專利名稱：檢測和計(jì)數(shù)樣品中微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和計(jì)數(shù)樣品中微生物的方法以及用于所探尋微生物的選擇性富集培養(yǎng)基。
本發(fā)明用于微生物如單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmoella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium paratuberculosis)，和侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophilla)的檢測。優(yōu)選通過許多種樣品如食品、固體、液體、植物、動(dòng)物等樣品以及來自動(dòng)物尤其是人組織樣品的流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)來進(jìn)行該檢測。
微生物污染對食品加工工業(yè)是主要的利害因素，因?yàn)槲廴究梢詫?dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)品降解并耽擱了等待所需質(zhì)量分析的庫存的運(yùn)輸。微生物分析所要求的標(biāo)準(zhǔn)涉及兩個(gè)方面。首先，必須盡可能早地監(jiān)控污染狀態(tài)，因此需要高度靈敏和差別懸殊的分析方法。其次，這些方法必須是快速的以致成批產(chǎn)品可以按時(shí)間表輸送，且它們必須使預(yù)言性的微生物分析成為可能。
如果要避免銷售產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)，快速判據(jù)是決定性的。傳統(tǒng)分析技術(shù)總是需要培養(yǎng)步驟，其相對于高效率的食品加工需要是冗長的。此外，傳統(tǒng)分析不考慮已經(jīng)失去繁殖能力的細(xì)菌，即使這樣的細(xì)菌如果將其暴露于特定條件下如提高食物鏈中一些點(diǎn)不充分的必須冷凍的溫度在或當(dāng)穿過消費(fèi)者的生物體時(shí)保留著能夠復(fù)活的代謝活性。
此外，在環(huán)境中，用于技術(shù)上的或飲用水的快速和靈敏的微生物分析方法是決定性標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@些水源可以直接(在飲用水的情況中)或通過環(huán)境污染間接(如空調(diào)系統(tǒng)中的軍團(tuán)菌和接觸食品表面的污染)地傳染人。
在微生物檢測和計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)微生物技術(shù)中，廣泛使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)。
培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)方法是常規(guī)手段，通過其計(jì)算微生物數(shù)量。生長和分化是這種用于尋找有生存能力細(xì)菌的微生物分析方法的基礎(chǔ)。在這種情況下，可培養(yǎng)性和生存能力相關(guān)。實(shí)際上，可培養(yǎng)性定義為單個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面引起可觀察的或可見數(shù)量的能力。
該技術(shù)已經(jīng)使用了數(shù)十年，并顯示了其自身以相對低的成本對保護(hù)人類健康的有效性。近年來，已經(jīng)引入關(guān)于培養(yǎng)基(顯色培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基制備的自動(dòng)化、培養(yǎng)基中地面取樣的稀釋、以及培養(yǎng)皿上菌落擴(kuò)展和計(jì)數(shù)的許多新方法(Garcia-Armesto等，1993)。然而，傳統(tǒng)技術(shù)在兩個(gè)方面仍然是弱勢的。首先，由于細(xì)菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上生長的基本需求，它們不是非常靈敏，上述培養(yǎng)基根據(jù)所測試的食品對于細(xì)菌選擇性生長的有效性是易變地。其次，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)需要所探尋的細(xì)菌處于最佳生理狀態(tài)以致能夠在選擇性培養(yǎng)基上生長。然而，通過傳統(tǒng)微生物技術(shù)即通過在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)在后來經(jīng)常不能檢測到起初存在于樣品中的細(xì)菌。這可以從兩方面來解釋作為極端緊張狀態(tài)(熱休克或滲透壓休克，營養(yǎng)缺失，等等)的結(jié)果細(xì)菌死亡或它們失去了在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中繁殖的能力并因此認(rèn)為其是有活力的但是非可培養(yǎng)的細(xì)菌(Barer等，1999)。因此重要的是能夠檢測樣品中的這些細(xì)菌。
最近已經(jīng)顯示了細(xì)菌的數(shù)個(gè)可培養(yǎng)種，當(dāng)它們受到營養(yǎng)缺失或另一個(gè)物理緊張狀態(tài)(熱、氫，等等)時(shí)可以進(jìn)入細(xì)胞存活狀態(tài)，在該過程中它們通過可培養(yǎng)測試(例如通過培養(yǎng)皿培養(yǎng))是不能檢測的。
這就是為什么發(fā)展了DNA擴(kuò)增技術(shù)，其對于所探尋的微生物給予了較高的特異性，且其是可自動(dòng)化的。這些技術(shù)包括微生物特異性核苷酸序列的檢測(基因擴(kuò)增后)。然而，該方法仍然不能夠使計(jì)數(shù)樣品中微生物成為可能。
就特異性而言，基因探針(DNA、RNA、PNA、分子信標(biāo)，等等)是使用熒光抗體的替換方案。這些探針必須使用熒光染料來標(biāo)記，并和所研究的細(xì)胞雜交，而后者沒有預(yù)先溶解這是原位雜交。在這種情況下，使用的探針對抗16S或23S PARN，其可以同時(shí)確保檢測的特異性和增強(qiáng)連接該細(xì)胞RNA復(fù)本數(shù)目的信號(hào)(Moter等，2000)。
其它技術(shù)，如免疫學(xué)方法(包括ELISA)，包括通過發(fā)光或熒光檢測微生物抗原的抗體。即使這些方法是容易自動(dòng)化的和靈敏的，由于它們不可能計(jì)數(shù)存在的微生物，它們提供了有限的信息。此外，有時(shí)候這些方法關(guān)于它們的特異性存在不足，因?yàn)槭褂玫目贵w可能存在于有限的微生物抗原識(shí)別范圍內(nèi)(Tortorello等，1994)。
不管使用何種方法，為了獲得合意的靈敏度和特異性它們都需要所探尋的細(xì)菌經(jīng)歷富集階段。
細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，其中流式細(xì)胞術(shù)是一個(gè)實(shí)例，存在的優(yōu)勢是允許直接檢測預(yù)先用熒光分子標(biāo)記的細(xì)菌。此外，該標(biāo)記可以顯示細(xì)菌的生存能力。使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的檢測是直接的、定量的，且僅需幾分鐘。
流式細(xì)胞術(shù)，通過其對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)成功的應(yīng)用，將其很好地定位至適于高產(chǎn)量的微生物分析(Alvarez-Barrientos等，2000；Davey等，1996)。流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)特征之一是可以在少于24或48小時(shí)分析通過特定生長特征所限定的群體(44℃的糞便大腸菌(fecalcoliform)，嗜冷菌群)，其在選擇性肉湯中富集后可以通過流式細(xì)胞術(shù)直接檢測，而不用等待其在特異性培養(yǎng)基中生長。
過去幾年中，許多用于真核細(xì)胞分析的商業(yè)細(xì)胞計(jì)數(shù)器已經(jīng)得到了發(fā)展，但是其不適于微生物的檢測。然而，光電倍增管的發(fā)展、激光的引入，以及光學(xué)系統(tǒng)的改良(聚焦、石英分析細(xì)胞)使今天大多數(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)器能夠定量細(xì)菌和病毒成為可能(Salzman等，1982，Steen等，1986)。最顯著的進(jìn)步包括測量所分析的真核或原核細(xì)胞大小的能力，首先通過光電二極管然后通過光電倍增管。因此，現(xiàn)在可以選擇限定大小的細(xì)胞群體(例如微生物)用于分析其發(fā)出的熒光。因此創(chuàng)造的分析窗口可以將細(xì)胞計(jì)數(shù)器的分析能力集中于預(yù)定事件上，其依次可以獲得微生物發(fā)出的熒光信號(hào)和基體背景干擾之間的可靠差別。
使用的熒光標(biāo)記普遍地標(biāo)記微生物群體且具有寬的作用范圍。這些包括DNA嵌入劑以及用于細(xì)菌膜電位或呼吸能力的標(biāo)記(Lopez-Amoros等，1995；Crepori等，2001)。細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的大小和顆粒團(tuán)的測定可以結(jié)合熒光信號(hào)。目前通過流式細(xì)胞術(shù)使用熒光分子來檢測有活力的微生物是公知的(Davey等，1996；Nebe-von Caron等，1995)。原理是檢測存在于所有微生物中的酶活性。在所有情況中，這些活性是非常寬范圍的并對細(xì)胞存活是必需的。文獻(xiàn)所述的多個(gè)實(shí)例中，最相關(guān)的包括總體顯示酯酶活性的底物，如熒光素二乙酸酯(FDA)或其同系物羧基熒光素二乙酸酯(CFDA)(Breeuwer等，1995)。
Drocourt等(FR2764305)描述了標(biāo)記(FDA和CFDA)復(fù)合樣品中所有有活力微生物的方法，基于酯酶活性的檢測，且尤其是使用對樣品自體熒光復(fù)染色的檢測。
Breeuwer等(WO05/00660)描述了使用熒光標(biāo)記測量樣品中微生物活力的方法。該方法包括測量這些微生物所發(fā)出的熒光失去一半所需的時(shí)間。
Inoue等(EP1203825)使用聚次甲基來顯示微生物中亞硝酸根離子的還原活性。這是在所有細(xì)菌中可檢測的先驗(yàn)細(xì)胞活性。
Rocco等(WO00/34509)使用抗生素，在其上結(jié)合熒光分子來顯示微生物。
Fazzi等(WO00/067065)已經(jīng)發(fā)展了可以通過細(xì)菌的革蘭氏染色來區(qū)分它們的方法，通過使用吖啶橙和熒光素的混合物。通過流式細(xì)胞術(shù)來完成標(biāo)記微生物群體的檢測。
Jespersen等(WO02/00036)也發(fā)展了革蘭氏染色方法，基于使用識(shí)別革蘭氏陽性細(xì)菌(細(xì)胞表面的聚糖結(jié)構(gòu))和革蘭氏陰性細(xì)菌(脂多糖的存在)之間結(jié)構(gòu)差異的分子。然而，該方法不可以測量細(xì)菌的活力。
Pyle等(WO95/31481)使用CTC作為用于微生物呼吸能力的指示劑分子。該檢測是聯(lián)合免疫磁性富集和/或使用熒光素標(biāo)記抗體的免疫學(xué)檢測。
然而，顯示上述活力的熒光標(biāo)記具有太寬的范圍以致不能提供檢測特異性微生物所需的特異性。
分子生物技術(shù)(使用熒光標(biāo)記的核苷酸探針)和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合是相當(dāng)新的方法(Amann等，1995；Wallner等，1995)。
然而，即使該方法適于革蘭氏陰性微生物，為了特異性標(biāo)記革蘭氏陽性細(xì)菌仍然需要做工作。Vlieger等，(1992)，描述了使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測通過PCR擴(kuò)增的核酸，通過將上述片段雜交至珠子。
特別地，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)用于計(jì)數(shù)牛奶中的，以及包括肉、發(fā)酵奶、速凍蔬菜，或鮮奶制品中總的細(xì)菌或酵母。對于這些，使用了活力標(biāo)記(Breeuwer等，1995)。將可以通過流式細(xì)胞術(shù)分析的大小和結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)加入這個(gè)首要的選擇標(biāo)準(zhǔn)中。
在食品中更特別地涉及微生物(屬和種)尤其是致病性菌群如沙門氏菌、單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌、大腸桿菌0157H7、金黃色葡萄球菌，和流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)的檢測(McCelland等，1994；Iannelli等，1998；Pinder等，1994；Skjerve等，1990，1991；Tomayasu等，1998；Tortorello等，1998)。
用于鑒定細(xì)菌屬的最常見熒光標(biāo)記仍然是抗生素，對于其規(guī)程是多樣和可變的，但是如果直接使用于食品中其不是非常靈敏。實(shí)際上，由于基質(zhì)和內(nèi)生菌群中高水平背景干擾的存在，食品樣品中小量細(xì)胞活動(dòng)的計(jì)數(shù)是困難的，并因?yàn)檫x擇合適的熒光標(biāo)記來獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)不是無價(jià)值的。因此，建議使用多個(gè)熒光標(biāo)記(抗生素、化學(xué)計(jì)量的探針、DNA嵌入劑、酶底物，等等)來鑒別熒光細(xì)菌和不同細(xì)菌種之間的粒子。
為了提高細(xì)菌屬和種的檢測，已經(jīng)成功使用免疫磁性分離來分離復(fù)合食品基質(zhì)中的致病性微生物。兩個(gè)公司，Dynal(挪威，奧斯陸)和Vicam(美國，沃特敦)，銷售磁性珠子，其上結(jié)合了識(shí)別致病性細(xì)菌的抗體。然而，常規(guī)應(yīng)用在用選擇性富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍然需要分布于培養(yǎng)皿上，且由于所用抗體缺少選擇性或天然菌群和磁性珠子載體的非特異性相互作用，有時(shí)必需需要進(jìn)行確認(rèn)測試(Tomayasu等，1998)。例如，其識(shí)別的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株可以非特異性地吸收至磁性珠子表面且該吸收能力依賴于弧菌(Vibrio)菌株的同一性。對這些順磁性珠子的結(jié)構(gòu)改良包括將珠子密封入與培養(yǎng)基較少反應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中(膠囊化的毫微珠子，Estapor)。
免疫磁性分離已經(jīng)顯示了從液體回收真核細(xì)胞和從各種各樣的如食品、牛奶，和排泄物樣品中分離微生物的有效性(Grant等，1998；Skjerve等，1990，1991，Pinder等，1994；Seo等，1998)。在其表面上存在對抗膜表面抗原的抗體的順磁性珠子是可購得的。它們可以濃縮復(fù)合樣品中的細(xì)菌并提高隨后技術(shù)如PCR、核酸探針雜交、免疫熒光，和流式細(xì)胞術(shù)的靈敏度。通過分離管壁上的細(xì)菌-珠子結(jié)合物來進(jìn)行的免疫濃縮可以同時(shí)除去存在于樣品中的抑制劑。此外，其構(gòu)成了選擇階段。
免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的使用對特異性問題反應(yīng)良好。對食品中致病性細(xì)菌的免疫學(xué)特性已經(jīng)知道了一段時(shí)間并廣泛用于快速檢測測試中。這些特異性FITC標(biāo)記的抗體已經(jīng)用于標(biāo)記加入牛奶和雞蛋樣品中的和來自污染雞畜體洗滌水的沙門氏菌(McClelland等，1994)。免疫熒光和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)合作使用也已經(jīng)應(yīng)用至檢測消除肉天然菌群后人為污染的肉樣品中的大腸桿菌0157H7(Seo等，1998)。
然而，所有的情況中，分析之前需要預(yù)處理(化學(xué)或免疫分離)樣品且檢測極限不能低于10000個(gè)細(xì)胞每克產(chǎn)品，其對于檢測食品中致病性細(xì)菌的需要太高了。
Forrest等，1979，(US4,141,687)和Ithakissios等，1978，(US4,115,534)描述了磁性顆粒的合成，當(dāng)其和識(shí)別分子結(jié)合時(shí)可以通過使用磁場從復(fù)雜混合物中提取真核和原核細(xì)胞。
Coulter Electronics(UK1,561,042)描述了使用流式細(xì)胞術(shù)來分離和分析與這些珠子連接的顆粒和細(xì)胞。
Pinder等(WO98/20214)已經(jīng)發(fā)展了尺寸小于1微米(100nm是優(yōu)選大小)的熒光磁性珠子。
這樣的珠子用于提取和標(biāo)記微生物的重要性在于其極小。為了使用流式細(xì)胞術(shù)檢測微生物不需要從微生物分離上述珠子。
Pyle等(WO95/31481)使用磁性珠子從復(fù)合樣品中濃縮細(xì)菌。然后用熒光抗體(例如熒光素)將這些細(xì)菌標(biāo)記成綠色并通過在細(xì)胞中誘導(dǎo)紅色熒光的CTC(氰基四唑氯)來檢測細(xì)胞的呼吸能力；使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。
Senyal等(EP/0016552)已經(jīng)將磁性珠子和可以連接大量抗體的蛋白質(zhì)A結(jié)合，以隨后回收表面帶有連接抗體的細(xì)胞。
Vesey等，(WO96/31777)使用流式細(xì)胞術(shù)來分析復(fù)合物，復(fù)合物由乳膠珠子通過熒光抗體介質(zhì)粘著微生物而形成。他們描述了使用熒光抗體來標(biāo)記已經(jīng)從樣品中免疫磁性提取的微生物。
Fortin等，(WO99/47933)使用0.08至0.5微米大小的乳膠珠子，其結(jié)合了細(xì)胞識(shí)別抗體。根據(jù)大小和結(jié)構(gòu)特性，因此形成通過流式細(xì)胞術(shù)可觀察的復(fù)合物。
還可以通過檢測特異性的酶活性或通過使用發(fā)色的或熒光底物來進(jìn)行樣品中微生物的檢測。Manafi(2000)的評論是基于微生物中特定酶活性的存在或缺失來鑒定微生物所用策略的相當(dāng)完整的更新。分叉式檢索表的原理是通過酯酶(其只水解限定脂肪鏈長度的脂肪酸)、糖苷酶(各種糖的水解)、磷酸酯酶，和硫酸酯酶表現(xiàn)的特定活性。使用的底物包括一個(gè)目標(biāo)部分和標(biāo)記部分，目標(biāo)部分是通過所探尋酶識(shí)別的。當(dāng)該標(biāo)記部分連接目標(biāo)時(shí)，其只在目標(biāo)-標(biāo)記銜接物水解后發(fā)出可見的信號(hào)(產(chǎn)色的或熒光的)。這些代謝活性使用最廣泛的顯示方法包括將這些底物加入培養(yǎng)基中。當(dāng)通過菌落中微生物同化時(shí)，底物給予了菌落有區(qū)別的顏色。選擇性培養(yǎng)基和底物(每個(gè)培養(yǎng)基一種或多種)的結(jié)合通過觀察細(xì)菌的形式和顏色可以獲得所探尋微生物的精確鑒定。
因此，使得菌落在發(fā)色培養(yǎng)基上變色，底物必須排出菌落內(nèi)的微生物體外。
Schbert等(WO99/48899)描述了用于熒光底物的合成途徑(在UV激發(fā)下)，其通過磷酸酯酶C可以顯示特異性磷酰基肌醇活性。該底物(其具有4-甲基傘形酮作為其熒光分子)用于可以鑒定單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的兩個(gè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)中。然而，該底物對于細(xì)菌屬的特異性不足以用于本發(fā)明的范圍中。
Conrad等，(WO00/03034)發(fā)展了七葉苷作為熒光分子的熒光底物。沒有描述使用這些底物來鑒定微生物的檢測方法和精確性。
Berg等(US5,292,644)描述了使用4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶，其通過UV光(λexc＝365nm)是可激發(fā)的，用于檢測細(xì)菌中的半乳糖苷酶活性，而與這些微生物是在液體或固體培養(yǎng)基中生長無關(guān)。從外部培養(yǎng)基中沉淀后通過UV光激發(fā)甲基傘形酮來進(jìn)行檢測。
Nelis等(WO98/13515)描述了UV激發(fā)后發(fā)色或熒光底物的使用，其可以證明微生物中β-D-半乳糖苷酶或β-D-葡萄糖醛酸酶活性。當(dāng)它們標(biāo)記于固體培養(yǎng)基上或保留于濾器上時(shí)，所描述的技術(shù)限于上述微生物的檢測。
Rambach Alain(WO00/53799)使用葡萄糖和磷酸鹽底物結(jié)合發(fā)色分子來檢測含有去鐵胺的特定培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌。該檢測是基于觀察已經(jīng)通過菌落內(nèi)部細(xì)菌排出的細(xì)菌菌落中的發(fā)色化合物。金黃色葡萄球菌的鑒定是基于觀察磷酸酯酶和葡糖醛酸酶的酶作用引起的發(fā)色化合物。
Cooke等(WO00/41409)使用上述微生物辛酸酯(octanoate)-酯酶(或辛酸酯(caprylate)-酯酶)活性特異性的發(fā)色底物來特異性標(biāo)記沙門氏菌。使用辛酸酯-酯酶作為沙門氏菌的鑒定方式已經(jīng)描述了好多年(Humbert等，1989)且當(dāng)結(jié)合固體培養(yǎng)基使用時(shí)顯示了極小的效能。Cooke等的專利申請中，為了獲得更高的特異性將可以檢測β-D-半乳糖苷酶的底物加入培養(yǎng)基中。
本發(fā)明打算通過在顯著改進(jìn)時(shí)間和特異性條件下提供檢測和讀數(shù)或計(jì)數(shù)固體或液體培養(yǎng)基中微生物的方法來改善現(xiàn)有技術(shù)的不便之處。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以進(jìn)行食品加工來源的樣品，如肉制品、蛋制品、水、包括牛奶的奶制品、果汁、農(nóng)作物產(chǎn)品及其衍生物，以及動(dòng)物來源包括人來源的樣品，如所有類型的組織、排泄物和血液中的微生物探尋。
本發(fā)明的方法特別包括對樣品中所探尋的微生物是選擇性和特異性的三個(gè)步驟，即所述微生物的選擇性富集，上述微生物在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的活化，和上述微生物的熒光標(biāo)記。
事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明的樣品中微生物檢測和讀數(shù)或計(jì)數(shù)方法包括五個(gè)步驟，其肯定是相互伴隨的且根據(jù)所探尋的微生物可以改變其順序。
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法包括步驟a)選擇性地富集樣品中所探尋的微生物，b)調(diào)控上述微生物，c)免疫磁性地濃縮調(diào)控的微生物，
d)熒光標(biāo)記濃縮的微生物，和e)檢測和分析熒光。
本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏的微生物檢測方法的靈敏度和特異性。根據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得非常低的檢測極限，大約10至100個(gè)微生物每克樣品，其所說的極限比現(xiàn)有技術(shù)的那些低100至1000倍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是可以在少于24小時(shí)內(nèi)檢測微生物，尤其是通過少于18小時(shí)的所探尋微生物的富集和調(diào)控步驟，少于3小時(shí)的熒光標(biāo)記，和幾分鐘內(nèi)的流式細(xì)胞術(shù)檢測而獲得的。
根據(jù)本發(fā)明方法的第一步是樣品中所探尋微生物的選擇性富集步驟，該步驟具有雙重目的。例如，該步驟不僅可以使上述微生物繁殖還可以在上述微生物受到脅迫的情況下使上述微生物復(fù)活。該富集步驟在含有適于所探尋微生物生長營養(yǎng)素的組合物中進(jìn)行8至15小時(shí)。該組合物還含有用于破壞存在于樣品中的氧活性菌種以及抗氧化劑的試劑。
該組合物還用于恢復(fù)和保存微生物的活力，該微生物的可培養(yǎng)性標(biāo)準(zhǔn)是無論出于什么原因的暫時(shí)丟失，例如脅迫如加熱處理后。
這樣步驟的意義是為了將它們包括于樣品分析中然后能夠檢測和計(jì)數(shù)所述的微生物。這是重要的，因?yàn)檫@樣的微生物在特定事件如溫度改變后是容易活化的，因此這些微生物可以成為消費(fèi)者健康的危險(xiǎn)物或可以引起對上述樣品污染或感染水平的估計(jì)不足。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，樣品中所探尋微生物的選擇性富集步驟中所用的組合物包括-濃度為1至20g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選1至10g/L，更優(yōu)選4至6g/L，-濃度為0.5至5g/L的硫代硫酸鈉，優(yōu)選0.5至3g/L，甚至更優(yōu)選約2g/L，-濃度為500至20000u/L的過氧化氫酶，優(yōu)選2000至8000u/L，甚至更優(yōu)選約5000u/L。
上述組合物除了達(dá)到所提及的兩個(gè)目的以外，如果根據(jù)樣品或上述微生物包括這樣的步驟，破壞所探尋微生物的競爭菌群也是可能的。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物此外可以包括至少一種抗微生物劑。
“抗微生物”劑或“選擇性試劑”意思是能夠破壞或抑制所探尋微生物競爭菌群的所有化合物。強(qiáng)調(diào)的是上述抗微生物或選擇性試劑可以是抗生素。
當(dāng)然，因此使用的抗微生物制劑(包括至少一種抗微生物劑)對所探尋微生物是特異性的。
事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明方法的后續(xù)步驟之一包括通過熒光檢測所探尋微生物的至少一種特異性活性，并因此上述熒光必須是限于所探尋的活性。
此外，抗微生物劑可以起改變目標(biāo)微生物膜完整性和因此可測量參數(shù)如膜電勢、氧化還原電勢，、或脫氫酶活性的作用。例如，用于選擇李司忒氏菌的抗微生物劑至少包括多粘菌素B、氧氟沙星、兩性霉素B、5-氟代胞嘧啶，以及氯化鋰。用于沙門氏菌的選擇性試劑包括煌綠和磺胺吡啶。用于金黃色葡萄球菌的選擇性試劑包括甘氨酸、氯化鋰，和去鐵胺。通過膽汁鹽獲得大腸桿菌的選擇。用于鳥分枝桿菌桿菌副結(jié)核亞種的選擇性試劑包括鹽酸萬古霉素和萘啶酮酸。用于侵肺軍團(tuán)菌的選擇性抗生素包括多粘菌素B、萬古霉素和放線菌酮混合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法“調(diào)控”樣品中所探尋微生物的意思是“誘導(dǎo)”或“激活”上述微生物的至少一種特異性活性或特征。該步驟是重要的且可以用來用熒光標(biāo)記檢測所述特異性活性或特征。
例如，所探尋微生物的調(diào)控包括所探尋微生物酶活性的誘導(dǎo)，其是通過將上述酶特異性的非熒光底物添加至微生物富集培養(yǎng)基中。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是調(diào)控可以包括一種或數(shù)種酶活性的誘導(dǎo)。
例如，對所探尋酶特異性的非熒光底物是異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷和蜜二糖-甲基-β-D-半乳糖吡喃糖苷來激活β-D-半乳糖苷酶；甲基-α-D-半乳糖吡喃糖苷用于誘導(dǎo)半乳糖苷酶；對-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸，異丙醇β-葡糖苷酸，或甲基β-D-葡糖苷酸鈉鹽用于誘導(dǎo)葡糖醛酸酶；甲基-β-D-葡糖苷、纖維二糖，和水楊苷用于誘導(dǎo)β-D-葡糖苷酶；甲基-辛酸酯用于誘導(dǎo)辛酸酯酶；4-硝基苯基-棕櫚酸酯和甲基-棕櫚酸酯用于誘導(dǎo)棕櫚酸酯酶；以及2-甲基-丙酸用于誘導(dǎo)丙酸酯酶。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中和包括誘導(dǎo)所探尋微生物至少一種特異性酶活性的調(diào)控情況中，本發(fā)明的步驟a)和步驟b)可以同時(shí)進(jìn)行。這樣，可以提高分析的靈敏度和速度。在這種情況下，同時(shí)進(jìn)行這兩個(gè)階段的總過程為6h至48h，優(yōu)選12h至24h，更優(yōu)選為15h至18h。
在樣品中所探尋微生物是革蘭氏陽性細(xì)菌的情況下，調(diào)控步驟還可以包括誘導(dǎo)上述微生物特異性的或特有的至少一種表面抗原的步驟，包括將濃度為5至50g/L的酵母提取物加入微生物的富集培養(yǎng)基中，優(yōu)選10至20g/L，更優(yōu)選約為10g/L。
在所探尋微生物是革蘭氏陽性細(xì)菌的情況下，還通過如下事實(shí)來解釋除了酶的誘導(dǎo)以外的至少一種表面抗原的誘導(dǎo)，即通過現(xiàn)有技術(shù)使用對抗細(xì)胞膜抗原或細(xì)胞壁抗原的抗體來進(jìn)行免疫磁性分選是可能的。在這些典型的培養(yǎng)條件下，革蘭氏陽性細(xì)菌合成外多糖莢膜來免于外部侵襲，其可以遮掩細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，因此致使它們不能夠接近抗體。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，這是為什么通過將酵母提取物加入富集培養(yǎng)基中來抑制該莢膜合成的原因，因此激活了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜抗原的表達(dá)，因此致使它們接近抗體。
所探尋微生物的免疫磁性濃縮步驟是從調(diào)控培養(yǎng)基進(jìn)行的。通過抗原-抗體反應(yīng)的免疫濃縮包括從條件調(diào)控培養(yǎng)基中濃縮上述微生物。
和磁性珠子結(jié)合并放置于與所探尋微生物接觸的抗體，是對抗上述微生物特異性抗原的。接著，將微生物-抗體-珠子復(fù)合體從培養(yǎng)基中分離然后將微生物從剩下的復(fù)合物中分離。
可以根據(jù)制造商的介紹用Dynabeads牌珠子來進(jìn)行該免疫磁性濃縮步驟，除了樣品體積是兩倍。還可以用共價(jià)連接至對抗兔抗體(主要)的抗體(次要)的珠子來進(jìn)行反應(yīng)(Dynabeads MP-280綿羊抗兔IgG)。
作為例子，所用的規(guī)程如下樣品體積1至50ml，優(yōu)選1至5ml，優(yōu)選2ml，在室溫下與1至250μg，優(yōu)選1至50μg，更優(yōu)選10μg對抗所探尋細(xì)菌的抗體接觸30分鐘。Dynabeads牌珠子(李司忒氏菌、沙門氏菌，等等)的量為1×106個(gè)至250×106，優(yōu)選10×106至20×106，優(yōu)選10×106，預(yù)先用0.1％PBS(14190-094，Invitrogen SARL)/BSA(ID-BIOSA)洗滌，將其加入并將所有成分在連續(xù)輕度攪拌下一起室溫培養(yǎng)30分鐘。使用磁性顆粒濃縮器(MPC-E，Dynal Biotech SA，或任何其他的磁性分選裝置)，通過除去殘余液體回收微管上的珠子。用大量PBS洗滌珠子然后使用顆粒濃縮器再次回收。
當(dāng)完成免疫濃縮反應(yīng)時(shí)，將珠子回收于225μl PBS中。然后從珠子上分離細(xì)菌。然后將磁性濃縮器用來除去珠子，且將含有濃縮細(xì)菌的分離上清液回收于5ml管中用于熒光標(biāo)記反應(yīng)。
免疫濃縮步驟，除了濃縮所關(guān)心細(xì)菌的事實(shí)以外，還因此提高了檢測靈敏度10倍，使得無論選擇性要素如何，都可以消除能夠在富集培養(yǎng)基或調(diào)控培養(yǎng)基中發(fā)展的細(xì)菌。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，和磁性珠子結(jié)合的抗體對抗所探尋微生物特異性的抗原。換句話說，通過將所探尋微生物與對抗對該微生物特異性抗原的稱為“主要”的抗體接觸來進(jìn)行第一個(gè)抗原-抗體反應(yīng)，并通過將“主要”抗體與稱為“次要”抗體接觸來進(jìn)行第二個(gè)抗原-抗體反應(yīng)，“次要”抗體與磁性珠子結(jié)合并對抗上述主要抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，磁性珠子的直徑為1至20μm，優(yōu)選2至8μm。更優(yōu)選，所示實(shí)施例中所用的珠子直徑為2.8μm或4.5μm。
本發(fā)明中所用珠子的大小是重要的，因?yàn)槠淇梢愿行У貜膹?fù)合培養(yǎng)基中提取細(xì)菌?，F(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)使用了比本發(fā)明所述那些小得多的珠子(納米珠)，但是發(fā)明者已經(jīng)表明了這些引起了太大的背景干擾，其不可能清楚地從培養(yǎng)基其他元素中分辨出微生物。
優(yōu)選在免疫磁性濃縮后獲得的所探尋微生物的熒光標(biāo)記是通過將至少一種底物加入含有上述微生物培養(yǎng)基中來進(jìn)行的，該底物包括一個(gè)對所示酶活性特異性的部分和一個(gè)標(biāo)記部分。
通過這些底物的選擇，根據(jù)微生物是否利用了它們，可以區(qū)分和表征所給微生物屬的種或亞種。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記部分包括在488nm激發(fā)的熒光標(biāo)記，其選自呫噸、吖啶、藻膽蛋白、花青、或七葉苷。
在呫噸中，對于以下所給的實(shí)施例，熒光素和熒光素衍生物，以及若丹明是可以作為更優(yōu)選的。在藻膽蛋白中，藻紅蛋白是十分優(yōu)選的。
在使用數(shù)種底物的情況中，每個(gè)可以包括相互不同的標(biāo)記部分，這樣，例如，可以表達(dá)熒光的數(shù)種顏色。
在本發(fā)明的范圍中，重要的是細(xì)菌內(nèi)部發(fā)生的底物轉(zhuǎn)化且熒光產(chǎn)物保留在細(xì)胞中。
或者，如果通過加入15％異丙醇并在37℃培養(yǎng)15分鐘細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)暫時(shí)滲透性。
熒光標(biāo)記的選擇是基于它們保留在細(xì)胞內(nèi)部的能力。例如，在細(xì)胞內(nèi)酶作用將這些自由熒光產(chǎn)物固定于細(xì)胞中后，熒光素的羧化、胺化，和五氟苯甲酰化形式尤其能很好地保留于細(xì)胞中(Haugland，1995)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對所指的酶活性特異性的底物部分包括脂肪酸、單糖、磷酸酯、肽和/或硫酸酯。
由2至20個(gè)碳原子長度的碳鏈來表征脂肪酸。優(yōu)選地，底物選自熒光素-二-辛酸酯、熒光素-二-棕櫚酸酯、熒光素-二-二丁酸酯、熒光素-二-二己酸酯、熒光素-二-二月桂酸酯、熒光素-二-丙酸酯，或5(6)-羧基-二氯-熒光素-二醋酸酯。
糖類化合物是戊糖或葡糖醛酸。優(yōu)選地，底物選自熒光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷、熒光素-α-D-吡喃半乳糖苷、熒光素-二-β-D-吡喃葡糖苷、熒光素-二-β-D-單吡喃糖苷、熒光素-二-β-D-巖藻糖苷、熒光素-二-β-D-N-乙酰氨基半乳糖苷、熒光素-二-β-D-N-乙酰氨基葡糖苷，和熒光素-二-β-D-木糖苷。
優(yōu)選地，肽底物是結(jié)合若丹明110的氨基酸鏈(1至10個(gè)氨基酸)。
優(yōu)選地，磷酸酯和硫酸酯底物各自是熒光素-二磷酸酯和熒光素-二硫酸酯。
優(yōu)選地，將可以檢測酯酶、糖苷酶(osidase)、磷酸酯酶、肽酶，或硫酸酯酶活性的熒光底物以0.1μM至1mM的濃度加入調(diào)控培養(yǎng)基中，優(yōu)選1μM至100μM。
作為實(shí)例，以下底物是特別合乎需要的-5，6-羧基-二氯-熒光素-二醋酸酯來顯示單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的強(qiáng)酯酶活性并用于該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的酸性條件；-5-(五氟苯甲酰氨基)熒光素或熒光素-二-β-D-吡喃葡糖苷來顯示單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的β-D-糖苷活性；上述活性在單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌中得到增強(qiáng)，優(yōu)選將濃度為1至10mM的水楊苷底物加入調(diào)控培養(yǎng)基中；-熒光素-二丙酸酯來顯示單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的丙酸酯酶活性；優(yōu)選通過將1至10mM濃度的2-甲基-丙酸加入調(diào)控培養(yǎng)基中進(jìn)行該酶的誘導(dǎo)；-熒光素二磷酸酯作為金黃色葡萄球菌的堿性磷酸酯酶活性的指示劑；通過將0.3％的無機(jī)磷酸鹽加入調(diào)控培養(yǎng)基中來進(jìn)行非金黃色葡萄球菌中酶的抑制；-熒光素-二-β-D-葡糖醛酸或5-(五氟苯甲酰氨基)熒光素-二-β-D-葡糖醛酸作為大腸桿菌中葡糖醛酸酶的指示劑；通過將1至10mM的4-硝基苯基β-D-葡糖苷酸加入條件培養(yǎng)基中來進(jìn)行微生物中的酶誘導(dǎo)；-熒光素-二-棕櫚酸鹽或5-(6)羧基熒光素-二-棕櫚酸鹽作為棕櫚酸酯酶的指示劑；通過將1至10mM的4-硝基苯基棕櫚酸鹽或甲基棕櫚酸鹽加入調(diào)控培養(yǎng)基中來進(jìn)行微生物中酶的誘導(dǎo)；-熒光素-二-辛酸鹽或5-(6)羧基熒光素-二-辛酸鹽作為沙門氏菌中辛酸酯酶的指示劑；通過將1至10mM甲基辛酸鹽加入調(diào)控培養(yǎng)基中來進(jìn)行微生物中的酶誘導(dǎo)。
取決于微生物，酶反應(yīng)可以在25至45℃之間不同的溫度下進(jìn)行，遠(yuǎn)離光并保持不超過1h。標(biāo)記反應(yīng)一完成，就將微生物保存于4℃來限制它們的生長且最重要的是防止標(biāo)記流出至微生物的外部。
此外，必須強(qiáng)調(diào)的是當(dāng)根據(jù)本發(fā)明方法的調(diào)控步驟包括誘導(dǎo)對所探尋微生物特異性的至少一種酶活性的步驟時(shí)，可以在進(jìn)行所述微生物調(diào)控步驟之前或微生物熒光標(biāo)記步驟之后進(jìn)行免疫磁性濃縮步驟。
換句話說，所探尋微生物的調(diào)控步驟可以在含有免疫磁性預(yù)先濃縮的上述微生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行。因此，熒光標(biāo)記將在調(diào)控步驟后進(jìn)行；但也可能的是在調(diào)控步驟之后立即進(jìn)行微生物地?zé)晒鈽?biāo)記步驟且微生物的免疫磁性濃縮只在上述熒光標(biāo)記后進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以讀數(shù)或計(jì)數(shù)所探尋微生物的檢測和分析通過選自以下的技術(shù)來進(jìn)行使用熒光顯微鏡的流式細(xì)胞術(shù)和過濾細(xì)胞計(jì)數(shù)，優(yōu)選流式細(xì)胞術(shù)。
作為根據(jù)本發(fā)明方法的最后步驟，已經(jīng)證明流式細(xì)胞術(shù)自身特別合乎需要，以便能夠產(chǎn)生可靠而快速的結(jié)果，也就是說24h內(nèi)，甚至12h內(nèi)。
微生物學(xué)領(lǐng)域中，最近已知流式細(xì)胞術(shù)具有數(shù)項(xiàng)改進(jìn)使用非特異性細(xì)胞標(biāo)記來計(jì)數(shù)總的微生物并使用結(jié)合熒光染料的特異性標(biāo)記(免疫球蛋白或基因標(biāo)記)來檢測和鑒定微生物(Robinson J.P.，1999)。
此外，該技術(shù)很好地應(yīng)用于上述不同類型的樣品中，而且應(yīng)用于獸醫(yī)診斷和環(huán)境分析中。
致病性微生物污染的動(dòng)物中，使用直接或間接的方法來顯示這些病原體的存在。直接方法包括通過在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)皿方法)來檢測活體解剖或組織中的上述微生物，通過ELISA技術(shù)檢測微生物抗原，或?qū)ふ夷繕?biāo)DNA序列。間接方法包括檢測對抗微生物抗原的抗體，該抗原是通過這些微生物的動(dòng)物傳染相應(yīng)產(chǎn)生的。目標(biāo)是盡可能早地診斷出動(dòng)物的健康狀態(tài)，以便避免其他動(dòng)物的污染。因此該分析方法必須快并可以應(yīng)用于疾病的早期。因此，需要提高檢測在培養(yǎng)基中生長非常緩慢(例如分枝細(xì)菌)或在家畜中繁殖非?？於袝r(shí)察覺不到就過去了的細(xì)菌，在該期間相當(dāng)于無癥狀階段(例如，副結(jié)核和牛粘膜病)。
如之前所示，通過根據(jù)本發(fā)明方法分析的樣品可以是不同來源的而且是不同相容性和/或性質(zhì)的。因此，上述樣品的物理特性需要本發(fā)明方法中步驟a)、b)、c)、d)和e)的預(yù)備步驟。更優(yōu)選，所述預(yù)備步驟是分析樣品的過濾步驟。
例如，在分析樣品是固體或半固體樣品，或樣品包括渾濁液體的情況下，上述的過濾也涉及減小顆粒大小，通過20至150微米孔隙度的過濾器來進(jìn)行，優(yōu)選30至100微米，更優(yōu)選約為63微米。
通過實(shí)施例，固體樣品的過濾可以在塑料袋中進(jìn)行，其中嵌入一個(gè)具有上述孔隙度的全表面塑料過濾器。
在根據(jù)本發(fā)明方法分析的樣品是清液的情況下，可以通過0.2至10μm孔隙度的膜來過濾，優(yōu)選0.2至5μm，更優(yōu)選為0.2至0.5μm。
本發(fā)明還涉及對樣品中所探尋微生物是特異性的富集培養(yǎng)基，包括可以使上述微生物繁殖的營養(yǎng)成分，使上述微生物復(fù)活的成分，以及可能破壞上述微生物競爭菌群的成分。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，富集培養(yǎng)基包括-濃度為1至20g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選1至10g/L，更優(yōu)選為4至6g/L，-濃度為0.5至5g/L的硫代硫酸鈉，優(yōu)選0.5至3g/L，更優(yōu)選為約2g/L，-濃度為500至20000u/L的過氧化氫酶，優(yōu)選為2000至8000u/L，更優(yōu)選為約5000u/L。
用于分析樣品中所探尋微生物的上述富集培養(yǎng)基中還可以包括至少一種抗生素。
最后，本發(fā)明還涉及試劑盒，通過其實(shí)施上述檢測和計(jì)數(shù)微生物的方法，該試劑盒包括-液體或脫水形式的根據(jù)本發(fā)明的富集培養(yǎng)基，-塑料袋，其中是一體化的全表面過濾器，優(yōu)選由約63μm孔隙度的塑料制得，-磁性珠子，其上結(jié)合了對上述微生物特異性的抗體，如上所述，保存于液體培養(yǎng)基中，例如在另一個(gè)玻璃容器中，-一種或數(shù)種底物，如上述微生物的上述那些熒光標(biāo)記，以凍干的形式，和-合適的溶劑，例如在另一個(gè)玻璃容器中。
根據(jù)以下實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明的說明。這些實(shí)施例既不是限定所分析樣品的性質(zhì)也不是限定來源。它們鑒定所探尋微生物和說明了該微生物的檢測，可以理解描述的規(guī)程同樣與樣品的性質(zhì)和來源無關(guān)。只有在富集步驟之前的樣品顆粒減小或過濾步驟沒有描述。
實(shí)施例實(shí)施例1單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的檢測激活單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的β-D-葡糖苷酶以及1型和4型菌體抗原的方法，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)來檢測。
單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性、無孢子、無莢膜桿菌，對人致病，其是造成李司忒氏菌病的原因，可以導(dǎo)致流產(chǎn)、敗血病，和腦膜腦炎的疾病。
其形成包括六個(gè)種(單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌、伊氏李司忒氏菌(ivanovii)、威氏李司忒氏菌(welshimeri)、斯氏李司忒氏菌(seeligeri)和格氏李司忒氏菌(grayi))的李司忒氏菌屬的一部分?；诰w抗原(從1至15)和鞭毛抗原(從A至E)將單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌菌株分成17個(gè)血清型，其中三個(gè)(1/2a、1/2b，和4b)表示分離菌株的95％并是造成人李司忒氏菌病的原因(Swaminathan等，1995)。
該細(xì)菌的存活和增殖特征解釋了其廣泛的分布。其可以在缺氧下、在5.6至9.6的pH下和1℃至45℃的溫度下繁殖；其對鹽(特定菌株高達(dá)20％)、干燥，和冰凍是耐受性的。最后，其可以形成或參與不管清潔和消毒而支持其持續(xù)性的生物膜。
為了在大多數(shù)其它細(xì)菌的敵對條件下繼續(xù)存在，其并不是非常競爭性的和通過復(fù)合微生物菌群來抑制。食品基質(zhì)中，單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌有時(shí)候數(shù)量是非常低的并和復(fù)合菌群結(jié)合，復(fù)合菌群通常包括鏈球菌、腸球菌、微球菌、芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌，和普通變形菌(Kramer和Jones，1969)。
李司忒氏菌主要通過污染的食品傳播。導(dǎo)致臨床情況的感染劑量是高于100個(gè)細(xì)菌每克或每毫升。
β-D-葡糖苷酶存在于所有李司忒氏菌菌種中但是只有單核菌種具有磷脂酰肌醇磷脂酶C(Notermans等，1991)。磷脂酰肌醇磷脂酶C活性液發(fā)現(xiàn)于其它微生物菌種中如芽孢桿菌。
單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌關(guān)于生長、血清學(xué)、和生物化學(xué)的特征規(guī)定了用于復(fù)活和繁殖復(fù)合樣品中單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的富集培養(yǎng)基的組成，而同時(shí)抑制競爭細(xì)菌，以便刺激1型和4型菌體抗原的產(chǎn)生并誘導(dǎo)β-D-葡糖苷酶的表達(dá)，其用于使用熒光底物的細(xì)菌檢測中。
通常用于李司忒氏菌的選擇性培養(yǎng)液是1/2Fraser。該培養(yǎng)基的組成作為我們培養(yǎng)液的基底用做非選擇性富集基底。將復(fù)活補(bǔ)充物加入該基底中來彌補(bǔ)1/2Fraser的不足，其是顯示受脅迫細(xì)菌的能力。此外，加入用于誘導(dǎo)β-D-葡糖苷酶活性的補(bǔ)充物。改變1/2Fraser選擇性補(bǔ)充物使其對所有復(fù)合產(chǎn)物有效，在其上可以進(jìn)行完整的單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的檢測程序。
另一個(gè)用于單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌的特定程序包括將2mM丙酸加入調(diào)控培養(yǎng)基中來激活丙酸酯酶。該活性在那些可以在培養(yǎng)液中非特異性地生長的腸球菌或其它革蘭氏陽性球菌中是不存在的。
1)組合物a.非選擇性富集基底。
5至15g/L的胰蛋白胨，優(yōu)選濃度為10g/L；5至15g/L的酵母提取物，優(yōu)選濃度為10g/L；9.6g/L的Na2HPO4；1.35g/L的KH2PO4；10至30g/L的NaCl，優(yōu)選濃度為20g/L。
胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、維生素、和礦物質(zhì)的來源。它們使產(chǎn)生抗原成為可能。鹽Na2HPO和KH2PO4可以將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7±0.2，其是李司忒氏菌生長的最佳pH，并在富集過程中來緩沖培養(yǎng)基。高濃度NaCl的目的是抑制腸球菌，腸球菌是經(jīng)常與李司忒氏菌結(jié)合的菌群并具有相同的特征，尤其是β-D-葡糖苷酶活性。
b.復(fù)活(revivication)補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度為2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
加入丙酮酸鈉和巰基乙酸鈉來參與刺激受脅迫生物體的代謝。過氧化氫酶用來消除對氧為活性、對微生物為毒性、且可能存在于食品中的菌種。
c.β-D-葡糖苷酶活性誘導(dǎo)補(bǔ)充物。
1至20mM的水楊苷，優(yōu)選2mM。
同樣地如真菌(Birk等，1997；Perez-Pons J.A.1995；Venturi等，2002)或細(xì)菌(Yang等，1996)中的一些β-D-葡糖苷酶，單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌中的β-D-葡糖苷酶是可誘導(dǎo)的。富集階段中不存在誘導(dǎo)劑時(shí)，酶活性是不可檢測的。
水楊苷是β-D-葡糖苷酶的底物；其在富集培養(yǎng)液中的存在可以誘導(dǎo)該酶的表達(dá)并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(也可以使用纖維二糖或甲基β-D-葡糖苷)。
d.丙酸酯酶誘導(dǎo)活性補(bǔ)充物。
1至20mM的2-甲基-丙酸，優(yōu)選濃度為2mM。
2-甲基-丙酸在調(diào)控培養(yǎng)液中的存在可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌中的丙酸酯酶活性，通過熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行檢測。
e.選擇性補(bǔ)充物。
5mg/L的多粘菌素B；1mg/L的氧氟沙星；2mg/L的兩性霉素B；4mg/L的5-氟代胞嘧啶；以及可能地9g/L的氯化鋰。
多粘菌素B對革蘭氏陰性細(xì)菌是殺菌性抗生素活性的，尤其作用于大腸桿菌和銅綠假單胞菌。氧氟沙星補(bǔ)充多粘菌素B對革蘭氏陰性細(xì)菌的作用，特別是對普通變形菌具有殺菌活性。在1/2Fraser中，氯化鋰結(jié)合萘啶酸來抑制革蘭氏陰性細(xì)菌；它們對假單胞菌或變形菌沒有效果。氧氟沙星活性也存在于鏈球菌和葡萄球菌的一些菌種中。兩性霉素B根據(jù)菌株是抑制真菌的或殺真菌的，和5-氟代胞嘧啶是殺真菌的。1/2Fraser的組成中沒有殺真菌劑。一些產(chǎn)品，尤其是蔡珀拉特(chipolata)香腸中，帶有干擾β-D-葡糖苷酶反應(yīng)和檢測的酵母。抑制革蘭氏陽性球菌的吖啶黃，沒有將其加入調(diào)控培養(yǎng)基中，因?yàn)槠鋵?dǎo)致培養(yǎng)基中的要素產(chǎn)生熒光，因此創(chuàng)造細(xì)胞上的背景干擾，其干擾對于它們的閱讀。對于程序最麻煩的球菌是那些帶有β-D-葡糖苷酶活性且這些球菌生長是通過培養(yǎng)液中高濃度的NaCl來抑制的。革蘭氏陽性球菌標(biāo)記葡糖苷酶活性引起的假陽性可以通過現(xiàn)實(shí)丙酸酯酶活性來消除，其在球菌中不存在且在單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌中是可誘導(dǎo)的。
將樣品以5至10倍(w/w)稀釋于沒有選擇性補(bǔ)充物的肉湯培養(yǎng)液中。使用的培養(yǎng)溫度是30℃和培養(yǎng)時(shí)間是12h。4小時(shí)復(fù)活后，加入選擇性補(bǔ)充物，然后在30℃選擇性富集8h。
2)免疫濃縮按照制造商的指導(dǎo)使用磁性珠子(例如，Dynabeads-Listeria，Dynal Biotech，直徑2.8μm)來進(jìn)行反應(yīng)，盡管該抗體對單核細(xì)胞增生菌種是非特異性的。
可以用于珠子上的各種抗體-特異性抗體“李司忒氏菌O抗血清聚血清型1，4”(“ListeriaO antiserum poly Serotypes 1，4”)(BD診斷系統(tǒng)，編號(hào)223021)，其對導(dǎo)致人李司忒氏病的單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌菌株是特異性的，其表達(dá)1型和4型抗原。
-用鈍化細(xì)菌接種兔子來產(chǎn)生單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌特異性血清，上述細(xì)菌已經(jīng)預(yù)先在調(diào)控培養(yǎng)液中培養(yǎng)過。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用覆蓋識(shí)別主要抗體的次要抗體的珠子(例如，Dynabeads M-280綿羊抗兔子IgG，直徑2.8μm，編號(hào)112-01，Dynal Biotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記a.酯酶活性的檢測。
底物5，6-羧基-二氯-熒光素-二醋酸鹽(Fluka Sigma-AldrichChemistry SARL，編號(hào)21884)以10mM的濃度制備于二甲基甲酰胺中，然后稀釋于PBS中至10μM。將25μl的稀釋液加入來自免疫濃縮分離步驟的上清液中于37℃15分鐘來完成標(biāo)記反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，5(6)-羧基-二氯-熒光素-雙醋酸鹽在微生物中釋放并變成熒光的。該分子的特征是當(dāng)其在酸性pH范圍內(nèi)時(shí)發(fā)射綠色熒光(Nedergaard等，1990)。
當(dāng)其以終濃度1μM使用時(shí)，該標(biāo)記顯示了單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌相對于許多其它菌株的特異性，(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形菌、芽孢桿菌、Yersinia alvei)。毫無疑問該細(xì)菌的特定特征，該觀察涉及該細(xì)菌具有比其它李司忒氏菌菌種高的酯酶活性的事實(shí)，在更酸性的胞內(nèi)pH中是雙倍的特征(個(gè)人觀察)。如果選擇水楊苷用于流式細(xì)胞術(shù)的李司忒氏菌檢測中，注意不是用于富集培養(yǎng)基中。
b.β-D-葡糖苷酶活性的檢測。
按照分子探針(Molecular Probes)的說明將底物熒光素二-β-D-吡喃葡糖苷或五氟苯甲酰氨基熒光素-二-β-D-吡喃葡糖苷以20mM制備于水中。在其以500μM使用之前將其稀釋于水中至4mM。
在底物是熒光素-二-β-D-吡喃葡糖苷的情況中，通過免疫濃縮回收的細(xì)菌可以通過添加15μL異丙醇，接著在底物添加之前通過在37℃下5分鐘的短培養(yǎng)成為可滲透的。
在所有情況下，酶反應(yīng)在37℃進(jìn)行1h，然后立即放置于4℃。
c.丙酸酯酶活性檢測。
底物熒光素-二丙酸鹽以10mM的濃度制備于10mM DMSO中。將其加入樣品中以致底物的終濃度為100μM。因此將樣品在37℃培養(yǎng)15分鐘，然后立即放置于4℃等待分析。
實(shí)施例2沙門氏菌檢測激活辛酸酯酶、沙門氏菌表面抗原的表達(dá)、通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測的過程。
Daniel E.Salmon，其是美國的獸醫(yī)，于1885年發(fā)現(xiàn)了第一株沙門氏菌。迄今，已經(jīng)知道了2213個(gè)菌株并且目錄繼續(xù)在增長。沙門氏菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧(氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，無孢子)，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽并發(fā)酵葡萄糖的桿狀菌。沙門氏菌屬包括多于2500個(gè)血清型，其中約50個(gè)在我們范圍內(nèi)是確實(shí)重要的。抗原公式是基于菌體抗原(O)、鞭毛抗原(H)，或莢膜抗原(K/Vi)的性質(zhì)。該莢膜抗原遮掩了O抗原且在加熱后顯露出來。O抗原對應(yīng)于LPS脂多糖。一些菌株，R或T形式，可以丟失全部或部分的該抗原能力。抗原H受到階段可變現(xiàn)象其可以發(fā)現(xiàn)兩種形式，相當(dāng)于1和2。
集體食物中毒的主要原因，單獨(dú)沙門氏菌病就代表了約2/3的這些情況。近些年，已經(jīng)可見人沙門氏菌病數(shù)量和嚴(yán)重程度的驚人增加。和1980年相比較，某些國家在過去10至15年有了20倍的增長。流行病學(xué)更深的觀點(diǎn)揭露了多數(shù)情況來源于腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)菌株，或更準(zhǔn)確，血清型。自從1990年代開始情況更糟糕出現(xiàn)了對大多數(shù)抗生素抗性的鼠傷寒沙門氏菌菌株，并可能成為嚴(yán)重的公共健康問題。
人們最常接觸沙門氏菌病是通過消費(fèi)動(dòng)物來源、粗制或未完全煮熟的受污染食品(主要是肉、家禽、雞蛋，和牛奶)，盡管大多數(shù)其他食品涉及傳播。因果試劑(causal agent)從初級(jí)生產(chǎn)穿過食品鏈移動(dòng)，或由于家中食物的交叉污染，或在集體食物供應(yīng)或機(jī)構(gòu)中如醫(yī)院。細(xì)菌在5℃-12℃，甚至在低于5℃的溫度下仍然繁殖。它們能很好地耐受冷凍、鹽，和干燥。
在發(fā)達(dá)國家個(gè)人對個(gè)人的傳播是極少的但仍然會(huì)發(fā)生，尤其在如新生兒看護(hù)設(shè)備或廢棄設(shè)備的設(shè)施中。
流行病學(xué)上，按照對人或動(dòng)物寄主適應(yīng)的作用和O血清型抗原將沙門氏菌分為三組-B組(51.8％的情況)，例如鼠傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi B)，只在人類和高等靈長類中導(dǎo)致傷寒。該組根據(jù)所涉及亞種系統(tǒng)地表達(dá)血清型抗原4和抗原1、5、12，和27的菌株來表征，-D組(19.1％的情況)，導(dǎo)致某些動(dòng)物但極少人類中的疾病牛的都柏林沙門氏菌(Salmonella dublin)，豬的豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)，雞蛋中的腸炎沙門氏菌。然而，當(dāng)這樣的傳染接觸人時(shí)，其經(jīng)常是侵襲性的且可以是致命的。包括該組的沙門氏菌通常表達(dá)抗原9且根據(jù)亞種表達(dá)抗原1和12，-C組(20.3％的情況)表達(dá)抗原6和7，6和8，或8；E組(6.2％的情況)的那些表達(dá)抗原3和10，3和15，1和3，或19；G組(1.2％的情況)的那些表達(dá)抗原13和22，或13和23；K組的那些表達(dá)抗原18；以及A組的甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi A)(0.24％的情況)表達(dá)抗原1和2。
沙門氏菌的感染劑量約為100000個(gè)細(xì)菌。當(dāng)涉及的血清型是傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和甲型、乙型和丙型副傷寒時(shí)，由這樣劑量引起的癥狀是傷寒(House等，2001)。在培養(yǎng)1至25天后，在進(jìn)入帶有發(fā)熱和麻痹的淋巴、敗血病階段之前疾病引起消化道癥狀(腹瀉、腹痛、嘔吐)。該現(xiàn)象是大腦中嗜神經(jīng)性內(nèi)毒素、脂多糖(LPS)活動(dòng)的結(jié)果。少數(shù)致病性血清型如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、都柏林沙門氏菌等是引起不太嚴(yán)重食品中毒如沙門氏菌病的那些。
可以在抑制革蘭氏陽性細(xì)菌生長和部分抑制大腸桿菌、變形菌和其他革蘭氏陰性細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基上直接探尋組成沙門氏菌一部分的致病性腸細(xì)菌。為該目的的培養(yǎng)基含有多種組合的膽汁提取物、脫氧膽酸檸檬酸鹽、硫酸鹽，和煌綠。
β-半乳糖苷酶的測試可以分辨沙門氏菌(β-革蘭氏陰性)和那些志賀氏菌(Shigella)(β-革蘭氏陽性)的菌株。這兩個(gè)細(xì)菌微生物具有相似的培養(yǎng)條件并因此經(jīng)常碰在一起。沙門氏菌的明顯特征是代謝辛酸的能力(C8酯酶活性)。使用通過UV光激發(fā)發(fā)出熒光的4-甲基傘形酮測試測量辛酸酯酶活性(Humbert等，1989；Olsson等，1991)。某些培養(yǎng)基使用兩種熒光底物的組合因?yàn)樯抽T氏菌是β-半乳糖苷酶陰性和葡糖醛酸陽性(SMID培養(yǎng)基)。
1)組合物a.非選擇性富集基底。
5至15g/L的胰蛋白胨，優(yōu)選濃度為10g/L；10至30g/L的NaCl，優(yōu)選濃度為20g/L；5至15g/L的酵母提取物，優(yōu)選濃度為10g/L；0.5至3g/L的D-葡萄糖，優(yōu)選濃度為1g/L；5至15g/L的Na2HPO4，優(yōu)選濃度為9.6g/L；和0.5至3g/L的KH2PO4，優(yōu)選濃度為1.35g/L。
胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、維生素、和礦物質(zhì)的來源。它們使產(chǎn)生抗原成為可能。鹽Na2HPO4和KH2PO4可以將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7±0.2，其是沙門氏菌的最佳生長pH，并在富集過程中緩沖培養(yǎng)基。高濃度NaCl的目的是抑制腸球菌b.復(fù)活補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度為2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
加入丙酮酸鈉和巰基乙酸鈉來參與刺激脅迫生物體的代謝(Bailey和Cox，1992)。過氧化氫酶用來消除對氧活性、對微生物毒性，并可能存在于食品中的菌種。培養(yǎng)溫度是20至40℃，優(yōu)選35℃。
c.辛酸酯酶活性誘導(dǎo)補(bǔ)充物。
4-硝基苯基辛酸鹽是辛酸酯酶的底物；它在富集培養(yǎng)液中的存在可以誘導(dǎo)該酶的表達(dá)和通過流式細(xì)胞術(shù)的檢測。
d.選擇性補(bǔ)充物。
1至10mg/L的煌綠，優(yōu)選濃度為5mg/L，來抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長；和1g/L的磺胺吡啶來抑制尤其是大腸桿菌的生長。
與傳統(tǒng)使用的在培養(yǎng)基中引起自身熒光并在細(xì)菌中形成被殼(反光體)的補(bǔ)充物(例如，?；悄懰徕c或其它膽鹽、酚紅、檸檬酸鐵)相比，這些補(bǔ)充物不產(chǎn)生自身熒光。在誘導(dǎo)補(bǔ)充物、辛酸酯酶活性補(bǔ)充物和選擇性補(bǔ)充物的存在下，培養(yǎng)溫度為20至40℃(優(yōu)選35℃)。這些補(bǔ)充物存在下的培養(yǎng)過程為6至15小時(shí)，作為所需檢測極限的函數(shù)。
2)免疫濃縮按照制造商的指導(dǎo)使用磁性珠子(例如，Dynabeads-Listeria，Dynal Biotech，直徑2.8μm)來進(jìn)行反應(yīng)可以用于珠子上的各種抗體-可商業(yè)購得的沙門氏菌特異性抗體(例如，BD診斷系統(tǒng)，編號(hào)2302-50)用于直接標(biāo)記。該抗體，直接對抗抗原1、4、5，和12，可以檢測D組沙門氏菌，-通過給兔子接種鈍化細(xì)菌來產(chǎn)生對沙門氏菌特異性的血清，上述微生物已經(jīng)預(yù)先在調(diào)控培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用識(shí)別主要抗體的次要抗體覆蓋的珠子(例如，Dynabeads M-280綿羊抗兔子IgG，直徑2.8μm，編號(hào)112-01，Dynal Biotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記辛酸酯酶活性的檢測優(yōu)選使用的底物是熒光素-二辛酸鹽。以10至400μM的濃度在丙酮中制備儲(chǔ)液。使用的終濃度是1至40μM，優(yōu)選10μM。在底物存在下，優(yōu)選在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘至1小時(shí)，然后立即將微生物放置于4℃。
實(shí)施例3金黃色葡萄球菌的特異性檢測激活磷酸酯酶、表達(dá)金黃色葡萄球菌表面抗原，和通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的過程。
金黃色葡萄球菌是細(xì)球菌科家族的成員。其是不能動(dòng)的，無孢子，革蘭氏陽性球菌，平均直徑范圍為0.8至1μm。其呼吸代謝是發(fā)酵性的。其是過氧化氫酶陽性且大多數(shù)菌株是凝固酶陽性。其引起多種疾病，如敗血癥、結(jié)膜炎、心內(nèi)膜炎，和骨髓炎(Sheagren J.N.，1984)。
當(dāng)菌株在胞外多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長時(shí)，蛋白質(zhì)A和金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的特殊成分被遮掩。這些多糖形成莢膜并約有90％金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生。已經(jīng)描述了十一個(gè)莢膜血清型但是分離的多數(shù)菌株屬于血清型5和8(Arbeit等，1984；Sompolinsky等，1985)。
金黃色葡萄球菌血清型CP5和CP8的表達(dá)受到環(huán)境條件和細(xì)菌生長條件的極大影響。通過高含量的酵母提取物來抑制CP5的產(chǎn)生。Dassy等，(1991)，和Ouyang等，(1999)，顯示了相同的酵母提取物抑制CP8微莢膜生成的效果。
對抗金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抗體可以是有莢膜的或膜狀的。對于這些細(xì)菌的免疫檢測，必須使用這兩種抗體的混合物(如對于PastorexStaph Plus測試，Biorad)或在進(jìn)行抗原-抗體識(shí)別反應(yīng)之前防止胞外多糖莢膜的生成。這是我們選擇來發(fā)展的第二個(gè)策略，并關(guān)注抑制多糖莢膜產(chǎn)生的復(fù)活組合物。
1)組合物a.非選擇性富集基底。
肉蛋白胨優(yōu)選濃度為8g/L；酪蛋白胨優(yōu)選濃度為2g/L；；酵母提取物優(yōu)選濃度為10g/L；肉提取物優(yōu)選濃度為5g/L。肉蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物和肉提取物是氮、碳、維生素、和礦物質(zhì)的來源。這使金黃色葡萄球菌的生長和抑制莢膜形成成為可能。
b.復(fù)活補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度為2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
加入丙酮酸鈉和巰基乙酸鈉來參與刺激脅迫生物體的代謝(Bailey和Cox，1992)。過氧化氫酶用來消除對氧活性，對微生物毒性，并可能存在于食品中的菌種。
c.堿性磷酸酯酶活性抑制補(bǔ)充物。
0.3％無機(jī)磷酸鹽。
磷酸酯酶活性是與細(xì)菌的腸毒性能力相關(guān)的活性之一并因此用于金黃色葡萄球菌檢測的顯示。
堿性磷酸酯酶活性在金黃色葡萄球菌中是組成的(Soro等，1990)。然而，由于其在一些非金黃色葡萄球菌菌株中受到磷酸鹽的抑制(Soro等，1990)，將磷酸鹽離子加入培養(yǎng)基中是有利的。
d.選擇性補(bǔ)充物。
12g/L的甘氨酸；5g/L的LiCl；和0.05g/L的去鐵胺。
氯化鋰是革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制劑。甘氨酸是革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制劑并刺激葡萄球菌的生長。去鐵胺抑制表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)的生長，其是除了金黃色葡萄球菌以外唯一具有磷酸酯酶活性的葡萄球菌。
2)免疫濃縮可以用于珠子上的各種抗體-可商業(yè)購得的金黃色葡萄球菌特異性血清(編號(hào)50-L030，AGROBIO)用于抗體和膜抗原直接結(jié)合，-通過已經(jīng)在調(diào)控培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鈍化細(xì)菌接種兔子來產(chǎn)生對金黃色葡萄球菌特異性的抗體。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用識(shí)別主要抗體的次要抗體覆蓋的珠子(例如，Dynabeads M-280綿羊抗兔子IgG，直徑2.8μm，編號(hào)112-01，Dynal Biotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記。
a.堿性磷酸酯酶活性的檢測底物熒光素-二磷酸鹽(編號(hào)F-2999，Molecular Probes)可以檢測堿性磷酸酯酶活性。通過溶解于100mM pH8.0 Tris-HCl制得10mM的濃度，然后稀釋于PBS中至1mM。將25μl稀釋液加125μlPBS加入免疫濃縮分離步驟的上清液中于37℃15分鐘來完成標(biāo)記反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，熒光素得到釋放并成為熒光的(激發(fā)/發(fā)射490/514nm)。
該標(biāo)記顯示了一些葡萄球菌種(金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的特異性，相對于藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，大腸桿菌和數(shù)個(gè)葡萄球菌菌種。培養(yǎng)液和免疫濃縮的組合可以消除對熒光標(biāo)記陽性敏感的菌株。去鐵胺抑制表皮葡萄球菌的生長。
實(shí)施例4大腸桿菌的檢測激活葡糖苷酸酶、表達(dá)大腸桿菌表面抗原、和通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測的過程。
Thomas Escherich于1855年發(fā)現(xiàn)了該細(xì)菌。大腸桿菌是腸桿菌(Enterobacteriaceae)家族的成員，是細(xì)菌屬，其中只發(fā)現(xiàn)一個(gè)種；但是有超過1000個(gè)抗原型。根據(jù)它們的O-菌體抗原(171)、K-莢膜抗原(80)，和H-鞭毛抗原(56)來定義這些血清型。此外，K抗原再細(xì)分成A、B和L型。與嬰兒腹瀉相關(guān)的菌株中專門發(fā)現(xiàn)B型。
相當(dāng)短(2-3μm×0.7μm)，單個(gè)、成對，或很少地成團(tuán)地發(fā)現(xiàn)它們。它們以球菌或桿菌形式，或在較久的培養(yǎng)基中以絲狀出現(xiàn)。它們周生鞭毛的活動(dòng)性是無關(guān)緊要的或例如在血清型O111的情況中是不存在的。培養(yǎng)它們非常容易因?yàn)樗鼈兡芎芎玫啬褪躳H的改變(最佳pH為7.5)。生長的最佳溫度是37℃但是它們可以在15℃至45℃生長，且在5℃仍然可以繁殖。它們能很好地耐熱在45℃培養(yǎng)它們發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、乳糖并產(chǎn)生大量氣體。它們對酸和冷凍是耐受性的。它們保持對抗生素的相對敏感性并和所有腸細(xì)菌一樣它們將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。它們發(fā)酵葡萄糖和乳糖，有時(shí)為蔗糖和水楊苷。大多數(shù)具有賴氨酸脫羧酶活性。
大腸桿菌是所有動(dòng)物包括人類的常見腸菌群細(xì)菌。其是腸共生的，代表80％需氧腸菌群。在排泄物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌。從那，其通過土壤和水分布于自然中。它在環(huán)境中的存在通常暗示了排泄物污染。設(shè)計(jì)了比色試驗(yàn)來鑒定其在水中的存在。
主要在動(dòng)物或人來源的原料或未充分煮熟的肉(牛肉、家禽)和排泄物中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌。碎肉操作通常是該細(xì)菌污染的來源。通常，大腸桿菌的主要作用是抑制有害細(xì)菌和促進(jìn)多種維生素的合成，僅有少數(shù)大腸桿菌菌株能夠?qū)е氯藗魅尽?br> 根據(jù)大腸桿菌的致病性將它們分成數(shù)個(gè)組或致病變種。該致病性通常基于和各種細(xì)胞受體粘著的能力。大腸桿菌屬于這些致病變種是通過如下血清學(xué)分辨的-O血清型抗原180個(gè)變種中的大約30個(gè)在I型EPEC(026、055、086、0111、0119、0125-0128、0142，等)，II型EPEC(018、044、0112、0114，等)，EIEC(028、029、0124、0136、0143、0152，等)，ETEC(06、08、015、020、025，等)，和EHEC(026、0113、0121、0145、0157，等)致病性菌株中是經(jīng)常碰到的，-多糖A或B天然(EPEC中若干重要的B型)或蛋白質(zhì)L天然(傘毛，尤其是CFA抗原)的K-莢膜抗原，-H-鞭毛抗原，其對EHEC是重要的，其中最常見的血清型是0157H7。
大多數(shù)致病性菌株是通過特定OxKyHz型血清型來表征的。
當(dāng)大腸桿菌引起急性腹瀉時(shí)，可以根據(jù)四個(gè)致病型來分類腸致病性的(EPEC)，腸侵襲性的(EIEC)，腸出血的(EHEC)，和腸毒性的(ETEC)。通過它們產(chǎn)腸毒素的能力來表征菌株，腸毒素作用于腸細(xì)胞來破壞通常由腸粘膜提供的吸收功能。這些微生物可以存在于如碎肉的特定食品中和水里在其中它們顯示了排泄物的污染。
如果它們穿過腸粘膜(腸壁機(jī)能障礙)，它們可以變成致病性的并可以導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染和膽感染、稱為大腸桿菌病的生殖器感染，以及很少的敗血癥。其充當(dāng)條件性致病菌。
1)組合物a.非選擇性富集基底。
10至30g/L的胰蛋白胨，優(yōu)選濃度為20g/L；5至15g/L的酵母提取物，優(yōu)選濃度為10g/L；1至10g/L的NaCl，優(yōu)選濃度為5g/L；1至10g/L的D-乳糖，優(yōu)選濃度為5g/L；5至15g/L的Na2HPO4，優(yōu)選濃度為9.6g/L；0.5至3g/L的KH2PO4，優(yōu)選濃度為1.35g/L。
胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、維生素和礦物質(zhì)的來源。它們使產(chǎn)生抗原成為可能。鹽Na2HPO4和KH2PO4緩沖培養(yǎng)基。
b.復(fù)活補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
加入丙酮酸鈉和巰基乙酸鈉來參與刺激脅迫生物體的代謝(Bailey和Cox，1992)。過氧化氫酶用來消除對氧活性、對微生物毒性，并可能存在于食品中的菌種。
c.葡糖醛酸酶活性誘導(dǎo)補(bǔ)充物。
4-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸是葡糖醛酸酶的底物；其在調(diào)控培養(yǎng)基中的存在可以誘導(dǎo)該酶的表達(dá)和通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測。將其以0.5至5mM的濃度加入調(diào)控培養(yǎng)基中，優(yōu)選最終為1mM。
d.選擇性補(bǔ)充物。
0.5至5g/L的膽鹽，優(yōu)選1.5g/L。
它們用來抑制革蘭氏細(xì)菌的生長，尤其是有孢子的細(xì)菌和糞便鏈球菌(fecal streptococci)，并用來刺激大腸桿菌的生長。在誘導(dǎo)葡糖醛酸酶活性補(bǔ)充物和選擇性補(bǔ)充物的存在下，培養(yǎng)溫度為20至50℃，優(yōu)選37℃。
在這些補(bǔ)充物的存在下培養(yǎng)階段為6至15小時(shí)，作為所需檢測極限的函數(shù)。
2)免疫濃縮可用的并與珠子結(jié)合的各種抗體-可商業(yè)購得的金黃色葡萄球菌特異性抗體用于直接標(biāo)記，-通過將預(yù)先在調(diào)控培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鈍化細(xì)菌接種兔子來產(chǎn)生對金黃色葡萄球菌特異性的抗體。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用識(shí)別主要抗體的次要抗體覆蓋的珠子(例如，Dynabeads M-280綿羊抗兔子IgG，直徑2.8μm，編號(hào)112-01，Dynal Biotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記葡糖醛酸酶活性的檢測優(yōu)選使用的底物是熒光素-二-β-D-葡糖醛酸，更優(yōu)選為五氟苯甲酰氨基-熒光素-二-β-D-葡糖醛酸。于水中制備濃度為10mM的儲(chǔ)液。于水中制備濃度為2mM的使用液。使用的終濃度為50至500μM，優(yōu)選160μM。
在底物存在下優(yōu)選在37℃進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘至1小時(shí)。
在底物是熒光素-二-β-D-葡糖醛酸的情況中，通過添加15μL的異丙醇于37℃5分鐘使細(xì)菌是暫時(shí)可滲透的。
在所有情況下，隨后在分析之前將熒光微生物立即放置于4℃。
實(shí)施例5鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的檢測激活棕櫚酸酯酶、表達(dá)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種表面抗原、和通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的過程。
鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種是乙醇耐受性革蘭氏陽性細(xì)菌，大小為0.5至1.5μm。其在Herrold’s蛋黃培養(yǎng)基上(HEYM)形成粗糙的白色菌落。其是生長非常緩慢的微生物菌落在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)三或四個(gè)月后才是可見的。培養(yǎng)基中營養(yǎng)補(bǔ)充物的存在沒有加快其生長速度(Cocito等，1994)。
分枝桿菌尤其對物理和化學(xué)因素有耐受性。鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種顯然是該家族中最具耐受性的細(xì)菌之一，其解釋了它在環(huán)境中存活這么長的能力。一些因素可能減少了它在環(huán)境中的存活時(shí)間干燥、暴露于陽光、pH高于7.0、以及缺鐵的土壤。
鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種在系統(tǒng)發(fā)生上與屬于同一家族的其它種相關(guān)其顯示了和鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種高于99％的DNA同源性。因此，該強(qiáng)大的基因同源性轉(zhuǎn)化成大量共同的抗原。當(dāng)使用直接免疫測試來特異性檢測鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種菌株時(shí)，這不是無價(jià)值的問題。
存在三種技術(shù)，形成了目前用于檢測細(xì)菌鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的分析試驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)血清學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法、和排泄物培養(yǎng)。
血清學(xué)分析是檢測抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種抗體的間接方法；其可以在24小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果但是對抗抗分枝桿菌抗體抗原特異性的缺乏使這些測試的靈敏度比排泄物培養(yǎng)低(37％)。
PCR技術(shù)是直接、快速(24小時(shí))、靈敏的分析但是不可以測量或從活細(xì)菌中分辯死細(xì)菌。當(dāng)所需的是接受滅菌的食品分析時(shí)這是重要問題。實(shí)際上，來自死細(xì)菌的DNA問題可能繼續(xù)存在于已經(jīng)接受充分應(yīng)力的產(chǎn)品中。因此，DNA檢測結(jié)果中產(chǎn)生了假陽性。
排泄物培養(yǎng)是靈敏、可靠，但是非常長的方法在3至4個(gè)月內(nèi)獲得結(jié)果。
以下提供的規(guī)程描述了分析方法，使用牛排泄物，其可以測定鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的存在并在短時(shí)間內(nèi)(5至7天)將其定量。
此外，存在于排泄物中的致病性細(xì)菌數(shù)量在傳染循環(huán)中改變很大；還有，引入了用于細(xì)菌的復(fù)活/富集步驟以便提高檢測的靈敏度，尤其是在鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種傳染發(fā)展的早期階段。
1)組成物a.非選擇性富集基底。
37g/L的腦心浸液；2.7％的甘油，2g/L的天冬酰胺；0.1％的吐溫(Tween)80；2ml的分枝桿菌素J(Synbiotics Corporation，編號(hào)ACME)，和10％的胎兒牛血清(FCS，Invitrogen)。該調(diào)控培養(yǎng)基一方面可以復(fù)活受到脅迫的或代謝活性降低細(xì)菌，另一方面是選擇性支持培養(yǎng)基中鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種生長的制劑。
b.復(fù)活補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度為2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
加入丙酮酸鈉和巰基乙酸鈉來參與刺激脅迫生物體的代謝(Bailey和Cox，1992)。過氧化氫酶用來消除對氧活性、對微生物毒性，并可能存在于食品中的菌種。
c.選擇性補(bǔ)充物。
50mg/L的萘啶酮酸；50mg/L的萬古霉素。
d.誘導(dǎo)補(bǔ)充物。
濃度為0.5至5mM的4-硝基苯基-棕櫚酸鹽，優(yōu)選濃度為2mM。
在鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種中棕櫚酸酯酶是可誘導(dǎo)的。4-硝基苯基-棕櫚酸鹽是該酶的底物。將其添加至調(diào)控培養(yǎng)液中可以誘導(dǎo)該酶的表達(dá)并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。
鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種存在于牛排泄物中，盡管它們具有顯著的傳染潛在性，但是在大多數(shù)情況下在合適的培養(yǎng)基中不易于很快地生長。它們生長非常緩慢的原因是環(huán)境脅迫或降低的代謝活性。在MCD8培養(yǎng)基中使用的丙酮酸鈉由于作用于三羧酸循環(huán)同樣具有復(fù)活特性。此外，可以理解富含脂肪酸特別是棕櫚酸和油酸(吐溫80)的培養(yǎng)基尤其支持鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的生長。分枝桿菌素J，當(dāng)充當(dāng)Fe2+的螯合劑時(shí)，幫助提供分枝桿菌生長的這個(gè)必需離子。最后，鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的生長通常伴隨有毒的過氧化氫(H2O2)分子的釋放。存在于培養(yǎng)基中的過氧化氫酶可以消除這些細(xì)胞代謝產(chǎn)物。將兩種寬譜的抗生素加入培養(yǎng)基中可以限制開始就存在于排泄物中的其它細(xì)菌的生長。建議在調(diào)控培養(yǎng)基中的富集階段進(jìn)行最小時(shí)間或5天；培養(yǎng)7天后可以獲得非常好的結(jié)果。
2)免疫濃縮各種可用并與珠子結(jié)合的抗體-用于直接標(biāo)記的可商業(yè)購得的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種特異性的抗體(Biodesign International)，-通過用鈍化細(xì)菌接種兔子來產(chǎn)生對鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種特異性的抗體，上述細(xì)菌已經(jīng)預(yù)先在調(diào)控培養(yǎng)基中生長。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用識(shí)別主要抗體的次要抗體覆蓋的珠子(例如，Dynabeads M-450山羊抗鼠IgG，直徑4.5μm，編號(hào)112-01，Dynal Biotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記磁性免疫濃縮步驟后，通過對其全部酶活性特異的熒光素來顯示鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種。該標(biāo)記可顯示活細(xì)菌，其是潛在感染性和毒性的。
a.棕櫚酸酯酶活性的檢測優(yōu)選使用的底物是熒光素-二-棕櫚酸鹽。
于丙酮中制備濃度為10至400mM的儲(chǔ)液。使用的最終濃度是1至40μM，優(yōu)選10μM。在底物存在下優(yōu)選于37℃進(jìn)行培養(yǎng)30分鐘至1小時(shí)。然后在分析之前將熒光的微生物立即放置于4℃。
實(shí)施例6侵肺軍團(tuán)菌的檢測軍團(tuán)菌是無孢子、嚴(yán)格厭氧、革蘭氏陰性細(xì)菌，大小為0.2至0.5μm。在感染組織中為球桿菌形式，在人工培養(yǎng)基上是絲狀或淺灰色多態(tài)群體。軍團(tuán)菌屬通常包括43個(gè)種和64個(gè)血清型。它們的天然棲所是水且它們通常認(rèn)為是變形蟲中的胞內(nèi)寄生菌。對人是致病性的(軍團(tuán)病)，侵肺軍團(tuán)菌是最常見的致病性血清群(80％的情況)。
支持軍團(tuán)菌繁殖的因素是水溫、生物膜的存在、變形蟲的存在、和水停滯。
特別地通過軍團(tuán)菌在支鏈脂肪酸中的富集度來對其表征，其對于革蘭氏陰性細(xì)菌是不尋常的。它的生長需要L-半胱氨酸和焦磷酸鐵，其是必需生長因子，但是其不水解糖也不在血瓊脂培養(yǎng)基上生長。最后，其耐熱處理和強(qiáng)酸(100℃10分鐘；0.2M HCl)。
在人造培養(yǎng)基上，在36℃進(jìn)行軍團(tuán)菌培養(yǎng)10天，在3天、7天、和10天讀數(shù)；通過2.5％的CO2促進(jìn)其生長。
可以以兩條途徑來進(jìn)行軍團(tuán)菌的鑒定使用多克隆或單克隆抗體通過乳膠免疫凝集實(shí)驗(yàn)或通過免疫熒光來直接檢測；或在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。直接檢測具有高度特異性的優(yōu)勢，因此其可以精確地鑒定血清型；然而，該方法不是非常靈敏并需要10000個(gè)細(xì)菌/mL的最小量來產(chǎn)生結(jié)果。因此，使用這些技術(shù)以便在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)后鑒定種和血清型。
在選擇性瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)具有相對靈敏(最小檢測極限是50CFU/mL)的優(yōu)勢，但是只可能推斷軍團(tuán)菌的存在。必然地，該技術(shù)必需通過直接檢測(直接免疫熒光或乳膠珠子免疫凝集)或通過分子生物技術(shù)(PCR)來完成。結(jié)果，這兩種技術(shù)主要的不方便是長，在獲得陰性結(jié)果之前需要10天。
1)組合物a.非選擇性富集基底。
10g/L的酵母提取物；10g/L的ACES；1g/L的α-酮戊二酸鹽；4g/L的活性碳；pH6.9±0.2；0.4g/L的L-半胱氨酸；0.25g/L的焦磷酸鐵。
b.復(fù)活補(bǔ)充物。
1至10g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選濃度為5g/L；0.5至5g/L的巰基乙酸鈉，優(yōu)選濃度為2.5g/L；和5000u/L的過氧化氫酶。
c.選擇性補(bǔ)充物。
5mg/L的多粘菌素B；2mg/L的鹽酸萬古霉素；和16mg/L的放線菌酮。
軍團(tuán)菌調(diào)控培養(yǎng)基配方是基于Pine等(1979)描述的成分；酵母提取物、ACES緩沖劑、甘氨酸、和L-半胱氨酸是典型的培養(yǎng)基成分，提供了軍團(tuán)菌生長必需的生長因子、礦物鹽，和氨基酸；α-酮戊二酸鹽是公知的強(qiáng)烈細(xì)菌生長激活劑。
最后，在侵肺軍團(tuán)菌生長過程中產(chǎn)生了大量的游離原子團(tuán)，這和其生長是不相容的，因此活性碳可以消除這些毒性分子。在調(diào)控培養(yǎng)基中的培養(yǎng)階段為24至72小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20至50℃，優(yōu)選約37℃。
2)免疫濃縮各種可用的并與珠子結(jié)合的抗體-用于直接標(biāo)記的可商業(yè)購得的侵肺軍團(tuán)菌特異性抗體，
-用鈍化細(xì)菌接種兔子來產(chǎn)生侵肺軍團(tuán)菌特異性的抗體，上述細(xì)菌已經(jīng)預(yù)先在調(diào)控培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
可以在未與珠子結(jié)合的主要抗體(上述兩個(gè)中的一個(gè))存在下通過第一個(gè)反應(yīng)來間接進(jìn)行該步驟，然后用識(shí)別主要抗體的次要抗體覆蓋的珠子(例如，Dynabeads M-450山羊抗鼠IgG，直徑4.5μm，DynalBiotech)來進(jìn)行免疫濃縮。
3)酶標(biāo)記200mM的若丹明123。
若丹明123是膜電勢熒光標(biāo)記。膜電勢的改變導(dǎo)致該熒光素較弱地并入細(xì)胞中。該探針的分布是細(xì)胞外部1單位，細(xì)胞質(zhì)間隔中為10000。結(jié)合并入方式(電勢依賴性)，該細(xì)胞特異性確保了發(fā)射的熒光反映了全部細(xì)胞活性。
若丹明123，調(diào)控培養(yǎng)基的成分，將在繁殖過程中并入微生物中，且可以獲得帶有633nm最佳發(fā)射波長的熒光細(xì)菌。
此外，加入寬譜抗生素可以消除通常和軍團(tuán)菌相關(guān)細(xì)菌如金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌的可能的樣品細(xì)菌污染。通過去耦膜電勢來作用的這些抗生素誘導(dǎo)弱的或不存在的若丹明123標(biāo)記。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測和計(jì)數(shù)樣品中微生物的方法，包括步驟a)選擇性地富集樣品中所探尋的微生物，b)調(diào)控上述微生物，c)免疫磁性濃縮調(diào)控的微生物，d)熒光標(biāo)記濃縮的微生物，和e)檢測和分析熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述富集步驟是在組合物中進(jìn)行的，該組合物包括-濃度范圍為1至20g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選為1至10g/L，更優(yōu)選為4至6g/L，-濃度范圍為0.5至5g/L的硫代硫酸鈉，優(yōu)選為0.5至3g/L，更優(yōu)選約為2g/L，-濃度為500至20000u/L的過氧化氫酶，優(yōu)選為2000至8000u/L，更優(yōu)選為約5000u/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中上述組合物另外包括至少一種抗生素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，其中調(diào)控步驟是對所探尋微生物特異性的至少一種酶活性的誘導(dǎo)步驟，包括將至少一種對上述酶特異性的非熒光底物加入微生物的富集培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述步驟a)和b)可以同時(shí)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中步驟c)可以在步驟b)之前進(jìn)行或步驟c)可以在步驟d)之后進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的方法，其中在所探尋微生物是革蘭氏陽性細(xì)菌的情況下，調(diào)控步驟另外包括所探尋微生物的至少一種表面抗原特征的誘導(dǎo)步驟，包括將濃度為5至50g/L的酵母提取物加入微生物的富集培養(yǎng)基中，優(yōu)選10至20g/L，更優(yōu)選為約10g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的方法，其中免疫磁性濃縮步驟包括如下步驟a)將存在于調(diào)控培養(yǎng)基中的所探尋微生物與對抗微生物特異性抗原的抗體接觸，上述抗體與磁性珠子結(jié)合，b)從培養(yǎng)基中分離珠子-抗體-微生物復(fù)合體，c)從剩下的復(fù)合物中分離微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中與磁性珠子結(jié)合的抗體是對抗一種抗體的，后一抗體是自身對抗微生物特異性抗原的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述磁性珠子具有1至20μm的直徑，優(yōu)選2至8μm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10之一的方法，其中所探尋微生物的熒光標(biāo)記是通過將至少一種底物加入含有上述微生物的培養(yǎng)基中來進(jìn)行的，底物包括一個(gè)對釋放的酶活性特異性的部分和一個(gè)標(biāo)記部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述標(biāo)記部分包括在488nm激發(fā)的熒光標(biāo)記，該熒光標(biāo)記選自呫噸、吖啶、藻膽蛋白、花青或七葉苷。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中對釋放的酶活性特異性的底物部分選自脂肪酸、單糖、磷酸鹽、和/或硫酸鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13之一的方法，其中可以計(jì)數(shù)微生物的熒光素檢測和分析是通過選自以下的技術(shù)來進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)、過濾細(xì)胞計(jì)數(shù)或熒光顯微鏡。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14之一的方法，其中在如權(quán)利要求1中所限定的步驟a)、b)、c)，和e)之前為分析樣品的過濾步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述過濾是通過孔隙度為20至150微米的過濾器來進(jìn)行的，優(yōu)選30至100微米，更優(yōu)選約為63微米。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述過濾是通過孔隙度為0.2至10μm的膜來進(jìn)行的，優(yōu)選0.2至5μm，更優(yōu)選為0.2至0.5μm。
18.用于樣品中所探尋微生物的選擇性富集培養(yǎng)基，包括-使上述微生物繁殖的營養(yǎng)組合物，和-用于上述微生物的選擇性復(fù)活組合物，其中其包括-濃度為1至20g/L的丙酮酸鈉，優(yōu)選為1至10g/L，更優(yōu)選為4至6g/L，-濃度為0.5至5g/L的硫代硫酸鈉，優(yōu)選為0.5至3g/L，更優(yōu)選約為2g/L，-濃度為500至20000u/L的過氧化氫酶，優(yōu)選為2000至8000u/L，更優(yōu)選為約5000u/L。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的富集培養(yǎng)基，其中其進(jìn)一步包括至少一種抗微生物劑。
20.用來實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至17之一的檢測和計(jì)數(shù)微生物方法的試劑盒，包括-液體或脫水形式的根據(jù)權(quán)利要求18或19的富集培養(yǎng)基，用約為63μm孔隙度的全面積過濾器排列的塑料袋，-如權(quán)利要求8所限定的磁性珠子，-如權(quán)利要求11所限定的一種或數(shù)種凍干形式的底物-合適的溶劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測和計(jì)數(shù)樣品中微生物的方法，包括以下步驟(a)選擇性富集樣品中所探尋的微生物，(b)調(diào)控所述微生物，(c)免疫磁性濃縮調(diào)控微生物，(d)熒光標(biāo)記濃縮微生物，和(e)檢測和分析熒光。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1714156SQ200380104040
公開日2005年12月28日 申請日期2003年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月1日
發(fā)明者B·韋德里納, A·拉雪茲, V·卡雷 申請人:梅蒂斯生物技術(shù)公司