專利名稱：活c－kit表達(dá)細(xì)胞的分離工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為分離c-kit表達(dá)細(xì)胞提供了一種工具。c-kit促癌基因(proto-oncogene)編碼Kit。Kit是干細(xì)胞因子(SCF)的膜受體酪氨酸激酶，經(jīng)鑒定它是許多細(xì)胞的特異性標(biāo)記物1，這些細(xì)胞包括Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)、造血干細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，如朗氏島的細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、松果體細(xì)胞和垂體細(xì)胞。
雖然Kit定位于細(xì)胞膜上，但由于在解離過程中膜蛋白丟失，難以進(jìn)行c-kit表達(dá)細(xì)胞的成功分離。利用c-kit特異性抗體的常規(guī)技術(shù)，如免疫熒光法或免疫組化法評價(jià)分離細(xì)胞的c-kit表達(dá)特征，其結(jié)果是失敗的。
本發(fā)明通過提供c-kit質(zhì)粒靶向載體解決了本領(lǐng)域的這一問題，其中c-kit質(zhì)粒靶向載體能夠整合到野生型c-kit等位基因上，并編碼包含核仁定位信號，如TCOF-12、RLP313、RPS254或Fxr2h5的嵌合熒光蛋白。所述的構(gòu)建體產(chǎn)生一個能夠定位于活組織中的、濃縮的、亮熒光信號，該信號在組織解離后也存在。該構(gòu)建體使得能夠使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，并使得能夠利用流式細(xì)胞儀對解離的細(xì)胞進(jìn)行自動細(xì)胞分選。
相應(yīng)地，c-kit質(zhì)粒靶向載體可用于產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因動物模型，該模型在內(nèi)源c-kit啟動子的控制下表達(dá)上述的嵌合熒光蛋白，從而使嵌合熒光蛋白在所述的轉(zhuǎn)基因動物中特異性地標(biāo)記c-kit表達(dá)細(xì)胞?？梢詫⒑笳叻蛛x，建立c-kit表達(dá)細(xì)胞系，如ICC細(xì)胞系或造血干細(xì)胞系。
因此本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供包含上述c-kit質(zhì)粒靶向載體的轉(zhuǎn)基因動物和c-kit表達(dá)細(xì)胞系。
參照下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可以更好地理解本發(fā)明，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員會明白這些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)僅是本發(fā)明的示例，其后的權(quán)利要求書中會更全面地加以描述，另外，在整篇申請文本中引用了各種出版物。這些出版物的內(nèi)容在申請文本中引用作為參考，以更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。
附圖簡述

圖1編碼嵌合熒光蛋白的四個構(gòu)建體圖譜，其中嵌合熒光蛋白位于c-kit啟動子控制下，包含核仁定位信號。
圖2pZsGreen-N1-c-kit-RLP31構(gòu)建體序列圖3在基因組c-kit毗鄰序列群(contig)(KOS)中插入Sfi位點(diǎn)，使得中間載體pKI中的SfiI序列盒在酵母中通過同源重組交換到KOS基因組克隆中；URA＝尿嘧啶。
圖4KOS克隆pKOS.12和pKOS.65組裝成完整的基因組c-kit克隆pKOS.11。
圖5c-kit gDNA毗鄰序列群(26567bp)和插入了圖3中PKI構(gòu)建體的c-kit gDNA毗鄰序列群(30072bp)。
發(fā)明詳述本發(fā)明為分離c-kit表達(dá)細(xì)胞提供了一個工具。該工具由一個核酸載體組成，能夠指導(dǎo)表達(dá)的嵌合熒光蛋白進(jìn)入c-kit表達(dá)細(xì)胞的核仁中，其中嵌合熒光蛋白特征是嵌合蛋白包含一個核仁定位信號，并位于c-kit表達(dá)細(xì)胞中c-kit啟動子的控制下。
這里所用的“嵌合蛋白”通常指融合蛋白，該融合蛋白由兩個或多個蛋白質(zhì)的全部或部分氨基酸序列組成，通過使用已知技術(shù)將蛋白質(zhì)編碼基因融合在一起而形成。在本發(fā)明中，嵌合蛋白由功能性核仁定位信號和熒光蛋白融合而成。舉例來說，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRED、AmCyan、AsRed，優(yōu)選由ZsGreen1組成。舉例來說，核仁定位信號選自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，優(yōu)選由RLP31組成。
相應(yīng)地，該構(gòu)建體或載體能夠產(chǎn)生表達(dá)嵌合熒光蛋白的非人類的動物細(xì)胞，其中所述嵌合熒光蛋白的表達(dá)位于c-kit啟動子的控制之下。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，核酸載體進(jìn)一包含促進(jìn)載體向非人類動物細(xì)胞的基因組中整合的序列，以抑制所述動物c-kit蛋白的功能性表達(dá)，促進(jìn)嵌合熒光蛋白的表達(dá)。因此本發(fā)明的一個目的是提供一個核酸載體，該核酸載體包括a)編碼嵌合熒光蛋白的核酸序列；和b)促進(jìn)載體整合到非人類動物基因組中的序列，以抑制所述動物c-kit蛋白的功能性表達(dá)，促進(jìn)嵌合熒光蛋白的表達(dá)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了能夠整合到野生型c-kit等位基因的c-kit質(zhì)粒靶向載體，所述的載體編碼包含核仁定位信號的嵌合熒光蛋白。在所述的發(fā)明中，核仁定位信號優(yōu)選自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，更為優(yōu)選的是，所述的核仁定位信號由RLP31組成。嵌合熒光蛋白分子進(jìn)一編碼熒光蛋白，所述的熒光蛋白選自任何商業(yè)來源的熒光蛋白，例如EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan或AsRed。在一個具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen1組成。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含SEQ ID No.2，特別包含SEQ ID No.1，更優(yōu)選由SEQ ID No.1組成。其中SEQ ID No.2由能夠促進(jìn)向非人類動物基因組中整合的多聚核苷酸序列組成，以抑制所述動物c-kit蛋白的功能性表達(dá)，促進(jìn)和編碼嵌合熒光蛋白的多聚核苷酸序列可操作性相連的嵌合熒光蛋白的表達(dá)。(Seq Id No2cagagtctagcgcagccaccgcgatgagaggcgctcgcggcgcctgggatctgctctgcgtcctgttggtcctgctccgtgaattccgcttgtccagaaaacgtaaggatccaccggtcgccaccatggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctgagc)編碼嵌合熒光蛋白的序列優(yōu)選是cDNA序列，該序列中核仁定位信號序列和編碼熒光蛋白的核酸序列可操作性相連接，其中本發(fā)明中使用的核仁定位信號序列(NoLs)選自表2中所列序列，即RLP31(參見圖1)、RPS25、Fxr2h和TCOF-1。為了獲得嵌合熒光蛋白，將所述序列中的一個序列連接到編碼熒光蛋白的商業(yè)來源載體上，例如購自Clontech的pZsGreen1、pZsYellow1或pDsRed。
本發(fā)明的載體可以轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，宿主細(xì)胞優(yōu)選真核細(xì)胞，自身用于轉(zhuǎn)化非人類動物。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了一種制備嵌合熒光蛋白的方法，該方法包括在一定條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，提供載體表達(dá)的所述蛋白質(zhì)，并回收表達(dá)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是，宿主細(xì)胞是非人類動物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選非人類動物的胚細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了轉(zhuǎn)染有本發(fā)明c-kit質(zhì)粒靶向載體的細(xì)胞。其中所述的細(xì)胞是一種真核細(xì)胞，特別是能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，所述細(xì)胞從包含敲入了本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)基因動物分離，或者所述細(xì)胞選自COS-7或Colon26，更優(yōu)選為COS-7細(xì)胞。
如下文更詳細(xì)加以討論的，可以使用本領(lǐng)域中在動物中操縱基因表達(dá)的已知方法，如使用Cre/Lox系統(tǒng)(使用Cre/Lox系統(tǒng)將可誘導(dǎo)基因靶向小鼠，酶學(xué)方法指南，14，381-392(1998)和最近如SigridW.et al.，1999 BioTechniques 261150-1160所述從λKOS基因組文庫中建立的基因靶向載體，將本發(fā)明的載體靶向到小鼠的相應(yīng)c-kit序列上。在后面的實(shí)施例中提供了該方法。該方法采用酵母同源重組機(jī)器來簡化敲入載體的構(gòu)建過程。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，促進(jìn)載體向非人類動物基因組中整合的序列包括和動物的c-kit序列或其旁側(cè)序列相比具有足夠同源性的核苷酸序列，該同源性優(yōu)選為95％，更優(yōu)選為98％，最優(yōu)選為100％，以進(jìn)行同源重組和隨后載體向所述動物基因組的插入，插入位置能夠破壞編碼區(qū)，進(jìn)而內(nèi)源c-kit的表達(dá)有利于所述載體中序列所編碼的嵌合熒光蛋白。
通過Sambrook et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社中所述的、本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知的方法，將核酸序列加到本發(fā)明的載體中，用于隨后的轉(zhuǎn)化和向所述宿主細(xì)胞基因組或非人類動物基因組中的整合。在一個具體的實(shí)施方案中，核酸序列SEQ IDNo.2最先克隆到中間載體pKI上(參見圖3)，所述的載體包括旁側(cè)有兩個SfiI位點(diǎn)的剪接受體/剪接供體序列盒和一個諸如PGK Neo標(biāo)記之類的floxed選擇標(biāo)記。該中間載體上剪接受體/剪接供體序列盒隨即交換為旁側(cè)有SfiI的酵母標(biāo)記URA，在酵母中通過同源重組導(dǎo)入包含c-kit基因的KOS基因組克隆。在包含Prm-CRE轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞中進(jìn)行c-kit基因的最終靶向。在該ES細(xì)胞系中，精子發(fā)生Cre的表達(dá)受控于魚精蛋白啟動子。因此，當(dāng)飼養(yǎng)產(chǎn)生于ES細(xì)胞系的嵌合小鼠時，靶等位基因傳經(jīng)雄性胚系，旁側(cè)帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的Neo序列盒切除，從而使Neo標(biāo)記在嵌合體的飼養(yǎng)過程中切除。
可以通過轉(zhuǎn)染或其他諸如電穿孔之類的適當(dāng)技術(shù)將載體導(dǎo)入。在本發(fā)明中，通過電穿孔法將載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，完成外源DNA向動物基因組中的導(dǎo)入?；蚪M中通過同源重組插入了外源DNA的細(xì)胞隨即注射到胚泡中，產(chǎn)生具有所需表型的轉(zhuǎn)基因動物。通過人們所熟知的技術(shù)鑒定包含本發(fā)明載體的成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞，比如裂解細(xì)胞，通過Southern印跡法或使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對DNA進(jìn)行驗(yàn)證。
舉例來說，載體可以是質(zhì)粒、病毒、粘?；蚴删w載體，可以含有一個或多個選擇標(biāo)記，如新霉素或潮霉素標(biāo)記基因。
本發(fā)明還有利地提供了由本發(fā)明的核酸中至少約10個連續(xù)核苷酸組成的核酸序列，優(yōu)選10至50個核苷酸，核酸序列包含如表1所示的序列。這些序列可以有利地用作探針或啟動復(fù)制的引物等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域人員所熟知的技術(shù)產(chǎn)生這種核酸序列。這些序列還可用于診斷試劑盒等，檢測本發(fā)明中核酸的存在與否。這些實(shí)驗(yàn)通常包括在雜交條件下將探針和樣品相接觸，檢測是否存在探針和樣品中任意核酸之間所形成的二聚體或三聚體。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，探針可以錨定在固體支持物上，優(yōu)選的是，它們存在于芯片上，使多個探針可以同時和單一的生物樣品雜交。探針可以點(diǎn)在芯片上，或在芯片上原位合成。(參見Lockhart et al.，Nature Biotechnology，vol.14，December 1996“通過和高密度寡核苷酸芯片雜交進(jìn)行表達(dá)監(jiān)測”。一個芯片可以包含處于離散位置上的多于100、500、甚至1000個的不同探針。
可以使用重組手段或合成手段來生成本發(fā)明中的核酸序列，例如使用PCR克隆機(jī)制，該克隆機(jī)制通常涉及制備引物對，這些引物可以是所要克隆的基因區(qū)域中的約10個至50個核苷酸；將引物和來源于人細(xì)胞的mRNA、cDNA或基因組DNA相接觸；在能夠?qū)е滤鑵^(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分離擴(kuò)增區(qū)域或片段，回收擴(kuò)增的DNA。通常來說，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域人員所熟知的，如Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1989)。
本發(fā)明的核酸或寡核苷酸可以攜帶一個展現(xiàn)標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括諸如32p或35S之類的同位素標(biāo)記，酶標(biāo)記或諸如生物素或熒光標(biāo)記之類的其他蛋白質(zhì)標(biāo)記。這些標(biāo)記可以加到本發(fā)明的核酸或核苷酸上，使用上文的已知技術(shù)進(jìn)行檢測。
根據(jù)本發(fā)明，特定的核酸不僅包括相同的核酸，還包括任意堿基突變，這些堿基突變尤其包括一種替換，這種替換由于保守氨基酸替換中的兼并密碼，導(dǎo)致產(chǎn)生同義密碼子(編碼同一氨基酸殘基的不同密碼子)。術(shù)語“核酸序列”還包括和具有堿基突變的任意單鏈序列互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面包括獲得轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，其中轉(zhuǎn)基因非人類動物在c-kit表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)嵌合熒光蛋白，該方法包括以下步驟(a)將本發(fā)明中的核酸載體導(dǎo)入所述動物的胚細(xì)胞中；(b)將步驟(a)獲得的胚導(dǎo)入雌性動物；(c)飼養(yǎng)步驟(b)中的雌性動物，直至胚發(fā)育成熟，從雌性動物體內(nèi)出生；和(d)飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動物。
優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明方法使用的非人類動物是哺乳動物，更優(yōu)選為小鼠。在一個進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明和涉及產(chǎn)生前面所述的轉(zhuǎn)基因動物相交配的后代，后面稱作子代。還包括從所述轉(zhuǎn)基因動物獲得的胚系細(xì)胞，這些胚系細(xì)胞自身用于產(chǎn)生后代，這些后代包含本發(fā)明中穩(wěn)定整合到基因組中的載體。
例如，可以通過電穿孔法將所述的核酸載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中。在處于單細(xì)胞期的胚上進(jìn)行細(xì)胞微注射，以確保核酸載體能夠摻入到動物的胚系中，并在動物的所有細(xì)胞中表達(dá)，并隨后轉(zhuǎn)移到子代中。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面包括本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因動物的子代，這些子代攜帶有本發(fā)明中穩(wěn)定整合到其基因組中的任意核酸載體。
在一個具體的實(shí)施方案中，將表達(dá)嵌合熒光蛋白的第一個非人類動物和轉(zhuǎn)入另一個目標(biāo)特征的另一個非人類轉(zhuǎn)基因動物雜交，尤其是和轉(zhuǎn)有SV40大T抗原的另一個非人類轉(zhuǎn)基因動物雜交，也提供了本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因的非人類動物。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了產(chǎn)生具有額外特征的轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，所述的動物包含編碼SV40大T抗原的核酸序列，后面稱之為c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因，包括步驟為將第一個轉(zhuǎn)基因非人類動物和第二個包含編碼SV40大T抗原之載體的轉(zhuǎn)基因非人類動物相雜交，尤其是和商業(yè)來源的無限增殖小鼠(H-2Kb-tsA58Charles River實(shí)驗(yàn)室)相雜交。其中第一個轉(zhuǎn)基因非人類動物包含的載體具有a)編碼嵌合熒光蛋白的核酸序列；和b)促進(jìn)載體向非人類動物基因組中整合的序列，該序列能夠抑制所述動物c-kit蛋白的功能性表達(dá)，促進(jìn)嵌合熒光蛋白的表達(dá)。
術(shù)語“子代”或“后代”包括攜帶有本發(fā)明載體的所述轉(zhuǎn)基因動物相交配的產(chǎn)物。還包括從所述轉(zhuǎn)基因動物獲得的胚系細(xì)胞，這些胚系細(xì)胞自身用于產(chǎn)生后代，這些后代包含本發(fā)明中穩(wěn)定整合到基因組中的載體。
在本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面中，所述的核酸載體用于促進(jìn)c-kit表達(dá)細(xì)胞從本發(fā)明中非人類轉(zhuǎn)基因動物或從分離的生物樣品的分離，尤其是從組織樣品，如轉(zhuǎn)染有所述載體的小腸；造血干細(xì)胞；上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，如朗氏島的細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、松果體細(xì)胞和垂體細(xì)胞的分離。因此，本發(fā)明的一個目的是提供從轉(zhuǎn)基因動物中分離c-kit表達(dá)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟；使包含c-kit表達(dá)細(xì)胞的組織解離；分離c-kit質(zhì)粒靶向載體，從所述解離組織分離熒光標(biāo)記細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)，從解離組織中分離熒光標(biāo)記細(xì)胞，優(yōu)選使用細(xì)胞分選儀進(jìn)行分離步驟，更優(yōu)選的細(xì)胞分選儀是流式細(xì)胞儀。在前面提到的方法中，包含c-kit表達(dá)細(xì)胞的組織選自Cajal間質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，如朗氏島的細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、松果體細(xì)胞和垂體細(xì)胞。優(yōu)選的是，收集的細(xì)胞由Cajal間質(zhì)細(xì)胞組成。
細(xì)胞分離的方法包括，但不局限于外科切除或解剖、解離、熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)、淘選、激光捕捉顯微解剖(LCM)。從轉(zhuǎn)基因動物標(biāo)本中分離和純化細(xì)胞的方法在Serafini于2001年2月14日提交的、題目為“轉(zhuǎn)基因動物系標(biāo)本(活體庫)”的PCT申請WO02/64749中作有介紹，將其整體在此引入作為參考。
在某些實(shí)施方案中，使用外科切除或解剖來分離表達(dá)嵌合熒光蛋白的細(xì)胞。在解剖前，對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行灌注。
優(yōu)選使用包含α-鵝膏蕈堿或其他轉(zhuǎn)錄阻斷劑的灌注液進(jìn)行灌注，防止細(xì)胞分離過程中發(fā)生基因表達(dá)變化。
在其他的實(shí)施方案中，從解剖和解離的嚙齒類動物小腸組織中分離表達(dá)嵌合熒光蛋白的細(xì)胞。這種解剖和解離的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。參見Epperson，2000，J.Physiol.Cell.Physiol.279C529-C539；Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)143-55；Nakajima et al.，1996，Nerosci.Res.26(2)195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience49(2)347-64；Baranes et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)2811-22；Martinou 1989，J Neurosci.9(10)3645-56；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)99-106；Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)198-206；Gilbert，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)191-98；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)372-78。所有文獻(xiàn)以整體形式在此引入作為參考。
在其他的實(shí)施方案中，通過透光度光直接顯影從組織片中分離表達(dá)嵌合蛋白的細(xì)胞，并使用Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience 49(2)347-64的方法對這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，這些文獻(xiàn)以整體形式在此引入作為參考。
在其他的實(shí)施方案中，使用蛋白酶，如木瓜蛋白酶(Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)143-55；Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)L195-203)或胰蛋白酶(Baranes，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)2811-22；Gilbert，1997，J.Neuroosci.Methods 71(2)191-98；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)99-106；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)372-78；這些文獻(xiàn)以整體形式在此引入作為參考)解離表達(dá)嵌合熒光蛋白的細(xì)胞。還可以使用膠原酶解離細(xì)胞(Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)198-206；以整體形式在此引入作為參考)。解離的細(xì)胞在飼養(yǎng)層上生長。在一個實(shí)施方案中，解離的細(xì)胞是培養(yǎng)在商業(yè)來源的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基，如Clonetic的SM或SMGM(Cambrex公司，NJ，美國)中的cajal間質(zhì)細(xì)胞。
在另一個實(shí)施方案中，標(biāo)記有嵌合熒光蛋白的組織可以使用Martinou的方法進(jìn)行顯微解剖和解離(1989，J.Neurosci.9(10)3645-56；以整體形式在此引入作為參考)。
標(biāo)記細(xì)胞的顯微解剖之后進(jìn)行密度梯度離心。通過熒光活化的細(xì)胞分選方法(FACS)對細(xì)胞進(jìn)行純化。在其他的實(shí)施方案中，可以通過僅使用光散射參數(shù)的細(xì)胞分選方法對細(xì)胞進(jìn)行純化，從而不必進(jìn)行標(biāo)記(Martinou，1989，J.Neurosci.9(10)3645-56)。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，通過關(guān)鍵基因，即嵌合熒光蛋白和標(biāo)記基因，即SV40大T抗原的表達(dá)，識別來源于轉(zhuǎn)基因動物標(biāo)本中轉(zhuǎn)基因動物的雜合細(xì)胞群體的細(xì)胞亞群?？梢允褂萌魏伪阌诓僮鞯姆椒▽?shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞亞群的選擇和/或分離。例如，如果標(biāo)記物是外部可接近的細(xì)胞表面相關(guān)蛋白或其他包含表位的分子，就可使用免疫吸附淘選技術(shù)或熒光免疫標(biāo)記和熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)相偶聯(lián)。
使用Mouawad等(1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56；以整體形式在此引入作為參考)所述的流式細(xì)胞儀方法檢測表達(dá)標(biāo)記基因產(chǎn)物的細(xì)胞。該方法的依據(jù)是使用與標(biāo)記基因序列所編碼的標(biāo)記酶特異結(jié)合的單克隆抗體，進(jìn)行見解免疫熒光染色。該方法可以用于哺乳動物中酶表達(dá)的體外和體內(nèi)定量。使用這種方法，可以對表達(dá)關(guān)鍵基因和/或標(biāo)記基因的細(xì)胞進(jìn)行定量，研究基因調(diào)控，包括轉(zhuǎn)染死亡率、啟動子效率、增強(qiáng)子活性和其他調(diào)控因子(Mouawad et al.，1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56)。
在另一個特定實(shí)施方案中，使用熒光活化的細(xì)胞分選儀(FACS)從轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中分離攜帶有嵌合熒光蛋白的個體細(xì)胞。參見Hadjaantonakis and Naki，2000，Genesis，27(3)95-8，以整體形式在此引入作為參考。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，嵌合熒光蛋白包含一個自體熒光(AFP)受體，包括但不局限于野生型綠色熒光蛋白(wtGFP)和其變體，包括增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)、ZsGreen、ZsYellow、DsRed、AmCyan或AsRed。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過在抗細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體上淘選來分離細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。使用本領(lǐng)域中已知的、Camu and Henderson，1992，Nez rosci.Methods44(1)59-79；KashTwagi et al.，2000，41(1)2373-7；Brocco and Panzetta，1997，75(1)15-20；Tanaka et al.，1997，Dev.Neurosci.19(1)106-11；和Barres et al.，1998，Neuron 1(9)791-803中所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行分離和鑒定，這些文獻(xiàn)以整體形式在此引入作為參考。
在其他的實(shí)施方案中，使用激光捕捉顯微解剖(LCM)來分離細(xì)胞。對神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行激光捕捉顯微解剖的方法是本領(lǐng)域中所熟知的。參見Emmert-Buck et al.，1996，Science 274，998-1001；Luo et al.，1999，Nature Med.5(1)117-122；Ohyama et al.，2000，Biotechniques29(3)530-36；Murakami et al.，2000，Kidney Int.58(3)1346-53；Goldsworthy et al.，1999，Mol.Carcinog.25(2)86-91；Fend et al.，1999，Am.J.Pathol.154(1)61-66；Schutze et al.，1998，Nat Biotechnol.Aug；16(8)737-42，這些文獻(xiàn)以整體形式在此引入作為參考。
在一個特定的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明中的c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因小鼠系標(biāo)本來分離表達(dá)關(guān)鍵基因，即本發(fā)明中嵌合熒光蛋白的cajal間質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞位于小腸中，產(chǎn)生對于腸蠕動重要的定步組分(慢波(slow waves))。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物系和從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物系中分離的細(xì)胞可用于靶證實(shí)、藥物發(fā)現(xiàn)、藥效學(xué)分析、行為分析、發(fā)育分析、電生理學(xué)分析和基因表達(dá)分析等，但優(yōu)選靶證實(shí)和藥物發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明因此提供了鑒定參與c-kit表達(dá)細(xì)胞功能的潛在藥物靶的方法，所述的方法包括用靶向特異基因沉默手段(means)對使用上述任意方法獲得的c-kit表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行處理，測定所述基因沉默手段對所述細(xì)胞功能的影響。
在第一個方面中，可以通過本領(lǐng)域中已知的任意方法來分析表達(dá)本發(fā)明中嵌合熒光蛋白的分離細(xì)胞，鑒定潛在的藥物靶。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個方面中，使用本領(lǐng)域中已知的任意方法來分析細(xì)胞的基因表達(dá)譜，舉例來說，但不具有限制性，這些方法通過從分離細(xì)胞中分離mRNA，將mRNA和芯片相雜交，鑒定分離細(xì)胞中表達(dá)或不表達(dá)的基因。對用或不用目標(biāo)化合物處理的細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行比較，或從經(jīng)或不經(jīng)特定處理的動物體內(nèi)獲得的細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行比較。另外，還可以通過Northern印跡分析、PCR、Rnase保護(hù)等對從分離細(xì)胞中獲得的mRNA進(jìn)行分析，確定編碼特定蛋白產(chǎn)物的mRNA存在與否，依賴于細(xì)胞處理的這些mRNA的存在或水平。
在另一個方面中，從分離細(xì)胞中獲得的mRNA可以用于生成cDNA文庫，事實(shí)上，可以從不同的分離細(xì)胞群產(chǎn)生這種細(xì)胞類型特異性cDNA文庫的集合。這種cDNA文庫可用于分離基因表達(dá)，分離和鑒定細(xì)胞類型特異性基因，剪接變體和非編碼RNA。在另一個方面中，從經(jīng)或不經(jīng)處理的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離、或從具有或不具有疾病狀態(tài)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離的細(xì)胞中制備的這種細(xì)胞類型特異性文庫，可用于進(jìn)行減法雜交，鑒定和未處理轉(zhuǎn)基因動物相比，特定處理或疾病狀態(tài)情況下更高或更低水平表達(dá)的基因。
這些分析數(shù)據(jù)可用于產(chǎn)生動物中，或特定組織中，或解剖區(qū)域，如小腸中不同細(xì)胞群基因表達(dá)分析的數(shù)據(jù)庫。使用這一數(shù)據(jù)庫和生物信息工具，如層級和非層級聚類分析和主成分分析，對細(xì)胞繪制“指紋圖譜”，用作健康和疾病模型動物或組織的具體指征。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用在上文所述分析中的分離細(xì)胞由來源于c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因動物的cajal間質(zhì)細(xì)胞組成。因此，本發(fā)明的一個目的是提供鑒定參與慢波形成的潛在藥物靶的方法，所述方法包括用靶向特異基因沉默手段對使用上述任意方法獲得的cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，測定所述基因沉默手段對所述細(xì)胞形成慢波的影響。在一個具體的實(shí)施方案中，cajal間質(zhì)細(xì)胞從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離，更優(yōu)選從c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離。這里所用的靶向特異基因沉默手段通常指本領(lǐng)域中抑制潛在藥物作用靶蛋白的基因表達(dá)的已知方法，該方法包括使用反義序列或段干擾RNA(siRNA)。
可以設(shè)計(jì)反義寡核苷酸，用來和核酸、前體mRNA或成熟mRNA的互補(bǔ)序列相雜交，干擾靶向DNA序列所編碼多肽的生成，總的表現(xiàn)為降低或抑制多肽的表達(dá)。反義序列的構(gòu)建及其應(yīng)用在Peyman andUlman，Chemical Reviews，90543-584，(1990)；Crooke，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32329-376，1992)和Zamecnik and Stephenson，P.N.A.S，75280-284，(1984)中作有介紹。核酶的構(gòu)建及其應(yīng)用在Gibsonand Shillitoe，Molecular Biotechnology 7(2)125-137，(1997)中作有介紹。
可以設(shè)計(jì)短干擾RNA，用來和編碼潛在藥物作用靶蛋白的mRNA相雜交，總的表現(xiàn)為降低或抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。SiRNA的構(gòu)建及其應(yīng)用在Elbashir，2001 Nature 411494；Brummelkamp，2002 Science296550；和Sui，2002 PNAS 99(8)5515中作有介紹。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中提供了鑒定參與慢波形成的潛在藥物靶(drug target)的方法，所述方法包括使從c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離的cajal間質(zhì)細(xì)胞和靶特異性siRNA相接觸，測定所述siRNA對所述細(xì)胞形成慢波的影響。
通過測定所述細(xì)胞中的Ca-擺動來測定慢波的形成。可使用各種技術(shù)實(shí)時測定離子流，例如傳統(tǒng)的電生理技術(shù)，當(dāng)可以使用電生理技術(shù)時，新的高通量(high throughput)篩選方法正在建立。尤其是使用完整細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來記錄(轉(zhuǎn)染有siRNA)ICC的膜電勢或電流。類似的，利用離子敏感的熒光染料，如fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura紅測定離子流，從而利用熒光計(jì)和熒光成像技術(shù)來進(jìn)行實(shí)時分析，其中熒光成像技術(shù)包括帶有或不帶有激光共聚焦的熒光顯微方法和成像分析公式聯(lián)用。
另一個方法是化合物的高通量篩選分析，其中化合物作為激動劑或調(diào)節(jié)劑發(fā)揮活性、從而影響分離ICC中鈣瞬間電流。該分析方法借助于稱作熒光成像板讀數(shù)儀((FLIPR)，Molecular Device公司)的儀器。在其最常見的構(gòu)型中，它能夠激發(fā)并測定熒光染料所發(fā)射的熒光。它使用氬離子激光產(chǎn)生熒光物質(zhì)在488nm處的高能激發(fā)，使用光學(xué)系統(tǒng)快速掃描96-/384-孔板，使用靈敏的冷CCD相機(jī)捕捉所發(fā)射熒光。它還含有一個96-/384-孔移液吸頭，使儀器能夠?qū)⑹茉囋噭┑娜芤恨D(zhuǎn)移到96-/384-孔板的孔中。設(shè)計(jì)FLIPR分析，在加入化合物之前、過程中或之后實(shí)時測定細(xì)胞群產(chǎn)生的信號，同時對所有96-/384-孔進(jìn)行測定。可以使用FLIPR分析法篩選并鑒定對ICC具有活性的化合物，其中ICC從c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離得到。
舉例來說，但決不具有限制性，可以監(jiān)測細(xì)胞電生理、生理(例如，細(xì)胞中15個生理參數(shù)的變化，如細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外鈣或其他離子濃度、pH變化、第二信使的存在或量上的變化、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、凋亡指標(biāo)、分泌因子的分泌、細(xì)胞復(fù)制、接觸抑制等)、形態(tài)等的變化。因此本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是提供篩選調(diào)控ICC中慢波形成的化合物的方法，所述方法包含使根據(jù)本發(fā)明方法獲得的cajal間質(zhì)細(xì)胞和受試化合物相接觸，測定所述受試化合物對所述細(xì)胞形成慢波的影響。在一個特定的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞從包含本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離，更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞從c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)分離得到。
參照下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可以更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員也明白這些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)僅是本發(fā)明的示例，后面的權(quán)利要求書會更為全面地描述本發(fā)明。另外，整篇申請中引用了多種出版物。這些出版物的內(nèi)容在本申請中引用作為參考，以更全面地描述本發(fā)明所述的技術(shù)領(lǐng)域。
實(shí)施例1 建立用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的ZsGreen1/NoLS c-kit構(gòu)建體引言Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)產(chǎn)生對于腸蠕動重要的定步標(biāo)記(慢波)。定步標(biāo)記的分子機(jī)制尚不清楚。由于在解離過程中ICC的唯一標(biāo)記物，即c-kit丟失，過去分離ICC的嘗試都是不成功的。因此，我們將產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因小鼠，這種小鼠和WlacZ模型1類似，只是攜帶有位于c-kit啟動子控制下的ZsGreen1基因，而非LacZ。核仁定位信號(NoLS)將和ZsGreen1相融合，產(chǎn)生一個濃縮的、亮熒光信號。這種定位的熒光報(bào)告基因?qū)⒛軌蚴聚櫥罱M織中的c-kit表達(dá)性ICC，和解離后的c-kit表達(dá)性ICC。
方法使用表1中提到的引物和退火溫度，通過PCR(30”94℃，(30”94℃，1’Tm，1’ 72℃)25×)獲得不同的NoLS(TCOF-12、RLP313、RPS254或Fxr2h5)和c-kit第一個外顯子的一部分。分別用EcoRI和BamHI、SacI和EcoRI、SacI和BamHI對NoLS、c-kit和載體pZsGreen1-N1進(jìn)行消化，并使它們相連接。將構(gòu)建體(參見圖1)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli中(one shot cells，Invitrogen)，DNA分離后瞬時轉(zhuǎn)染COS-7(DOTAP，Roche)細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡和FACS對各構(gòu)建體的亞細(xì)胞靶向效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行定量。固定后，使用TOPRO-3核染料(Molecular Probe)，用溶于PBS中的0.1μM TOPRO-3將細(xì)胞孵育5分鐘對細(xì)胞核進(jìn)行染色。
結(jié)果1.共聚焦顯微觀察顯示了細(xì)胞核的紅色信號(TOPRO-3核染色)和構(gòu)建體的綠色信號(ZsGreen1)。
和不具有核仁定位信號的pZsGreen1-N1不同，NoLS構(gòu)建體RPS25、TCOF-1和Fxr2h誘導(dǎo)熒光蛋白在核仁的積累(圖2)。長時間后，這些核仁定位的ZsGreen1重新轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中(圖3)。
轉(zhuǎn)染后24h，RPS25良好地定位于核仁中，但是在32h時，RPS25返回到細(xì)胞質(zhì)中。TCOF-1信號較弱，僅緩慢地定位于核仁中(32h)。雖然有些Fxr2h-ZsGreen1定位于核仁中，但仍有大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中。
四個構(gòu)建體中，RLP31能夠最好地將ZsGreen1定位。定位的發(fā)生早在8h，持續(xù)至轉(zhuǎn)染后32h。另人奇怪的是，該信號并不定位在細(xì)胞核中，而是定位在鄰近細(xì)胞核的部位。用抗-球蛋白(MolecularProbes)對RLP31轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，結(jié)果表明ZsGreen1確實(shí)定位于高爾基體中，不非定位于核仁中，和以前的報(bào)道相一致3(圖3)。
2.RLP31轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FACS分析表明有20％的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染群體中死亡細(xì)胞的百分比分別是8％～10％和5％～7％(數(shù)據(jù)未列出)。
為了比較未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的增殖效率，進(jìn)行了Via Light HS分析。72h時，不同克隆間沒有觀察到顯著的差異，說明RLP31-ZsGreen1蛋白沒有毒性(圖5)。共聚焦顯微分析表明5個克隆中RLP31-ZsGreen1的表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)?數(shù)據(jù)未列出)。
結(jié)論除了RLP31將ZsGreen1定位于高爾基體之外，所有的NoLS(RPS25＞TCOF-13Fxr2h)都將ZsGreen1定位于核仁中。使用pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31構(gòu)建體獲得了持續(xù)時間最長的定位。其表達(dá)不導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性，能夠使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選。通過同源重組，pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31正用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因Kit W-GFP小鼠。
表1.引物(SEQ ID No.3)c-kit正向 GAGCTCAGAGTCTAGCGCAGCC 521bp Tm＝61℃(SEQ ID No.4)c-kit反向 GGACAAACGTCAGGTCCGTGG(SEQ ID No.5)c-kit嵌套正向 CATGGAGCTCAGAGTCTAGCGCAG84bp Tm＝65℃(SEQ ID No.6)c-kit嵌套反向 GCTGTGAATTCACGGAGCAGGAC(SEQ ID No.7)RPS25正向 GACGACAAGAAGAAGAAAGATGCCG 302bp Tm＝58℃(SEQ ID No.8)RPS25反向 GCTCTGTGCTTTGAAACCAGCTTGA(SEQ ID No.9)RPS25嵌套正向 GACCCAGAATTCAAATCTGGTGGC53bp Tm＝66℃(SEQ ID No.10)RPS25嵌套反向TTGTFCGGATCCTCCCGAACTTTG(SEQ ID No.11)RLP31as1引物GCATCGAATTCCGCTTGTCCAGAAAACGTAAGGATCCTGAGG(SEQ ID No.12)FXR2H正向CGCCGTACTGATGAAGACAGGACTG 296bp Tm＝60℃(SEQ ID No.13)FXR2H反向GGAGCTTGCTGACAGAGTCACCCT(SEQ ID No.14)FXR2H嵌套正向GAATCAGAATTCAGACCCCAGAGACG 44bp Tm＝65℃(SEQ ID No.15)FXR2H嵌套反向CAGTCGGATCCCCACGATTACGG(SEQ ID No.16)TCOF-1正向GTGCTGGTGGCAAGGGGAAG 263bp Tm＝59℃(SEQ ID No.17)TCOF-1反向TCACACGGCAGGCTCGGCTG(SEQ ID No.18)TCOF-1嵌套正向GAAAGAATTCAAGAAAAAAAAAGACAAG 125bpTm＝58℃(SEQ ID No.19)TCOF-1嵌套反向GTATGGATCCCACACGGCAG
表2-所用的NoLS和c-kit序列
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實(shí)施例2.建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建了一個構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含79個核苷酸的c-kit片段(外顯子1的22nt的5′非編碼序列agagtctagcgcagccaccgcg(SEQ ID No.24)和外顯子1的57nt編碼序列atgagaggcgctcgcggcgcctgggatctgctctgcgtcctgttggtcctgctccgt(SEQ ID No.25))、以前I.K.E.描述為NoLS定位信號的一個高爾基體信號肽序列和一個ZsGreen1編碼序列。通過SacI-NotI消化可以將該片段從pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31載體上分離。隨后將該片段連接到小鼠c-kit基因外顯子1的5′非編碼區(qū)中的相同位置上(包含外顯子1的gDNA片段的4262位置處MMCKITEX1)。為了使重組cDNA片段整合到小鼠c-kit基因的5′UTR中，設(shè)計(jì)了以下對策將目標(biāo)cDNA克隆到中間載體pKI中。這使得我們能夠獲得剪接受體/剪接供體序列盒和多聚腺苷酸化信號，以及floxed PGKNeo標(biāo)記。然后使中間載體中的SfiI序列盒隨即交換為旁側(cè)有SfiI的酵母標(biāo)記，在酵母中通過同源重組導(dǎo)入包含c-kit基因的KOS基因組克隆。這樣就將SfiI序列盒的5′區(qū)置到了基因的5′UTR中，我們能夠盡可能多地刪除天然基因。在包含Prm-CRE轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞中進(jìn)行c-kit基因的最終靶向。在該ES細(xì)胞系中，精子發(fā)生Cre的表達(dá)受控于魚精蛋白啟動子。因此，當(dāng)飼養(yǎng)產(chǎn)生于ES細(xì)胞系的嵌合小鼠時，靶等位基因傳經(jīng)雄性胚系，旁側(cè)帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的Neo序列盒切除，從而使Neo標(biāo)記在嵌合體的飼養(yǎng)過程中切除。
2.1構(gòu)建體已經(jīng)克隆到了多個重疊的KOS克隆，并通過基因特異的測序進(jìn)行了驗(yàn)證。通過限制性消化和部分測序產(chǎn)生并驗(yàn)證了cKit-nols-GFP敲入靶載體。通過電穿孔法將靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞中。
對gDNA文庫進(jìn)行篩選，結(jié)果從組裝成小鼠毗鄰序列區(qū)(圖4)的c-kit基因座上分離到了數(shù)個基因組克隆(pkos/JNJ33/32和pkos/JNJ33/85)。在該序列中，包含c-kit/GFP融合體的pKI-PLUS選擇序列盒插入到了核苷酸5583～5686的位置。將c-kit/GFP融合體構(gòu)建體以BglII-SacII片段形式克隆到pKI-PLUS中的BglII-SacII上(圖3)。
為了驗(yàn)證基因型，設(shè)計(jì)了以下對策
SOUTHERN利用5′端探針JNJ33-19+JNJ33-20進(jìn)行Southern分析，驗(yàn)證基因型。可以使用小鼠基因組DNA作為模板，使用引物JNJ33-19+JNJ33-20(參見下文)來擴(kuò)增該探針。對經(jīng)KpnI消化的尾基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，會產(chǎn)生一個源于野生型等位基因的13kb和一個來源于靶向等位基因的8kb條帶(Neo切除后的條帶)。請注意如果ES細(xì)胞DNA用作對照，則JNJ33-19+JNJ33-20探針將用于檢測來源于靶向(未切除)等位基因的條帶，JNJ33-19+JNJ33-20是一個5′探針，KpnI在Neo序列盒的5′一側(cè)進(jìn)行切割。
PCRPCR基因型驗(yàn)證可用于區(qū)分野生型等位基因和靶向等位基因。引物JNJ33-2+JNJ33-25應(yīng)該從WT等位基因中擴(kuò)增得到一個238bp的產(chǎn)物(Neo切除后)。提供的ES細(xì)胞具有靶向的、未切除的等位基因，不能作為該分析的陽性對照。
引物序列Southern序列JNJ33-19 5′-CATTCAGAGATATTTAAAGTGCTC(SEQ IDNo.26)JNJ33-20 5′-CGTTTGGATTCTAAAAGTAAG(SEQ ID No.27)PCR基因型驗(yàn)證KI5′5′-GTTGAGATGGGACTGCAGGAA(SEQ ID No.28)JNJ33-2 5′-CAGCTCAGGTGAGCGAGGCG(SEQ ID No.29)JNJ33-25 5′-GAGGCGCTCGCGGCGCCTGGGA(SEQ IDNo.30)2.2 ES細(xì)胞和嵌合體分離了400個ES細(xì)胞克隆，準(zhǔn)備用于Southern印跡篩選。
鑒定到了數(shù)個靶向ES細(xì)胞克隆，并在兩個同源臂上都得到了證實(shí)。另外，還通過Neo Southern篩選了具有隨即靶向載體插入的克隆。
產(chǎn)生了6個雄性嵌合體和3個雌性嵌合體。一個雄性5％嵌合體是第一個給出胚系轉(zhuǎn)移的嵌合體。
實(shí)施例3.將c-kit-ZsGreen轉(zhuǎn)基因小鼠和無限增殖小鼠(CharlesRiver)一起飼養(yǎng)為了獲得帶有大T抗原的熒光ICC，雜合的c-kit雌性小鼠和無限增殖轉(zhuǎn)基因的純合雄性小鼠(H-2Kb-tsA58)一起飼養(yǎng)。通過尾部活組織檢查驗(yàn)證所產(chǎn)生后代的基因型。
PCR驗(yàn)證雜合動物的基因型根據(jù)Qiagen或酚小鼠尾部DNA方案從小鼠尾部提取基因組DNA。每次提取～100ng基因組DNA，典型1μg用作模板。根據(jù)PCR準(zhǔn)備方案(50μL反應(yīng)體系)在并上準(zhǔn)備1×10×PCR緩沖液 5μL(含有15mM MgCl2的Boehringer)10mM dNTP(Invitrogen) 2μL50μM混合的引物 1μL5U/μL Taq聚合酶 0.2μLDdH2O 40.8μL每管加49μL總的混合物，加入1μL模板DNA程序1× @94℃；4min30×@94℃；30sec58℃；1min72℃；1min 30sec1× @72℃；5min寡聚c-kit-ZsGreenKI5’5’-GTTGAGATGGGACTGCAGGAA(SEQ ID No.28)JNJ33-2 5’-CAGCTCAGGTGAGCGAGGCG(SEQ ID No.29)JNJ33-25 5’-GAGGCGCTCGCGGCGCCTGGGA(SEQ ID No.30)
野生型動物對JNJ33-2+JNJ33-25顯示出一條238bp的帶，而c-kit-ZsGreen小鼠對KI5+JNJ33-2顯示出一條300bp的帶。
寡聚無限增殖小鼠組分Immo15’-AGCGCTTGTGTCGCCATTGTATTC(SEQ ID No.31)Immo25’-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC(SEQ ID No.32)無限增殖組分?jǐn)y帶者顯示出一條～1000bp的帶，而WT動物則不顯示該帶。
實(shí)施例4.產(chǎn)生ICC細(xì)胞系將c-kit-ZsGreen-無限增殖小鼠組分雜合小鼠的空腸解剖成肌肉條，并進(jìn)行酶消化，以獲得單個細(xì)胞。通過熒光活化的細(xì)胞分選儀(MOFLO)選擇熒光細(xì)胞，開始原代細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞于33℃培養(yǎng)會激活大T抗原，這些原代細(xì)胞培養(yǎng)物將可以無限增殖，隨后分離單克隆細(xì)胞系。
4.1單細(xì)胞解離將任意性別的c-kit/無限增殖復(fù)合物雜合小鼠(對于細(xì)胞培養(yǎng)來說9～15天大小)引頸處死。取出小腸，并置于冷的Krebs-Ringer緩沖液中。洗去腔內(nèi)容物，用一對細(xì)小的鑷子將黏膜取下。解剖的肌肉條在包含(mM)125 NaCl、5.36 KCl、15.5 NaOH、0.336 Na2PO4、0.44KH2PO4、10葡萄糖、2.9蔗糖和11 HEPES(pH7.4)的無Ca的HanK’s溶液中平衡1h。對組織進(jìn)行輕洗，于包含無Ca的HanK’s溶液、1.3mg/mL膠原酶(II型；Worthington)、2mg/mL牛血清白蛋白(Sigma)、2mg/mL胰蛋白酶抑制劑(Sigma)和0.55mg/mL三磷酸腺苷的酶溶液中靜置過夜。第二天，組織于37℃孵育5min，用無Ca的HanK’s溶液重復(fù)洗滌，將酶去除。將組織小塊研磨成離散的細(xì)胞。
Ref.Epperson A.et al.，Am.J.Physiol.Cell.Physiol.279C529-C539，20004.2細(xì)胞選擇MOFLO通過熒光活化的細(xì)胞分選對細(xì)胞內(nèi)GFP標(biāo)記的Kit表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行選擇，將產(chǎn)生高度富集有Kit+ICC的活細(xì)胞群。
單細(xì)胞懸液是關(guān)鍵的。因此，在上樣到流式細(xì)胞儀之前將樣品經(jīng)40微篩加以過濾。1*106細(xì)胞/mL的濃度將以1000細(xì)胞/秒的效率進(jìn)行分選。維持下列規(guī)格電壓板為2700V，液滴延遲頻率為97～98kHz，液滴延遲振幅為15V?？梢噪S時根據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整?？梢愿鶕?jù)純度或回收方式優(yōu)化MoFlo。Cyclone，一個自動控制的微孔滴定板控制器，可以完全程序化地進(jìn)行分選，包括克隆(單細(xì)胞分選)。
通過免疫染色法kit+細(xì)胞和sv40+細(xì)胞的百分比，作為質(zhì)控。帶有內(nèi)部ZsGreen熒光的細(xì)胞將被選擇為kit+細(xì)胞(ICC)，用冷的甲醇固定10min后，使用抗SV40大T抗原的單克隆抗體(pab419-alexa594)進(jìn)一步檢測SV40大T抗原的存在。通過激光共聚焦顯微鏡檢測紅色(pab419-alexa594)和綠色(ZsGreen1，λ＝488)熒光。
4.3細(xì)胞培養(yǎng)隨后將細(xì)胞培養(yǎng)在SM培養(yǎng)基中，據(jù)報(bào)道該培養(yǎng)基配方有利于ICC培養(yǎng)。
將產(chǎn)生的細(xì)胞懸液鋪在包被有小鼠膠原的無菌玻璃蓋片條上。使細(xì)胞適應(yīng)10min后，加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是添加有2％抗生素/抗麻醉劑(GIBCO)和小鼠干細(xì)胞因子(SCF 5ng/mL，Sigma)的SMGM(Clonetics)。往每mL培養(yǎng)基中添加10個單位的干擾素γ。細(xì)胞于33℃、90％O2-10％CO2條件下孵育，33℃是tsA58大T抗原表達(dá)的溫度。24h后，將培養(yǎng)基換為含有SCF、而不含有抗生素/抗麻醉劑的SMGM，然后隔天換液，直至細(xì)胞能夠用于其他實(shí)驗(yàn)。但細(xì)胞將長滿時，使用膠原酶和蛋白酶(Boehringer Mannheim)的混合物將細(xì)胞傳代，后期(6代之后)可以使用胰蛋白酶。培養(yǎng)物以小于1∶3的比例傳代，使用Mycoplasma PCR ELISA試劑盒(Roche)驗(yàn)證Mycoplasma的存在與否。進(jìn)一步的所有實(shí)驗(yàn)都在33℃、10％CO2條件下進(jìn)行。3個月后，干擾素γ濃度可以降至1單位/mL，而對細(xì)胞生長沒有副作用。
Ref.S.D.Koh，K.M.Sanders，and S.M.Ward.來源于小鼠小腸的、培養(yǎng)的cajal間質(zhì)細(xì)胞的自發(fā)性電節(jié)律.Journal of Physiology 513(pt1)203-213，1998.
Whitehead et al，1993.來源于成年-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸和slamm腸的、條件固化的上皮細(xì)胞系的建立.Proc.Natl.Acad.SciUSA 90，587-591.
實(shí)施例5.評價(jià)ICC細(xì)胞系和慢波形成過程中潛在靶點(diǎn)的參與一旦建立了ICC細(xì)胞系，就必須驗(yàn)證ICC在體外形成慢波的潛力。其次，如果ICC形成慢波，則驗(yàn)證參與慢波形成的候選基因。短干擾RNA(siRNA)是基于序列特異性靶向和RNA降解的基因調(diào)控類型，是下調(diào)特定靶基因的一種簡單方式。電生理學(xué)研究可以證實(shí)它們是否參與慢波的形成。
5.1電生理實(shí)驗(yàn)將使用完整細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來記錄(siRNA轉(zhuǎn)染的)ICC的膜電勢或電流。如果ICC培養(yǎng)物表現(xiàn)出自發(fā)性的慢波，則通過siRNA將一些候選基因敲除，觀察慢波的頻率和振幅來驗(yàn)證這些候選基因的功能。
使用標(biāo)準(zhǔn)的膜片鉗放大器(EPC9 HEKA)可以放大電勢或電流。使用Pulse軟件(HEKA)將數(shù)據(jù)數(shù)字化。使用8孔Bessel濾器在1kHz處對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。培養(yǎng)的細(xì)胞在包含(mM)5 KCl、135 NaCl、2CaCl2、10葡萄糖、1.2 MgCl2和10 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)，并用三羥甲基氨基甲烷(TRIS)調(diào)整至pH7.4的溶液中洗滌。用不同濃度的n-甲基-D-谷氨酰胺取代NaCl。還用MnCl2取代CaCL2。移取(pipette)溶液包含(mM)110K-葡萄糖酸鹽、20KCl、5 MgCl2、2.7 K2ATP、0.1 Na2GTP、2.5肌酸磷酸二鈉、5HEPES和0.1 EGTA，用TRIS調(diào)整至pH7.2。
使用Pulse Fit(HEKA)和Igar Pro軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
5.2 siRNA作為工具下調(diào)特異基因5.2.1體外轉(zhuǎn)錄和siRNA雜交在10mM Tris-HCl pH9.0、100mM NaCl、1mM EDTA中，通過煮沸2min，2～3h內(nèi)緩慢冷卻至室溫使寡聚模板鏈和正義T7啟動子序列(5′TAATACGACTCACTATAGG 3′)相雜交。使用MEGAshortscriptTMT7試劑盒(Ambion)，根據(jù)生產(chǎn)商的建議進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在G-25旋轉(zhuǎn)柱上，使用Heavy Phase-Lock凝膠(Eppendorf)進(jìn)行酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，及乙醇-80℃沉淀過夜來純化siRNA鏈。在1mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA pH8.0中，通過煮沸2min、2～3h內(nèi)緩慢冷卻至室溫使互補(bǔ)siRNA鏈相雜交。在非變性20％聚丙烯酰胺TBE凝膠上進(jìn)行雙鏈和單鏈siRNA的電泳，評價(jià)雜交效率。
5.2.2細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染ICC在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)Elbashir等(Nature 2001)的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24h，細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，用不含抗生素的生長培養(yǎng)基稀釋至3×105細(xì)胞/mL。將細(xì)胞接種到24孔板中，每孔0.5mL。使用LipofectamineTM2000(LF2000；Invitrogen)，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，用50pmol單鏈或25pmol雙鏈siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。具體地說，對于每孔，我們將2μL LF2000稀釋在48μL無血清無抗生素的培養(yǎng)基中。稀釋的LF2000在室溫預(yù)孵育1min，然后和稀釋在相同培養(yǎng)基中至終體積50μL的siRNA相混合。復(fù)合物于室溫孵育20min，然后加到細(xì)胞中。對于siRNA劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，使用6-孔板。細(xì)胞數(shù)增加4倍，試劑增加約5倍。
實(shí)施例6.篩選作為上述電生理實(shí)驗(yàn)的替換方案，通過FLIPR測定可能負(fù)責(zé)慢波的Ca波動。以這種方式，通過測定ICC細(xì)胞系中的Ca波動，也可以鑒定增加或減小慢波形成的振幅和/或頻率的化合物。
Protocol Flipr膜電勢分析試劑盒(Clontech)
試劑盒組成每個FLIPR膜電勢分析試劑盒(cat.#R8034)都包括下列組分，足夠做100個96-孔板或384-孔板。
-1瓶10×試劑緩沖液，組分B(含有200mM HEPES，pH6.0的10×Hank’BSS)-10小瓶FLIPR膜電勢分析試劑，組分A-每小瓶足夠做10個96-孔板或384-孔板不包括試劑盒中的其他所需材料-NaOH和HCl，用于調(diào)整pH-購自Molecular Devices的540～590 Bandpass FLIPR Filter試劑盒細(xì)胞操作將板置于FLIPR系統(tǒng)之前，膜電勢分析試劑盒要求產(chǎn)生長滿的細(xì)胞單層。
對于貼壁細(xì)胞來說，細(xì)胞接種過夜，對于96-孔板鋪板體積為100μL/孔，對于384-孔板鋪板體積為25μL/孔。
6.1制備上樣緩沖液下面的步驟適用于10個96-孔板或384-孔板，利用如上所述制備的貼壁細(xì)胞進(jìn)行。
1.1為了配制1×試劑緩沖液，吸取10mL 10×試劑緩沖液(組分B)，用蒸餾水稀釋至100mL。用NaOH調(diào)整至pH7.4。
注意根據(jù)細(xì)胞類型和用途，F(xiàn)LIPR膜電勢試劑盒提供的Hanks/HEPES緩沖液可能并不是理想的選擇。如果該緩沖液不理想，不同的使用者為了達(dá)到最佳效果，可以采用其他的緩沖液。
1.2取出一小瓶膜電勢分析試劑(組分A)加入10mL1×試劑緩沖液，將小瓶的內(nèi)容物完全溶解。反復(fù)吹打混勻，直至內(nèi)容物完全溶解。
1.3警告提供的組分對于適當(dāng)?shù)募?xì)胞上樣是足夠的。為了獲得最佳結(jié)果，千萬不要加入多余的試劑或改變體積。
將小瓶混合物稀釋到90mL1×試劑緩沖液中來配制上樣緩沖液。有必要對小瓶進(jìn)行多次沖洗，以將內(nèi)容物完全轉(zhuǎn)移。
6.2使用上樣緩沖液進(jìn)行細(xì)胞上樣從孵箱或離心機(jī)中取出細(xì)胞板。不要移出上清液。往各孔中加入等體積的上樣緩沖液(96-孔板為100μL/孔，384-孔板為25μL/孔)。雖然Molecular Devices并不建議在染色上樣之前洗細(xì)胞，在加入上樣緩沖液之前可以洗去生長培養(yǎng)基和血清因子，只要終體積和所述相同?；蛘?，細(xì)胞培養(yǎng)在無血清的條件下。
2.2注意在某些情況下，在室溫下孵育可能效果更好。
2.2將細(xì)胞板于37℃孵育30min。
警告染色上樣后不要洗細(xì)胞。
2.3配制化合物在分析過程中，在細(xì)胞板中將化合物配制成終濃度的2×、3×、4×或5×。需要快速進(jìn)行測定，以顯示快速的細(xì)胞動力學(xué)。由于有效混合的需要，建議體積比不小于1∶3至1∶4。為了避免將貼壁能力較弱的細(xì)胞吹起，應(yīng)該往細(xì)胞板中加入較小的化合物體積。
2.4洗細(xì)胞洗液的需要量為150mL/96孔板或200mL/384孔板。用細(xì)胞洗液洗細(xì)胞3～4次。
6.3運(yùn)行FLIPR膜電勢分析3.1孵育前，取出位于FLIPR系統(tǒng)的濾門內(nèi)的濾光片架。簡單地說，將固定濾光片架的兩個螺絲松開，將架放在潔凈的或鋪有毛巾的桌面上。濾光片#2位置應(yīng)該是空的。順時針將螺絲松開，移出一個環(huán)。小心將540～590 bandpass發(fā)射濾光片放在#2位置上，將環(huán)螺回原處，使V型槽口朝外。將濾光片架放在FLIPR系統(tǒng)中的正確位置上。
3.2在FLIPR軟件的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中選擇濾光片#2。孵育后，將板直接轉(zhuǎn)移FLIPR系統(tǒng)中，開始膜電勢分析。膜電勢分析可以在室溫至生理溫度的條件下運(yùn)行。
3.3推薦使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)置參數(shù)如下。注意加入速率比傳統(tǒng)方案快，這是因?yàn)樾碌纳蠘映绦蚝笤黾恿思?xì)胞的強(qiáng)度。
更快的加入速度導(dǎo)致更好的混合和板上更低的信號差異。
權(quán)利要求
1.能夠整合到野生型c-kit等位基因中的c-kit質(zhì)粒靶向載體，所述載體的特征是編碼包含核仁定位信號的嵌合熒光蛋白。
2.權(quán)利要求1的c-kit質(zhì)粒靶向載體，其中核仁定位信號選自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h。
3.權(quán)利要求1的c-kit質(zhì)粒靶向載體，其中核仁定位信號由RLP31組成。
4.權(quán)利要求1的c-kit質(zhì)粒靶向載體，其中熒光蛋白選自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan、AsRed。
5.權(quán)利要求1的c-kit質(zhì)粒靶向載體，其中熒光蛋白由ZsGreen1組成。
6.權(quán)利要求1的c-kit質(zhì)粒靶向載體，其包含SEQ ID No.1。
7.一種細(xì)胞，它被權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)的c-kit質(zhì)粒靶向載體轉(zhuǎn)染。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中連續(xù)生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自COS-7、colon26。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞由COS-7組成。
12.一種轉(zhuǎn)基因非人類動物，其包含權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)的c-kit質(zhì)粒靶向載體。
13.從權(quán)利要求12中的轉(zhuǎn)基因動物分離c-kit表達(dá)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(a)解離包含c-kit表達(dá)細(xì)胞的組織；和(b)從所述解離組織中分離包含c-kit質(zhì)粒靶向載體的熒光標(biāo)記細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中使用細(xì)胞分選儀進(jìn)行分離步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中細(xì)胞分選儀是流式細(xì)胞儀。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中包含c-kit表達(dá)細(xì)胞的組織選自Cajal間質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，如朗氏島的細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、松果體細(xì)胞和垂體細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中包含c-kit表達(dá)細(xì)胞的組織由Cajal間質(zhì)細(xì)胞組成。
18.一種c-kit表達(dá)細(xì)胞，其可根據(jù)權(quán)利要求13～17任意一項(xiàng)的方法獲得。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的c-kit表達(dá)細(xì)胞，其用于建立原代細(xì)胞系。
20.鑒定參與慢波形成的潛在藥物靶的方法，所述方法包括用靶特異基因沉默手段對可根據(jù)權(quán)利要求17的方法獲得的Cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，測定所述基因沉默手段對所述細(xì)胞形成慢波的影響。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中基因沉默手段包括使用反義序列或短干擾RNA(siRNA)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中的Cajal間質(zhì)細(xì)胞分離自c-kit/無限增殖轉(zhuǎn)基因。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中基因沉默手段由靶特異的siRNA組成。
24.篩選調(diào)節(jié)Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)中慢波形成的化合物的方法，所述方法包括使可根據(jù)權(quán)利要求17的方法獲得的ICC和受試化合物相接觸，測定所述化合物對所述細(xì)胞形成慢波的影響。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中使用離子靈敏性熒光染料和熒光測定儀和熒光成像技術(shù)測定慢波的形成。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中離子靈敏性熒光染料是鈣離子靈敏性染料，優(yōu)選地選自fluo-3、fluo-4、fluo-5N和fura red。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中熒光成像技術(shù)由熒光成像板讀數(shù)儀(FLIPR)組成。
全文摘要
本發(fā)明為分離c－kit表達(dá)細(xì)胞提供了一個工具。該工具由c－kit質(zhì)粒靶向載體組成，該載體能夠整合到野生型c－kit等位基因上，并編碼包含核仁定位信號，如TCOF－文檔編號C12N5/10GK1604967SQ02824941
公開日2005年4月6日 申請日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者M·M·W·沃特爾斯, K·A·A·斯曼斯, J·－M·范德溫登 申請人:詹森藥業(yè)有限公司