專利名稱：一種以自由基發(fā)生源與生物反應器耦合系統(tǒng)促進微生物生產(chǎn)自由基相關酶及化合物的方法
技術領域：
一種以自由基發(fā)生源與生物反應器耦合系統(tǒng)促進微生物生產(chǎn)自由基相關酶及化合物的方法，自由基可以通過光催化、超聲波、放射法、Fenton試劑反應及臭氧發(fā)生法等自由基發(fā)生的物理或化學方法產(chǎn)生，與自由基代謝相關的酶類及化合物包括有過氧化氫酶(CAT)、輔酶Q10、過氧化物酶(POX)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽、膽紅素、胱氨酸、組氨酸、?；撬岬任⑸锎x產(chǎn)物。
背景技術：
自由基是指分子、原子或基團中有未配對電子的一類物質，包括超氧陰離子(O2-或H2O-)、羥自由基(-OH)、單線態(tài)氧(1O2)、脂質過氧化物(RO-、ROO-與ROOH)等。
自由基具有高度的氧化活性，極不穩(wěn)定，活性極高，它們攻擊細胞膜、線粒體膜，與膜中的不飽和脂肪酸反應，造成脂質過氧化增強。脂質過氧化產(chǎn)物又可分解為更多的自由基，引起自由基的連鎖反應。這樣，膜結構的完整性受到破壞，引起肌肉、肝細胞、線粒體、DNA、RNA等廣泛損傷從而引起各種疾病，諸如炎癥癌癥、擴張性心肌病、老年性白內障、哮喘等疾患。故自由基是人體疾病、衰老和死亡的直接參與和制造者。
人體靠某些酶來清除自由基，故體內自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。人類機體組織的清除自由基相關酶與化合物有過氧化氫酶(CAT)、輔酶Q10、過氧化物酶(POX)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽、膽紅素、胱氨酸、組氨酸、?；撬岬?。
上述酶類除了在保健、抗衰老方面具有作用外，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)其應用領域也越來越廣泛。以過氧化氫酶為例，它在食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)一直有著廣泛的用途。它可作為消除啤酒、飲料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化劑。與葡萄糖氧化酶并用作為氧的去除劑，用于牛乳及干酪原料乳的殺菌。在臨床分析中，對研究自由基代謝失衡，抗衰老和腫瘤發(fā)病機理具有一定價值，對某些疾病的診斷，鑒別亦具有重要意義。在醫(yī)藥方面，可用于隱形眼鏡消毒過程中殘留過氧化氫的分解。過氧化氫酶還與H2O2同時使用，用于橡膠成型，塑料及多泡性粘合劑。近年來隨著H2O2在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應用，市場對過氧化氫酶的需求呈大幅增長趨勢。其中在織物染整工藝中，采用過氧化氫酶去除漂白廢液中殘余H2O2，不僅能避免給后續(xù)染色工序帶來問題，大幅度提高過氧化氫去除率從而確保染色的良好可再現(xiàn)性，還能使漂染同浴，節(jié)省大量的水、電、汽的消耗，并顯著提高生產(chǎn)效率。
目前自由基相關酶及化合物的生產(chǎn)主要有兩個途徑一是從生物體內提取，二是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。而后者大多處于研究階段，生產(chǎn)水平較低。后者的生產(chǎn)中，自由基的來源目前以添加過氧化氫為主要手段，還沒有考慮到將自由基發(fā)生源與生物反應器相結合。由于自由基濃度升高對自由基代謝相關酶及化合物產(chǎn)生具有誘導作用，如果將自由基發(fā)生源結合到生物發(fā)酵過程中，將可能為微生物提供各種自由基種類并實現(xiàn)更為穩(wěn)定的濃度控制，最終將促進自由基相關酶及化合物的生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高微生物法生產(chǎn)自由基相關酶及化合物如過氧化氫酶產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的技術方案，采用自由基發(fā)生源與生物反應器耦合系統(tǒng)促進微生物生產(chǎn)自由基相關酶及化合物的方法是A)以物理或化學方法獲得穩(wěn)定的自由基發(fā)生源；B)自由基發(fā)生源與生物反應器相耦合；C)該耦合系統(tǒng)所針對的對象為與自由基反應相關的所有酶類及化合物。
通過物理或化學方法產(chǎn)生自由基的途徑主要有A)水經(jīng)紫外線照射及光催化分解產(chǎn)生多種氧的自由基；B)通過生成臭氧后進一步在水中轉變成自由基；C)通過超聲波作用在水中生成自由基；D)采用放射線照射使水分解，產(chǎn)生自由基；E)利用Fenton試劑生成自由基。
自由基發(fā)生源與生物反應器相耦合的系統(tǒng)。包括生物反應器與自由基發(fā)生源的串聯(lián)系統(tǒng)；生物反應器與自由基發(fā)生源的流加組合系統(tǒng)；生物反應器與自由基發(fā)生源的一體化系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及的促進微生物合成的相關酶類及化合物，包括過氧化氫酶、輔酶Q10、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、膽紅素、胱氨酸、組氨酸、?；撬?。
本發(fā)明方法還可用于篩選對自由基及活性氧具有抗性的微生物菌種的篩選方法。
本技術方案自由基發(fā)生源以二氧化鈦光催化反應器為例，生產(chǎn)的自由基相關酶及化合物以過氧化氫酶為例。
自由基發(fā)生源二氧化鈦光催化反應器，紫外燈為光源。
菌種金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862，購自日本NBRC(原日本“大阪發(fā)酵研究所”)。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基PDA(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂16，pH6.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO41，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.8。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)糊精10～30，乙醇0.5％～3％(培養(yǎng)基體積比)，蛋白胨5～20，K2HPO45，KH2PO4·3H2O 3，MgSO4·7H2O 2，pH7.0。
培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養(yǎng)6-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。吸取種子培養(yǎng)液，按5-12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，5L生化反應器培養(yǎng)5天。
過氧化氫酶活性測定發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后的清液直接用于過氧化氫酶活力的分析。過氧化氫酶活力采用分光光度法在25℃下測定。反應總體積為3mL，含0.1ml酶液和2.9ml含有10mmol/L H2O2的50mmol/L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.0)。過氧化氫的分解速率用752型紫外-可見光分光光度計在240nm下測定。酶活定義為在25℃下，每分鐘分解1μmol H2O2所需的酶量為一個酶活單位。
提高過氧化氫酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式在發(fā)酵體系中流加由光催化產(chǎn)生的自由基。
5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時，罐中裝3L培養(yǎng)基，實罐滅菌，冷卻后用NaOH調節(jié)pH至7.0。通氣量為0.5vvm～1.5vvm，攪拌轉速為300r·min-1～500r·min-1，接種量為2％～10％。培養(yǎng)基中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液，流加速率為0.1～1.0mL/h。5天后發(fā)酵液中過氧化氫酶水平達到5188U/mL。
本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明選用的光催化自由基發(fā)生源可以穩(wěn)定產(chǎn)生各種自由基，通過流加方式加入到生物發(fā)酵體系中，對金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus IFO9862)合成過氧化氫酶具有很強的誘導與刺激作用。通過上述光催化反應器與生物反應器的耦合工藝，在5L發(fā)酵罐中恒速流加自由基，5天后過氧化氫酶水平達到5188U/mL。
具體實施例方式
實施例1以乙醇為單一碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為408U/mL。
實施例2以糊精為單一碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為882U/mL。
實施例3采用由糊精和乙醇組成的混合碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為1594U/mL。
實施例4在實施例1的基礎上，發(fā)酵中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液(10mmol/L，以過氧化氫當量計)，流加速率為0.1～1.0mL/h，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為1020U/mL。
實施例5在實施例2的基礎上，發(fā)酵中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液(10mmol/L，以過氧化氫當量計)，流加速率為0.1～1.0mL/h，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為1680U/mL。
實施例6在實施例3的基礎上，發(fā)酵中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液(20mmol/L，以過氧化氫當量計)，流加速率為0.1～1.0mL/h，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為5188U/mL。
權利要求
1.一種促進微生物生產(chǎn)自由基相關酶及化合物的方法，其特征是采用以自由基發(fā)生源與生物反應器耦合系統(tǒng)A)以物理或化學方法獲得穩(wěn)定的自由基發(fā)生源；B)自由基發(fā)生源與生物反應器相耦合；C)該耦合系統(tǒng)所針對的對象為與自由基反應相關的所有酶類及化合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是自由基發(fā)生源，包括水經(jīng)紫外線照射及光催化分解產(chǎn)生多種氧的自由基；通過生成臭氧后進一步在水中轉變成自由基；通過超聲波作用在水中生成自由基；采用放射線照射使水分解，產(chǎn)生自由基；利用Fenton試劑生成自由基。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是自由基發(fā)生源與生物反應器相耦合的系統(tǒng)，包括生物反應器與自由基發(fā)生源的串聯(lián)系統(tǒng)；生物反應器與自由基發(fā)生源的流加組合系統(tǒng)；生物反應器與自由基發(fā)生源的一體化系統(tǒng)。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是促進微生物合成的相關酶類及化合物，包括過氧化氫酶、輔酶Q10、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、膽紅素、胱氨酸、組氨酸、?；撬?。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是將自由基發(fā)生源與生物反應器相耦合系統(tǒng)用于篩選對自由基及活性氧具有抗性的微生物菌種的篩選方法。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是采用二氧化鈦光催化反應器，紫外燈為光源的自由基發(fā)生源；以金黃色嗜熱子囊菌為發(fā)酵菌種；以糊精和乙醇為培養(yǎng)基的混合碳源促進發(fā)酵制備過氧化氫酶。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是所述發(fā)酵過程菌種金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862；培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基PDA(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂16，pH6.0；種子培養(yǎng)基(g/L)酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO41，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.8；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)糊精10～30，乙醇0.5％～3％(培養(yǎng)基體積比)，蛋白胨5～20，K2HPO45，KH2PO4·3H2O 3，MgSO4·7H2O 2，pH7.0；培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養(yǎng)6-8d，待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，吸取種子培養(yǎng)液，按5-12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，5L生化反應器培養(yǎng)5天。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是流加自由基5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時，罐中裝3L培養(yǎng)基，實罐滅菌，冷卻后用NaOH調節(jié)pH至7.0，通氣量為0.5vvm～1.5vvm，攪拌轉速為300r·min-1～500r·min-1，接種量為2％～10％，培養(yǎng)基中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液，流加速率為0.1～1.0mL/h。
全文摘要
一種以自由基發(fā)生源與生物反應器耦合系統(tǒng)促進微生物生產(chǎn)自由基相關酶及化合物的方法，涉及以物理或化學發(fā)生源產(chǎn)生的自由基提高自由基相關酶類及化合物的生產(chǎn)。以金黃色嗜熱子囊菌發(fā)酵制備過氧化氫酶為例，本發(fā)明通過采用糊精和乙醇作為培養(yǎng)基的混合碳源，在發(fā)酵過程中流加光催化產(chǎn)生的含自由基的水溶液，流加速率為0.1～1.0mL/h，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為5188U/mL。
文檔編號C12N13/00GK1546661SQ20031011268
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權日2003年12月16日
發(fā)明者堅 陳, 陳堅, 華兆哲, 李寅, 倫世儀 申請人:江南大學