專利名稱：工程菌lz－17的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工程菌LZ-17的構(gòu)建和應(yīng)用，即工程菌LZ-17的構(gòu)建方法和應(yīng)用方法，屬生物工程或基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Ames試驗(yàn)是一種檢測(cè)被檢樣品的致突變性的方法。該法采用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA97作為受試生物，包括以下基本操作1.增菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖瓶于37℃培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌TA97，12h，然后從搖瓶取出0.1ml(需活化的樣品加10％S-9液)，與被檢樣品一起放入基本培養(yǎng)基，混勻后倒進(jìn)皿底鋪有底層培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，把平皿放入37℃溫箱，培養(yǎng)48h；2.平皿計(jì)數(shù)人工點(diǎn)數(shù)平皿上長出的回變菌落數(shù)，與空白對(duì)照平皿上的回變菌落數(shù)進(jìn)行比較，計(jì)算MR值，MR值＝被檢樣品平皿的菌落數(shù)/空白對(duì)照平皿上的菌落數(shù)，若MR值≥2，判定被檢樣品致突變性為陽性，否則為陰性，Ames試驗(yàn)到此結(jié)束。
背景技術(shù)：
的缺點(diǎn)是平皿計(jì)數(shù)只能手工操作，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，易于產(chǎn)生人為誤差，且無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。此外，檢驗(yàn)結(jié)果必須等待48h后才能獲得，在面對(duì)被檢樣品多、要求盡快得到檢測(cè)結(jié)果的情況時(shí)，背景技術(shù)往往無能為力。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度與發(fā)光細(xì)菌數(shù)成正比。如用分子克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)將青?；【?Vibrio qinghaiensis)(發(fā)光細(xì)菌一新種—青海弧菌，海洋與湖沼Qceanologia et Limnolcgia Sinica Vol.25，No.3，273-279)的發(fā)光基因(lux gene)導(dǎo)入鼠傷寒沙門氏菌TA97，使其成為具有發(fā)光性能的工程菌LZ-17，那末上述的Ames試驗(yàn)的平皿計(jì)數(shù)就可改用發(fā)光檢測(cè)來代替。發(fā)光檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，不僅省時(shí)、省力，還可杜絕人為誤差。發(fā)光檢測(cè)靈敏度高，使細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間可縮短至24h，對(duì)有的被檢樣品而言，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間甚至可縮短至12h。采用工程菌LZ-17作為受試生物后，Ames試驗(yàn)便能應(yīng)付被檢樣品多、要求盡快得到檢驗(yàn)結(jié)果的要求了。
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是推出一種工程菌LZ-17的構(gòu)建方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是用分子克隆技術(shù)，將青海弧菌的發(fā)光基因?qū)胧髠抽T氏菌TA97，構(gòu)建成具有發(fā)光性能的工程菌LZ-17。
現(xiàn)結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的上述技術(shù)方案。一種構(gòu)建工程菌LZ-17的方法，其特征在于，操作步驟第一步 構(gòu)建含有青?；【l(fā)光基因的質(zhì)粒pDC67培養(yǎng)青海弧菌，提取該菌的DNA，然后用鳥槍法獲取發(fā)光基因，利用質(zhì)粒pBR322，使發(fā)光基因與該質(zhì)粒重組，構(gòu)建成帶有青海弧菌發(fā)光基因的重組質(zhì)粒pDC67；第二步 構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCL184培養(yǎng)重組質(zhì)粒pDC67，用Hind III和BamHI雙酶切，與經(jīng)同樣培養(yǎng)的質(zhì)粒pACYC184一起，用Hind III酶切，T4連接酶連接，用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入受體菌HB101中，培養(yǎng)后長出菌落，從中挑取發(fā)光菌落，提取該菌落中的重組質(zhì)粒pACYCL184；第三步 構(gòu)建成工程菌LZ-17的菌株將TA97細(xì)胞培養(yǎng)至感受態(tài)，加入質(zhì)粒pACYCL184，用電擊穿孔法使質(zhì)粒pACYCL184進(jìn)入TA97細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48h后，長出菌落，從中挑取發(fā)光菌落，即構(gòu)建成的工程菌LZ-17的菌株，得工程菌LZ-17。
TA97，各種工具酶，如Hind III、BamHI、T4連接酶，受體菌HB101，質(zhì)粒pBR322和pACYC184均購自市場(chǎng)。
工程菌LZ-17的主要性能
1.帶有質(zhì)粒pACYCL184，其基因略圖及各酶切位點(diǎn)，見圖1。該質(zhì)粒約9.0kb。它與質(zhì)粒pACYC184的區(qū)別在于它內(nèi)部插入了一段5.0kb青?；【陌l(fā)光基因2，它保留了質(zhì)粒pACYC184的各種基因，包括復(fù)制子。
2.帶有質(zhì)粒pACYCL184，該質(zhì)粒能產(chǎn)生細(xì)菌熒光酶，加入葵醛后能發(fā)出波長為440～640nm的可見光，高峰在490nm左右。
3.仍具備鼠傷寒沙門氏菌TA97所具有的與Ames試驗(yàn)有關(guān)的性狀，故仍可用來做傳統(tǒng)的Ames試驗(yàn)。
本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是推出一種用本發(fā)明所述的構(gòu)建方法構(gòu)建成的工程菌LZ-17的應(yīng)用方法。本發(fā)明采用下述技術(shù)方案解決第二個(gè)技術(shù)問題一種工程菌LZ-17的應(yīng)用方法，其特征在于，在Ames試驗(yàn)中，采用工程菌LZ-17作為受試生物，采用發(fā)光檢測(cè)確定回變細(xì)菌的數(shù)量?，F(xiàn)詳細(xì)說明該技術(shù)方案的操作步驟第一步 細(xì)菌培養(yǎng)先用含氨芐青霉素和氯霉素的肉湯培養(yǎng)基，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)工程菌LZ-17，12h，抗生素濃度均為50μg/ml，然后取1體積菌液接入10體積肉湯培養(yǎng)基，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)2～3h，使培養(yǎng)的工程菌LZ-17處于對(duì)數(shù)生長期；第二步 清洗和重新懸浮細(xì)菌先對(duì)上步培養(yǎng)的細(xì)菌于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min，去上清液，得到細(xì)菌，接著用基本葡萄糖培養(yǎng)基清洗兩次，然后用含組氨酸和生物素的基本培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)菌，組氨酸和生物素的濃度為0.045mmol/L，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的用量，使重新懸浮細(xì)菌的菌液的光密度OD660＝0.2；第三步 空白對(duì)照液和被檢樣品液的配制和培養(yǎng)空白對(duì)照液配方基本培養(yǎng)基、二次蒸餾水與上步制得菌液的體積比為1∶7.1∶0.7，空白對(duì)照液總體積為8.8ml，分裝于8個(gè)小試管，每管1ml被檢樣品液配方基本培養(yǎng)基、二次蒸餾水、被檢樣品與上步制得菌液的體積比為1∶7∶0.1∶0.7，被檢樣品液總體積為8.8ml，分裝于8個(gè)小試管，每管1ml將空白對(duì)照管和被檢樣品管于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)24h，接著對(duì)上述各管菌液于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min，去上清液，得到細(xì)菌，然后每管注入1ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌；第四步 發(fā)光檢測(cè)向上步制得的各管菌液中注入濃度為20μg/ml的癸醛20～50μl混勻，1min后用測(cè)光儀測(cè)定每管菌液的發(fā)光強(qiáng)度；第五步 計(jì)算MR值MR值＝被檢樣品液的發(fā)光強(qiáng)度/空白對(duì)照液的發(fā)光強(qiáng)度，若8個(gè)MR值的平均值≥2，判定被檢樣品致突變性為陽性，本應(yīng)用方法的操作到此結(jié)束，若8個(gè)MR值的平均值＜2，繼續(xù)進(jìn)行以下操作；第六步 溫育處理重復(fù)操作本應(yīng)用方法的第一、第二步配制空白對(duì)照液和被檢樣品液原液，空白對(duì)照液原液配方第二步制得菌液和4％S-9液的體積比為0.7∶1.7，原液總體積為2.4ml，被檢樣品液原液配方被檢樣品、第二步制得菌液和4％S-9液的體積比為0.1∶0.7∶1.7，原液總體積為2.5ml將上述兩種原液于37℃，溫育8～10h，接著對(duì)上述原液于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min，去上清液，得到細(xì)菌，以基本培養(yǎng)基清洗一次，離心條件同上，清除S-9液，然后向每種原液注入2.5ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌，再向每種原液注入二次蒸餾水6.3ml，充分混勻，此時(shí)的空白對(duì)照液和被檢樣品液總體積各為8.8ml，各分裝8個(gè)小試管，每管1ml，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)24h，然后分別于4℃高速離心，5000rpm，10min，去上清液，向每管注入1ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌；第七步 后續(xù)處理重復(fù)操作本應(yīng)用方法的第四、第五步，若8個(gè)MR值的平均值≥2，仍判定被檢樣品致突變性為陽性，若8個(gè)MR值的平均值＜2，判定被檢樣品的致突變性為陰性。
本發(fā)明所述的工程菌LZ-17的應(yīng)用方法，即采用發(fā)光檢測(cè)的Ames試驗(yàn)與背景技術(shù)，即傳統(tǒng)的Ames試驗(yàn)相比，有以下突出效果1.點(diǎn)數(shù)回變細(xì)菌數(shù)量由可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作的發(fā)光檢測(cè)完成，省時(shí)、省力，還可杜絕人為誤差。
2.發(fā)光檢測(cè)靈敏度高，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間可縮短至12～24h。


圖1是重組質(zhì)粒pACYCL184的基因分布和酶切位點(diǎn)的示意圖，其中1是PstI酶切位點(diǎn)，2是發(fā)光基因，3是Hind III的酶切位點(diǎn)，4是EcoRI的酶切位點(diǎn)，5是Bam HI的酶切位點(diǎn)，6是Sal I的酶切位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例完全按本發(fā)明所述的應(yīng)用方法的操作步驟實(shí)施。
實(shí)施例1 應(yīng)用工程菌LZ-17判定4-硝基鄰苯二胺的致突變性除被檢樣品是4-硝基鄰苯二胺，即NPD外，第一、二、三、四和五步的操作均與本發(fā)明的應(yīng)用方法相應(yīng)步驟的操作完全相同。在第五步中測(cè)得8個(gè)MR值的平均值為2.2，判定4-硝基鄰苯二胺，即NPD的致突變性為陽性。
實(shí)施例2 應(yīng)用工程菌LZ-17判定二氨基芴的致突變性除被檢樣品是二氨基芴，即2-AF外，第一、二、三、四、五、六、七步的操作均與本發(fā)明的應(yīng)用方法相應(yīng)步驟的操作完全相同。在第五步中測(cè)得8個(gè)MR值的平均值小于2，繼續(xù)進(jìn)行第六、七步操作。在第七步中測(cè)得8個(gè)MR值的平均值為2.56，判定二氨基芴，即2-AF的致突變性為陽性。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建工程菌LZ-17的方法，其特征在于，操作步驟第一步 構(gòu)建含有青?；【l(fā)光基因的質(zhì)粒pDC67培養(yǎng)青海弧菌，提取該菌的DNA，然后用鳥槍法獲取發(fā)光基因，利用質(zhì)粒pBR322，使發(fā)光基因與該質(zhì)粒重組，構(gòu)建成帶有青?；【l(fā)光基因的重組質(zhì)粒pDC67；第二步 構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCL184培養(yǎng)重組質(zhì)粒pDC67，用Hind III和BamHI雙酶切，與經(jīng)同樣培養(yǎng)的質(zhì)粒pACYC184一起，用Hind III酶切，T4連接酶連接，用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入受體菌HB101中，培養(yǎng)后長出菌落，從中挑取發(fā)光菌落，提取該菌落中的重組質(zhì)粒pACYCL184；第三步 構(gòu)建成工程菌LZ-17的菌株將TA97細(xì)胞培養(yǎng)至感受態(tài)，加入質(zhì)粒pACYCL184，用電擊穿孔法使質(zhì)粒pACYCL184進(jìn)入TA97細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48h后，長出菌落，從中挑取發(fā)光菌落，即構(gòu)建成的工程菌LZ-17的菌株，得工程菌LZ-17。
2.權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的工程菌LZ-17的應(yīng)用方法，其特征在于，在Ames試驗(yàn)中，采用工程菌LZ-17作為受試生物，采用發(fā)光檢測(cè)確定回變細(xì)菌的數(shù)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌LZ-17的應(yīng)用方法，其特征在于，操作步驟第一步 細(xì)菌培養(yǎng)先用含氨芐青霉素和氯霉素的肉湯培養(yǎng)基，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)工程菌LZ-17，12h，抗生素濃度均為50μg/ml，然后取1體積菌液接入10體積肉湯培養(yǎng)基，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)2～3h，使培養(yǎng)的工程菌LZ-17處于對(duì)數(shù)生長期；第二步 清洗和重新懸浮細(xì)菌先對(duì)上步培養(yǎng)的細(xì)菌于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min去上清液，得到細(xì)菌，接著用基本葡萄糖培養(yǎng)基清洗兩次，然后用含組氨酸和生物素的基本培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)菌，組氨酸和生物素的濃度為0.045mmol/L，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的用量，使重新懸浮細(xì)菌的菌液的光密度OD660＝0.2；第三步 空白對(duì)照液和被檢樣品液的配制和培養(yǎng)空白對(duì)照液配方基本培養(yǎng)基、二次蒸餾水與上步制得菌液的體積比為1∶7.1∶0.7，空白對(duì)照液總體積為8.8ml，分裝于8個(gè)小試管，每管1ml被檢樣品液配方基本培養(yǎng)基、二次蒸餾水、被檢樣品與上步制得菌液的體積比為1∶7∶0.1∶0.7，被檢樣品液總體積為8.8ml，分裝于8個(gè)小試管，每管1ml將空白對(duì)照管和被檢樣品管于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)24h，接著對(duì)上述各管菌液于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min，去上清液，得到細(xì)菌，然后每管注入1ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌；第四步 發(fā)光檢測(cè)向上步制得的各管菌液中注入濃度為20μg/ml的癸醛20～50μl混勻，1min后用測(cè)光儀測(cè)定每管菌液的發(fā)光強(qiáng)度；第五步 計(jì)算MR值MR值＝被檢樣品液的發(fā)光強(qiáng)度/空白對(duì)照液的發(fā)光強(qiáng)度，若8個(gè)MR值的平均值≥2，判定被檢樣品致突變性為陽性，本應(yīng)用方法的操作到此結(jié)束，若8個(gè)MR值的平均值＜2，繼續(xù)進(jìn)行以下操作；第六步 溫育處理重復(fù)操作本應(yīng)用方法的第一、第二步配制空白對(duì)照液和被檢樣品液原液，空白對(duì)照液原液配方第二步制得菌液和4％S-9液的體積比為0.7∶1.7，原液總體積為2.4ml，被檢樣品液原液配方被檢樣品、第二步制得菌液和4％S-9液的體積比為0.1∶0.7∶1.7，原液總體積為2.5ml，將上述兩種原液于37℃，溫育8～10h，接著對(duì)上述原液于4℃實(shí)施高速離心，5000rpm，10min，去上清液，得到細(xì)菌，以基本培養(yǎng)基清洗一次，離心條件同上，清除S-9液，然后向每種原液注入2.5ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌，再向每種原液注入二次蒸餾水6.3ml，充分混勻，此時(shí)的空白對(duì)照液和被檢樣品液總體積各為8.8ml，各分裝8個(gè)小試管，每管1ml，于37℃，100～200rpm振搖培養(yǎng)24h，然后分別于4℃高速離心，5000rpm，10min，去上清液，向每管注入1ml基本培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)菌；第七步 后續(xù)處理重復(fù)操作本應(yīng)用方法的第四、第五步，若8個(gè)MR值的平均值≥2，仍判定被檢樣品致突變性為陽性，若8個(gè)MR值的平均值＜2，判定被檢樣品的致突變性為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及工程菌LZ－17的構(gòu)建和應(yīng)用，屬生物工程或基因工程技術(shù)領(lǐng)域。用分子克隆技術(shù)，將青海弧菌的發(fā)光基因?qū)胧髠抽T氏菌TA97，構(gòu)建成工程菌LZ－17。該工程菌能產(chǎn)生細(xì)菌熒光酶，加入葵醛后能發(fā)出波長為440～640nm的可見光；具備鼠傷寒沙門氏菌TA97所具有的與Ames試驗(yàn)有關(guān)的性狀。該工程菌作為受試生物應(yīng)用在Ames試驗(yàn)中，可采用發(fā)光檢測(cè)確定回變細(xì)菌的數(shù)量。發(fā)光Ames試驗(yàn)具有發(fā)光檢測(cè)可自動(dòng)化操作，省時(shí)、省力和細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。該工程菌特別適于用來檢測(cè)被檢樣品的致突變性。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1448504SQ0311675
公開日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2003年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者朱文杰, 楊曄曄, 景奉香, 趙曙霞 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué), 北京濱松光子技術(shù)有限公司