培法來計(jì)算葡萄糖濃度。如果使用安培法的話，則與庫侖法相比，能夠在短時(shí)間進(jìn)行濃度測定。
雖然檢測部23、控制部24以及計(jì)算部25各自例如由CPU以及ROM或者RAM等存儲(chǔ)器構(gòu)成，但是也可以通過向一個(gè)CPU連接多個(gè)存儲(chǔ)器而構(gòu)成檢測部23、控制部24以及計(jì)算部25的整體。
顯示部26除了用于顯示計(jì)算部25得到的計(jì)算結(jié)果外，例如還顯示錯(cuò)誤信息和操作順序等，例如由液晶顯示裝置構(gòu)成。
接下來，對使用葡萄糖傳感器1以及濃度測定裝置2進(jìn)行的葡萄糖濃度的測定順序進(jìn)行說明。
如圖4所清楚表示的那樣，首先將葡萄糖傳感器1安裝在濃度測定裝置2上。這樣的話，葡萄糖傳感器1的作用極31以及對極32的端部31b、32b與濃度測定裝置2的第一以及第二端子20a、20b接觸。在該狀態(tài)下，可以經(jīng)由第一以及第二端子20a、20b向作用極31以及對極32之間施加電壓。在實(shí)際測定中，從葡萄糖傳感器1被安裝在濃度測定裝置2上的時(shí)候起，向作用極31和對極32之間施加電壓。由于Ru絡(luò)合體在低電壓時(shí)會(huì)產(chǎn)生媒介作用(mediation)，所以在使用Ru絡(luò)合體的情況下，施加在作用極31以及對極32之間的定電壓例如被設(shè)定在100～500μm的范圍內(nèi)。在本實(shí)施方式中，向作用極31以及對極32之間的定電壓的施加，一直持續(xù)到用于計(jì)算葡萄糖濃度的響應(yīng)電流值被測定為止。
接下來，通過葡萄糖傳感器1的導(dǎo)入口61將血液導(dǎo)入到反應(yīng)空間6內(nèi)。血液在反應(yīng)空間6內(nèi)通過毛細(xì)管力而從導(dǎo)入口61向著形成于蓋體5上的排氣口51行進(jìn)。在這個(gè)過程中，血液使試藥33溶解。
另一方面，若向試藥部33供給血液，則通過氧化還原酶而使葡萄糖被氧化為葡糖酸內(nèi)脂，同時(shí)，使媒介物成為還原型。其中，葡糖酸內(nèi)脂成為非酶的葡糖酸。
還原型的媒介物在經(jīng)由作用極31以及對極32的端部31b、32b向作用極31以及對極32施加定電壓的狀態(tài)下，向作用極的端部31a側(cè)移動(dòng)，向該端部31a放出電子而成為氧化型的媒介物。所以，在通過電壓施加部21向作用極31以及對極32之間施加定電壓的狀態(tài)下，從還原型媒介物所給與的電子量經(jīng)由作用極31以及第一端子20a，在電流值測定部22作為響應(yīng)電流值而被測定。該響應(yīng)電流值與源于通過施加電壓而在試藥部33移動(dòng)了的還原型的媒介物有關(guān)，被稱為所謂的擴(kuò)散電流。
另一方面，在電流值測定部22中所測定的響應(yīng)電流值，在檢測部23中被監(jiān)視，當(dāng)響應(yīng)電流值超過閾值時(shí)，檢測部23檢測出血液被供給到試藥部33，試藥部33溶解。在檢測部23檢測到供給了血液的情況下，通過檢測部23來判斷從該檢測起是否經(jīng)過了一定的時(shí)間。
當(dāng)在檢測部23判斷出經(jīng)過了一定時(shí)間的情況下，在電流值測定部22測定響應(yīng)電流值，基于該響應(yīng)電流值來在計(jì)算部25中計(jì)算葡萄糖濃度。葡萄糖的計(jì)算是在將響應(yīng)電流值換算為電壓值之后，通過將該電壓值與預(yù)先作成的表示電壓值和葡萄糖濃度之間關(guān)系的檢測線對比來計(jì)算的。將計(jì)算部25的計(jì)算結(jié)果例如顯示在顯示部26。
雖然與作用極31接觸的還原型媒介物立刻向作用極31放出電子而成為氧化型，但是也可以是距離作用極31一定距離的還原型媒介物向作用極31放出電子而成為氧化型。以下，將還原型媒介物能夠向作用極31放出電子的區(qū)域稱為放出電子區(qū)域，而將還原型媒介物不能向作用極31放出電子的區(qū)域稱為非放出電子區(qū)域。
如從后述實(shí)施例推測的那樣，放出電子區(qū)域距離作用極的表面的距離不小于45μm。因此，如圖5A所示那樣，當(dāng)從作用極31的上面31c到蓋體5的下面5a的相對距離H1較大時(shí)，例如相對距離H1在50μm以上的情況下，在作用極31的正上方，在電子放出區(qū)域70的上方存在非放出電子區(qū)域71。
與其相對，如本專利申請的葡萄糖傳感器1那樣，當(dāng)將從作用極31的上面31c到蓋體5的下面5a的相對距離H1設(shè)定在45μm以下的情況下，如圖5B所示那樣，位于電子放出區(qū)域70的作用極31的正上方部分的厚度尺寸(以下簡稱為“放出電子區(qū)域70的厚度尺寸”)與相對距離H1一致，該放出電子區(qū)域70的厚度尺寸與圖5A所示的情況相同或者比其小。
這樣，在相對距離H1較大的情況下(參照圖5A)和相對距離H1較小的情況下(參照圖5B)，作用極31的正上方的狀況是不同的。其結(jié)果，也可以如從后述本發(fā)明的實(shí)施例推測的那樣，因?yàn)橄鄬嚯xH1的大小不同，所以還原型媒介物消耗的狀況也不同。
這里，在不施加電壓的狀態(tài)下，認(rèn)為存在于放出電子區(qū)域的還原型媒介物(以下稱“非擴(kuò)散媒介物”)的濃度與存在于非放出電子區(qū)域的還原型媒介物(以下稱“擴(kuò)散媒介物”)的濃度是相同的。
在圖5所示的相對距離H1較大的情況下，因?yàn)榉懦鲭娮訁^(qū)域70(被虛線包圍的部分)的厚度尺寸大，所以在施加電壓時(shí)，非擴(kuò)散媒介物不會(huì)被全部氧化。所以，非擴(kuò)散媒介物只消耗一定量，因此，在放出電子區(qū)域70和非放出電子區(qū)域71之間產(chǎn)生了還原型媒介物的濃度差。因此，擴(kuò)散媒介物從其上方以及側(cè)面向放出電子區(qū)域70擴(kuò)散。然后，存在于放出電子區(qū)域70的還原型媒介物的氧化以及向放出電子區(qū)域70的媒介物的擴(kuò)散重疊地產(chǎn)生。因此，在相對距離H1較大的情況下，大致劃分為初期是非擴(kuò)媒介物的消耗，中期是非擴(kuò)散媒介物以及擴(kuò)散媒介物的消耗，后期是擴(kuò)散媒介物的消耗的過程。
這里，擴(kuò)散媒介物的擴(kuò)散速度除了受放出電子區(qū)域70與非放出電子區(qū)域71之間的還原型媒介物濃度差影響外，還受擴(kuò)散媒體(血液)的溫度或者移動(dòng)阻抗(血液的血細(xì)胞比容值)的影響。所以，在相對距離H1較大的情況下，血液的溫度或者血細(xì)胞比容值的影響隨時(shí)間而逐漸變大。
與其相對，在相對距離H1較小的情況下(參照圖5B)，因?yàn)榉懦鲭娮訁^(qū)域70的厚度尺寸較小，所以非擴(kuò)散媒介物在初期幾乎全部被消耗，接下來，產(chǎn)生擴(kuò)散媒介物向放出電子區(qū)域的擴(kuò)散以及消耗。因此，在相對距離H1較小的情況下，大致劃分為初期是非擴(kuò)散媒介物的消耗，后期是擴(kuò)散媒介物的消耗的過程。因此，在相對距離H1較小的情況下，可以分為不容易受到血液溫度或者血細(xì)胞比容值影響的階段和受它們影響較大的階段。
在相對距離H1與放出電子區(qū)域的厚度尺寸一致的情況下，擴(kuò)散媒介物向放出電子區(qū)域的擴(kuò)散只從放出電子區(qū)域的側(cè)面進(jìn)行。因此，與相對距離H1比放出電子區(qū)域的尺寸大、擴(kuò)散媒介物從放出電子區(qū)域的側(cè)面以及上方擴(kuò)散的情況相比，可以說在相對距離H1較小的情況下，擴(kuò)散媒介物的擴(kuò)散速度等對測定電流值的影響較小。特別是，在不容易受到血液溫度或者血細(xì)胞比容值影響的階段，擴(kuò)散媒介物的舉動(dòng)對測定電流值的影響小。因此，若使相對距離H1與放出電子區(qū)域的厚度尺寸相同或者比其小，則難以受到血液溫度或者血細(xì)胞比容值影響，在從施加電壓開始的短時(shí)間范圍內(nèi)(測定時(shí)間短的范圍)的再現(xiàn)性良好。
本發(fā)明的葡萄糖傳感器不限于上述實(shí)施方式，可以進(jìn)行各種設(shè)計(jì)變更。例如，作用極31以及對極32只要至少一部分在反應(yīng)空間6內(nèi)即可，例如可以采用圖6A以及圖6B所示的結(jié)構(gòu)。
圖6A所示的葡萄糖傳感器1’在基板3’上形成有凹部35’、36’，在該凹部35’、36’內(nèi)埋設(shè)形成有作用極31’以及對極32’。
作用極31’以及對極32’的上面31c’、32c’既可以如圖示那樣與基板3’的上面30’是同一個(gè)面，也可與基板3’的上面不是同一個(gè)面。
在該葡萄糖傳感器1’中，相對距離H1’被定義為從作用極31’的上面31c’到蓋體5的下面5a’的距離，在作用極31’以及對極32’的上面31c’、32c’與基板3’的上面30’是同一個(gè)面的情況下，相對距離H1’與基板3’和蓋體5’之間的距離H2’一致。
另一方面，圖6B所示的葡萄糖傳感器1”是在基板3”上形成有作用極31”，在蓋體5”上形成有對極32”的結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，也可以在基板上形成對極，在蓋體上形成作用極。
在該的葡萄糖傳感器1”中，相對距離H1”被定義為作用極31”的上面31c”和對極32”的上面32c”之間的距離。
本發(fā)明并不局限于通過隔板來規(guī)定反應(yīng)空間的高度尺寸的分析用具，也可以適用于在形成有作為反應(yīng)空間的凹部的基板上接合蓋體而構(gòu)成的分析用具。
(實(shí)施例)以下，通過實(shí)施例1～4，對本發(fā)明的葡萄糖傳感器在測定響應(yīng)電流值時(shí)，受血液中的血球和溫度的影響小、以及能夠在短時(shí)間內(nèi)高精度地測定葡萄糖濃度這一點(diǎn)進(jìn)行說明。
(葡萄糖傳感器的制作)在實(shí)施例1～4中，是使用與圖1至圖3所示相同結(jié)構(gòu)的葡萄糖傳感器來進(jìn)行評價(jià)的。在各實(shí)施例中使用的葡萄糖傳感器的反應(yīng)空間6的長度尺寸L(參照圖2)、寬度尺寸W(參照圖1)、作用極31以及對極32的厚度尺寸D(參照圖2)為3.4mm、1.5mm、10μm。對于葡萄糖傳感器的相對距離H1、基板3與蓋體5之間的距離H2(參照圖2)、以及試藥部33的結(jié)構(gòu)，如下表1所示。
表1

對于本案葡萄糖傳感器1、2以及比較葡萄糖傳感器1來說，試藥部33采用的是由電子傳遞層以及含酶層所組成的雙層結(jié)構(gòu)。電子傳遞層通過在基板3上涂敷0.4μL含有電子傳遞物質(zhì)的第一材料液后、對第一材料液進(jìn)行送風(fēng)干燥(30℃、10％Rh)而形成。含酶層通過在電子傳遞層上涂敷0.3μL含氧化還原酶的第二材料液后、對第二材料液進(jìn)行送風(fēng)干燥(30℃、10％Rh)而形成。
第一材料液通過這樣調(diào)制而成將按照其號(hào)碼順序混合下表2的①～④所示的材料的混合液放置1～3天后，向該混合液添加電子傳遞物質(zhì)。使用[Ru(NH3)6]Cl3(同仁化學(xué)研究所制“LM722”)作為電子傳遞物質(zhì)。
表2第一材料液的組成(除電子傳遞物質(zhì))

在表2等中，SWN是產(chǎn)品“ル一センタイトSWN”的縮寫，而CHAPS是3-[(膽氨基丙基)二甲氨]丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)的縮寫，ACES是N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid)的縮寫。使用コンプケミカル(株)制的“3150”作為SWN，使用同仁化學(xué)研究所制的“KC062”作為CHAPS，使用同仁化學(xué)研究所制的“ED067”作為ACES。另外，將ACES溶液調(diào)制成pH為7.5。
另外，第二材料液通過使氧化還原酶溶解于0.1％的CHAPS中而調(diào)制成。使用CyGDH(葡萄糖脫氫活性為800U/mg)作為氧化還原酶。對于CyGDH來說，是如上述那樣的。
與其相對，對于本案葡萄糖傳感器3、4以及比較葡萄糖傳感器2，是試藥部3采用鐵氰化鉀與氰亞鐵酸鉀共存的結(jié)構(gòu)。這是為了除去氧化還原酶的催化能等其他因素的影響，而單純地判斷相對距離H1的高度對再現(xiàn)性的影響。更加具體地說，試藥部33通過使材料液在基板3上保持而形成液相。使用按照鐵氰化鉀為20mM、氰亞鐵酸鉀為24mM、氯化鉀為1.5M那樣調(diào)制而成的液體作為材料液。
實(shí)施例1(血細(xì)胞比容值的影響的研究)在本實(shí)施例中，使用本案葡萄糖傳感器1、2以及比較葡萄糖傳感器1來評價(jià)血細(xì)胞比容值(Hct值)對響應(yīng)電流值的影響。
在該評價(jià)中，作為血液，使用葡萄糖濃度為412mg/dL、Hct值為19％、42％或者69％中的任意一個(gè)。
向作用極31和對極32之間施加電壓，使施加電壓值為200mV并與供應(yīng)血液同時(shí)開始，在從開始施加電壓起的五秒、七秒以及十秒后測定響應(yīng)電流值。對各個(gè)Hct值的血液各測五次響應(yīng)電流值。
對于響應(yīng)電流值的測定結(jié)果，在圖7、圖8、圖9中分別表示本案葡萄糖傳感器1、本案葡萄糖傳感器2、比較葡萄糖傳感器1。另外，在圖7～圖9中，橫軸表示時(shí)間(sec)、縱軸表示Bias(％)。Bias(％)是以Hct值為42％時(shí)的響應(yīng)電流值為基準(zhǔn)值，相對該基準(zhǔn)值的偏移量，在各圖中，Bias(％)表示五次測定的平均值。
通過比較圖7～圖9可知，不論施加電壓的時(shí)間如何，具有相對距離H1越小、則Bias(％)越小的傾向。因此，可知具有相對距離H1越小、則Hct值的影響越小的傾向。
實(shí)施例2(溫度的影響)在本實(shí)施例中，使用本案葡萄糖傳感器1、2以及比較葡萄糖傳感器1來評價(jià)血液溫度(Hct值)對響應(yīng)電流值的影響。
在該評價(jià)中，作為血液使用Hct值為42％，葡萄糖濃度為100mg/dL、422.0mg/dL、或者636.0mg/dL中的任意一個(gè)，而使溫度為5℃、25℃或者45℃。
向作用極31和對極32之間的電壓施加是以200mV為施加電壓值并從血液的供應(yīng)起開始進(jìn)行的，響應(yīng)電流值是在開始施加電壓起五秒后測定的。對各葡萄糖濃度的血液各測定五次響應(yīng)電流值。
對于響應(yīng)電流值的測定結(jié)果，在圖10、圖11、圖12中分別表示本案葡萄糖傳感器1、本案葡萄糖傳感器2、比較葡萄糖傳感器1。另外，在圖10～圖12中，以橫軸表示溫度(℃)、縱軸表示Bias(％)來分別表示各葡萄糖濃度。Bias(％)表示的是以溫度為25℃時(shí)的響應(yīng)電流值為基準(zhǔn)值，相對該基準(zhǔn)值的偏移量，在各圖中，Bias(％)表示五次測定的平均值。
通過比較圖10～圖12可知，不論葡萄糖濃度以及施加電壓的時(shí)間如何，具有相對距離H1越小、則Bias(％)越小的傾向。所以，可知具有相對距離H1越小、則血液溫度的影響越小的傾向。
實(shí)施例3(測定范圍的評價(jià))在本實(shí)施例中，使用本案葡萄糖傳感器1對測定范圍進(jìn)行了評價(jià)。通過葡萄糖濃度和響應(yīng)電流值之間的關(guān)系(線性)評價(jià)了測定范圍。
在該評價(jià)中，使用Hct值為42％，葡萄糖濃度為0mg/dL、100mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、610mg/dL、805mg/dL或者980mg/dL的血液。向作用極31和對極32之間的電壓施加，是以施加的電壓值為200mV而從供應(yīng)血液起開始進(jìn)行的，在從電壓的施加起三秒后測定響應(yīng)電流值。對每個(gè)葡萄糖濃度的血液各測十次響應(yīng)電流值。
響應(yīng)電流值的測定結(jié)果表示在圖13中。但是，在圖13中，響應(yīng)電流值(μA)表示的是十次測定的平均值。
從圖13中可以得知，在葡萄糖傳感器1中，在葡萄糖濃度為0～1000mg/dL的范圍內(nèi)表現(xiàn)出很高的直線性，可以說即使在葡萄糖濃度較大的情況下(大于600mg/dL)，也可以良好地測定葡萄糖濃度。因此，如本案葡萄糖傳感器1所示那樣，若使用CyGDH作為氧化還原酶，使用Ru絡(luò)合體作為媒介物，則即使相對距離H1設(shè)定得小，也可以在三秒左右的短時(shí)間內(nèi)良好地測定0～1000mg/dL范圍內(nèi)的葡萄糖濃度。
實(shí)施例4(再現(xiàn)性的評價(jià))在本實(shí)施例中，使用本案葡萄糖傳感器3、4以及比較葡萄糖傳感器2，基于多次的響應(yīng)電流值測定的時(shí)間變化過程以及相對標(biāo)準(zhǔn)差C.V(％)的時(shí)間變化過程來評價(jià)響應(yīng)電流值的再現(xiàn)性。
在該評價(jià)中，使用Hct值為42％，葡萄糖濃度為412mg/dL的血液。向作用極31和對極32之間的電壓施加是以所施加電壓值為200mV而從血液的供給起五秒后開始進(jìn)行的，從開始施加電壓開始，每隔50msec測定一次響應(yīng)電流值。
時(shí)間變化曲線的測定結(jié)果表示在圖14～圖16中。在這些圖中，同時(shí)表示五次測定的響應(yīng)電流值的時(shí)間變化曲線，圖14、圖15、圖16中分別表示本案葡萄糖傳感器3、本案葡萄糖傳感器4、比較葡萄糖傳感器2。另外，圖17表示C.V(％)的時(shí)間變化曲線。該時(shí)間變化曲線基于為了得到響應(yīng)電流值的時(shí)間變化曲線而進(jìn)行的五次響應(yīng)電流值的測定而制成。
從圖14～圖16可知，在本案葡萄糖傳感器3、4中，與比較葡萄糖傳感器2相同，在響應(yīng)電流值上幾乎看不到偏差，能夠在多次測定中得到良好的再現(xiàn)性。另外，從圖17可知，在本案葡萄糖傳感器3中，在施加電壓開始的初期、即從開始施加電壓的0.5～3.0(sec)的時(shí)間范圍內(nèi)，與本案葡萄糖傳感器4以及比較葡萄糖傳感器2相比，C.V.小，C.V.值大約小于2.5％。在本案葡萄糖傳感器4中，在從開始施加電壓起3.0～7.0(sec)的時(shí)間范圍內(nèi)，與比較葡萄糖傳感器2相比，C.V.小，C.V.值大約小于2.5％。從這些結(jié)果可知，如果相對距離H1設(shè)定得小，則在開始施加電壓起的很短的時(shí)間范圍內(nèi)，再現(xiàn)性良好。所以，從再現(xiàn)性的角度出發(fā)，可以說將相對距離H1設(shè)定得較小的葡萄糖傳感器適于短時(shí)間的測定。
權(quán)利要求
1.一種薄型分析用具，它是具備用于保持試料液的反應(yīng)空間的分析用具，其特征在于在所述反應(yīng)空間配置有當(dāng)保持有試料液時(shí)溶解的試藥部，所述反應(yīng)空間的一部分由互相相對的第一以及第二面所規(guī)定，而且將所述第一以及第二面的相對距離設(shè)定為45μm以下。
2.如權(quán)利要求1所述的薄型分析用具，其特征在于具有以互相相對的狀態(tài)隔開間隔而配置的、并規(guī)定所述反應(yīng)空間的第一以及第二板材，所述第一以及第二面是沿著與所述第一以及第二板材的厚度方向垂直的方向而擴(kuò)展的面。
3.如權(quán)利要求2所述的薄型分析用具，其特征在于還具有第一以及第二電極，被設(shè)置在所述第一板材的一面上、并且至少一部分鄰接所述反應(yīng)空間，同時(shí)，用于向試料液施加電壓而被利用，所述相對距離是從所述第一或者第二電極的上面到所述第二板材的與該電極的上面相對部分的最小距離。
4.如權(quán)利要求3所述的薄型分析用具，其特征在于所述相對距離在25～45μm的范圍內(nèi)。
5.如權(quán)利要求2所述的薄型分析用具，其特征在于還具有設(shè)置在所述第一板材上的第一電極，以及以與所述第一電極相對的方式而被設(shè)置在所述第二板材上、并用于與所述第一電極一起向試料液施加電壓而被利用的第二電極，所述相對距離為所述第一電極與所述第二電極之間的最小距離。
6.如權(quán)利要求5所述的薄型分析用具，其特征在于所述相對距離在25～45μm的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1所述的薄型分析用具，其特征在于所述反應(yīng)空間構(gòu)成為通過毛細(xì)管力來使試料移動(dòng)。
8.如權(quán)利要求1所述的薄型分析用具，其特征在于所述試藥部包含電子傳遞物質(zhì)以及氧化還原酶。
9.如權(quán)利要求8所述的薄型分析用具，其特征在于所述電子傳遞物質(zhì)為Ru化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的薄型分析用具，其特征在于所述Ru化合物是以下述化學(xué)式(1)所表示的物質(zhì)[Ru(NH3)5X]n+……(1)，在所述化學(xué)式(1)中，X為NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺或者H2O，n+表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)絡(luò)合體的價(jià)數(shù)。
11.如權(quán)利要求10所述的薄型分析用具，其特征在于所述化學(xué)式(1)的X為NH3或者鹵離子。
12.如權(quán)利要求8所述的薄型分析用具，其特征在于所述氧化還原酶具有葡萄糖脫氫活性。
13.如權(quán)利要求12所述的薄型分析用具，其特征在于所述氧化還原酶是來源于屬于伯克霍爾德菌屬的微生物的葡萄糖脫氫酶。
14.如權(quán)利要求13所述的薄型分析用具，其特征在于所述氧化還原酶具有葡萄糖脫氫活性，而且具有在還原條件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝膠電泳的分子量約為60kDa的α輔助單元。
15.如權(quán)利要求14所述的薄型分析用具，其特征在于所述氧化還原酶具有在所述還原條件下的SDS-聚丙烯酰酸胺凝膠電泳的分子量約為43kDa的細(xì)胞色素C。
16.如權(quán)利要求8所述的薄型分析用具，其特征在于所述電子傳遞物質(zhì)是Ru化合物，所述氧化還原酶是來源于屬于伯克霍爾德菌屬的微生物的葡萄糖脫氫酶。
17.如權(quán)利要求16所述的薄型分析用具，其特征在于所述Ru化合物是以下述化學(xué)式(2)所表示的物質(zhì)，所述氧化還原酶具有葡萄糖脫氫活性，而且具有在還原條件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝膠電泳的分子量約為60kDa的α輔助單元，以及在所述還原條件下的SDS-聚丙烯酰酸胺凝膠電泳的分子量約為43kDa的細(xì)胞色素C，[Ru(NH3)5X]n+……(2)，在化學(xué)式(2)中的X為NH3、鹵離子、CN、吡啶、煙酰胺、或者H2O，n+表示由X的種類所決定的氧化型Ru(III)絡(luò)合體的價(jià)數(shù)。
18.如權(quán)利要求1所述的薄型分析用具，其特征在于使用血液、尿、唾液或者它們的調(diào)整液等的生化試料液作為試料液，構(gòu)成為能夠分析葡萄糖、膽固醇、乳酸或者抗壞血酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種配置有試藥部(33)而且具備有用于保持試料液的反應(yīng)空間(6)的分析用具(1)。試藥部(33)構(gòu)成為在所述反應(yīng)空間(6)內(nèi)保持試料液時(shí)溶解。反應(yīng)空間(6)的一部分被互相相對的第一以及第二面(31c、5a)所規(guī)定，而且將所述第一以及第二面(31c、5a)的相對距離(H1)設(shè)定在45μm以下。相對距離(H1)例如被定為從所述第一或者第二電極(31、32)的上面(31c、32c)到所述第二板材(5)的與該電極(31、32)的上面(31c、32c)相對的部分(5a)為止的最小距離。
文檔編號(hào)C12M1/34GK1729394SQ20038010693
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者山岡秀亮 申請人:愛科來株式會(huì)社