專利名稱：去纖肽生物學活性的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定去纖肽(defibrotide)生物學活性的方法，更確切的說，涉及一種測定去纖肽生物學活性的間接酶學方法。
發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域去纖肽(Merke Index，1996，no.2915)是從動物器官提取、由低分子量的多脫氧核糖核苷酸鈉鹽組成的天然物質(zhì)。
大量藥理學研究以去纖肽為主題，并且提示去纖肽可以作為抗血栓試劑應(yīng)用于治療(US 3,829,567)。
另外，去纖肽還被成功的應(yīng)用于外周動脈病、急性腎功能不全(US4,694,134)或急性心肌缺血(US 4,693,995)。
同其他經(jīng)過提取獲得的生物學物質(zhì)類似，去纖肽的組成同樣具有一定的可變性，其組成以天然的生物多聚體為典型。肝素是這種情況的一個經(jīng)典例子，每一批肝素的鏈長、分子量、組成以及硫酸化程度等的可變性眾所周知。這種可變性的結(jié)果就是，同樣質(zhì)量的去纖肽，實際上其特異性的生物學活性可能并不相同。
正是因為其固有的生物多聚體特性，提取、分離和純化方法本身不能從根本上保證產(chǎn)物的絕對可重復(fù)性。然而，在良好的控制下，這種可變性有可能降低出于這個目的，對從器官提取的去纖肽進行分離的標準化工業(yè)方法的研究已經(jīng)開展，例如，美國專利US 4,985,552所述。
按上述方法獲得的產(chǎn)品，其特征通過測定某些具體的物理-化學參數(shù)(例如電泳遷移率、消光系數(shù)、旋光本領(lǐng)和可逆增色性)來表示。然而，這些參數(shù)主要依賴于去纖肽的結(jié)構(gòu)，并不能提供有關(guān)其生物學活性的信息。
就我們所知，纖維蛋白平板試驗(fibrin plate test)和優(yōu)球蛋白溶解時間的血栓彈性描記記錄是迄今為止僅有的被報道用來評價去纖肽生物學活性的方法[Prino G.，Mantovani M.，Niada R.，CoccheriS.，Butti A.，Indagini preliminari sull′attività fibrinolitica，nell′animale e nell′uomo，di una nuova sostanza presente indiversi organi animali，Simposio InternazionaleLa ricercascientifica nell′industria farmaceutica in Italia，Rome，2-4October 1975-I1 Farmaco，Ed.Prat.)(1969)，24，552-561]。
然而，上述方法的特征是，實驗復(fù)雜，重復(fù)性和精確度不盡人意，而且在血栓彈性描記記錄的情況中，反應(yīng)線性局限在有限的濃度范圍。
因此，至今仍無真正有效、精確并且可重復(fù)的方法來測定去纖肽的生物學活性。
我們發(fā)展了一種簡單、可靠的方法來測定去纖肽的生物學活性，從而使通過提取得到的樣品可以被控制，進而使基于去纖肽的藥物制劑得以標準化。
本發(fā)明涉及的方法使得去纖肽與參考標準相比的特異性生物學活性得以測定，該方法具有高度的精確度、速度和重復(fù)性。
發(fā)明描述本發(fā)明描述了一種測定去纖肽樣品的特定生物學活性的方法。該方法包括a)將去纖肽、血纖蛋白溶酶和血纖蛋白溶酶特異性底物相接觸，所述的血纖蛋白溶酶特異性底物通過與血纖蛋白溶酶反應(yīng)，產(chǎn)生可以測量的產(chǎn)物，以及b)隨后逐次測定所形成的產(chǎn)物的量。
本發(fā)明的方法是一種以去纖肽和血纖蛋白溶酶功能性相互作用為基礎(chǔ)、在體外間接測定去纖肽活性的方法。
由文獻得知，血纖蛋白溶酶是凝血/纖維蛋白溶解級聯(lián)中的一種蛋白水解酶，能夠剪切纖維蛋白、纖維蛋白原和其他血漿蛋白。
血纖蛋白溶酶的酶活性通常通過不同的標準體外實驗測定。最常用的方法是使用分光光度計或熒光光度計測定血纖蛋白溶酶與合適的底物反應(yīng)釋放的發(fā)光或熒光化合物[Haemostasis，(1978)，7，138-145]。通常使用具有分子式A1-A2-A3-X的肽底物，其中，A1和A2為具有顯著非極性的氨基酸，A3為賴氨酸或精氨酸，X代表可以測量的釋放化合物，例如對硝基苯胺(pNa)或2-萘胺(NA)[Haemostasis，(1978)，7，146-149]。除上述肽底物之外，使用其他的簡單化合物(如對硝基芐基-對甲苯磺酰-L-精氨酸也取得成功[Haemostasis，(1978)，7，105-108]。
在這些試驗中，化合物X被釋放到孵育基質(zhì)當中的速率與樣品中血纖蛋白溶酶的活性(國際單位)成正比。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在上述血纖蛋白溶酶評價試驗中，去纖肽能夠增加化合物X的釋放速率，釋放速率的增加與去纖肽的濃度成正比，這正是本發(fā)明的原理。
本發(fā)明涉及的方法首先要求將去纖肽樣品、血纖蛋白溶酶和血纖蛋白溶酶底物相混合。
根據(jù)此發(fā)明，使用的去纖肽樣品通常按照已知步驟(例如前面提到的美國專利US 4,985,552中所述)從器官提取制備。
選擇一批正規(guī)工業(yè)制造的去纖肽為參照樣品(標準)，按照本發(fā)明方法用其制備校正曲線。
總體而言，即使在存在如RNA、肝素、降解的去纖肽(失去嘌呤或嘧啶的去纖肽)或乙醇等污染物的情況下，如果污染物濃度不會削弱整個體系(通常，質(zhì)量百分比低于10％)，本方法都可以對去纖肽進行精確而且準確的測量。
除了去纖肽，該方法同樣可以用于測定來源于去纖肽的其它生物學等價物，例如脫氨基去纖肽，或者更簡單的為熱變性的去纖肽。
本方法具有充分的靈敏度，可以檢測到等于或低于0.1μg/ml(檢測體系中終濃度)的去纖肽，而且通常表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，甚至在最大濃度等于或高于100μg/ml時。
所使用的血纖蛋白溶酶通常可以是各種哺乳動物血纖蛋白溶酶，例如牛、豬或者人的，優(yōu)選人血纖蛋白溶酶。
但是，盡管所選用的酶為血纖蛋白溶酶，使用其他等價的酶系統(tǒng)，如血纖蛋白溶酶的前體如血纖蛋白溶酶原，或具有相關(guān)化學性和類似功能的血纖蛋白溶酶類似酶，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明方法中，血纖蛋白溶酶底物為在本方法條件下，能夠釋放可測量的水解產(chǎn)物X的任何血纖蛋白溶酶特異性底物。
依賴于可檢測基團X的性質(zhì)，被本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍了解的替代檢測系統(tǒng)同樣可以很好的采用。
分光光度或者熒光檢測系統(tǒng)，特別是分光光度系統(tǒng)，具有獨特的優(yōu)勢。
常用的底物具有血纖蛋白溶酶特異性，優(yōu)選具有分子式A1-A2-A3-X的肽類，其中A1和A2為顯著非極性的氨基酸，A3為賴氨酸或精氨酸，X為可檢測基團。這種底物的實例為Val-Leu-Lys-pNa、Val-Phe-Lys-pNa或pyroGlu-Phe-Lys-pNa，其中可使用分光光度計檢測的X基團為對硝基苯胺(pNA)。其他適宜的底物，如Val-Gly-Arg-2NA，含有可用熒光光度計檢測的2-萘胺。一種特別優(yōu)選的底物是化合物H-D-纈氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酸-對硝基苯胺(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)。
用于去纖肽測定的血纖蛋白溶酶及其特異性底物一般均可商購獲得。
本發(fā)明中的測定方法通過將去纖肽樣品和試劑置于水溶液中于特定pH和摩爾濃度下實施。
尤其是，血纖蛋白溶酶的濃度是可變的，常在0.0016至0.20I.U./ml，優(yōu)選0.0064至0.050I.U./ml之間，更加優(yōu)選約0.0125I.U./ml。
然而，關(guān)于血纖蛋白溶酶底物，當其為生色底物時，濃度為0.3至4mM，優(yōu)選2.5至3.5mM，有利地為3mM；當其為熒光底物時，濃度為0.05至0.15mM。
與其他酶學方法類似，本發(fā)明中的測定方法對介質(zhì)的pH敏感。
事實上，在使酶系統(tǒng)失活的極端pH值下，不能使用本方法。
同樣，在測量過程中的任何時間，介質(zhì)的pH最好不要變化，因此，反應(yīng)溶液通常選擇血纖蛋白溶酶測定試驗中常用的緩沖液來進行緩沖。合適的緩沖系統(tǒng)可以是例如磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，或者三羥甲基氨基甲烷鹽酸(TRIS)緩沖液。
本方法通常優(yōu)選保持介質(zhì)pH在接近7至8范圍內(nèi)，更加優(yōu)選7.4左右。
此外，緩沖系統(tǒng)濃度保持在10到200mM范圍內(nèi)為佳，優(yōu)選50mM左右。
本發(fā)明中測定去纖肽的方法，要保證將血纖蛋白溶酶、血纖蛋白溶酶底物和去纖肽混合。為了保證測量準確進行，尤其優(yōu)選在開始測量步驟之前，將血纖蛋白溶酶，或其特異性底物，或者兩者一起加入到含有去纖肽樣品的緩沖溶液當中。血纖蛋白溶酶底物優(yōu)選最后加入。
本測量方法的一個重要參數(shù)是溫度。
無論是構(gòu)建參考曲線，還是在測量階段，在整個測量過程中，以及在所有樣品的測定過程中，優(yōu)選保持同樣的溫度。為此，優(yōu)選使用溫度控制儀器，有必要時可以用幾套測量設(shè)備來進行，要適當?shù)母淖儤悠返奈恢茫员ＷC系統(tǒng)具有最大的熱同質(zhì)性。
本測定方法通常應(yīng)用于25～40℃范圍內(nèi)，優(yōu)選35～39℃，更優(yōu)選在37℃。
根據(jù)本發(fā)明，當加入所有試劑后，開始測量通過血纖蛋白溶酶反應(yīng)釋放到介質(zhì)中的化合物X的濃度，并且持續(xù)一段預(yù)先確定的時間，其測量頻率依賴于X的化學性質(zhì)和檢測系統(tǒng)。
與其他生物學測定方法類似，本發(fā)明方法同樣提供了校正和測量過程，為了盡量減少試驗可變性的發(fā)生率，校正和測量過程應(yīng)平行進行。
校正過程包括獲得已知的濃度漸升的去纖肽樣品(標準)的光吸收數(shù)據(jù)，將這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學再加工，外推為表現(xiàn)本發(fā)明增加的酶反應(yīng)速率與介質(zhì)中去纖肽濃度相關(guān)性的校正曲線。
在測量過程中，由于在校正過程獲得的相關(guān)性，可以根據(jù)在同樣條件下測量并且處理的去纖肽樣品光吸收值來測定其未知生物學活性。
實驗方案通常更詳細地提供已知不同濃度去纖肽的幾個標準和未知樣品。去纖肽樣品依照預(yù)先確定的稀釋因子，由母液逐步稀釋。
本方法中，優(yōu)選將標準和待測樣品至少各準備5個濃度，通常用母液連續(xù)1∶2稀釋，每個濃度的標準或待測樣品各準備5份，更加優(yōu)先選擇準備10份。
去纖肽的標準和測試樣品濃度通常為0.1至100μg/ml，優(yōu)選0.3至50μg/ml，0.5至8μg/ml最佳。
測試樣品的濃度優(yōu)選與標準的濃度處于相同的數(shù)量級。
與上述說明一致，每個濃度的測量宜分別在兩個微孔板上進行，相應(yīng)濃度的每個樣品(即標準與檢測樣品)在兩塊微孔板上的位置最好反轉(zhuǎn)。排列方案在實驗部分有更加詳細的說明，按照此樣品排列方案，每個濃度的去纖肽標準和測試樣品，每次至少要測量5個光吸收值，優(yōu)選10個。
上述測量在預(yù)先確定的時間進行，也就是說，首先在時間為t0(即添加所有組分后、本發(fā)明酶學反應(yīng)開始之前)，繼而在精確的時間間隔和足夠獲得必要數(shù)據(jù)的時期內(nèi)進行。
吸光率測量的時間最大以90分鐘為宜，每1到10分鐘讀取一次。更有利地，在t0時讀取，然后在20-50分鐘內(nèi)每5分鐘讀取。
進行光度吸光率讀取的波長依賴于酶水解反應(yīng)中釋放的可檢測基團X的性質(zhì)。具體到X為p-NA時，吸光率在405nm測量。
標準和未知去纖肽樣品吸光率的讀取，即原始數(shù)據(jù)，通常是從提供讀取操作的同一儀器直接產(chǎn)生；原始數(shù)據(jù)通過一定方式列表，表示各孔的每次吸光率值。
接下來對原始數(shù)據(jù)進行處理，例如，使用Spread Sheet-MicrosoftExcel_。這是第一步加工處理，其計算了每次每組讀數(shù)的吸光率平均值和相關(guān)的標準差，每組讀數(shù)包括去纖肽標準和測試樣品各個濃度的至少5份、優(yōu)選10的讀數(shù)。
數(shù)據(jù)的進一步處理由Sigma Plot Computer Program_type程序(SPSS，Chicago，USA)執(zhí)行，獲得各個濃度去纖肽樣品的吸光率值與時間之間存在的數(shù)學關(guān)系式，得到斜率與去纖肽濃度成正比的直線。
為了得到更高的精確度，在反應(yīng)為線性的時間間隔內(nèi)(優(yōu)選20至50分鐘)，用該程序?qū)ν粷舛鹊?份(優(yōu)選10份)計算了回歸線，以線性回歸系數(shù)“b”、決定系數(shù)“r2”和截距“a”為特征。
按此程序產(chǎn)生的直線通常具有良好的相關(guān)性，表現(xiàn)為通常不小于0.97、優(yōu)選大于或等于0.99的高r2值。
經(jīng)該程序產(chǎn)生的每組濃度的數(shù)據(jù)可以制成數(shù)字數(shù)據(jù)列表，或者繪圖表示。
如

圖1所示，將時間置于橫坐標、吸光率置于縱坐標，獲得了以“b”為斜率的直線，斜率“b”與酶反應(yīng)速率成正比增加去纖肽濃度，水解速率和“b”值成正比地增加。
如上所述對去纖肽標準和測試樣品各份計算得到的斜率值，最后要與其對應(yīng)的去纖肽濃度對數(shù)作相關(guān)性分析。
從圖形上看，對于標準和測試樣品，該相關(guān)性顯示為S形(圖2)；S形中央部分有兩條直線，通常是相互平行的，兩條直線之間的距離即為測試樣品和標準之間的生物學活性差異的函數(shù)。
在此線性距離內(nèi)，根據(jù)Finey DJ所著Statistical Method inBiological Assay，2nd ed.Ch.Griffin，London中介紹的平行線生物學測定方法，與標準相比較，測定未知去纖肽樣品的活性(power)。
當生物學反應(yīng)是待測物質(zhì)的濃度對數(shù)的線性函數(shù)時，并且當分別與標準和未知濃度相關(guān)的直線之間具有平行性或線性時，可以應(yīng)用本發(fā)明的方法學。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，活性比率和去纖肽的未知活性的測定，優(yōu)選使用建立在上述方法學基礎(chǔ)上的專用軟件。
在常用化學分析尤其是本方法中，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理使誤差和實驗可變性降至最低，然而，統(tǒng)計學分析處理卻并不限于本發(fā)明方法，只是代表廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的、并且普遍應(yīng)用于本領(lǐng)域的一種評價結(jié)果的方法。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明方法一致的去纖肽生物學活性測定試劑盒，試劑盒至少包括a)已測數(shù)量的如前定義的血纖蛋白溶酶底物和b)已測數(shù)量的血纖蛋白溶酶。
優(yōu)選的試劑盒包括，每單位血纖蛋白溶酶20至30mg血纖蛋白溶酶特異性底物，更優(yōu)選的為每單位血纖蛋白溶酶25mg底物。
根據(jù)本發(fā)明，包含血纖蛋白溶酶特異性底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA和人血纖蛋白溶酶的試劑盒尤其有利。
根據(jù)本發(fā)明，試劑盒還可以含有緩沖水溶液，優(yōu)選以50mM，pH7.4的TRIS-HCl緩沖。
或者，本試劑盒也可以含有已測數(shù)量的去纖肽(標準)，以允許進行對照測量。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，去纖肽標準溶液和待測去纖肽樣品溶液分別被加入微孔板的孔中。血纖蛋白溶酶溶液在使用時制備，加到含有去纖肽的孔中，最后加入含有血纖蛋白溶酶底物的溶液。隨后將微孔板置于恒溫讀數(shù)儀中，快速攪拌后，在預(yù)定的時間內(nèi)按照預(yù)定的時間間隔讀取系統(tǒng)吸光率。將獲得的原始數(shù)據(jù)進行處理，從而測定去纖肽樣品的未知活性。
本發(fā)明提及的這些以及其他方面將在下面的實施例中得到更好的闡明，然而，這些實施例不能認為是對本發(fā)明的限制。
實施例此處提供的實施例使用以下材料儀器-96孔板檢測儀MRX TCII(Dynex Technologies，Chantilly，VA，USA)，恒溫且裝備酶動力學程序。
-平底96孔板(Greiner L.，Kremunster，Austria，cat.655101)-可連續(xù)調(diào)節(jié)體積的移液槍Pipetman P200(30-200μl)和具有質(zhì)量認證的8×200(20-200μl)以及200-μl槍頭(Gilson，Milan，Italy)-pH計PHM85 Radiometer(Analitica De Mori，Milan，Italy)程序-Microsoft Exel_(Microsoft Corporat ion，Redmond，WA，USA)-Sigma Plot Computer Program_(SPSS，Chicago，USA)
物質(zhì)-去纖肽(Gentium)-人血纖蛋白溶酶，1單位，P-4895(Sigma Aldrich，Milan，Italy)-生色底物S-2251，820332-39(Chromogenix InstrumentationLaboratory S.p.A.，Milan，Italy)-三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，255285-9(Sigma-Aldrich，Milan，Italy)-1N HCl 1090571000(Merck)-1N NaOH 1091411000(Merck)溶液TRIS-HCl緩沖液將2.4 2克TRIS溶解于蒸餾水中，稀釋至體積為100ml。向溶液中加入1N HCl 16ml，繼而加入更多蒸餾水，使終體積為400ml。最終溶液pH為7.4。如果數(shù)值有差異，通過加入1N HCl或者1N NaOH校正為所需的pH值。
血纖蛋白溶酶溶液將1單位(1I.U.)人血纖蛋白溶酶在0℃溶解于4ml TRIS-HCl緩沖液中。操作始終于冰上進行，溶液以每份200μl分裝，置于10-ml塑料試管中，于-20℃保存。
生色底物S-2251的溶液25mg S-2251溶解于15.15ml蒸餾水中，于+4/+8℃保存。
標準去纖肽溶液標準溶液制備●0.1至100μg/ml的(終)濃度60mg去纖肽溶解于3ml TRIS-HCl緩沖液中，并用TRIS-HCl緩沖液以1∶15的比例稀釋。這樣得到的溶液濃度為1.333mg/ml，再經(jīng)過連續(xù)1∶2稀釋，產(chǎn)生濃度為666μg/ml、333μg/ml和166μg/ml的去纖肽溶液。最后的所述溶液作為母液，進一步稀釋，得到濃度為83.33μg/ml、41.67μg/ml、33.33μg/ml、25μg/ml、16.66μg/ml、8.33μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.66μg/ml、0.83μg/ml、0.5μg/ml和最終0.16μg/ml的溶液。
●0.5至8μg/ml的(終)濃度60mg去纖肽溶液于3ml TRIS-HCl緩沖液中，并用TRIS-HCl緩沖液按照1∶1500比例稀釋。獲得濃度為13.33μg/ml的溶液，經(jīng)過連續(xù)1∶2稀釋，產(chǎn)生濃度為6.66μg/ml、3.33μg/ml、1.66μg/ml和0.83μg/ml的去纖肽溶液。
步驟上述每個標準去纖肽溶液各150μl加入微孔板孔中。
迅速制備血纖蛋白溶酶溶液，即在0℃下將3.8ml TRIS-HCl緩沖液加入含有0.2ml人血纖蛋白溶酶溶液的試管中。輕輕攪動溶液體系直至溶解，取50μl加到微孔板孔中，隨后向各孔加入50μl S-2251。
將微孔板置于37℃的MRX TCII測讀儀上，攪拌約10秒鐘；在405nm處，根據(jù)酶動力學程序，在初始時間t0以及此后10至20分鐘期間內(nèi)，每2分鐘讀取吸光率。
如下文作為舉例的圖1、圖2所示，對濃度為0.1至100μg/ml去纖肽所測量的數(shù)據(jù)進行處理(Excel和Sigma Plot程序)及圖示。
將去纖肽標準和測試樣品相應(yīng)直線的角系數(shù)b值(斜率)(圖1)對去纖肽濃度(對數(shù)值)作圖(圖2)。
如圖所見，體現(xiàn)為直線的線性反應(yīng)在曲線中部獲得。根據(jù)Finney DJ在Statistical Method in Biological Assay，2nd ed.Ch.Griffin，London中描述的平行線生物學測定方法，在此線性區(qū)間內(nèi)，測定了相對于標準的未知去纖肽樣品的活性。除了線性以外，標準和待測去纖肽分別對應(yīng)的直線之間的平行性對于此方法的應(yīng)用也非常重要。
未知去纖肽樣品相對于標準去纖肽生物學活性的測定實驗優(yōu)選使用引起上面測定的S形曲線直線部分的濃度。標準和未知去纖肽尤其優(yōu)選在0.5至8μg/ml的濃度范圍內(nèi)。
實驗中，標準和樣品的去纖肽各濃度的副本(replicate)在微孔板孔上的排列在下文給出。

標準去纖肽溶液置于2至6列，待測去纖肽樣品置于7至11列，濃度如表所示。在第二塊板上，樣品的位置最好翻轉(zhuǎn)。
微孔板的外列和外行未用作測量，但是以水添注，以保證整個系統(tǒng)的最大熱同質(zhì)性。
微孔板置于調(diào)至37℃的MRX II讀數(shù)儀中，攪拌約10秒鐘；根據(jù)酶動力學程序，于初始時間t0，以及此后的20至50分鐘期間，每隔5分鐘于405nm讀取吸光率。
測得的吸光率值隨后經(jīng)處理(Excel和Sigma Plot程序)、制表及制圖表示(回歸線)。
繼而可以使用與上述相同的計算系統(tǒng)計算活性比，測定未知去纖肽樣品相對于標準的活性。
在下文中，作為例子將給出涉及去纖肽樣品(分別在濃度0.5μg/ml，2.0μg/ml和8.0μg/ml測試)的表格(1、2和3)和圖表(圖3、4和5)。
權(quán)利要求
1.測定去纖肽生物學活性的方法，包括以下步驟a)使去纖肽、血纖蛋白溶酶和所述血纖蛋白溶酶的特異性底物接觸，其中所述底物通過與血纖蛋白溶酶反應(yīng)，提供可測量的產(chǎn)物，和b)隨后逐次測量所形成的產(chǎn)物數(shù)量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中血纖蛋白溶酶是哺乳動物血纖蛋白溶酶，優(yōu)選人血纖蛋白溶酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述血纖蛋白溶酶的特異性底物是分子式為A1-A2-A3-X的化合物，其中，A1和A2為非極性氨基酸，A3為賴氨酸或精氨酸，X為可測量產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述可測量產(chǎn)物X選自對硝基苯胺和2-萘胺。
5.權(quán)利要求3的方法，其中血纖蛋白溶酶底物為H-D-纈氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酸-對硝基苯胺。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述血纖蛋白溶酶濃度為0.0064至0.050I.U./ml，血纖蛋白溶酶底物濃度為2.5至3.5mM。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述血纖蛋白溶酶濃度為0.0125I.U./ml，所述血纖蛋白溶酶底物濃度為3mM。
8.權(quán)利要求1的方法，其中可測量產(chǎn)物X使用分光光度法測定。
9.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)介質(zhì)為水溶液，緩沖到pH為7至8，優(yōu)選pH7.4。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述體系溫度保持在35至39℃，優(yōu)選37℃。
11.權(quán)利要求1的測定去纖肽生物學活性的方法，包括以下階段a)在酶反應(yīng)過程中，測定標準和測試類型的每一個去纖肽樣本的可測量產(chǎn)物X的釋放速率，b)以算術(shù)和/或圖形形式使上述釋放速率與相應(yīng)的去纖肽濃度相關(guān)聯(lián)，c)獲得去纖肽測試樣品的生物學活性。
12.用于根據(jù)前述權(quán)利要求測定去纖肽生物活性的試劑盒，其至少包含a)已測定數(shù)量的血纖蛋白溶酶底物；和b)已測定數(shù)量的血纖蛋白溶酶。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述血纖蛋白溶酶底物為H-D-Val-Leu-Lys-pNA，所述血纖蛋白溶酶為人血纖蛋白溶酶。
14.權(quán)利要求12的試劑盒，其中包括每單位血纖蛋白溶酶20至30mg血纖蛋白溶酶特異性底物，優(yōu)選每單位血纖蛋白溶酶25mg特異性底物。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種測定去纖肽生物學活性的酶學方法。該方法的基礎(chǔ)是去纖肽具有增強血纖蛋白溶酶的酶活性的能力，步驟包括a)將去纖肽、血纖蛋白溶酶和一種血纖蛋白溶酶特異性底物相接觸，所述的血纖蛋白溶酶底物通過與血纖蛋白溶酶反應(yīng)，產(chǎn)生可以測量的產(chǎn)物，和b)隨后逐次測定所形成的產(chǎn)物的含量。
文檔編號C12Q1/68GK1612938SQ02826979
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月17日
發(fā)明者R·波爾塔, F·卡特尼奧, L·費羅 申請人:金蒂姆股份公司