專利名稱：一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，更具體地說涉及一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法。
微生物是極微小的生物(包括病毒)，形態(tài)簡單、繁殖迅速，廣泛地分布在土壤、水、空氣和人、動物、植物體內(nèi)，有對人類有益的如酵母等，也有對人類有害的如各種致病菌、病毒。微生物的檢測是一種定性定量的分析。定性分析，檢測微生物的種類、種群或變種或某種特殊的抗原或基因序列的存在，例如鑒定含轉(zhuǎn)基因的動植物；定量分析，檢測物種的數(shù)量或濃度，測定的方法可以是細胞培養(yǎng)計數(shù)方法、血清免疫方法以及核酸擴增方法，細胞培養(yǎng)計數(shù)方法(培養(yǎng)、分離、鑒定)為直接方法，無需標(biāo)準(zhǔn)樣，其它為間接方法，需要有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣作對照。核酸是生物物種的遺傳物質(zhì)，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本組成是四種核苷酸(或堿基)，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。核苷酸(堿基)在核酸中組成鏈狀結(jié)構(gòu)，DNA一般為雙鏈結(jié)構(gòu)，RNA為單鏈結(jié)構(gòu)；DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)可以在適當(dāng)?shù)臈l件下分解成單鏈，單鏈的DNA也可以與單鏈的RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一核酸結(jié)構(gòu)中，一部分可以是單鏈另一部分可以是雙鏈。在雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)中堿基A與另一鏈的T(U)通過氫鍵形成堿基對，同理G與另一鏈的C形成堿基對，能形成堿基對的堿基為互補堿基。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補核酸鏈，互補的核酸鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，由互補的兩單鏈分子結(jié)構(gòu)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)的過程稱為分子雜交。非完全互補的核酸鏈(部分互補)在特定條件下也會形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復(fù)制出互補的核酸鏈，在復(fù)制過程中，被復(fù)制的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA互補鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補，并可與其雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。核酸聚合酶反應(yīng)的始點決定于引物的位置，DNA的聚合反應(yīng)從引物的3’末端開始(DNA及cDNA聚合反應(yīng))。RNA聚合酶反應(yīng)需要有雙鏈的被RNA聚合酶識別的結(jié)構(gòu)，稱為驅(qū)動子。引物核酸片段可以由幾個或幾十個堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過降解自然核酸而取得的片段，也可以通過人工化學(xué)合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))，非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))包括在自然界中不是核酸組分的結(jié)構(gòu)，也包括不存在于自然界的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復(fù)制以及模板分子的擴增。DNA可以在聚合酶等的作用下被復(fù)制，即由模板鏈復(fù)制出互補鏈，DNA的復(fù)制需要有一引物，引物一般為一含有幾個或幾十個堿基的核酸鏈，核酸鏈具有方向性分別用5’端和3’端表示，接近5’端的序列稱為5’端部分，接近3’端的稱為3’端部分，核酸復(fù)制前引物與模板在3’端有特異性地根據(jù)堿基配對原理結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)(這一過程稱為分子雜交)，此后聚合酶可從引物的3’端開始沿5’→3’方向合成與模板相互補的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(℃＞90℃)分離成獨立的單鏈，當(dāng)溫度下降時余下的引物分子可再與相應(yīng)的模板核酸分子雜交，并可在聚合酶的作用下復(fù)制出新的核酸鏈，反復(fù)如上過程，一個核酸片段可被擴增出千萬個同樣的分子片段，如上過程即為聚合酶鏈反應(yīng)過程(PCR)。另外一種擴增方法為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即把一個帶驅(qū)動子的DNA分子轉(zhuǎn)錄成多個RNA分子，然后可把所產(chǎn)生的RNA分子再逆轉(zhuǎn)錄成多個DNA分子。一核酸樣品需擴增的部分為靶片段，進行PCR反應(yīng)一般在靶片段兩端要有相應(yīng)的引物，對一多態(tài)位點附近的序列專一的引物為多態(tài)性引物，用化學(xué)的方法可以人工合成核酸片段作為引物，引物的堿基序列與靶片段序列相互補，另外引物序列中可具有與核酸樣品中的序列非互補的序列，這種與樣品不具互補性的序列稱為外源序列，外源序列可作為引物的部分結(jié)構(gòu)。靶物或靶分子即被檢查的物質(zhì)或分子(蛋白、核酸、多糖等)或是一化學(xué)反應(yīng)中所需探明的物質(zhì)?；蛐酒且环N把不同核酸分子分別排列于特定位置，并用于核酸分子雜交的裝置，固定于基因芯片上的核酸分子為探針分子，與探針分子進行特異性雜交的為靶分子，根據(jù)探針分子及標(biāo)記在芯片的位置可對靶分子進行識別，標(biāo)記可有多種形式，如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、納米顆粒標(biāo)記、酶標(biāo)記、色素標(biāo)記等，用以區(qū)別不同基因型的核酸探針分子為基因型探針。由引物引發(fā)的聚合反應(yīng)或擴增反應(yīng)常用于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測。RNA包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA，mRNA為信使RNA，作為蛋白質(zhì)合成的模板，帶有指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的密碼，rRNA為核糖體RNA，是蛋白質(zhì)合成過程中所需的核糖體的組成部分，tRNA為轉(zhuǎn)移RNA是用于識別mRNA上的密碼并攜帶相應(yīng)氨基酸的RNA，基因組RNA為病毒RNA。細菌中的(不包括病毒)rRNA有如下特點①一細胞內(nèi)有大量的rRNA，當(dāng)用rRNA作為靶物(靶分子)時，可以提高檢查的靈敏度；②不同的微生物種類在rRNA結(jié)構(gòu)上有差異，因此也可根據(jù)rRNA的序列進行微生物(細菌、真菌)的物種鑒別(識別)。對RNA(包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA)進行擴增前，必須把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，用RNA做為模板所合成的DNA鏈，cDNA可用常規(guī)的PCR方進行擴增。核酸擴增前需進行提取，或叫純化，RNA的提取出方法與DNA的提取有差異，具體方法為已知技術(shù)。抗原是一類能刺激人或動物機體產(chǎn)生抗體，并能與這些抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w是由抗原刺激人體或動物體的B細胞，由B細胞轉(zhuǎn)化成漿細胞所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白。特異性，即專一性或選擇性，或非隨機性，但這種特異性在生物反應(yīng)中不一定是100％的，一般要根據(jù)反應(yīng)的條件和對結(jié)果的要求而定。在應(yīng)用中，所需要的試劑為反應(yīng)試劑，要進行混合然后在試管或其他反應(yīng)器中進行反應(yīng)。反應(yīng)試劑根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專一試劑，專一試劑包括引物、酶等。一種反應(yīng)試劑在某個反應(yīng)中可能是專一試劑，在另一反應(yīng)中可能是通用試劑。一般來說通用試劑指的是同一批的多個反應(yīng)中的共同試劑，專一試劑是多個反應(yīng)中，個別反應(yīng)所需的試劑。另外反應(yīng)中可以加入添加劑，添加劑在反應(yīng)中不參與反應(yīng)。常用的添加劑包括蛋白質(zhì)(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會影響酶反應(yīng)。添加劑的特性包括溶于水后會膨脹并可形成膠狀物態(tài)，可起到膠合劑作用；去水后會收縮、結(jié)塊，也可以固化，形成固化物。在有些反應(yīng)中也可使用親和分子，或叫親和物，即一種有機分子或有機物，它對另一種有機分子(物)有特異性(或?qū)Ｒ恍?的親和結(jié)合能力。對大多數(shù)微生物都能找到或制出相應(yīng)的抗體蛋白，這些抗體可以用來富集、識別和檢測相應(yīng)的微生物，親和分子也可是核酸分子，一核酸片段與另一核酸片段有互補序列(能相互雜交)，則其中一種核酸片段可以是另一種核酸片段的親和分子(物)，被認識的叫靶分子。親和物(分子)可與相應(yīng)的靶物(如細菌)或靶分子(如核酸或蛋白分子)結(jié)合，親和物(分子)也可結(jié)合到含鐵或具順磁性(能被磁力吸引)物體的微顆粒表面，在磁力的作用下可將被檢樣品中靶物(靶分子)分離出來。已有的檢測微生物的方法主要還是延續(xù)細胞培養(yǎng)計數(shù)方法，這種方法檢測周期長，人工操作工作量大，易出錯；現(xiàn)有核酸擴增法由于對樣品的處理較為麻煩而且對多菌種同時檢測準(zhǔn)確率較低，很難適應(yīng)成批量的經(jīng)常性項目檢測。
本發(fā)明的目的是提供一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法，包括取樣、樣品中微生物核酸提取，核酸靶片段擴增，及對微生物進行定性定量分析，其特征是用親和試劑對樣品中的靶物進行特異性富集，使靶物中的靶分子和標(biāo)準(zhǔn)樣中的靶分子在置有固化引物的反應(yīng)器內(nèi)擴增，把樣品的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果進行比較，根據(jù)比較作出定性定量分析。
本發(fā)明的優(yōu)點是能大大提高批量的和經(jīng)常性項目的微生物檢測的效率，并能省時省料大幅降低成本，能提高檢測質(zhì)量并可防止產(chǎn)物污染。本方法可對人體、動植物、食品、環(huán)境中的微生物(病毒)進行定性定量檢測，用于疾病診斷、食品檢測、商檢、環(huán)保評估、檢疫等。
下面通過實施例說明本發(fā)明。
實施例一。一種可同時對8種微生物進行定性定量檢測的試劑盒及檢測方法?？蓹z的微生物種類為沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、糞鏈球菌、大腸菌、糞大腸菌、肉毒梭菌、創(chuàng)傷弧菌，試劑盒包括以下幾個部分。1、標(biāo)準(zhǔn)樣，按微生物學(xué)方法，制備微生物菌種，使每種微生物的濃度均為每毫升液體有1×106群落單位，存于-20℃25％的甘油和75％的培養(yǎng)液中，微生物的濃度也可根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)的最高限而設(shè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣要做定期檢查鑒定其群落單位濃度。標(biāo)準(zhǔn)樣是已知的定性定量的經(jīng)過計算的比照物(是與未知的待檢測的樣品中的微生物相比較的)。標(biāo)準(zhǔn)樣分裝成多個1毫升的標(biāo)準(zhǔn)樣管(一次性使用)并存于-80℃或-20℃的冰柜中。2、親和試劑，親和試劑是附有親和分子的微顆粒，此實施例中是順磁性的微顆粒(順磁性物體是會被磁力吸引，但本身不具有磁性，如鐵屑等)，體積為1mm3左右，微顆粒外附有與上述8種微生物具特異性的抗體分子，這些抗體可用已知的方法取得(如常規(guī)免疫學(xué)方法)，把此試劑分裝于多個小管，每個小管的親和試劑能足夠吸附所有8種微生物的細胞(共8×107個或10倍大于標(biāo)準(zhǔn)樣)，親和試劑存放于磷酸緩沖液中。3、固化引物及反應(yīng)器，分別用已知的分子生物學(xué)方法設(shè)計并合成8組(種)反應(yīng)引物(核酸引物分子)(將用于PCR擴增)，每組相對應(yīng)于一種微生物，核酸靶片段可為微生物的rRNA中的特殊序列或基因組中的特殊序列(這些是已知)。把每組引物與淀粉(一種添加劑)混合，加熱溶解使淀粉濃度為5％，引物的濃度為5μM，然后把10μl的混合物放到設(shè)定的反應(yīng)器孔中。反應(yīng)器是具有96孔(8×12)的平面裝置，孔的橫向排列(排)編號為A、B、C、D、E、F、G、H，縱向排列(列)編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，96個孔的編號分別為A1、A2……A12……H1、H2……H12。把8組溶解的引物分別放于相應(yīng)的96個孔內(nèi)(每孔10μl)，使同一排中的12孔具有相同的引物(如A1、A2……A12是一種引物；B排是另一種)。全部填置溶解的引物與淀粉的混合物后，用已知的方法使引物的水分蒸發(fā)，使得引物分子固定于淀粉塊中形成固化引物。把反應(yīng)器加封封存待用。4、核酸純化試劑，此試劑可根據(jù)已知的方法配制或購置，本實施例中使用RNA純化試劑。5、酶試劑，用于對核酸靶分子進行擴增，第一部分是用于cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄酶試劑，可購置，對cDNA或DNA進行PCR擴增的PCR試劑也可購置。6、進行數(shù)據(jù)分析的電腦軟件。7、其它，用于完成檢測過程的必要緩沖液及用具；說明書，說明書規(guī)定了詳細嚴格的操作程序及注意事項。本實施例的操作程序及方法①微生物(靶物)的富集，把2.0ml的待測的樣品原液(勻液)轉(zhuǎn)種于18.0ml的增菌液內(nèi)，然后分成兩份裝管，分別標(biāo)為甲管、乙管。甲管中再加入1管親和試劑，再加入1.0ml增菌液；乙管中再加入1管標(biāo)準(zhǔn)樣再加入1管親和試劑。把甲乙兩管在37℃搖動60分鐘后，用磁鐵把親和試劑與微生物的復(fù)合體吸引到管壁，把增菌液除去，撤掉磁鐵，加入10ml冰冷的生理鹽水進行清洗，再加磁鐵，反復(fù)清洗一次，除去清洗液后甲乙兩管各加入1ml核酸抽提液。以上過程稱為對樣品中靶物進行特異性富集。②核酸抽提，用已知的方法進行RNA提取，最后把RNA溶解于50μl超凈水中，仍分為甲乙兩管。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用已知的方法進行，反應(yīng)后RNA被轉(zhuǎn)錄成cDNA，至此分別產(chǎn)生了兩個cDNA樣品，分別稱為(樣品)甲管，(標(biāo)準(zhǔn)樣)乙管，每樣為160μl。④DNA(cDNA)擴增，用本試劑盒所提供的具固化引物的(96孔)反應(yīng)器進行。首先用已知方法配制12管相同的PCR反應(yīng)液，每管720μl，反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)所需的酶和其他成分(如對雙鏈DNA有專一的熒光劑)，但不包括靶物和引物。把12管反應(yīng)液分成兩組(每組6個)即甲組、乙組，12管的編號分別為甲0、甲-4、甲-3、甲-2、甲-1、甲1；乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1。取經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的樣品甲管中的樣品80μl加入甲1中(80μl+原720μl共800μl)將甲1中的800μl液體均分為8份，分別加入到反應(yīng)器A6、B6、C6、D6、E6、F6、G6孔中。然后對樣品甲管中余留的80μl樣品液進行10倍梯度稀釋。分別把80μl稀釋樣加入到相應(yīng)的反應(yīng)液管中，如1/10稀釋樣放入到甲-1；1/100稀釋樣放入到甲-2；1/1000的稀釋樣放入到甲-3；1/10000稀釋樣放入到甲-4；在甲0中加入80μl水做為零對照。甲-1內(nèi)800μl液體同樣均分為8份，分別加入到反應(yīng)器第五列的8孔A5、B5、C5、D5、E5F5、G5、H5孔中，甲-2同樣均分，分別加入到第四列的8孔A4、B4……G4、H4孔中；甲-3同樣均分，分別加入到第三列的8孔A3……H3孔中；甲-4同樣均分，分別加入到第二列的8孔A2……H2孔中；甲0同樣均分，分別加入到第一列的8孔A1……H1孔中。標(biāo)準(zhǔn)樣乙管如同樣品甲管同樣做反應(yīng)液稀釋處理，分別成為乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1，然后各管同樣均分，分別加入到A7、B7、C7……F12、G12、H12(第七列至第十二列的)孔中。以上甲類管是樣品稀釋液，乙類管是標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋液。96個孔裝好后，每個孔內(nèi)都有不同的固化引物加樣品稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋液。相同的固化引物孔內(nèi)加入不同的質(zhì)、量的稀釋液；相同的質(zhì)、量的稀釋液添入不同的固化引物孔內(nèi)。以上工作也可由自動化的機械手進行操作。如上工作完成后用透光密封片將反應(yīng)器加封然后放入PCR儀中進行擴增。⑤信號采集，經(jīng)過約2小時的PCR反應(yīng)后，對每孔的反應(yīng)物進行熒光測定(不開封)，也可用附有熒光儀的PCR儀在PCR反應(yīng)過程中進行同步熒光測定。⑥結(jié)果分析，獲取熒光信號后做一圖表，把熒光信號強度做Y軸，稀釋度的X軸，X軸與Y軸交叉點為O，把樣品甲的熒光信號與稀釋度對比在圖中標(biāo)出6個點來連成一條曲線；把標(biāo)準(zhǔn)樣乙的熒光信號與稀釋度對比做出另一條曲線。這樣每一種相應(yīng)的微生物都在圖中有兩條曲線(一為樣品的對數(shù)曲線，一為加標(biāo)準(zhǔn)樣的對數(shù)曲線)，由于標(biāo)準(zhǔn)樣的菌數(shù)已知，從兩曲線的差值中就可推算出樣品中某種微生物的菌數(shù)(單位體積，或重量所含某種微生物的數(shù)量)。當(dāng)樣品的微生物數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)樣的微生物數(shù)一樣時，樣品曲線的斜率應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)樣曲線的一半。當(dāng)樣品曲線的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同時，樣品中的這種微生物必定大于標(biāo)準(zhǔn)物的微生物的最高濃度。數(shù)據(jù)分析也可采取別的半自動或全自動方法，如用先設(shè)定的電腦軟件進行比較、作圖、輸入基本數(shù)據(jù)作出曲線，可以簡化操作減少誤差。
作為實施例的變更，反應(yīng)器可具有384個反應(yīng)孔(16×24)反應(yīng)器可分為4個部分，每個部分96個孔(8×12)，可同時進行4個樣品、8種微生物或2個樣品16種微生物的檢測。同理，可采用1536(32×48)個反應(yīng)孔的反應(yīng)器對多樣品多種微生物進行檢測。
實施例二。一種通用的檢測食品安全性(微生物)的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法。在本實施例中操作方法及程序基本上與實施例一相同，所不同的在于①本實施例需要檢測的微生物包括沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌。②本實施例只對如下微生物進行定性檢測沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒，因只做定性檢測，無需做梯度稀釋，節(jié)省的反應(yīng)器空間可用于更多種類的微生物進行測定。③對大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌進行定性定量檢測。④定性檢測與定性定量檢測在一個反應(yīng)器內(nèi)一次完成。⑤此試劑盒是通用的可適用于任何食品，即能完成對致病菌的定性檢測，并同時檢測定性定量的菌群，完成定量菌群的數(shù)量確定。⑥將大多食品有關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)、國際標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)全部輸入到計算機制成軟件，當(dāng)食品樣品檢測完畢后再比照。
實施例三。水質(zhì)污染檢測試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法。此類試劑盒產(chǎn)品及方法基本上同食品安全性試劑盒相同，只是個別的菌種有所增減，取樣的方法方式略有不同，如采用過濾取樣法。
實施例四。一種醫(yī)學(xué)臨床微生物檢測的試劑盒及其檢測方法。此類試劑盒主要是檢測危及人類健康的致病菌及病毒，對其進行定性定量分析，為疾病診斷提供根據(jù)。檢測樣品的采樣方法可按照國家標(biāo)準(zhǔn)，樣品來源于血液、骨髓液、漿膜腔液、尿液、膿液、胃液、膽汁、糞便、皮膚標(biāo)本、各種分泌物等。產(chǎn)品的主要部分及其檢測方法如同實施例一。產(chǎn)品主要檢測醫(yī)學(xué)臨床微生物(病毒)經(jīng)常檢測的種類，計有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腸球菌、嗜血桿菌、沙門菌、大腸埃希菌、結(jié)核菌、李斯特菌、銅綠甲單胞菌、厭氧菌、克雷伯菌、變形桿菌、淋球菌、鉤端螺旋體、放線菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉菌、念珠菌、百日咳菌、腸道細菌、曲霉菌、彎曲菌、志賀菌、弧菌、副溶血弧菌、梅毒、棒狀桿菌、真菌、莫拉菌、幽門螺旋菌、軍團菌；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、人巨細胞病毒、EB病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒I型(II型)、柯薩奇病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、乙型腦炎病毒、骨髓灰質(zhì)炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、HIV、ECHO病毒、森林腦炎病毒、登革病毒、漢坦病毒、新疆出血熱病毒、狂犬病病毒。
實施例五。一種用于商品進出品檢驗的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法。對于進出口的食品、動物、植物按照國家標(biāo)準(zhǔn)、國際標(biāo)準(zhǔn)進行微物(病毒)檢測。進出口的商品范圍廣泛，所檢的微生物(病毒)種類多，產(chǎn)品的變化也較快。產(chǎn)品的主要部分及其檢測方法與程序參照實施例一，對于進出口的食品的商檢參照實施例二。進出口商檢包括動物、植物、物種鑒定、轉(zhuǎn)基因品種等，對動、植物主要是進行病毒的檢測，如雞瘟病毒、瘋牛病病毒、口蹄疫病毒等等，1999年國際第七次病毒標(biāo)準(zhǔn)約有4000種，按照核酸分類共八大類，即DNA—單股DNA病毒，DNA-雙股DNA病毒，DNA與RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，RNA病毒—雙股RNA病毒，RNA病毒—負鏈、單股RNA病毒，RNA病毒—正鏈、單股RNA病毒，裸露RNA病毒及類病毒。本產(chǎn)品根據(jù)國家、國際標(biāo)準(zhǔn)在產(chǎn)品設(shè)計上約有以上八大類中百余種病毒，根據(jù)不同的商品，時期性、標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。
實施例六。一種用于人員檢疫的試劑盒及其檢測方法。此類試劑盒主要是針對傳染病病毒設(shè)計的，主要用于進出境人員檢疫等。產(chǎn)品的主要部分及其檢測方法與程序參照實施例一、實施例四。該類試劑盒所不同的是①主要是檢測引發(fā)傳染病的病毒；②檢測種類較少；③主要是定性檢測。具體檢測的種類依照國家最新標(biāo)準(zhǔn)。
本方法對樣品中病毒的檢測與對細菌的檢測略有不同①使用與病毒有親和性的親和試劑(帶有抗體的順磁性微顆粒)，富集時也可在常溫下進行，用生理鹽水取代增菌液；②逆轉(zhuǎn)錄，可用與RNA病毒有專一性的核酸引物進行逆轉(zhuǎn)錄，對DNA病毒無須進行逆轉(zhuǎn)錄。
本方法所述的標(biāo)準(zhǔn)樣中與固化引物可在產(chǎn)品出廠前已配制好，在使用時只加稀釋液；或者是標(biāo)準(zhǔn)樣、固化引物、稀釋液已配置好。
本方法所述的親和試劑為附有特異性的抗體蛋白的顆粒，或附有特異性的核酸探針分子的顆粒。微顆粒的體積≤4mm3。
本方法所述的固化引物是專一試劑(如引物)和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％；或者是專一試劑及通用試劑和添加劑的復(fù)合物，添加劑在最終反應(yīng)中的濃度不高于20％。固化引物水分含量不多于30％。
本方法所述的固化引物可以用機械的方法制成小顆粒狀或薄片狀，其每個體積≤8mm3。制成小顆粒狀或薄片狀的固化引物可以粘接固定在反應(yīng)器的孔內(nèi)。
本方法所述的親和試劑靶物為微生物或其所其具有的多糖類、蛋白質(zhì)、核酸。
本方法所述的靶分子擴增是通過PCR反應(yīng)，所被擴增的靶分子是被檢微生物所專有的RNA或DNA、cDNA。
權(quán)利要求
1.一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法，包括取樣、樣品中微生物核酸提取，核酸靶片段擴增，及對微生物進行定性定量分析，其特征是用磁親和試劑對樣品中的靶物進行特異性富集，使靶物中的靶分子和標(biāo)準(zhǔn)樣中的靶分子在置有固化引物的反應(yīng)器內(nèi)擴增，把樣品的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果進行比較，根據(jù)比較作出定性定量分析。
2.一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品，其特征是標(biāo)準(zhǔn)樣、磁親和試劑及固化引物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是標(biāo)準(zhǔn)樣做為比照物共同參與PCR擴增，并在PCR擴增后經(jīng)過信號采集、分析得出結(jié)果。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是將引物固定在反應(yīng)器的各孔內(nèi)，在進行PCR反應(yīng)時同化引物溶于反應(yīng)溶液作用于核酸擴增。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在PCR擴增前相同的固化引物孔內(nèi)加入不同的質(zhì)、量稀釋液；相同質(zhì)、量的稀釋液添入不同的固化引物孔內(nèi)。
6.如權(quán)利要求2所述，其特征是固化引物是專一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％。
7.如權(quán)利要求2所述，其特征是親和試劑是附有特異性的抗體蛋白的顆粒。
8.如權(quán)利要求2所述，其特征是親和試劑是附有特異性的核酸探針分子的顆粒。
9.如權(quán)利要求2所述，其特征是一種成小顆粒狀的固化引物，其體積≤8mm3。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是定性檢測與定性定量檢測在一個反應(yīng)器內(nèi)一次完成。
全文摘要
一種檢測微生物的試劑盒產(chǎn)品及其檢測方法，其特征是用親和試劑對樣品中的靶物進行特異性富集，使靶物中的靶分子和標(biāo)準(zhǔn)樣中的靶分子在置有固化引物的反應(yīng)器內(nèi)擴增，把樣品的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果進行比較，根據(jù)比較作出定性定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點是能大大提高批量的和經(jīng)常性項目的微生物檢測的效率，并能省時省料大幅降低成本，能提高檢測質(zhì)量并可防止產(chǎn)物污染。本方法可對人體、動植物、食品、環(huán)境中的微生物(病毒)進行定性定量檢測，用于疾病診斷、食品檢測、商檢、環(huán)保評估、檢疫等。
文檔編號C12Q1/68GK1544651SQ20031010563
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者吳昌, 吳 昌 申請人:吳昌, 吳 昌