專利名稱：一種堿性磷酸酶基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程和基因工程領(lǐng)域中一種堿性磷酸酶基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堿性磷酸酶(Alkaline phosphatases，AP)是原核和高等動物中普遍存在的一種鋅離子結(jié)合蛋白。在人和高等動物中，AP有組織特異性AP(如胎盤AP、精細胞AP和腸AP等)和非組織特異性AP(如肝、腎、骨AP)兩類。在活性上，哺乳動物體內(nèi)的AP比原核(大腸桿菌)中的活性要高10-100倍。而在所有哺乳動物中，牛小腸AP(bovine Intestine Alkaline phosphatases，bIAP)的活性最高。因此，目前bIAP被廣泛用作酶診斷試劑或者在分子克隆中用于DNA的去磷酸化或者作為報告基因研究目的基因的功能。目前堿性磷酸酶在抗原-抗體顯色系統(tǒng)中的應(yīng)用主要是先將堿性磷酸酶和目的蛋白在體外通過化學試劑進行偶聯(lián)，但這種方法成本極高，而且偶聯(lián)的效率很低，同時由于在透析過程中很難徹底除去偶聯(lián)試劑，所以進一步反應(yīng)時，特異性不強并出現(xiàn)信號干擾。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可和目的蛋白編碼基因融合并在多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)中高效表達的堿性磷酸酶基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的堿性磷酸酶基因名稱為APm，是按照多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)高表達基因的密碼子對Genbank上報道的牛小腸堿性磷酸酶(Alkalinephosphatases，AP)序列進行優(yōu)化設(shè)計得到的，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1349個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第10位到第1349位堿基。
堿性磷酸酶APm，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №2由446個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明堿性磷酸酶基因APm的表達載體，如pHFMDHZ-APm，和細胞系以及含有本發(fā)明的堿性磷酸酶基因的融合蛋白編碼基因均屬于本發(fā)明的保護范圍。
可將本發(fā)明的堿性磷酸酶基因和目的基因融合，導入多形漢遜酵母，建立基于多形漢遜酵母的堿性磷酸酶診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)生產(chǎn)的堿性磷酸酶和目的蛋白產(chǎn)物無論表達生物量以及提取制備步驟都優(yōu)于其它表達體系。
本發(fā)明利用多形漢遜酵母高表達基因的密碼子用法重新設(shè)計了堿性磷酸酶基因，它克服了天然堿性磷酸酶基因在漢遜酵母表達系統(tǒng)中的不適應(yīng)性，從而使該基因可在漢遜酵母中高效表達堿性磷酸酶，而且所表達的堿性磷酸酶易于純化。在堿性磷酸酶基因的5’端留有多個多克隆位點接頭，其它外源基因可以直接插入AP基因的5’端，和AP基因一起在漢遜酵母中融合表達，該融合蛋白比用化學試劑偶聯(lián)的堿性磷酸酶-蛋白偶聯(lián)物更穩(wěn)定，無化學試劑殘留，顯色時重現(xiàn)性好，無信號干擾，而且成本大大降低；利用本發(fā)明的方法得到的融合蛋白可以直接用于基于抗原-抗體反應(yīng)設(shè)計的所有酶免疫試驗(如ELISA、Western blot)或者作為報告基因用于基因功能的研究，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。


圖1為漢遜酵母高表達基因和低表達基因同義密碼子用法表圖2為重組表達載體的構(gòu)建示意圖具體實施方式
實施例1、APm基因的合成及其在多形漢遜酵母中的表達1、APm基因的合成利用本發(fā)明的發(fā)明人以前建立的多形漢遜酵母高表達基因密碼子用法表(圖1，中國專利申請?zhí)?3110441.X)，根據(jù)Genbank上報道的牛AP蛋白序列(登錄號P19111)，按照漢遜酵母密碼子設(shè)計牛APm基因，去掉P19111序列中的信號肽，只取信號肽后面的1335bp序列；同時為提高活性，對個別氨基酸進行了改造和替換；為連接方便，在AP基因的5’端加了NotI，3’端加XbaI位點(圖2)，這樣新設(shè)計的基因全長1349bp，即SEQ ID №1。通過基因合成儀，人工合成新設(shè)計的APm編碼基因，如SEQ ID №1所示，其編碼SEQ ID №2的氨基酸序列，測序結(jié)果表明序列正確。圖1中，高表示高表達基因；低表示低表達基因；N為CodonW程序?qū)Ω摺⒌捅磉_基因進行分類時，每個氨基酸的密碼子數(shù)目；RSCU(Relativesynonymous codon usage，相對同義密碼子用法)，RSCU反映的是一個基因中各個同義密碼子的使用情況，其數(shù)值等于某個密碼子在基因中的實際觀測值與各密碼子以相同的頻率出現(xiàn)時的期望值之間的比值；*@表示高表達基因?qū)?yīng)的優(yōu)越密碼子，其中*為經(jīng)卡方檢驗后差異極顯著；@為經(jīng)卡方檢驗后差異顯著；底紋加黑的為本發(fā)明中設(shè)計APm基因時選用的密碼子。
2、轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母合成的APm基因經(jīng)NotI/XbaI酶切后，分別導入NotI/XbaI酶切的漢遜酵母表達載體pHFMDHZ-A(其物理圖譜如圖2所示)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得到重組子pHFMDHZ-APm。
外源基因再插入時，可以利用BspHI、EcoRI、PmlI、SfiI、XhoI、SacII、NotI中的任意兩個酶切位點(如圖2所示)，比如外源基因為編碼口蹄疫病毒VP1蛋白的基因，可借助BspHI和NotI兩個酶切位點與APm基因進行連接。將重組子用ApaI線化后，采用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母。
3、多形漢遜酵母培養(yǎng)和發(fā)酵條件先將多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化子在YPG(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％甘油)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時后，按照1∶20的比例接種新鮮的YPG發(fā)酵培養(yǎng)基中，維持發(fā)酵溫度30-37℃，pH3-5，溶氧量20％，空氣流速5-10L/min。24小時后當O2壓力急劇升高時(提示培養(yǎng)基中的甘油已經(jīng)消耗完畢)，開始加料，嚴格控制加料速度，使發(fā)酵液中甘油的終濃度維持在0.05％-0.2％之間。發(fā)酵72-96小時后，即可收獲。由于是胞內(nèi)表達的發(fā)酵液，4℃離心收獲菌體。
4、融合蛋白產(chǎn)物的純化由于表達產(chǎn)物的3’端含有6×His-tag標記，所以表達產(chǎn)物可以利用Ni2+柱進行親和層析一步純化。這樣表達的融合蛋白可以用于檢測動物體內(nèi)口蹄疫病毒(FMDV)的抗體水平。
序列表<160>2<210>1<211>1349<212>DNA<213>人工序列<400>1gcggccgcaa tgggtgtccc aaccgtcacc gctaccagaa tcttgaaggg tcaaatgaac 60ggtaagttgg gtccagagac cccattggct atggaccaat tcccatacgt cgctttgtcc120aagacctaca acgtcgacag acaagtccca gactccgctg gtaccgctac cgcttacttg180tgtggtgtca agggtaacta cagaaccatc ggtgtctccg ctgctgctag atacaaccaa240tgtaacacca ccagaggtaa cgaggtcacc tccgtcatca acagagctaa gaaggctggt300aaggctgtcg gtgtcgtcac caccaccaga gtccaacacg cttccccagc tggtgcttac360gctcacaccg tcaacagaaa ctggtactcc gacgctgact tgccagctga cgctcaaaag420aacggttgtc aagacatcgc tgctcaattg gtctacaaca tggacatcga cgtcatcttg480ggtggtggta gaatgtacat gttcccagag ggtaccccag acccagagta cccagacgac540gcttccgtca acggtgtcag aaaggacaag caaaacttgg tccaagagtg gcaagctaag600caccaaggag ctcaatacgt ctggaacaga accgctttgt tgcaagctgc tgacgactcc660tccgtcaccc acttgatggg tttgttcgag ccagctgaca tgaagtacaa cgtccaacaa720gaccacacca aggacccaac cttggctgag atgaccgagg ctgctttgca agtcttgtcc780agaaacccaa gaggtttcta cttgttcgte gagggtggta gaatcgacca cggtcaccac840gacggtaagg cttacatggc tttgaccgag gctatcatgt tcgacaacgc tatcgctaag900gctaacgagt tgacctccga gttggacacc ttgatcttgg tcaccgctga ccactcccac960gtcttctcct tcggtggtta caccttgaga ggtacctcca tcttcggttt ggctccaggt 1020aaggctttgg actccaagtc ctacacctcc atcttgtacg gtaacggtcc aggttacgct 1080ttgggtggtg gttccagacc agacgtcaac ggttccacct ccgaggagcc atcctacaga 1140caacaagctg ctgtcccatt ggcttccgag acccacggtg gtgaggacgt cgctgtcttc 1200gctagaggtc cacaagctca cttggtccac ggtgtccaag aggagacctt cgtcgctcac 1260atcatggctt tcgctggttg tgtcgagcca tacaccgact gtaacttgcc agctccagct 1320accgctacct ccatcccaga cggtctaga 1349
<210>2<211>446<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Gly Val Pro Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met1 5 10 15Asn Gly Lys Leu Gly Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro20 25 30Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp35 40 45Ser Ala Gly Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr50 55 60Arg Thr Ile Gly Val Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr65 70 75 80Thr Arg Gly Asn Glu Val Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala85 90 95Gly Lys Ala Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser100 105 110Pro Ala Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp115 120 125Ala Asp Leu Pro Ala Asp Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala130 135 140Ala Gln Leu Val Tyr Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly145 150 155 160Arg Met Tyr Met Phe Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp165 170 175Asp Ala Ser Val Asn Gly Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln180 185 190Glu Trp Gln Ala Lys His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr
195 200 205Ala Leu Leu Gln Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly210 215 220Leu Phe Glu Pro Ala Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr225 230 235 240Lys Asp Pro Thr Leu Ala Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu245 250 255Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile260 265 270Asp His Gly His His Asp Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala275 280 285Ile Met Phe Asp Asn Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu290 295 300Leu Asp Thr Leu Ile Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser305 310 315 320Phe Gly Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro325 330 335Gly Lys Ala Leu Asp Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn340 345 350Gly Pro Gly Tyr Ala Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly355 360 365Ser Thr Ser Glu Glu Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu370 375 380Ala Ser Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly385 390 395 400Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala405 410 415His Ile Met Ala Phe Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn420 425 430Leu Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp Gly Leu435 440 44權(quán)利要求
1.一種堿性磷酸酶基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述堿性磷酸酶基因是序列表中SEQ ID №1。
3.一種堿性磷酸酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的堿性磷酸酶，其特征在于所述堿性磷酸酶是序列表中的SEQ ID №2。
5.含有權(quán)利要求1所述堿性磷酸酶基因的表達載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為pHFMDHZ-APm。
7.含有權(quán)利要求1所述堿性磷酸酶基因的細胞系。
8.權(quán)利要求1所述堿性磷酸酶基因在構(gòu)建融合蛋白中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述堿性磷酸酶基因在構(gòu)建堿性磷酸酶診斷系統(tǒng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性磷酸酶基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，目的是提供一種可和目的蛋白編碼基因融合并在多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)中高效表達的堿性磷酸酶基因及其編碼蛋白。本發(fā)明所提供的堿性磷酸酶基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明所提供的堿性磷酸酶，是具有序列表中SEQ ID№2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/63GK1609222SQ200310101859
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者邱并生, 李勇, 宋厚輝, 王旭 申請人:中國科學院微生物研究所