專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定和開(kāi)發(fā)治療劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及鑒定和確定生物活性氨基酸序列的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供了確定宿主基因中的變異對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響的方法，該方法的目的是為了設(shè)計(jì)治療藥物或疫苗或使這種治療個(gè)體化(individualisation)。本發(fā)明也提供了鑒定HLA等位基因特異性微生物序列多態(tài)的方法，該多態(tài)由HLA限定的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生。它也提供了診斷和治療方法，該方法可用于測(cè)量或治療微生物感染或預(yù)防微生物感染。
背景技術(shù)：
動(dòng)物對(duì)病理微生物或腫瘤的反應(yīng)由大量生物學(xué)反應(yīng)和相互作用組成。例如，對(duì)感染病毒的細(xì)胞的反應(yīng)主要由稱(chēng)為CD8+T-細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的效應(yīng)T細(xì)胞亞群介導(dǎo)。盡管這些細(xì)胞可直接殺死感染病毒的細(xì)胞，但它們通常需要由稱(chēng)為CD4+輔助T-細(xì)胞的其他T淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物或細(xì)胞因子的幫助。
參與病理微生物識(shí)別以及起始和活化對(duì)抗性免疫反應(yīng)的主要CTL受體是僅存在于T-細(xì)胞表面的稱(chēng)為T(mén)-細(xì)胞受體分子的抗原特異性受體。該受體特定地與存在于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)或人白細(xì)胞抗原(HLA)分子中的加工過(guò)的肽抗原反應(yīng)?？乖噪暮虷LA分子之間的相互作用在起始和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中是基本的要素。
HLA分子是在體內(nèi)各種細(xì)胞表面表達(dá)的多態(tài)性受體。這些受體的功能是結(jié)合并展示某些細(xì)胞表面的不同肽片段，從而抗原可由T淋巴細(xì)胞識(shí)別。這使得免疫系統(tǒng)可監(jiān)控體內(nèi)是否存在源自感染因子或異常癌性組織的肽。這種肽當(dāng)與HLA受體復(fù)合時(shí)將觸發(fā)T-細(xì)胞對(duì)該“外源”因子起反應(yīng)。
肽-HLA復(fù)合物的形成和隨后的T-細(xì)胞識(shí)別對(duì)肽序列是高度敏感的。因而，向活化型野生肽中引入突變可消除T-細(xì)胞活化。那些具有這種突變的生物能避開(kāi)宿主的免疫反應(yīng)并因此具有選擇優(yōu)勢(shì)。
人們相信HLA的多樣性或多態(tài)是由協(xié)同進(jìn)化的感染性疾病威脅所驅(qū)動(dòng)的。同時(shí)，許多感染性因子也通過(guò)協(xié)同進(jìn)化來(lái)逃避宿主HLA-特異性的選擇壓力。這一進(jìn)化和協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程在某些病毒中是特別明顯的，如人免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹病毒和肝炎病毒如丙型肝炎病毒(HCV)。
例如，對(duì)與CTL反應(yīng)減少或喪失相關(guān)的HIV-1變體的選擇已在具有急性或晚期HIV-1感染的各種個(gè)體中證明。然而，其他HIV-1感染的個(gè)體缺乏顯而易見(jiàn)的病毒逃避。迄今為止，CTL逃避型突變的頻率以及其對(duì)全球HIV進(jìn)化的重要性以及HLA-多樣的人類(lèi)群體中的致病性都尚未完全闡明。此外，對(duì)HIV-1序列的免疫作用還有許多未得到充分表征。
由于前述原因，目前的DNA或蛋白質(zhì)分析方法不能解釋許多競(jìng)爭(zhēng)性壓力，該壓力驅(qū)動(dòng)動(dòng)物對(duì)病原微生物和(更特定的)由該微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。
本發(fā)明致力于提供同時(shí)確定和分析競(jìng)爭(zhēng)性選擇力的方法，該選擇力在來(lái)自病原生物蛋白質(zhì)的單個(gè)氨基酸水平上起作用。利用這種方法，可以分析由宿主的單個(gè)多態(tài)基因?qū)μ囟ㄎ⑸锏鞍踪|(zhì)序列中氨基酸施加的選擇壓力。也可以檢查多個(gè)標(biāo)記或一個(gè)標(biāo)記和其他外在變量對(duì)特定蛋白質(zhì)序列中氨基酸變異的影響。當(dāng)患者由特定微生物感染時(shí)或當(dāng)他們可能處于易于由特定微生物感染的高危組中時(shí)，收集這些數(shù)據(jù)可提供監(jiān)控、選擇和使患者的治療和疫苗接種個(gè)體化的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了適合于鑒定和確定生物活性氨基酸序列的分析方法。它提供了能夠確定宿主內(nèi)在多肽或多核苷酸序列中的變異對(duì)微生物變體中特定氨基酸序列的選擇的影響的方法。它也提供了用于分析宿主內(nèi)在多肽中的變異聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)其他變量如治療劑(如藥物或疫苗)對(duì)微生物變體中特定氨基酸序列的選擇的影響的方法。它提供了利用這種信息使患者的治療個(gè)體化的方法以及確定患者對(duì)特定藥物治療的易感性的方法，并可以對(duì)患者個(gè)體定制藥物治療法。在本發(fā)明一個(gè)高度優(yōu)選的形式中，提供了鑒定HLA-等位基因特異性微生物序列多態(tài)的方法，該序列多態(tài)由HLA限定的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生。
為了便于描述本發(fā)明，選擇HIV來(lái)闡明如何應(yīng)用在此處描述的方法和如何應(yīng)用從該方法揭示的數(shù)據(jù)以制備適合于治療HIV感染的患者和有HIV感染危險(xiǎn)的患者的治療劑。然而應(yīng)該理解的是這里描述的方法可應(yīng)用于大量的分析中，其并不僅僅包括皰疹病毒和肝炎(如HCV)病毒感染。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了確定宿主基因中的變異對(duì)具有蛋白質(zhì)取代的微生物的選擇的影響的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇被特定微生物感染的患者或動(dòng)物群體，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的內(nèi)在多肽標(biāo)記對(duì)該群體中的所有個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在該群體中于步驟(a)中確定的每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中部分多核苷酸序列或多肽序列；(c)在該群體中確定步驟(b)分析的序列中每一個(gè)殘基位置上的一致(即最大頻率的)氨基酸；(d)對(duì)在步驟(a)和步驟(b)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定步驟(a)中的宿主多態(tài)序列如何在步驟(b)中確定的序列中的第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上增加或降低微生物多態(tài)的概率；(e)對(duì)步驟(b)中鑒定的每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)并比較獲得的數(shù)據(jù)。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種方法，該方法鑒定宿主多態(tài)標(biāo)記序列的變異與第二個(gè)變量(如治療藥物或疫苗)之間的相互作用以及它們對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響，該方法包含以下步驟a.選擇被微生物感染的患者或動(dòng)物群體，其中的一些接受了第二個(gè)變量作為對(duì)所述微生物的部分治療，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物的反應(yīng)的宿主內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記序列對(duì)所述群體的個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；b.在接受第二個(gè)變量處理之前和之中，在群體每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中的部分或全長(zhǎng)多核苷酸和/或多肽序列，其中該多核苷酸和/或多肽序列是第二個(gè)變量的潛在或已知的靶標(biāo)，另外，以相似的時(shí)間間隔在相似的但未經(jīng)治療的個(gè)體中也進(jìn)行了上述操作；c.確定在步驟(b)中確定的時(shí)間點(diǎn)之間在步驟(b)中檢查的序列中每一個(gè)殘基上是否發(fā)生了變化(“突變”)；d.對(duì)在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)、治療和未治療的序列中向第二個(gè)變量暴露與否的作用以及步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定步驟(a)中的多態(tài)序列以及用第二個(gè)變量的處理如何影響步驟(c)中第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上突變的概率；e.對(duì)步驟(c)中確定的序列中每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了設(shè)計(jì)能夠在患者中誘導(dǎo)特定的T-細(xì)胞反應(yīng)的治療劑的方法，該方法包含如上所述的步驟，接著分析該數(shù)據(jù)以鑒定病毒群體中因?yàn)樵撊后w感染而發(fā)生的多態(tài)，其中該多態(tài)是HLA相關(guān)的。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了檢驗(yàn)特定治療劑在特定群體中的可能功效的方法。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了鑒定T細(xì)胞表位的方法，該方法包含如上所述的步驟，接著分析該數(shù)據(jù)以鑒定病毒群體中因?yàn)樵撊后w感染而發(fā)生的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)是HLA相關(guān)的。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了對(duì)感染性疾病進(jìn)行亞分類(lèi)、預(yù)測(cè)和監(jiān)控的方法。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了設(shè)計(jì)疫苗以防止或延遲在用對(duì)微生物特異性的特定藥物治療的患者中出現(xiàn)藥物抗性的方法，其中該藥物在核苷酸或氨基酸水平影響微生物的復(fù)制，該方法包含以下步驟進(jìn)行如上所述的步驟，然后分析數(shù)據(jù)以鑒定已用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的感染個(gè)體中的病毒群體中發(fā)生的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)頻率是在微生物中藥物具有活性的核苷酸或氨基酸序列區(qū)城中確定的，然后設(shè)計(jì)一種或多種治療劑，該治療劑促進(jìn)針對(duì)含有展示一種或多種鑒定的多態(tài)的病毒群體的細(xì)胞的T-細(xì)胞反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體的方法，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是制備組合物的方法，該方法包含制備根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)，然后將治療劑和藥物可接受的賦形劑進(jìn)行組合。
本發(fā)明也提供了用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)HIV的T-細(xì)胞反應(yīng)的組合物。該組合物包含根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)該組合物用于治療患者時(shí)，它也可包含藥物可接受的賦形劑。該免疫原性組合物可進(jìn)一步包含載體如生理鹽水和佐劑，該佐劑如不完全弗氏佐劑、明礬或montanide。氨基酸序列可進(jìn)一步如在此處所描述的進(jìn)行修飾以增強(qiáng)其在感染的患者中的壽命或其他想要的特征。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)抗原的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的方法。該方法包含向哺乳動(dòng)物給予根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防疾病的方法，其中該疾病對(duì)借助T細(xì)胞反應(yīng)的治療是敏感的，所述方法通過(guò)給予根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)給予組合物而在動(dòng)物中引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該組合物包含藥物可接受的賦形劑和經(jīng)過(guò)改變而含有細(xì)胞免疫反應(yīng)表位的氨基酸序列以及佐劑，該表位包含至少與患者中HLA等位基因類(lèi)型相關(guān)的病毒多態(tài)。該細(xì)胞反應(yīng)可為CD8+T細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T細(xì)胞反應(yīng)、或CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞兩者的反應(yīng)。
在一個(gè)可選擇的形式中，本發(fā)明提供了通過(guò)給予組合物而在動(dòng)物中引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該組合物包含藥物可接受的賦形劑和經(jīng)過(guò)改變而含有至少一個(gè)對(duì)于特定HLA類(lèi)型高度保守的細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的表位的氨基酸序列，或者包含能夠在動(dòng)物中表達(dá)該氨基酸序列的載體構(gòu)建體。待引起免疫反應(yīng)的動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物可為人，該人可為HIV陽(yáng)性或HIV陰性的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是在暴露于感染性HIV中的動(dòng)物中延遲HIV發(fā)病的方法，這是通過(guò)給動(dòng)物接種藥物可接受的賦形劑和根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明也提供了能夠在被HIV感染的或有HIV感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)HIV特異性T-細(xì)胞反應(yīng)的HIV氨基酸序列。該T-細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)性氨基酸序列一般為7-15個(gè)殘基，且更通常為9-11個(gè)殘基。
本發(fā)明的這些和其他方面將參照下面的附圖和發(fā)明詳述更充分地進(jìn)行描述。附圖和描述是用來(lái)輔助本發(fā)明的描述的，但不應(yīng)該認(rèn)為是限制本發(fā)明的方面的。
附圖簡(jiǎn)述附圖描述如下

圖1HIV-1 RT的氨基酸位置95-202多態(tài)率的圖和已知的氨基酸功能特征。
HIV-1 RT的氨基酸位置95-202的圖顯示在抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療前HIV-1 RT序列(n＝185)中每一個(gè)位置上的群體一致氨基酸發(fā)生改變的患者百分比。保守的(灰色條)或非保守的(實(shí)心黑色條)氨基酸取代均進(jìn)行了顯示。殘基的已知功能特征在靠近殘基處標(biāo)記為穩(wěn)定性(S)、有功能的(F)、催化的(C)和外部的(E)。
圖2HIV-1 RT的氨基酸位置20-227多態(tài)率的圖和與HLA-A和HLA-B等位基因的關(guān)聯(lián)性(association)。
已知的HLA-A和HLA-B限定的CTL表位(B.T.M.Korber等人，HIV Molecular Immunclogy Database 1999(Theoretical Biology andBiophysics，New Mexico，1999))在A框中標(biāo)記為灰色線(xiàn)。D框顯示在大多數(shù)最近的HIV-1 RT序列(n＝473)中每一個(gè)位置上具有與群體一致序列不同的氨基酸的患者的百分比。顯著與多態(tài)關(guān)聯(lián)的HLA等位基因以及關(guān)聯(lián)的比值比(odds ratio)(OR)在B框中多態(tài)殘基上面顯示。限定于相同的寬(broad)HLA等位基因的29個(gè)已知的CTL表位中的15個(gè)HLA-特異性多態(tài)以灰色文本顯示，而側(cè)面殘基的5個(gè)以黑色文本顯示。黑色文本中簇聚的關(guān)聯(lián)性可位于新的或推定的CTL表位中。加框的關(guān)聯(lián)性是那些在對(duì)如文中所述鑒定的殘基的總數(shù)目進(jìn)行校正后仍然是顯著的關(guān)聯(lián)性。HLA-B*5101是HLA-B5的亞型，HLA-B44是HLA-B12的亞型，而HLA-A24是HLA-A9的亞型。在C框中，負(fù)的HLA關(guān)聯(lián)性用表示為倒數(shù)的OR(1/OR)標(biāo)記，＞1的比值比表示與一致序列無(wú)差異。如果這些位于已知的CTL表位中或在其側(cè)面，則也用灰色或黑色文本顯示。
圖3所有HLA-B5患者中的HIV-RT氨基酸序列。
與群體一致序列相比，群體中所有52個(gè)患者中HIV-1 RT的最近的氨基酸序列具有血清學(xué)定義的HLA-B5(患者1-52)。將HIV-1 RT序列根據(jù)患者的HLA-B亞型進(jìn)行分組。在所有序列中，點(diǎn)(.)顯示與一致序列無(wú)差異。顯示了與一致序列不同的氨基酸。在對(duì)具有不同氨基酸的準(zhǔn)種進(jìn)行探測(cè)時(shí)，除位置135之外顯示了最常見(jiàn)的氨基酸，在位置135上顯示了在混合的病毒群體中所有探測(cè)到的氨基酸。具有HLA-B*5101亞型的40個(gè)患者中除1個(gè)外(98％)均在位置135具有對(duì)一致氨基酸異亮氨酸(I)的取代，最常見(jiàn)地為由蘇氨酸(T)的取代。1無(wú)I135x的序列是在急性HIV感染中具有HAART的單個(gè)HLA-B*5101患者的序列。2該患者沒(méi)有進(jìn)行分子基因分型(genotyping)。3該患者是HLA-B*5101/HLA-B*5201雜合體，但在HLA-B*5101組中僅計(jì)數(shù)了一次。
圖4HIV-1蛋白酶氨基酸位置1-90多態(tài)率的圖以及與HLA-A和HLA-B等位基因的關(guān)聯(lián)性。
已知的HLA-A和HLA-B限定的CTL表位在A框中標(biāo)記為灰色線(xiàn)。D框顯示在大多數(shù)最近的HIV-1蛋白酶序列(n＝493)中每一個(gè)位置上具有與群體一致序列不同的氨基酸的患者的百分比。顯著與多態(tài)關(guān)聯(lián)的HLA等位基因以及關(guān)聯(lián)性的比值比(OR)在B框中多態(tài)殘基上面顯示。加框的關(guān)聯(lián)性是那些在對(duì)如文中所述鑒定的殘基的總數(shù)目進(jìn)行校正后仍然是顯著的關(guān)聯(lián)性。在C框中，負(fù)的HLA關(guān)聯(lián)性用表示為倒數(shù)的OR(1/OR)標(biāo)記，＞1的幾率值表示與一致序列無(wú)差異。
圖5(a)顯示病毒對(duì)HLA-限定的反應(yīng)的適應(yīng)程度與HIV病毒負(fù)載之間的關(guān)系。
圖5(b)顯示6個(gè)疫苗候選物(SIV、A進(jìn)化枝病毒(clade A virus)、C進(jìn)化枝病毒(clade C virus)、HXB2病毒、我們?nèi)后w的一致病毒和我們最佳的疫苗)的每一個(gè)中有利殘基數(shù)目的頻率分布，該候選物與西澳大利亞群體中每一個(gè)潛在的感染性病毒相匹配。結(jié)果顯示疫苗候選物的功效從最高到最低排列為我們最佳的疫苗、我們?nèi)后w的一致病毒、B進(jìn)化枝HXB2病毒、C進(jìn)化枝病毒、A進(jìn)化枝病毒和SIV。
圖6利用表6所示的病毒負(fù)載柱狀圖中估計(jì)的改變中闡明的病毒負(fù)載結(jié)果，顯示了估計(jì)的HLA-限定的免疫反應(yīng)強(qiáng)度的頻率分布，該免疫反應(yīng)被SIV、A進(jìn)化枝病毒(clade A virus)、C進(jìn)化枝病毒(clade C virus)、HXB2病毒、我們?nèi)后w的一致病毒序列和我們最佳的疫苗中的每一個(gè)所誘導(dǎo)，并針對(duì)西澳大利亞群體(West Australian population)中每一個(gè)潛在的病毒起反應(yīng)。結(jié)果顯示該群體中疫苗候選物的功效從最高到最低排列為我們最佳的疫苗、我們?nèi)后w的一致病毒序列、C進(jìn)化枝病毒、A進(jìn)化枝病毒、B進(jìn)化枝HXB2病毒和SIV。
圖7顯示了推定的HIV蛋白酶治療劑。
圖8顯示了推定的HIV RT治療劑。
發(fā)明詳述概要本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解在此處描述的發(fā)明除了那些特定描述的之外可進(jìn)行變化和修飾。應(yīng)理解的是本發(fā)明包括所有這些變化和修飾。本發(fā)明也包括在說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或共同涉及或顯示的所有步驟、特征、組合物和化合物以及該步驟或特征的任何和所有組合或任何兩個(gè)或更多組合。
本發(fā)明范圍不受在此處描述的特定實(shí)施方案限制，該實(shí)施方案僅是為了示例性的目的。功能等價(jià)的產(chǎn)物、組合物和方法明顯地在此處描述的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本說(shuō)明書(shū)中包括的含有核苷酸和氨基酸序列信息的序列標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO)集中在本說(shuō)明書(shū)的末尾，并用程序Patentln Version 3.0制作。序列表中的每一個(gè)核苷酸或氨基酸序列均由數(shù)字標(biāo)識(shí)符<210>及其后的序列號(hào)識(shí)別(如<210>1、<210>2等)。每一個(gè)核苷酸或氨基酸序列的序列長(zhǎng)度、類(lèi)型和來(lái)源生物均分別由數(shù)字標(biāo)識(shí)符<211>、<212>和<213>中提供的信息顯示。說(shuō)明書(shū)中涉及的核苷酸和氨基酸序列由數(shù)字標(biāo)識(shí)符<400>中提供的信息及其后的序列號(hào)來(lái)定義(如<400>1、<400>2等)。
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優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了適合于鑒定和確定生物活性氨基酸序列的分析方法。它提供了能夠確定宿主內(nèi)在多肽或多核苷酸序列中的變異對(duì)微生物變體中特定氨基酸序列的選擇的影響的方法。它也提供了用于分析宿主內(nèi)在多肽中的變異聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)其他變量如治療劑(如藥物或疫苗)對(duì)微生物變體中特定氨基酸序列的選擇的影響的方法。它提供了利用這種信息對(duì)患者的治療進(jìn)行個(gè)體化的方法以及確定患者對(duì)特定藥物治療的敏感性的方法，并提供了對(duì)患者個(gè)體定制藥物治療法的潛力。在本發(fā)明一個(gè)高度優(yōu)選的形式中，提供了鑒定HLA-等位基因特異性微生物序列多態(tài)的方法，該序列多態(tài)由HLA限定的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了確定宿主基因中的變異對(duì)具有蛋白質(zhì)取代的微生物的選擇的影響的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇被特定微生物感染的患者或動(dòng)物群體，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的內(nèi)在多肽標(biāo)記對(duì)該群體中的所有個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在群體中于步驟(a)中鑒定的每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中的部分多核苷酸序列或多肽序列；(c)在群體中確定步驟(b)中分析的序列中每一個(gè)殘基位置上的一致(即最大頻率的)氨基酸；(d)對(duì)在步驟(a)和步驟(b)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定步驟(a)中的宿主多態(tài)序列如何在步驟(b)中確定的序列中的第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上增加或降低微生物多態(tài)的概率；(e)對(duì)步驟(b)中鑒定的每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)并比較獲得的數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明的步驟(d)中可應(yīng)用任何單變量的或多變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。優(yōu)選地，將獲得的數(shù)據(jù)在多變量的Logistic回歸模型中進(jìn)行分析。例如，在模型中可將步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)用作解釋性協(xié)變量(explanatory co-variable)，而將步驟(b)中獲得的數(shù)據(jù)用作結(jié)果(outcome)(或反應(yīng))變量。當(dāng)以這種方式進(jìn)行該分析時(shí)，可以對(duì)存在多態(tài)的結(jié)果設(shè)定一個(gè)值如一(1)，而對(duì)無(wú)多態(tài)的結(jié)果設(shè)定另一個(gè)值如零(0)。
來(lái)自這種分析的數(shù)據(jù)將揭示傾向于變異或?qū)ψ儺愑锌剐缘陌被嵝蛄袇^(qū)域。傾向于變異的氨基酸可能參與涉及所分析的蛋白質(zhì)的外部生物學(xué)相互作用，或者它們可代表具有補(bǔ)償性改變從而允許序列中其他位置能夠發(fā)生變異的蛋白質(zhì)序列區(qū)域。對(duì)改變有抗性的氨基酸殘基更可能具有重要的結(jié)構(gòu)、催化或功能性質(zhì)。利用宿主和微生物多態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性，可以鑒定微生物序列中已進(jìn)行選擇性修飾以逃避宿主免疫學(xué)反應(yīng)的影響的推定區(qū)域。例如，鑒定的區(qū)域可代表HLA限定的CTL相關(guān)性表位，微生物在該區(qū)域進(jìn)行了選擇性的修飾以逃避宿主的CTL反應(yīng)。應(yīng)該理解的是這種區(qū)域可提供對(duì)于治療劑設(shè)計(jì)有價(jià)值的氨基酸序列?？蛇x擇地，當(dāng)觀(guān)察到負(fù)的關(guān)聯(lián)性時(shí)(即在特定宿主基因多態(tài)存在時(shí)對(duì)多態(tài)變異有抗性的氨基酸)，這可能代表已通過(guò)選擇壓力進(jìn)行選擇而逃避用該生物感染的以前宿主中保護(hù)性反應(yīng)的氨基酸殘基。這種氨基酸可能是高度重要的，這是因?yàn)樗鼈兛纱砦⑸镏凶鳛樗幬锘蝾A(yù)防或治療性疫苗治療的適當(dāng)靶標(biāo)的殘基。
優(yōu)選地，在步驟(a)中選擇的多態(tài)序列與感染動(dòng)物對(duì)所感染的微生物的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)?！瓣P(guān)聯(lián)”指直接或間接地參與宿主對(duì)微生物的反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的形式中，宿主內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記核酸序列是那些形成HLA的核酸序列。例如，HLA類(lèi)型的標(biāo)記可為I型HLA(A、B或C)或II型HLA(DR、DQ)。可選擇地，標(biāo)記核酸序列對(duì)于微生物可為更加特異性的，這在于它編碼活躍地參與宿主-微生物相互作用的受體或其他蛋白質(zhì)，如趨化因子受體，例如參與HIV結(jié)合的CCR5。
確定宿主內(nèi)在標(biāo)記類(lèi)型和/或鑒定微生物序列中多態(tài)的方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這種方法可包括但不局限于DNA直接測(cè)序或如RFLP、SNP、SSO、SSP、可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)等分析法。假定目前可相對(duì)容易地進(jìn)行測(cè)序，則該序列優(yōu)選地進(jìn)行直接測(cè)序。
在此處描述的方法可用于檢查在宿主中展示病原性狀的大量生物所面臨的選擇壓力。這種生物包括但不局限于細(xì)菌、真菌、分枝菌屬、病毒和病毒樣顆粒。應(yīng)該理解的是在此處描述的方法在檢查已進(jìn)行改變而快速進(jìn)化的微生物時(shí)將具有特別的價(jià)值。這種微生物的例子包括HIV和AIDS相關(guān)病毒、皰疹病毒和肝炎相關(guān)病毒如HCV和HBV。
當(dāng)在此處描述的方法涉及鑒定和確定多核苷酸和/或多肽的部分序列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解每一個(gè)序列均可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法確定。如果僅知道多核苷酸序列，多肽序列可進(jìn)行理論確定或在需要時(shí)進(jìn)行直接測(cè)序。
應(yīng)該理解的是進(jìn)行檢查的多核苷酸或多肽的部分序列可為僅僅20或30個(gè)氨基酸或核苷酸的短序列到包含完整基因或蛋白質(zhì)序列的非常長(zhǎng)的序列。優(yōu)選地，它將包含完整的基因或蛋白質(zhì)序列。
為了有效地檢查在宿主中施加的選擇壓力對(duì)微生物的影響，在步驟(a)中選擇的宿主多態(tài)基因序列優(yōu)選地應(yīng)該為直接或間接參與宿主和微生物之間相互作用的序列。通常，對(duì)于微生物的內(nèi)在蛋白質(zhì)，直接或間接與那些蛋白質(zhì)或HLA基因相互作用的治療劑是相關(guān)的。對(duì)于在微生物外表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，大量其他多態(tài)宿主因子可能也是相關(guān)的。例如，在檢查HIV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因(HIV的一種內(nèi)在蛋白質(zhì))時(shí)，HIV反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物和HLA等位基因是最相關(guān)的。如果檢查HIV包膜蛋白，則應(yīng)該考慮與趨化因子受體阻斷劑或融合抑制劑藥物、HLA等位基因、抗-HIV抗體反應(yīng)、CCR5和CXCR4基因型或任何其他編碼導(dǎo)向于包膜蛋白或與包膜蛋白相互作用的產(chǎn)物的多態(tài)基因相關(guān)聯(lián)的作用。
為了確定步驟(b)選擇的序列中的多態(tài)在所研究的群體中是隨機(jī)分布的還是作為選擇壓力的結(jié)果與解釋性協(xié)變量相關(guān)聯(lián)的，將群體一致序列優(yōu)選地用作參考序列，并通過(guò)在每一個(gè)位置上分配群體中最常見(jiàn)的氨基酸而確定該一致序列?？蛇x擇地且依賴(lài)于所進(jìn)行的分析，可將在每一個(gè)宿主個(gè)體中獲得的第一個(gè)序列或發(fā)表的參考序列用作參考序列。所估計(jì)的結(jié)果通常是來(lái)自檢查的微生物參考序列的氨基酸中的任何改變(即使是低水平的但可探測(cè)的突變或變異序列)?？蛇x擇地，可對(duì)分析進(jìn)行精煉以將對(duì)特定或特征性的氨基酸改變的檢查限制于特定的殘基上(例如HIV反轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)位置184上從M到V的改變)。
所述的用于探測(cè)宿主基因變體對(duì)微生物多態(tài)的作用的方法的能力(power)隨宿主基因分型(genotyping)分辨率的改善和數(shù)據(jù)量的增加(具有宿主基因分型(genotyping)的個(gè)體數(shù)目和微生物測(cè)序)而增加。探測(cè)這些模型中任何單個(gè)內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記如HLA等位基因的作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)能力依賴(lài)于群體中的等位基因頻率和所研究的氨基酸位置的多態(tài)頻率。對(duì)每一個(gè)位置可進(jìn)行初始的能力計(jì)算以確定對(duì)于哪個(gè)等位基因當(dāng)存在關(guān)聯(lián)性時(shí)有探測(cè)該關(guān)聯(lián)性的合理的能力(如至少30％的能力來(lái)探測(cè)OR＞2.0或＜0.5)。然后可將該分析單獨(dú)限制于所鑒定的等位基因。該方法減少了所進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較的數(shù)目，且也鑒定了這樣的等位基因/位點(diǎn)的組合，即對(duì)于這樣的組合即使存在關(guān)聯(lián)性也未有探測(cè)該關(guān)聯(lián)性的足夠能力(這在大的數(shù)據(jù)組中是非常明顯的)。
如果解釋性變量(即宿主多態(tài))的頻率是低的，且結(jié)果(即微生物多態(tài))的頻率也是低的，那么探測(cè)負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力將比探測(cè)正關(guān)聯(lián)性的能力低。例如，在10.9的HLA等位基因頻率和4.0％的多態(tài)頻率時(shí)，探測(cè)2.0的比值比(即正關(guān)聯(lián)性)的能力為30％，但探測(cè)等價(jià)的0.5負(fù)比值比的能力僅為5.6％。
優(yōu)選地，在隨后的分析中在每一個(gè)病毒殘基上僅檢查那些與多態(tài)具有一定程度的單變量關(guān)聯(lián)性(如具有P≤0.1)的內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記。優(yōu)選地，Logistic回歸模型中的最終協(xié)變量能夠經(jīng)受標(biāo)準(zhǔn)的正向選擇和反向消除程序(backwards elimination procedure)。基于Logistic模型的排列測(cè)驗(yàn)也可用于確定關(guān)聯(lián)性的實(shí)際P-值(參見(jiàn)如F.L.Ramsey和D.W.Schafer，The Statistical Sleuth，A course in methods of dataanalysis，(Duxbury Press，1997)，第二章)。
對(duì)諸如這些數(shù)據(jù)的大量遺傳數(shù)據(jù)的分析受到統(tǒng)計(jì)學(xué)困難的阻礙，該統(tǒng)計(jì)學(xué)困難是由多重統(tǒng)計(jì)學(xué)比較和大量的潛在解釋性變量引起的。這些問(wèn)題可應(yīng)用下面方法的任何一個(gè)或全部來(lái)最小化a.將所檢查的解釋性協(xié)變量限制為那些具有顯示關(guān)聯(lián)性的能力的解釋性協(xié)變量；b.將所檢查的解釋性協(xié)變量限制為那些在單變量分析中與結(jié)果(如p＞0.1)具有一定關(guān)聯(lián)性程度的解釋性協(xié)變量；c.將所檢查的解釋性協(xié)變量限制為那些具有足夠數(shù)目結(jié)果(如“突變”＞5)的解釋性協(xié)變量；d.在Logistic回歸模型中進(jìn)行正向協(xié)變量選擇過(guò)程，然后進(jìn)行反向協(xié)變量選擇過(guò)程；和e.將宿主基因分型(genotyping)結(jié)果隨機(jī)分配給其他個(gè)體，然后進(jìn)行完整的分析并將該過(guò)程重復(fù)多次(“n”，如為1000)以確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)性的數(shù)目(“c”)(p＜0.05)，其中該關(guān)聯(lián)性對(duì)于每一個(gè)宿主等位基因在每一個(gè)微生物殘基上可單獨(dú)偶然預(yù)測(cè)。該信息可用函數(shù)1-(1-P)20f來(lái)計(jì)算已對(duì)多重比較進(jìn)行校正的P值，其中f等于“c”除以“n”，而P是未對(duì)在步驟(e)中生成的多重比較進(jìn)行校正的p值。
在對(duì)多重比較進(jìn)行校正后仍然顯著的關(guān)聯(lián)性(通常＜0.05)更可能是真實(shí)的關(guān)聯(lián)性。由Logistic回歸模型鑒定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)性的比值比給出了對(duì)生物學(xué)作用可能強(qiáng)度的量度。
將所有單獨(dú)的模型中的結(jié)果在步驟(c)中確定的氨基酸序列圖上繪制在一起?？砂l(fā)現(xiàn)對(duì)于特定的內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記特異性的多態(tài)沿著序列簇聚。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種方法，該方法鑒定宿主多態(tài)標(biāo)記序列中的變異和第二個(gè)變量如治療藥物或疫苗對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響和相互作用，該方法包含以下步驟a.選擇被微生物感染的患者或動(dòng)物群體，其中的一些已經(jīng)接受了第二個(gè)變量作為對(duì)所述微生物的部分治療，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的內(nèi)在宿主多態(tài)標(biāo)記序列對(duì)所述群體中的個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；b.在用第二個(gè)變量處理之前和之中，在群體每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中的部分或全長(zhǎng)多核苷酸和/或多肽序列，其中該多核苷酸和/或多肽序列是第二個(gè)變量的潛在或已知的靶標(biāo)，另外，以相似的時(shí)間間隔在相似的但未經(jīng)治療的個(gè)體中也進(jìn)行了上述操作；c.確定在步驟(b)中確定的時(shí)間點(diǎn)之間在步驟(b)中檢查的序列中每一個(gè)殘基上是否發(fā)生了變化(“突變”)；d.對(duì)在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)、治療和未治療的序列中用第二個(gè)變量處理與否的作用以及步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定步驟(a)中的多態(tài)序列和用第二個(gè)變量的處理如何影響步驟(c)中第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上突變的概率；
e.對(duì)步驟(c)中確定的序列中每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)。
盡管內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記是在上述方法中檢查的唯一一個(gè)協(xié)變量，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是所述方法也能夠檢查其他選擇壓力，該選擇壓力可充當(dāng)變量且可對(duì)微生物驅(qū)動(dòng)的進(jìn)化變化施加選擇力。任何能夠?qū)颊咧械奈⑸锶后w施加選擇力的變量均可通過(guò)該方法進(jìn)行檢查。例如在HIV感染的情況下，選擇壓力可為特定藥物或治療劑如疊氮胸苷(或AZT)的影響。在患者中，在細(xì)菌感染的情況下該選擇壓力可為特定抗生素的影響，或者在混合的生物群體的情況下為其他微生物的存在與否。可選擇地，它可為特定的抗體或抗體群體或基因治療系統(tǒng)(如反義相關(guān)的治療)。
這種分析尋求檢查宿主內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記和第二個(gè)協(xié)變量之間對(duì)步驟(b)中的變異速率的競(jìng)爭(zhēng)性壓力。例如，當(dāng)宿主多態(tài)標(biāo)記是HLA等位基因，微生物是HIV-1，步驟(b)中選擇的序列是反轉(zhuǎn)錄酶基因(RT基因)且選擇壓力是由治療劑如抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物導(dǎo)致時(shí)，HLA等位基因和抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物可在病毒RT序列的位點(diǎn)上施加競(jìng)爭(zhēng)性的協(xié)同或拮抗壓力。
通過(guò)在所述方法中分析內(nèi)在標(biāo)記和治療劑的作用，可以鑒定抗病毒藥物和/或HLA類(lèi)型對(duì)病毒DNA核苷酸或氨基酸殘基的突變或變異具有什么影響。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解這些數(shù)據(jù)提供了使患者的治療方案?jìng)€(gè)體化的唯一工具?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒藥物治療的個(gè)體化可通過(guò)應(yīng)用在此處描述的方法而改進(jìn)，該方法可鑒定免疫壓力和藥物壓力之間的協(xié)同或拮抗相互作用。利用該信息，可以鑒定HLA限定的免疫反應(yīng)所施加的選擇壓力與那些由治療劑施加的選擇壓力是否是協(xié)同的或是拮抗的。如果是，那么抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療法可根據(jù)具有特定HLA基因型和HIV序列的群體成員而進(jìn)行改變。因而該方法有效地提供了鑒定特定類(lèi)型的患者對(duì)特定藥物治療法的敏感性或抗性的方法。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)選形式，本發(fā)明涉及一種方法，該方法確定宿主多態(tài)標(biāo)記序列中的變異和治療藥物對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響和相互作用，該方法包含以下步驟
(a)選擇被微生物感染的患者或動(dòng)物群體，其中的一些接受了至少一種意欲治療所存在的微生物的藥物，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的宿主內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記序列對(duì)所述群體的個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在用藥物處理之前和之中，在群體每一個(gè)治療的個(gè)體中鑒定和確定微生物中作為藥物潛在靶標(biāo)的部分或全長(zhǎng)多核苷酸或多肽序列，另外，以相似的時(shí)間間隔在相似的但未經(jīng)治療的個(gè)體中也進(jìn)行了上述操作；(c)確定在步驟(b)中確定的時(shí)間點(diǎn)之間在步驟(b)中檢查的序列中每一個(gè)殘基上是否發(fā)生了變化(“突變”)；(d)對(duì)在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)、治療和未治療的序列中用藥物處理與否的作用以及步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定步驟(a)中的多態(tài)序列和用藥物處理如何影響步驟(c)中第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上的突變；(e)對(duì)步驟(c)中確定的序列中每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)。
如在此處所用的，突變涉及與每一個(gè)個(gè)體中處理前的序列相比在處理中或處理后序列的氨基酸中的改變。在一個(gè)可選擇的分析形式中，可將群體一致序列或發(fā)表的參考序列用作參考序列，在該情況下，突變定義為與群體限定的參考序列相比在處理中或處理后氨基酸中的改變。
來(lái)自上述分析的數(shù)據(jù)將揭示競(jìng)爭(zhēng)性壓力對(duì)序列中特定氨基酸或一組氨基酸的相對(duì)突變的影響。此外，這種分析將提供對(duì)微生物序列中特定的多態(tài)改變的個(gè)體相互作用壓力的分析方法。
與前面的實(shí)施方案一樣，在步驟(d)中可應(yīng)用任何能夠進(jìn)行單變量或多變量分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。然而，優(yōu)選地將該數(shù)據(jù)在多變量的Logistic回歸模型中進(jìn)行比較。例如，可將在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)以及涉及兩個(gè)序列用第二個(gè)變量處理與否的數(shù)據(jù)用作單獨(dú)的解釋性協(xié)變量，而將在步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)用作模型中的結(jié)果變量。當(dāng)進(jìn)行這種分析時(shí)，如果第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的氨基酸與第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的氨基酸相同，則可將結(jié)果定義為一個(gè)值(如0)，而如果該氨基酸與第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同則定義為另一個(gè)值(如1)。此外，或者在可選擇的分析形式中，該方法可用于檢查HLA等位基因?qū)σ粋€(gè)氨基酸到另一個(gè)氨基酸的特征性抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性改變的影響，當(dāng)有改變時(shí)分配一個(gè)值(1)而當(dāng)無(wú)改變時(shí)分配另一個(gè)值(0)。例如，如果進(jìn)行確定HLA等位基因?qū)μ卣餍岳追蚨剐酝蛔僊184V的影響(如果有的話(huà))的檢查，那么存在改變(HIV反轉(zhuǎn)錄酶位置184的V)可分配一個(gè)值如1，而不存在改變可分配第二個(gè)值如0。通過(guò)比較這些數(shù)據(jù)，可以鑒定抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物和HLA等位基因?qū)λ霭被岣淖兊挠绊?。利用這種信息，可以對(duì)特定HLA類(lèi)型的患者設(shè)定特定的治療法。
一些氨基酸改變需要超過(guò)一個(gè)的(即至少2個(gè)或3個(gè))DNA核苷酸改變。這種氨基酸改變顯示了特別強(qiáng)的選擇壓力，它可與藥物或疫苗設(shè)計(jì)或治療的個(gè)體化相關(guān)聯(lián)。
微生物的一個(gè)殘基的多態(tài)或突變可能與微生物中別處的多態(tài)或突變連鎖或相關(guān)聯(lián)?？蓪⑽⑸镏衅渌麣埢系母淖兗{入對(duì)數(shù)模型中作為解釋性協(xié)變量以鑒定可能的補(bǔ)償性或次級(jí)多態(tài)或突變。然而，補(bǔ)償性突變可能作為中間結(jié)果起作用，因此在多變量模型中將它們納入作為解釋性協(xié)變量可取消或隱藏HLA等位基因或藥物的真實(shí)的初級(jí)解釋性影響。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解在多變量模型中將中間結(jié)果納入作為解釋性協(xié)變量將導(dǎo)致不熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。
如果群體中的不同個(gè)體已在步驟(b)中不同數(shù)目的時(shí)刻(occasion)進(jìn)行了測(cè)序，那么可將Logistic回歸模型用通用的估算方程方法學(xué)進(jìn)行修飾以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，從而防止那些具有較多序列的個(gè)體與具有較少序列的個(gè)體相比不成比例地對(duì)模型起作用。
在一個(gè)高度優(yōu)選形式中，本發(fā)明涉及包含下面步驟的方法(a)對(duì)被HIV感染的宿主大群體進(jìn)行HLA測(cè)序；(b)對(duì)每一個(gè)患者中主要的HIV種類(lèi)的全部或部分進(jìn)行測(cè)序；(c)通過(guò)在病毒的每一個(gè)殘基位置確定最常見(jiàn)的氨基酸殘基以限定HIV的一致序列；(d)在每一個(gè)生物的殘基上
(i)對(duì)每一個(gè)個(gè)體(患者)確定目標(biāo)HIV氨基酸殘基與一致殘基相比是相同的(“非突變的”)還是不同的(“突變的”)；(ii)進(jìn)行多變量(在該情況下為L(zhǎng)ogistic)回歸模型分析，在得到的結(jié)果中，對(duì)突變的氨基酸分配值(1)或?qū)⒎峭蛔兊陌被岱峙渲?0)；(iii)在多變量模型中檢查一個(gè)或多個(gè)如下潛在的解釋性協(xié)變量以尋找與目標(biāo)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性(1)患者個(gè)體的HLA等位基因；(2)由宿主攝入的導(dǎo)向目標(biāo)蛋白質(zhì)的治療藥物(例如，當(dāng)檢查HIV反轉(zhuǎn)錄酶時(shí)為反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物，當(dāng)檢查HIV蛋白酶時(shí)為蛋白酶抑制劑)；和/或(3)宿主蛋白質(zhì)中其他位置的突變；和(iv)解釋結(jié)果。
考慮到在此處描述的方法的特性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解所述的分析方法在檢查蛋白質(zhì)相互關(guān)系和生物活性分子分析中將具有廣泛的應(yīng)用。這些應(yīng)用的一些在下面進(jìn)行闡明1.檢查推定的類(lèi)型I或II和逃避或非逃避對(duì)決定宿主中所測(cè)量生物的數(shù)量的任一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡(如病毒調(diào)定點(diǎn)(viral set point))的影響。
2.HLA類(lèi)型對(duì)在例如HIV相異對(duì)(discordant pair)(非傳播)、HIV相似配對(duì)(concordant pair)(傳播)或任何其他類(lèi)型的感染中的傳播危險(xiǎn)的影響。
3.生物中HLA限定的免疫壓力、密碼子使用和其他多態(tài)對(duì)由治療劑誘導(dǎo)的突變途徑的影響和相互作用，如HIV蛋白酶中的L90M或D30N一級(jí)藥物抗性突變是否由奈非那韋誘導(dǎo)。
4.它提供了用于疫苗抗原選擇的方法。
5.它提供了檢查外部蛋白質(zhì)(如包膜蛋白)與HLA限定的免疫壓力和/或抗體和/或趨化因子受體應(yīng)用/開(kāi)關(guān)和/或避開(kāi)趨化因子受體阻斷劑或融合抑制劑的相互作用的方法。
6.它也提供了檢查蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的方法。
7.它提供了使抗微生物治療個(gè)體化的方法。例如，該方法提供了選擇抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中許多標(biāo)準(zhǔn)的治療組合中哪一個(gè)對(duì)于由HIV感染的患者個(gè)體的治療是最有效的方式。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了設(shè)計(jì)能夠在患者中誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)治療劑的方法，該方法包含如上所述的步驟，并因而分析該數(shù)據(jù)以鑒定病毒群體中由于該群體感染而產(chǎn)生的多態(tài)，其中該多態(tài)是HLA相關(guān)聯(lián)的。
根據(jù)本方法，對(duì)個(gè)體進(jìn)行HLA分類(lèi)，且對(duì)編碼潛在的微生物蛋白質(zhì)目標(biāo)(例如HIV反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶)的基因進(jìn)行測(cè)序。HLA等位基因和微生物多態(tài)之間的正和負(fù)的關(guān)聯(lián)性在微生物感染個(gè)體的大群體中進(jìn)行確定。該群體理想地應(yīng)該與從中抽取所研究的個(gè)體的群體相同或相似。然后檢查微生物氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基與存在于所研究個(gè)體中的HLA等位基因有已知的關(guān)聯(lián)性。
對(duì)于這種分析，可以鑒定特定的關(guān)聯(lián)性，其中多態(tài)頻率表現(xiàn)為氨基酸或核苷酸中的改變與特定的HLA類(lèi)型相關(guān)聯(lián)且與T-細(xì)胞逃避相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，選擇用于分析的多態(tài)頻率大于10％，更優(yōu)選地為大于15％，且想要地為大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。這種數(shù)據(jù)將揭示潛在編碼T-細(xì)胞表位的氨基酸序列。這種數(shù)據(jù)也將提供可用于開(kāi)發(fā)治療劑的氨基酸序列。例如，可設(shè)計(jì)治療劑以編碼其中存在逃避突變的氨基酸區(qū)域，從而防止逃避突變發(fā)揮其作用。在此處提供的例子闡明了這種序列如何可從由上述方法獲得的數(shù)據(jù)中生成。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了鑒定T細(xì)胞表位的方法，該方法包含如上所述的步驟，接著分析該數(shù)據(jù)以鑒定病毒群體中由于該群體感染而產(chǎn)生的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)是HLA相關(guān)聯(lián)的。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了設(shè)計(jì)疫苗以防止或延遲在用對(duì)微生物特異性的特定藥物治療的患者中出現(xiàn)藥物抗性的方法，其中該藥物在核苷酸或氨基酸水平影響微生物的復(fù)制，該方法包含以下步驟進(jìn)行如上所述的步驟，然后分析數(shù)據(jù)以鑒定已用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的感染個(gè)體中的病毒群體中發(fā)生的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)頻率是在微生物中藥物具有活性的核苷酸或氨基酸序列區(qū)域中確定的，然后設(shè)計(jì)一種或多種治療劑，該治療劑促進(jìn)針對(duì)含有展示一種或多種所鑒定的多態(tài)的病毒群體的細(xì)胞的T-細(xì)胞反應(yīng)。
當(dāng)將該方法用于使抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療個(gè)體化時(shí)，對(duì)該個(gè)體進(jìn)行HLA分類(lèi)，并對(duì)編碼抗微生物治療的潛在微生物蛋白質(zhì)靶標(biāo)(例如HIV反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶)的基因進(jìn)行測(cè)序。HLA等位基因和微生物多態(tài)之間的正和負(fù)的關(guān)聯(lián)性在微生物感染個(gè)體的大群體中進(jìn)行確定。該群體理想地應(yīng)該與從中抽取所研究個(gè)體的群體相同或相似。然后檢查微生物氨基酸殘基，該氨基酸殘基與存在于所研究的個(gè)體中的HLA等位基因具有已知的關(guān)聯(lián)性。然后根據(jù)選擇具有如下特性的抗微生物藥物1)在群體中HLA特異性負(fù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)具有群體一致序列的殘基上和在群體中HLA特異性正關(guān)聯(lián)位點(diǎn)不具有群體一致序列的殘基上促進(jìn)突變發(fā)展；或2)在群體中HLA特異性正突變位點(diǎn)具有群體一致序列的殘基上和在群體中HLA特異性負(fù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)不具有群體一致序列的殘基上阻止突變。如果應(yīng)用超過(guò)一種抗微生物治療手段，那么可能的是組合應(yīng)用試劑，該試劑在特定的殘基具有競(jìng)爭(zhēng)性作用(即一種藥物在群體中具有正關(guān)聯(lián)性而另一種藥物在相同殘基具有負(fù)關(guān)聯(lián)性)或在體外或體內(nèi)證實(shí)具有協(xié)同性質(zhì)。
設(shè)計(jì)疫苗的方法前述方法提供了鑒定多態(tài)區(qū)域的方法，該方法可用于治療劑的開(kāi)發(fā)。一旦對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行了定位，那么則可用下面的原則優(yōu)選地設(shè)計(jì)治療性疫苗1.編碼共同的抗性突變2.編碼推定的“適合性突變(fitness mutations)”，其中這些突變不與共同的關(guān)鍵突變(key mutations)相干涉3.盡可能應(yīng)用完整蛋白質(zhì)，但避免長(zhǎng)的野生型氨基酸片段，這是因?yàn)閷?duì)野生型序列的反應(yīng)是相對(duì)不想要的
4.應(yīng)用實(shí)施例1中描述的最優(yōu)的一致序列樣序列作為主鏈(即不是抗反轉(zhuǎn)錄病毒抗性突變的殘基上的氨基酸序列)?？赡軙r(shí)(如蛋白酶)應(yīng)用已知可正確折疊的主鏈(如真實(shí)的分離物)，這是因?yàn)榭乖€(wěn)定性可更好。
5.在抗性突變非?？拷鼤r(shí)(＜4個(gè)氨基酸)生成僅表達(dá)單個(gè)抗性表位的分離片段，這是因?yàn)閷?duì)含有2個(gè)抗性突變的表位的反應(yīng)是相對(duì)不想要的6.對(duì)于含有單個(gè)突變的片段，在每一側(cè)編碼7個(gè)氨基酸以增強(qiáng)CD8 T細(xì)胞對(duì)所編碼的突變的反應(yīng)的發(fā)展和降低對(duì)野生型序列反應(yīng)的可能性7.然而，編碼盡可能少的分離片段，這是因?yàn)閷?duì)2個(gè)片段(無(wú)關(guān)表位)的重疊氨基酸序列的反應(yīng)是不想要的8.盡可能多地分離含有相同編碼序列的片段，從而減少構(gòu)建過(guò)程中的重組潛力制備氨基酸序列的方法根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的任一個(gè)氨基酸序列的方法。
本發(fā)明的全長(zhǎng)氨基酸序列可應(yīng)用眾所周知的重組DNA技術(shù)方法進(jìn)行制備，如那些在Sambrook等人(Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. )和/或Ausubel等人，eds，(Current Protocols inMolecular Biology，Green Publishers Inc.and Wiley and Sons，N.Y. )中提出的。
編碼蛋白質(zhì)或其片段的基因或cDNA可由例如對(duì)微生物序列的PCR擴(kuò)增而獲得。改進(jìn)的體外擴(kuò)增核酸的克隆方法描述于Wallace等人，美國(guó)專(zhuān)利No.5,426,039中。
可選擇地，編碼多肽或片段的基因可用技術(shù)人員眾所周知的方法通過(guò)化學(xué)合成制備，如那些由Engels等人(Angew.Chem.Intl.Ed.，28716-734 )描述的。這些方法(除其他之外)還包括核酸合成用的磷酸三酯、亞磷酰胺和H-磷酸酯方法。這種化學(xué)合成的優(yōu)選方法是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)的聚合物支持的合成。一般地，編碼多肽的DNA長(zhǎng)度將為幾百個(gè)核苷酸。大于約100個(gè)核苷酸的核酸可用這些方法以幾個(gè)片段進(jìn)行合成。然后將片段連接在一起以形成全長(zhǎng)的多肽。通常，編碼多肽氨基末端的DNA片段將具有ATG，該ATG編碼甲硫氨酸殘基。依賴(lài)于宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽是否從該細(xì)胞分泌，該甲硫氨酸可存在于或不存在于該多肽的成熟形式中。
可將這樣分離的基因或cDNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中以在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。一般選擇在應(yīng)用的特定宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的載體(即該載體與宿主細(xì)胞機(jī)器相容，從而可發(fā)生該基因的擴(kuò)增和/或該基因的表達(dá))。多肽或其片段可在原核生物、酵母、昆蟲(chóng)(桿狀病毒系統(tǒng))和/或真核宿主細(xì)胞中擴(kuò)增/表達(dá)。
然后可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化氨基酸序列，該方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。優(yōu)選的是在純化過(guò)程中存在低濃度的鈣離子(約0.1-5mM)(Price等人，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可應(yīng)用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可應(yīng)用高效液相層析(HPLC)以進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的氨基酸序列可為天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成程序的產(chǎn)物，或由重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生的(例如，由培養(yǎng)物中的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的)。
制備能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體的方法，該載體構(gòu)建體能夠誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體的方法，該載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)。
根據(jù)本方法，將基因分離然后插入到能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體中，該載體構(gòu)建體能夠在患者中誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)。
例如，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可包含用重組DNA或RNA病毒感染目標(biāo)細(xì)胞，該重組DNA或RNA病毒包含驅(qū)動(dòng)編碼多態(tài)的氨基酸表達(dá)的核酸序列。用于本發(fā)明的適當(dāng)DNA病毒包括但不局限于腺病毒(Ad)、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、痘苗病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒。用于本發(fā)明的適當(dāng)RNA病毒包括但不局限于反轉(zhuǎn)錄病毒或辛德比斯病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解存在幾種適用于本發(fā)明的此類(lèi)DNA和RNA病毒。
已經(jīng)證明腺病毒載體對(duì)于向真核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移是尤其有用的(Stratford-Perricaudet，L.和M.Perricaudet，1991.Gene transferinto animalsthe promise of adenovirus.第51-61頁(yè)，Human GeneTransfer，Eds，O.Cohen-Haguenauer和M.Boiron，Editions JohnLibbey Eurotext，法國(guó))。腺病毒載體已成功用于研究真核基因表達(dá)(Levrero，M.等人，1991，Defective and nondefective adenovirusvectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo.Gene101195-202)、疫苗開(kāi)發(fā)(Graham，F(xiàn).L.和L.Prevec(1992)Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines.VaccinesNew Approaches to Immunological Problems，(Ellis，R.V.Ed.)，第363-390頁(yè)，Butterworth-heinemann，Boston)和動(dòng)物模型中(Stratford-Perricaudet等人，1992，Widespread long-termgene transfer to mouse skeletal muscles and heart.J.Clin.Invest.90，626-630；Rich等人，1993，Development and analysis ofrecombinant adenoviruses for gene therapy of cystic fibrosis.Human Gene Ther.4，461-476)。人類(lèi)中Ad-介導(dǎo)的基因治療的首次嘗試是囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)基因向肺中的轉(zhuǎn)移(Crystal等人，1994，Nature Genetics 8，42-51)。將重組Ad在體內(nèi)給予不同組織的實(shí)驗(yàn)途徑包括氣管內(nèi)滴注法(Rosenfeld等人，1992，In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembraneconductance regulator gene to the airway epithelium.Cell 68，143-155)、肌肉內(nèi)注射(Quantin，B.等人，1992，Adenovirus as anexpression vector in muscle cells in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，2581-2584)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz，J.和R.D.Gerard，1993，Adenovirus-mediated transfer of low density lipoproteinreceptor gene acutely accelerates cholesterol clearance innormal mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2812-2816)和向腦中的腦功能區(qū)定位接種(Le Gal La Salle等人，1993.An adenovirusvector for gene transfer into neurons and glia in the brain.Science 259，988-990)。因而，腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員可廣泛獲得的且適用于本發(fā)明。
最近已將腺伴隨病毒(AAV)作為在基因治療中具有潛在應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。野生型AAV展示高水平的感染性、寬的宿主范圍和向宿主細(xì)胞基因組中整合的特異性(Hermonat，P.L.和N.Muzyczka，1984，Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vectortransduction of neomycin resistance into mammalian tissueculture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470)。1-型單純皰疹病毒(HSV-1)由于其親神經(jīng)性質(zhì)而是有吸引力的用于神經(jīng)系統(tǒng)中的載體系統(tǒng)(Geller，A.I.和H.J.Federoff，1991，The use ofHSV-1 vectors to introduce heterologous genes into neuronsimplications for gene therapy.Human Gene Transfer，Eds，O.Cohen-Haguenauer和M.Boiron，第63-73頁(yè)，Editions John LibbeyEurotext，法國(guó)；Glorioso等人，1995，Herpes simplex virus as agene-delivey vectors for the central nervous system.ViralVectors-Gene therapy and neuroscience application，Eds，M.G.Kaplitt和A.D.Loewy，第1-23頁(yè)，Academic Press，New York)。痘病毒(poxvirus)科中的痘苗病毒也已發(fā)展為表達(dá)載體(smith，G.L.和B.Moss，1983，Infectious poxvirus vectors have capacity forat least 25,000 base pairs of foreign DNA. Gene 2521-28；Moss，B.1992，Poxviruses as eukaryotic expression vectors.Semin.Virol.3277-283)。上述載體的每一個(gè)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員可廣泛獲得的且適用于本發(fā)明。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染大百分比的目標(biāo)細(xì)胞并整合入細(xì)胞基因組中(Miller，A.D.和G.J.Rosman，1989，Improved retroviralvectors for gene therapy and expression.Biotechniques 7980-990)。反轉(zhuǎn)錄病毒比其他病毒相對(duì)較早發(fā)展為基因轉(zhuǎn)移載體，并首先成功用于基因標(biāo)記和將腺苷脫氨酶(ADA)的cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入人淋巴細(xì)胞中。
已用于或計(jì)劃用于基因治療中的“非病毒”送遞技術(shù)包括DNA-配體復(fù)合物、腺病毒-配體-DNA復(fù)合物、直接DNA注射、CaPO4.sub.4沉淀、基因槍技術(shù)、電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Mulligan，R.C.1993，The basicscienee of gene therapy.Science 260926-932)。這些方法的任何一個(gè)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員可廣泛獲得的且適用于本發(fā)明。其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的，且應(yīng)理解本發(fā)明可應(yīng)用任何一種可用的轉(zhuǎn)染方法實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已不同程度成功地應(yīng)用了幾種這樣的方法(Mulligan，R.C.1993，The basic science of gene therapy.Science 260926-932)。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法可通過(guò)將分離的DNA分子包被入脂質(zhì)體顆粒中并使脂質(zhì)體顆粒與目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸而實(shí)現(xiàn)。脂質(zhì)體是自組裝的膠體狀顆粒，其中包含兩親性分子如磷脂酰絲氨酸或磷脂酰膽堿的脂雙層包被了一部分周?chē)幕|(zhì)，從而脂雙層圍繞了親水內(nèi)核。可構(gòu)建單層或多層脂質(zhì)體，從而內(nèi)核含有想要的化學(xué)藥品、藥物或本發(fā)明中分離的DNA分子。
治療方法在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的方法。該方法包含向哺乳動(dòng)物給予根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防疾病的方法，該疾病對(duì)借助于T細(xì)胞反應(yīng)的治療是易感的，所述方法通過(guò)給予根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)給予組合物而在動(dòng)物中引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該組合物包含藥物可接受的賦形劑、佐劑和進(jìn)行改變以含有細(xì)胞免疫反應(yīng)表位的氨基酸序列，該表位至少包含與患者中HLA等位基因類(lèi)型相關(guān)聯(lián)的病毒多態(tài)。該細(xì)胞反應(yīng)可為CD8+T細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T細(xì)胞反應(yīng)或CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞兩者的反應(yīng)。
在一個(gè)可選擇的形式中，本發(fā)明提供了通過(guò)給予組合物而在動(dòng)物中引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該組合物包含藥物可接受的賦形劑和進(jìn)行改變以至少含有對(duì)于特定HLA類(lèi)型高度保守的細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的表位的氨基酸序列，或者包含能夠在動(dòng)物中表達(dá)該氨基酸序列的載體構(gòu)建體。在其中引起免疫反應(yīng)的動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物可為人，該人可為HIV陽(yáng)性或HIV陰性的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是在暴露于感染性HIV中的動(dòng)物中延遲HIV發(fā)病的方法，這是通過(guò)給動(dòng)物接種藥物可接受的賦形劑和根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列或能夠在患者中表達(dá)該序列的載體構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該氨基酸序列或載體構(gòu)建體能夠在被微生物感染的或有該微生物感染危險(xiǎn)的患者中誘導(dǎo)特異性的T-細(xì)胞反應(yīng)。
關(guān)于人類(lèi)中HIV感染的治療或預(yù)防，可如在此處提出的那樣選擇用于本發(fā)明中的T-細(xì)胞誘導(dǎo)性氨基酸序列。通過(guò)選擇一種或多種可誘導(dǎo)針對(duì)HIV抗原的T-細(xì)胞反應(yīng)的氨基酸序列，能夠生成如下反應(yīng)，該反應(yīng)能夠殺死(或抑制)感染的細(xì)胞或者表達(dá)天然HIV抗原的細(xì)胞。關(guān)于人類(lèi)中HIV1和2的治療或預(yù)防，可選擇一種或多種誘導(dǎo)針對(duì)HIV1或HIV2抗原的T-細(xì)胞反應(yīng)的氨基酸序列。HIV T-細(xì)胞誘導(dǎo)性氨基酸序列通常將具有至少4個(gè)殘基，有時(shí)為6個(gè)殘基，經(jīng)常為7個(gè)或更多殘基，或者與天然存在的HIV序列的相應(yīng)部分相同或同源的氨基酸序列的大部分氨基酸。例如，優(yōu)選地用于刺激HIV T-細(xì)胞反應(yīng)的那些氨基酸序列包括鑒定為SEQ ID NO 2-10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)。
在本發(fā)明的組合物和方法中應(yīng)用的T-細(xì)胞誘導(dǎo)性氨基酸序列不需要與在前述公開(kāi)內(nèi)容中公開(kāi)的特定氨基酸序列相同，且可通過(guò)各種技術(shù)進(jìn)行選擇，例如根據(jù)如上所述的某些方法。
在一些情況中，可能想要的是組合兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，該氨基酸序列在一個(gè)或多個(gè)患者中或在組織相容性類(lèi)型中對(duì)刺激特異性T-細(xì)胞反應(yīng)有貢獻(xiàn)。該組合物中的氨基酸序列可為相同的或不同的，且它們一起提供了與親代氨基酸序列等價(jià)的或更高的生物學(xué)活性。例如，應(yīng)用在此處描述的方法，兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列可限定來(lái)自特定區(qū)域的不同或重疊的T-細(xì)胞表位，該氨基酸序列可組合入“混合物”中以提供增強(qiáng)的T-細(xì)胞反應(yīng)免疫原性，且該氨基酸序列可與具有不同MHC限制性元件的氨基酸序列組合。該組合物可有效用于拓寬由本發(fā)明的治療劑、疫苗或診斷方法和組合物在不同群體中提供的免疫學(xué)覆蓋度。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的T-細(xì)胞誘導(dǎo)性氨基酸序列由間隔區(qū)分子連接，或者T-細(xì)胞氨基酸序列可不由間隔區(qū)連接。當(dāng)存在間隔區(qū)時(shí)，該間隔區(qū)一般包含相對(duì)小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模擬物，該分子在生理學(xué)條件下基本是不帶電荷的，且可具有線(xiàn)形或分支的側(cè)鏈。間隔區(qū)一般選自如Ala、Gly或其他非極性氨基酸的中性間隔區(qū)或中性極性氨基酸的中性間隔區(qū)。在此處某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，中性間隔區(qū)是Ala。將理解的是本發(fā)明的間隔區(qū)可選擇地不必由相同的殘基組成，從而可為異寡聚體或同寡聚體。優(yōu)選的間隔區(qū)是Ala的同寡聚體。當(dāng)間隔區(qū)存在時(shí)，該間隔區(qū)通常具有至少1個(gè)或2個(gè)殘基，更通常為3-6個(gè)殘基。
本發(fā)明的氨基酸序列可通過(guò)鍵合以形成聚合物(多聚體)，或者可形成無(wú)鍵合的組合物，如混合物。當(dāng)相同的氨基酸序列與自身連接從而形成同聚合物時(shí)，則提供了許多重復(fù)的表位單位。當(dāng)氨基酸序列不同時(shí)，如代表不同抗原種類(lèi)或亞型、亞型中的不同表位、不同組織相容性限制特異性或含有表位的氨基酸序列的混合物，則提供了具有重復(fù)單位的雜聚合物。除共價(jià)連接之外，也預(yù)期能夠形成分子間和結(jié)構(gòu)內(nèi)鍵的非共價(jià)連接。
本發(fā)明的氨基酸序列和其藥物組合物和疫苗組合物可用于給予哺乳動(dòng)物特別是人以用于治療和/或預(yù)防病毒、細(xì)菌和寄生物感染。由于該氨基酸序列用于刺激針對(duì)感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)，所以該組合物可用于治療或預(yù)防急性和/或慢性感染。
對(duì)于藥物組合物，可將如上所述本發(fā)明的T-細(xì)胞氨基酸序列給予已患待治療的疾病或?qū)ζ湟赘械牟溉閯?dòng)物。那些處于疾病(如病毒感染)的潛伏期或急性期的受試者可適當(dāng)?shù)貑为?dú)用免疫原性氨基酸序列進(jìn)行治療或與其他治療手段結(jié)合進(jìn)行治療。在治療應(yīng)用中，將組合物以一定量給予患者，該量足以引起對(duì)疾病的有效T-細(xì)胞反應(yīng)和至少部分地阻止其癥狀和/或并發(fā)癥。足以實(shí)現(xiàn)這一目的的數(shù)量定義為“治療有效量”。用于該用途的有效量將依賴(lài)于例如氨基酸序列組合物、給予方式、所治療疾病的階段和嚴(yán)重性、患者的體重和總體健康狀況和開(kāi)處方醫(yī)生的判斷，但通常對(duì)于初始的免疫接種(即治療或預(yù)防目的的給予)范圍約1.0μg-約50mg氨基酸序列，優(yōu)選地為1μg-500μg，更優(yōu)選地為1μg-250μg，隨后為約1.0μg-50mg氨基酸序列的強(qiáng)化免疫劑量，優(yōu)選地為1μg-500μg，且更優(yōu)選地為1μg-約250μg，該強(qiáng)化免疫方案持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，具體則依賴(lài)于患者的反應(yīng)和狀況，其中患者的反應(yīng)和狀況是通過(guò)測(cè)量患者血液中的特異性T-細(xì)胞活性得到的。必須牢記的是本發(fā)明的氨基酸序列和組合物通常可應(yīng)用于嚴(yán)重的疾病狀態(tài)中，即威脅生命的或潛在地威脅生命的病癥。在這種情況下，考慮到所引入外源物質(zhì)的最小化和氨基酸序列的相對(duì)無(wú)毒性的特性，可能的且治療醫(yī)生認(rèn)為想要的是給予顯著過(guò)量的這些氨基酸序列組合物。
組合物的單次或多次給藥可以以治療醫(yī)生選擇的劑量水平和模式實(shí)現(xiàn)。無(wú)論如何，該藥物制劑應(yīng)該提供本發(fā)明足以有效治療患者的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞刺激性氨基酸序列的量。
對(duì)于治療應(yīng)用，給藥應(yīng)該在疾病(HIV感染)的最初跡象出現(xiàn)時(shí)開(kāi)始，隨后伴隨強(qiáng)化給藥直到癥狀至少顯著減少且持續(xù)一段時(shí)間。在已經(jīng)確診的或慢性疾病的情況下，如慢性HIV感染，可需要負(fù)荷劑量和隨后的強(qiáng)化劑量。在對(duì)急性疾病階段的早期治療中對(duì)有效T-細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)將使慢性疾病如HIV攜帶階段的隨后發(fā)展概率最小化。
用本發(fā)明的組合物對(duì)感染的哺乳動(dòng)物的治療可促進(jìn)對(duì)急性患病的哺乳動(dòng)物中疾病的解決。對(duì)于那些對(duì)發(fā)展慢性疾病易感(或易患病的)的哺乳動(dòng)物，本發(fā)明的組合物在預(yù)防疾病的發(fā)展中特別有用。例如，如在此處所描述的當(dāng)在感染前或在感染過(guò)程中確定易感個(gè)體后，可使該組合物定向應(yīng)用于該個(gè)體，從而使向較大群體給藥的需要最小化。
該氨基酸序列組合物也可用于治療確診的疾病和刺激免疫系統(tǒng)以消除病毒感染的細(xì)胞。感染后約3-6個(gè)月檢測(cè)呈病毒陽(yáng)性的個(gè)體可以被認(rèn)為是具有確診疾病的個(gè)體。因?yàn)閭€(gè)體可由于在其感染早期中不足的(或缺失的)T-細(xì)胞反應(yīng)而發(fā)展HIV感染，所以重要的是以足以有效刺激T-細(xì)胞反應(yīng)的制劑和給藥模式提供本發(fā)明一定量的免疫強(qiáng)化性氨基酸序列組合物。因而，對(duì)于確診疾病的治療，代表性的劑量范圍為每次給藥約1.0μg-約50mg，優(yōu)選地為1μg-500μg，最優(yōu)選地為1μg-250μg，隨后為每次給藥約1.0μg-50mg的強(qiáng)化劑量，優(yōu)選地為1μg-500μg，且更優(yōu)選地為1μg-約250μg。應(yīng)該持續(xù)給藥直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)指示物顯示HIV感染已顯著減少且持續(xù)一段時(shí)間。可能需要在確定的時(shí)間間隔如1-4個(gè)星期進(jìn)行免疫給藥以及隨后的強(qiáng)化給藥，要治療該感染，也可能需要延長(zhǎng)的時(shí)間。
用于治療處理的藥物組合物意欲進(jìn)行腸胃外的、局部的、口腔的或局域的給藥。優(yōu)選地，將藥物組合物經(jīng)腸胃外給藥，如靜脈內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi)地或肌內(nèi)地。因而，本發(fā)明提供了用于腸胃外給藥的組合物，該組合物包含溶解于或懸浮于可接受的載體(優(yōu)選地為水性載體)中的T-細(xì)胞刺激性氨基酸序列?？蓱?yīng)用各種水性載體，如水、緩沖的水、0.4％的鹽水、0.3％的甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌，或可通過(guò)過(guò)濾滅菌。結(jié)果所得的水溶液可進(jìn)行包裝以備應(yīng)用，或者可以?xún)龈?，該凍干的制劑在給藥前與無(wú)菌溶液組合。該組合物可含有藥物可接受的輔助物質(zhì)以使其接近生理學(xué)條件，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖試劑、漲度調(diào)節(jié)試劑、潤(rùn)濕劑等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖、油酸合三乙醇胺、甲醇和溶解劑如DMSO等。
本發(fā)明藥物制劑中T-細(xì)胞刺激性氨基酸序列的濃度可大范圍地變動(dòng)，即按重量計(jì)從少于約1％、通常為或至少為約10％到高達(dá)20％-50％或更高，且根據(jù)所選的給藥的特定模式而主要根據(jù)流體體積、粘度等進(jìn)行選擇。
因而，用于靜脈內(nèi)灌輸?shù)牡湫退幬锝M合物可含有250ml無(wú)菌的林格溶液和50mg氨基酸序列。制備腸胃外給藥的組合物的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知且顯而易見(jiàn)的，并更詳細(xì)地描述于如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)，在此處將其引入作為參考。
本發(fā)明的氨基酸序列也可通過(guò)脂質(zhì)體給藥，該脂質(zhì)體用于將氨基酸序列導(dǎo)向特定的組織如淋巴組織，或者選擇性地導(dǎo)向感染的細(xì)胞，以及增加氨基酸序列組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、微團(tuán)、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、片層等。在這些制劑中，要送遞的氨基酸序列作為脂質(zhì)體的部分進(jìn)行整合，該氨基酸序列為單獨(dú)的，或者可以與結(jié)合淋巴細(xì)胞中普遍存在的受體的分子(如與CD45抗原結(jié)合的單克隆抗體)或與其他治療性或免疫原性組合物組合。因而，充滿(mǎn)本發(fā)明想要的氨基酸序列的脂質(zhì)體可導(dǎo)向淋巴細(xì)胞位點(diǎn)，然后脂質(zhì)體在該位點(diǎn)送遞所選的治療性/免疫原性氨基酸序列組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體從標(biāo)準(zhǔn)的小泡形成性脂質(zhì)生成，該脂質(zhì)通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通?？紤]如脂質(zhì)體大小和血流中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。用于制備脂質(zhì)體的各種方法是可用的，如描述于Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國(guó)專(zhuān)利No.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中的，在此處將其引入作為參考。為導(dǎo)向免疫細(xì)胞，整合入脂質(zhì)體中的配體可包括，例如對(duì)想要的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇特異性的抗體或其片段。含有氨基酸序列的脂質(zhì)體懸浮液可以以一定劑量進(jìn)行靜脈內(nèi)、局域、局部等的給藥，該劑量除其他因素之外根據(jù)給藥的方式、送遞的氨基酸序列和治療的疾病的階段而變化。
對(duì)于固體組合物，可應(yīng)用常規(guī)的無(wú)毒性固體載體，該載體包括如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服給藥，藥物可接受的無(wú)毒性組合物通過(guò)將任何通常應(yīng)用的賦形劑(如前面所列的那些載體)與通常10-95％的活性成分整合而形成，該活性成分即為一種或多種本發(fā)明的氨基酸序列組合物，且更優(yōu)選地濃度為25％-75％。
對(duì)于氣霧劑給藥，T-細(xì)胞刺激性氨基酸序列組合物優(yōu)選地以良好分散的形式連同表面活性劑和推進(jìn)劑一起提供。氨基酸序列的典型百分比為0.01wt％-20wt％，優(yōu)選地為1wt％-10wt％。表面活性劑當(dāng)然必須無(wú)毒，且優(yōu)選地溶于推進(jìn)劑中。這種試劑的代表為脂肪酸與脂族多羥基醇或其環(huán)狀酐的酯或偏酯，所述脂肪酸含有6-22個(gè)碳原子，如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸?？蓱?yīng)用混合酯如混合的甘油酯或天然的甘油酯。表面活性劑構(gòu)成組合物的0.1wt％-20wt％，優(yōu)選地為0.25wt-5wt％。組合物的其余組分通常為推進(jìn)劑。如果需要，也可包括載體如卵磷脂以用于鼻內(nèi)送遞。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有如在此處描述的免疫原性有效量的T-細(xì)胞刺激性氨基酸序列組合物作為活性成分的治療劑?？蓪⒃摪被嵝蛄幸氲讲溉閯?dòng)物宿主包括人中，該氨基酸序列與其自身載體連接或作為活性氨基酸序列單位的同聚合物或異聚合物。這種聚合物具有增強(qiáng)的免疫學(xué)反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，且當(dāng)不同氨基酸序列用于組成該聚合物時(shí)，該聚合物具有誘導(dǎo)與病毒的不同抗原決定簇反應(yīng)的抗體和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的額外能力。有用的載體是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括如甲狀腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、聚氨基酸如聚(D-賴(lài)氨酸∶D-谷氨酸)、流感病毒蛋白質(zhì)等。該治療劑也可含有生理學(xué)耐受的(可接受的)稀釋劑如水、磷酸緩沖鹽水或鹽水，且一般進(jìn)一步地包括佐劑。佐劑如不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬或MONTANIDE.RTM.(Seppic，Paris，法國(guó)；具有二縮甘露醇油酸酯的油基佐劑)是本領(lǐng)域中眾所周知的材料。在用如在此處所述的氨基酸序列組合物通過(guò)注射、氣霧劑、口服、經(jīng)皮或其他途徑進(jìn)行免疫接種后，宿主的免疫系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生大量對(duì)疾病相關(guān)抗原特異性的T-細(xì)胞而應(yīng)激于治療劑，且宿主變?yōu)閷?duì)疾病至少部分免疫或?qū)膊∮锌剐浴?br> 將含有本發(fā)明的氨基酸序列的治療組合物給予患者以增強(qiáng)患者自身的免疫反應(yīng)能力，其中該患者對(duì)疾病如病毒感染易感或者處于該疾病危險(xiǎn)之中。這種量定義為“免疫原性有效量”。在該應(yīng)用中，精確的量依賴(lài)于患者的健康狀況、年齡、給藥方式、制劑的特性等。將氨基酸序列給予具有適當(dāng)HLA類(lèi)型的個(gè)體，如對(duì)于具有下面氨基酸序列的治療組合物，應(yīng)將它們給予所確定的HLA類(lèi)型個(gè)體。
(i)FLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAM和HLA-B*4402(ii)GKWSKSSMVGWPAVRERMRRAEP和HLA-C*0701(iii)AQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYK和HLA-B*0702(iv)SFRFGEETTTPSQKQEPIDKENY和HLA-B*4402(v)RIGCQHSRIGIIRQRRARNGASR和HLA-DRB1-0701(vi)KTIHTDNGSNFTSTTVKAACWWA and HLA-C*0501(vii)TGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIG和HLA-DRB1-1302(viii)GEETTTPSQKQEPIDKENYPLAS和HLA-A*2402(ix)WPVKTIHTDNGSNFTSTTVKAAC和HLA-B*4402(x)MQRGNFRNQRKTVKCFNCGK和HLA-B*1801已應(yīng)用了許多不同的HIV感染動(dòng)物模型系統(tǒng)(Kindt等人，1992)。非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如黑猩猩和短尾猿(pig-tailed macaque)可被HIV-1感染。盡管在這些系統(tǒng)中CD4+細(xì)胞未減少，但這些動(dòng)物可由病毒進(jìn)行可探測(cè)的感染并可用于確定HIV治療的功效。小的動(dòng)物模型包括嵌合模型，該模型包括將人體組織移植到免疫缺陷小鼠中。一種這樣的系統(tǒng)是由Mosier等人(1988)發(fā)展的hu-PBL-SCID小鼠。另一種是由McCune等人(1988)發(fā)展的SCID-hu小鼠。在兩個(gè)小鼠模型中，SCID-hu小鼠一般是優(yōu)選的，這是因?yàn)樵谶@些動(dòng)物中的HIV感染與人中的更相似。植入了人腸的SCID-hu小鼠已顯示是HIV粘膜傳播的體內(nèi)模型(Gibbons等人，1997)。構(gòu)建具有人免疫系統(tǒng)的動(dòng)物的方法描述于美國(guó)專(zhuān)利No.5,652,373、5,698,767和5,709,843中。
動(dòng)物將用本發(fā)明的治療劑進(jìn)行接種，然后用感染性病毒劑量進(jìn)行攻擊。治療的功效可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定。通常，可檢驗(yàn)與HIV感染相關(guān)的各種參數(shù)并在免疫接種和未免疫接種的動(dòng)物之間進(jìn)行比較。這種參數(shù)包括病毒血癥、血液細(xì)胞中整合的HIV的探測(cè)、CD4+細(xì)胞的喪失、HIV顆粒由PBMC的產(chǎn)生等。如果相對(duì)于未免疫接種的組在免疫接種的組中HIV感染跡象有顯著降低則認(rèn)為治療是有效的。
當(dāng)然，本發(fā)明者預(yù)期應(yīng)用本發(fā)明作為對(duì)人中HIV的治療。本發(fā)明者預(yù)期對(duì)本發(fā)明作為人中的治療手段的檢驗(yàn)將依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的指南。人體應(yīng)用的一個(gè)重要方面是對(duì)治療劑產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。盡管可進(jìn)行各種離體檢驗(yàn)，例如測(cè)量抗-HIV細(xì)胞反應(yīng)，但最終的檢驗(yàn)是治療劑在接受了該治療劑的個(gè)體中至少改善HIV的感染或顯著延長(zhǎng)AIDS發(fā)病的能力。對(duì)人中HIV治療劑功效的監(jiān)控是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且本發(fā)明者不預(yù)期本發(fā)明將需要發(fā)展檢驗(yàn)HIV治療劑功效的新方法。
該氨基酸序列也可用作診斷試劑。例如，本發(fā)明的氨基酸序列可用于確定特定個(gè)體對(duì)采用該氨基酸序列或相關(guān)氨基酸序列的治療方案的易感性，因而可有助于修改現(xiàn)有的治療方案或確定對(duì)患病個(gè)體的預(yù)后。此外，該氨基酸序列也可用于預(yù)測(cè)哪些個(gè)體將基本不被HIV感染。
診斷方法根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了對(duì)感染性疾病進(jìn)行亞分類(lèi)、預(yù)測(cè)和監(jiān)控的方法。
診斷和預(yù)后方法一般用從患者獲得的生物學(xué)樣品進(jìn)行，該生物學(xué)樣品含有微生物。“樣品”指來(lái)自個(gè)體的懷疑含有微生物或部分(如氨基酸序列或核苷酸序列)的組織或體液樣品，該樣品包括但不局限于血漿、血清、脊髓液、淋巴液及體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品。
根據(jù)本發(fā)明的診斷和預(yù)測(cè)方法，微生物氨基酸序列的改變可用在此處描述的任何一個(gè)方法進(jìn)行探測(cè)。此外，可進(jìn)行診斷和預(yù)測(cè)方法以探測(cè)微生物氨基酸序列改變的頻率或速率。
如在此處所用的，用于本發(fā)明上下文中的術(shù)語(yǔ)“診斷”或“預(yù)測(cè)”用于指1)對(duì)展示逃避突變的微生物進(jìn)行分類(lèi)，2)確定逃避突變的嚴(yán)重性，或3)在治療前、治療中和治療后監(jiān)控疾病進(jìn)程。
為了在組織中探測(cè)野生型微生物核苷酸或氨基酸序列中的改變，從患者中分離微生物是有用的。濃縮微生物制劑的方法是本領(lǐng)域中公知的，且依賴(lài)于分離的微生物類(lèi)型。
在DNA序列中探測(cè)多態(tài)的快速初步分析可通過(guò)觀(guān)察一系列核苷酸材料的DNA印跡或RNA印跡而進(jìn)行，該核苷酸材料已用一種或多種限制性?xún)?nèi)切酶切割，優(yōu)選地為已用大量限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割。展示雜交片段的RNA或DNA印跡顯示可能的突變。如果應(yīng)用產(chǎn)生非常大片段的限制性?xún)?nèi)切酶，那么也可應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)。
點(diǎn)突變的探測(cè)也可通過(guò)用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)對(duì)微生物序列進(jìn)行分子克隆和對(duì)等位基因進(jìn)行測(cè)序而實(shí)現(xiàn)。可選擇地，該基因序列可用公知的技術(shù)直接從核苷酸序列制劑中擴(kuò)增。
用于探測(cè)基因多態(tài)是否存在的一些其他有用的診斷技術(shù)包括，但不局限于1)等位基因特異性PCR；2)單鏈構(gòu)象分析(SSCA)；3)變性梯度凝膠電泳(DGGE)；4)RNase保護(hù)測(cè)定法；5)識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，如大腸桿菌mutS蛋白質(zhì)；6)等位基因特異性寡核苷酸(ASO)；和7)熒光原位雜交(FISH)。
突變的微生物基因的改變也可通過(guò)篩選野生型微生物蛋白質(zhì)的改變而探測(cè)。這種改變可根據(jù)常規(guī)技術(shù)通過(guò)氨基酸序列分析來(lái)確定。更優(yōu)選地，抗體(多克隆或單克隆)可用于探測(cè)突變的微生物蛋白質(zhì)或肽中的差異或其不存在性。
對(duì)突變等位基因產(chǎn)物特異性的抗體可用于探測(cè)突變的微生物氨基酸序列。這種免疫學(xué)測(cè)定可以以本領(lǐng)域中公知的任何方便形式進(jìn)行。這些包括蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)測(cè)定和ELISA測(cè)定。探測(cè)改變的氨基酸序列的任何方法可用于探測(cè)野生型氨基酸序列中的改變。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體可以與來(lái)自溶液的突變氨基酸序列進(jìn)行免疫沉淀，以及在聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)或免疫印跡上與突變的氨基酸序列反應(yīng)。
涉及探測(cè)突變氨基酸序列的方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶法測(cè)定(IEMA)，其中包括應(yīng)用單克隆和/或多克隆抗體的三明治測(cè)定法。
抗體制備方法本發(fā)明的抗體一般通過(guò)用含有本發(fā)明氨基酸序列的接種物對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫接種并因而誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物抗體分子而產(chǎn)生，其中該抗體分子具有對(duì)免疫接種的氨基酸序列的免疫特異性。然后從哺乳動(dòng)物中收集抗體分子并用眾所周知的技術(shù)以想要的程度進(jìn)行分離以獲得IgG組分，該技術(shù)例如應(yīng)用DEAE葡聚糖凝膠或蛋白質(zhì)G。
用于本發(fā)明的診斷方法和系統(tǒng)中的示例性抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和那些含有抗原互補(bǔ)位的免疫球蛋白部分，包括那些本領(lǐng)域中已知為Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的部分?？贵w的Fab和F(ab’)2部分分別通過(guò)眾所周知的方法用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)基本完整的抗體的蛋白水解反應(yīng)制備。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4,342,566。Fab’抗體部分也是眾所周知的且通過(guò)如下步驟從F(ab’)2部分產(chǎn)生，即用巰基乙醇對(duì)連接兩個(gè)重鏈部分的二硫鍵進(jìn)行還原，隨后用如試劑碘乙酰胺對(duì)結(jié)果所得的蛋白質(zhì)硫醇進(jìn)行烷基化。含有完整抗體分子的抗體是優(yōu)選的，且在此處用作示例物。
抗含有多態(tài)的氨基酸序列的抗體的制備是本領(lǐng)域中眾所周知的。參見(jiàn)Staudt等人，J.Exp.Med.，157687-704(1983)或Sutcliffe，J.G.的教導(dǎo)，如描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4,900,811中的，在此處將該教導(dǎo)引入作為參考。簡(jiǎn)言之，為了產(chǎn)生含有多態(tài)的本發(fā)明氨基酸序列抗體組合物，用有效量的含有多態(tài)的本發(fā)明氨基酸序列對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物進(jìn)行免疫學(xué)接種，其中該序列一般存在于本發(fā)明的疫苗中。然后從哺乳動(dòng)物中收集因而誘導(dǎo)的抗氨基酸序列的抗體分子，并將那些對(duì)含有多態(tài)的氨基酸序列為免疫特異性的抗體用眾所周知的技術(shù)以想要的程度進(jìn)行分離，該技術(shù)如免疫親和層析。
為了增強(qiáng)抗體的特異性，優(yōu)選地通過(guò)免疫親和層析用固相附著的免疫多肽對(duì)抗體進(jìn)行純化。使抗體與固相附著的免疫多肽接觸足夠的時(shí)間，從而使該多肽與抗體分子進(jìn)行免疫反應(yīng)以形成固相附著的免疫復(fù)合物。結(jié)合的抗體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從復(fù)合物中分離。
對(duì)于含有少于約35個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，為了誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的目的優(yōu)選地是應(yīng)用與載體結(jié)合的肽。可將一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸殘基添加于多肽的氨基-或羧基-末端以有助于多肽與載體的結(jié)合。人們已發(fā)現(xiàn)在多肽的氨基-或羧基-末端添加半胱氨酸殘基對(duì)于通過(guò)二硫鍵形成綴合物是特別有用的。然而，也可應(yīng)用本領(lǐng)域中用于制備綴合物的眾所周知的其他方法。本領(lǐng)域中目前已知的通過(guò)活化的功能基團(tuán)進(jìn)行多肽綴合或偶聯(lián)的技術(shù)是特別適用的。參見(jiàn)如Aurameas等人，Scand.J.Immunol.，第8卷，增刊77-23(1978)和美國(guó)專(zhuān)利Nos.4,493,795、3,791,932和3,839,153。此外，可進(jìn)行位點(diǎn)定向的偶聯(lián)反應(yīng)，從而可使偶聯(lián)后由于多肽的定向而導(dǎo)致的任何活性喪失最小化。參見(jiàn)如Rodwell等人，Biotech.，3889-894(1985)和美國(guó)專(zhuān)利No.4,671,958。額外的示例性連接程序包括應(yīng)用Micheal加成反應(yīng)產(chǎn)物、應(yīng)用二醛如戊二醛，Klipstein等人，J.Infect.Dis.，147318-326(1983)，等等，或者應(yīng)用碳二亞胺技術(shù)，如應(yīng)用水溶性碳二亞胺形成與載體連接的酰胺。可選擇地，可將異雙功能交聯(lián)劑SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸)用于對(duì)肽進(jìn)行綴合，在該肽中引入了羧基末端的半胱氨酸。
有用的載體是本領(lǐng)域中眾所周知的，且通常是蛋白質(zhì)自身。這種載體的示例為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、麻仁球蛋白、甲狀腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血紅細(xì)胞如綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、霍亂毒素以及聚氨基酸如聚D-賴(lài)氨酸∶D-谷氨酸等。載體的選擇更依賴(lài)于接種物的最終應(yīng)用，并基于本發(fā)明中未特別涉及的標(biāo)準(zhǔn)。例如，應(yīng)該選擇在進(jìn)行接種的特定動(dòng)物中不生成不想要的反應(yīng)的載體。
本發(fā)明的接種物含有如在此處所述有效量和免疫原性量的氨基酸序列，一般作為與載體連接的綴合物。如在此處所述每單位劑量中足以誘導(dǎo)對(duì)免疫接種多肽的免疫反應(yīng)的氨基酸序列的有效量除其他因素之外依賴(lài)于接種的動(dòng)物物種、動(dòng)物的體重和選擇的接種方法，且是本領(lǐng)域中眾所周知的。接種物在每次接種(劑量)中一般含有濃度為約10微克-約500毫克的氨基酸序列，優(yōu)選地為每次劑量約50微克-約50毫克。涉及接種物的術(shù)語(yǔ)“單位劑量”指適用于動(dòng)物的單一劑型的物理離散單位，每一個(gè)單位含有預(yù)定量的經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生想要的免疫原性作用的活性材料以及所需的稀釋劑，即載體或賦形劑。本發(fā)明接種物的新單位劑量規(guī)格由如下部分指示并直接依賴(lài)于如下部分(a)活性材料的獨(dú)特特征和要實(shí)現(xiàn)的特定免疫學(xué)作用，和(b)配制這些活性材料以在動(dòng)物中進(jìn)行免疫學(xué)應(yīng)用的領(lǐng)域中固有的局限，如在此處詳細(xì)描述的，這是本發(fā)明的特征。
接種物一般通過(guò)將氨基酸序列-綴合物在生理學(xué)耐受的(可接受的)稀釋劑如水、鹽水或磷酸緩沖鹽水中分散以形成水組合物而從干燥的氨基酸序列綴合物中制備。該接種物也可包括佐劑作為稀釋劑的部分。佐劑如完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)和明礬是本領(lǐng)域中眾所周知的材料，且商業(yè)上可從幾個(gè)來(lái)源購(gòu)得。
這樣制備的抗體可用于本發(fā)明的診斷方法和系統(tǒng)中以探測(cè)體液樣品中本發(fā)明的氨基酸序列。這種抗體的典型例子為單克隆抗體。
單克隆抗體一般由通過(guò)單細(xì)胞克隆生產(chǎn)的抗體組成，該單細(xì)胞克隆稱(chēng)為雜交瘤細(xì)胞，并且僅分泌(產(chǎn)生)一種抗體分子。雜交瘤細(xì)胞通過(guò)將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤或其他自身永生化的細(xì)胞系融合而形成。這種抗體的制備首先由Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)描述，將該描述引入作為參考?？蓪?duì)這樣制備的雜交瘤上清液進(jìn)行篩選以確定抗體分子的存在，該抗體分子與含有多態(tài)的氨基酸序列能進(jìn)行免疫反應(yīng)。
試劑盒本發(fā)明涉及包含可用于探測(cè)含有目標(biāo)多態(tài)的氨基酸序列的特定探針的試劑盒，其中這種探針可為功能化的抗體蛋白質(zhì)、多克隆抗體、單克隆抗體或這種蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，該氨基酸序列基本與選自SEQ ID NOS.1-33的序列相同。
實(shí)施本發(fā)明的最好方式本發(fā)明的進(jìn)一步的特征更充分描述于下面非限制性的實(shí)施例中。然而，應(yīng)該理解的是該詳細(xì)描述僅是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例的目的而包括的。絕不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明在上文中提出的廣泛描述的限制。
在下面實(shí)施例中未清楚描述的分子生物學(xué)方法報(bào)道于文獻(xiàn)中并是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。描述本技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的綜合書(shū)籍包括如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；Glover ed.，DNA CloningA Practical Approach，卷I和II，MRL Press，Ltd.，Oxford，英國(guó)(1985)；和Ausubel，F(xiàn).，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.，Current Protocols inMolecular Biology.Greene Publishing Associates/WileyIntersciences，New York。
實(shí)施例1
檢查HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶(RT)下面的實(shí)施例以對(duì)HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的檢查為例闡明了本發(fā)明。HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶(RT)在病毒體中是高度表達(dá)的，且在對(duì)HIV-1的早期反應(yīng)中是免疫原性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可將HIV-1 RT替代為其他適當(dāng)?shù)腍IV蛋白質(zhì)，或者選擇用于檢查的序列可源自其它病毒或生物。
數(shù)據(jù)收集檢查了西澳大利亞(WA)HIV群體研究中473個(gè)參加者中的HIV-1 RT序列與其HLA-A、-B和-DRB1基因型之間的關(guān)系。存在于個(gè)體中的HLA-A和-B等位基因包括A1、A2、A3、A9、A10、A11、A19、A28、A31、A36、B5、B7、B8、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B40、B41、B42、B55、B56、B58、B60和B61。
群體中絕大多數(shù)的患者居住于或靠近西澳大利亞的首府Perth，該城市是世界上在地理上最隔離的城市之一。新的HIV-1感染最頻繁地從西澳大利亞(53.3％)或澳大利亞其他州(24.3％)獲得，而較不經(jīng)常地從亞洲(8.2％)、非洲(5.1％)、歐洲(4.9％)、北美洲(3.4％)或南美洲(0.8％)獲得。參加者具有某些常規(guī)收集的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，包括I型HLA血清學(xué)分型和基于II型HLA序列的分型。HIV-1RT原病毒DNA測(cè)序在初次實(shí)驗(yàn)(at first presentation)時(shí)(在185個(gè)病例中為任何抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療之前)進(jìn)行，接著在RT抑制劑治療中進(jìn)行。該研究包含在多年觀(guān)察的約2210個(gè)患者中收集的數(shù)據(jù)。
WA群體研究于1983年確立，其是HIV感染的患者的預(yù)期觀(guān)察群體研究。從1983年到1998年，該研究獲取了來(lái)自西澳大利亞州中所有HIV-感染病例中80％的數(shù)據(jù)和所有通報(bào)的AIDS病例的數(shù)據(jù)。在醫(yī)生診治的門(mén)診病人和住院病人中收集了綜合的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)并將其輸入電子數(shù)據(jù)庫(kù)中。記錄了所有抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的起止日期。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果自動(dòng)從實(shí)驗(yàn)室下載并直接進(jìn)入群體數(shù)據(jù)庫(kù)中。在Logistic回歸模型中對(duì)來(lái)自最多473個(gè)群體被試者的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，該被試者具有HLA和病毒序列數(shù)據(jù)。
HLA基因分型應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的NIH技術(shù)通過(guò)微量細(xì)胞毒性測(cè)定對(duì)HLA-A和HLA-B寬等位基因(broad allele)進(jìn)行了分型。對(duì)于該研究，對(duì)51個(gè)HLA-B5個(gè)體和57個(gè)HLA-B35個(gè)體的HLA-B序列用以前所述的針對(duì)第一個(gè)內(nèi)含子雙態(tài)的引物進(jìn)行了擴(kuò)增(參見(jiàn)如N.Cereb和S.Y.Yang，Tissue Antigens 50，74-76(1997))，且將產(chǎn)物通過(guò)自動(dòng)測(cè)序進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)用以前報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)序而對(duì)HLA-DRB1等位基因進(jìn)行分型(參見(jiàn)如D.Sayer等人，Tissue Antigens 57，46-54(2001))。
HIV-1 RT測(cè)序從棕黃層(buffy coat)提取HIV-1 DNA(QIAMP DNAblood mini kit；Qiagen，Hilden，德國(guó))，且通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增RT的密碼子20-227。進(jìn)行第二輪嵌套PCR，并將PCR產(chǎn)物用Bresatec_純化柱進(jìn)行純化并用373 ABI DNA測(cè)序儀進(jìn)行正向和反向測(cè)序。利用軟件包Factura和MT Navigator(PE Biosystems)手工對(duì)原始序列進(jìn)行編輯。
定量HIV RNA測(cè)定直到1999年11月所應(yīng)用的病毒負(fù)載測(cè)定一直都是HIV AmplicorTM(Roche，Branchburg，美國(guó)，探測(cè)下限為400個(gè)拷貝/mL)。其后應(yīng)用探測(cè)下限為50個(gè)拷貝/mL的Roche Amplicor HIVmonitor version 1.5，即Ultrasehsitive。病毒負(fù)載測(cè)定常規(guī)地在所有患者中至少每3個(gè)月進(jìn)行一次。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用WA HIV群體研究數(shù)據(jù)庫(kù)以進(jìn)行基于Fisher精確性檢驗(yàn)和Logistic回歸模型的分析，將標(biāo)準(zhǔn)公式用于進(jìn)行能力(power)的計(jì)算(參見(jiàn)如J.H.Zar，Biostatistical Analysis，Bette Kurtz，Ed.(Prentice-Hall International，New Jersey，1984)，chap.22.11)。
然后用Fisher精確性檢驗(yàn)單獨(dú)估計(jì)單個(gè)協(xié)變量與研究的氨基酸位置的多態(tài)的關(guān)聯(lián)性，并僅將那些具有單變量P-值≤0.1的包括進(jìn)來(lái)以用于進(jìn)一步分析。如果由該方法選擇的協(xié)變量超過(guò)患者數(shù)目的10％，則應(yīng)用基于標(biāo)準(zhǔn)Logistic回歸的正向逐步程序(forward stepwiseprocedure)用于將該數(shù)目減少到10％，并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的反向消除程序直到所有協(xié)變量具有P-值≤0.1。
例如，用Fisher精確性檢驗(yàn)單獨(dú)估計(jì)協(xié)變量與I135的關(guān)聯(lián)性，并僅將那些具有單變量P-值≤0.1的包括進(jìn)來(lái)以用于進(jìn)一步分析。去除的等位基因?yàn)锳1、A2、A3、A9、A11、A19、A28、B7、B8、B13、B14、B15、B16、B21、B22、B27和B35。
由于在位置I135選擇的協(xié)變量數(shù)目少于患者數(shù)目的10％，所以不需要正向選擇。然后在位置I135進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的反向消除程序。將具有最大P-值的協(xié)變量去除并修改Logistic模型。對(duì)此進(jìn)行重復(fù)直到所有協(xié)變量均具有小于0.1的P-值，從而去除了HLA等位基因B12、B17和B40。
為了在一些邏輯回歸中容納相對(duì)小的樣品，精確的P-值基于隨機(jī)化檢驗(yàn)而不是通常的大樣本逼近(參見(jiàn)如F.L.Ramsey和D.W.Schafer，The statistical sleuth.A course in methods of data analysis，(Duxbury Press，1997)，第2章)。在該程序中，在患者中隨機(jī)排列協(xié)變量組并對(duì)每一個(gè)排列計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)值與多態(tài)的關(guān)聯(lián)性。該程序?qū)γ恳粋€(gè)模型生成了1000個(gè)隨機(jī)排列，p值為基于比與實(shí)際數(shù)據(jù)相應(yīng)的檢驗(yàn)值更極端的檢驗(yàn)值的適當(dāng)百分比。將P-值≤0.05認(rèn)為是顯著的。
例如，在位置I135去除了等位基因HLA-A10和-B18，剩下HLA-B5與I135顯著關(guān)聯(lián)。
進(jìn)行分析以確定在相應(yīng)的已知CTL表位中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)至少15個(gè)顯著正關(guān)聯(lián)的概率。如果顯著關(guān)聯(lián)在殘基上隨機(jī)發(fā)生，那么在局限于該等位基因的已知CTL表位中HLA關(guān)聯(lián)性發(fā)生的概率等于該表位中所有殘基的相對(duì)百分比。因而已知表位中顯著關(guān)聯(lián)的總數(shù)目是不同的二項(xiàng)式變量的總和，該變量的分布可通過(guò)例如模擬而進(jìn)行估計(jì)。與15個(gè)觀(guān)察值相比，基于隨機(jī)假說(shuō)可以預(yù)測(cè)在已知的表位中僅有4.27個(gè)顯著正關(guān)聯(lián)(P值約＜0.001)。
多重比較的校正因子如隨后所描述的那樣生成，且校正的精確P-值由函數(shù)1-(1-P)x確定，其中x＝校正因子。所有位置上所有關(guān)聯(lián)的總P-值通過(guò)考慮每一個(gè)位置上單個(gè)檢驗(yàn)的總和相對(duì)于從隨機(jī)化的數(shù)據(jù)集合中獲得的總和值的極端性而獲得。
對(duì)于病毒負(fù)載的Cox proportional hazards models，HLA關(guān)聯(lián)性必須具有至少4個(gè)代表HLA等位基因?qū)Ψ?HLA等位基因的個(gè)體，該個(gè)體具有或不具有包括的多態(tài)(n＝106)。所測(cè)量的與最初治療前HIV-1 RT測(cè)序最接近的病毒負(fù)載被采用。
HIV-1 RT氨基酸序列中的多態(tài)受殘基的功能重要性限制為了確定研究的群體中HIV-1 RT序列中的多態(tài)是隨機(jī)分布還是在優(yōu)選位點(diǎn)發(fā)生的，將群體一致序列用作參考序列，且該一致序列是通過(guò)在任何抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(n＝185)前在所有初始HIV-1 RT氨基酸序列中22-227(編碼系統(tǒng)參考B.T.M.Korber等人，HIV MolecularImmunology Database 1999(Theoretical Biology and Biophysics，New Mexico，1999))的每一個(gè)位置上分配最常見(jiàn)的氨基酸而確定。該群體一致序列在RT中除122(賴(lài)氨酸而不是谷氨酸)和214(苯丙氨酸而不是亮氨酸)之外的所有位置上與B進(jìn)化枝參考序列HIV-1 HXB2相匹配(L.Ratner等人，Nature 313，277-284(1985))。對(duì)每一個(gè)殘基計(jì)算了治療前初始HIV-1 RT序列中具有不同氨基酸的患者與具有一致序列的患者的比例。對(duì)該多態(tài)率和HIV-1 RT中位置95-202的氨基酸的已知功能特征(穩(wěn)定性、有功能的、催化的或外部的)之間的關(guān)系進(jìn)行了檢查。
單個(gè)殘基上的多態(tài)率是高度可變的，范圍為0％-60％，且似乎與該位點(diǎn)改變的預(yù)期病毒耐受性相關(guān)聯(lián)(圖1)。例如，HIV-1 RT中3個(gè)關(guān)鍵的催化殘基(0.53％)、穩(wěn)定性殘基(n＝37，1.06％)和有功能的殘基(n＝11，3.05％)的多態(tài)率比外部殘基(n＝10，5.95％)的低(P＝0.0009，Wilcoxon)。
HIV-1 RT中已知和推定的CTL表位中或附近殘基的多態(tài)是I型HLA特異性的由于抗原特異性CTL反應(yīng)是I型HLA限定的，所以對(duì)作為CTL逃避突變結(jié)果的HIV-1 RT中的多態(tài)進(jìn)行檢查以確定它們?cè)谌后w中是否是I型HLA等位基因特異性的及是否存在于CTL表位中或附近的殘基中。因此檢查了多變量Logistic回歸模型中HLA-A和HLA-B寬等位基因(作為解釋性的協(xié)變量)和HIV-1 RT中多態(tài)(作為結(jié)果或反應(yīng)變量)之間的關(guān)系。將每一個(gè)患者中最近的HIV-1 RT序列用于這些分析中(n＝473)。在單獨(dú)的模型中檢查了HIV-1 RT中單個(gè)的氨基酸殘基。在單個(gè)殘基上的單獨(dú)的模型確定了協(xié)變量(HLA等位基因)和結(jié)果(僅僅該殘基的多態(tài))之間的關(guān)系并給出了關(guān)聯(lián)性的幾率(OR)。
探測(cè)這些模型中任何單個(gè)等位基因作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)能力依賴(lài)于群體中該等位基因的頻率和所檢查的該氨基酸位置的多態(tài)頻率。對(duì)每一個(gè)位置進(jìn)行了初始的能力計(jì)算以確定對(duì)于哪些等位基因存在探測(cè)關(guān)聯(lián)性(如果其存在時(shí))的合理能力(探測(cè)OR＞2.0或＜0.5需至少30％的能力)。在隨后的分析中在每一個(gè)病毒殘基上僅僅檢查了那些具有與P≤0.1多態(tài)單變量關(guān)聯(lián)性的HLA等位基因(1-10個(gè)HLA等位基因，在72個(gè)位置上平均為3.15個(gè)等位基因)。對(duì)Logistic回歸模型中的最終協(xié)變量也進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的正向選擇和反向消除程序。將基于Logistic模型的排列檢驗(yàn)用于確定關(guān)聯(lián)性的精確P-值(F.L.Ramsey和D.W.Schafer，TheStatistical Sleuth，A course in methods of data analysis，(DuxburyPress，1997)，第二章)。
將低于30％能力的HLA等位基因去除。在位置135去除的等位基因?yàn)锳31、A36、B42、B55、B56、B58和B61。重要的是要注意用于探測(cè)負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力比用于探測(cè)正關(guān)聯(lián)性的低。例如，在10.9的平均HLA頻率和4.0％的平均多態(tài)時(shí)，探測(cè)2.0的OR(即正關(guān)聯(lián)性)的能力為30％，但探測(cè)等價(jià)的0.5OR的負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力僅為5.6％。
將所有單個(gè)模型中的結(jié)果一起繪制于位置20-227的HIV-1 RT氨基酸序列圖中(圖2)。在HIV-1 RT單個(gè)殘基的多態(tài)和特定的HLA-A或-B等位基因之間有64個(gè)正關(guān)聯(lián)性(即OR＞1)(在所有情況下P≤0.05)(圖2，B框)。對(duì)特定HLA等位基因特異性的多態(tài)在序列上簇聚。例如，HLA-B7與位置158(OR＝4)、162(OR＝10)、165(OR＝2)和169(OR＝13)的多態(tài)相關(guān)聯(lián)，這些位置均在已知的HLA-B7限定的CTL表位RT(156-165)中或其側(cè)面(C.M.Hay等人，J Virol 73，5509-5519(1999)；L.Menendez-Arias，A.Mas，E.Domingo，Viral Immunol11，167-181(1988)；C.Brander和B.D.Walker，HIV molecularimmunology database，B.T.M.Korber等人，Eds.New Mexico(1997))。對(duì)于HLA-B12(在位置100和102、115和118、203和211)、HLA-B35(121和123)、HLA-B18(在135和142)和HLA-B15(在207、211和214)也有關(guān)聯(lián)性的簇聚。
在29個(gè)CTL表位中的殘基上存在15個(gè)I型HLA等位基因相關(guān)聯(lián)的多態(tài)(圖2，B框，以灰色文本顯示)，其中該殘基是已表征的、已發(fā)表的且已知局限于那些等位基因。這些殘基的4個(gè)(101、135、165和166)位于CTL表位中的主要錨定位置(分別受限于HLA-A3(C.Brander和P.J.R.Goulder，HIV Molecular Immunology 2000，B.T.M.Korber等人，Eds.(Theoretical Biology and Biophysics，New Mexico，2000)，chap.Part 1.綜述文章)，HLA-B51(L.Menendez-Arias，A.Mas，E.Domingo，Viral Immunol 11，167-181(1988)；N.V.Sipsas等人，J Clin Invest 99，752-762(1997))/HLA-B*5101(H.Tomiyama等人，Hum Immunol 60，177-186(1999))，HLA-B7(C.M.Hay等人，J Virol 73，5509-5519(1999)；L.Menendez-Arias，A.Mas，E.Domingo，Viral Immunol 11，167-181(1988)；C.Brander和B.D.Walker，HIV molecular immunology database，B.T.M.Korber等人，Eds.New Mexico(1997))和HLA-A11(Q.J.Zhang，R.Gavioli，G.Klein，M.G.Masucci，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A90，2217-2221(1993)))，在該位置的突變將消除與HLA分子的結(jié)合。剩余的11個(gè)關(guān)聯(lián)性位于發(fā)表的CTL表位的非主要錨定位置。還有5個(gè)位于CTL表位側(cè)面且局限于相同的HLA等位基因的HLA-等位基因特異性多態(tài)殘基(圖2，以黑色文本顯示)。位于已知的HLA-A2和HLA-A3限定的表位側(cè)面的位置26和28的殘基是預(yù)測(cè)的蛋白體切割位點(diǎn)(C.Kuttler等人，J Mol Biol 298，417-429(2000))。如果顯著的正關(guān)聯(lián)性在殘基中隨機(jī)發(fā)生，那么預(yù)期僅有4.18將位于相應(yīng)的已知CTL表位中。而觀(guān)察到的數(shù)目15顯著高于該值(P＜0.0004)。此外，對(duì)于具有HIV-1 RT該片段中表位的11個(gè)HLA特異性中的10個(gè)均觀(guān)察到比該預(yù)期高的關(guān)聯(lián)性。
進(jìn)行了最后一組分析以鑒定在對(duì)在整個(gè)分析上進(jìn)行獨(dú)立比較的有效數(shù)字進(jìn)行校正后，這些顯著的HLA關(guān)聯(lián)性中的哪些仍然是顯著的。將HLA基因型隨機(jī)在個(gè)體中進(jìn)行再分配，并將以前描述的分析運(yùn)行1000次以確定對(duì)于每一個(gè)HLA等位基因單獨(dú)隨機(jī)預(yù)測(cè)的錯(cuò)誤正關(guān)聯(lián)的數(shù)目。將獲得的P-值≤0.05的平均數(shù)目乘以20(即1/0.05)以估計(jì)所進(jìn)行的獨(dú)立檢驗(yàn)的有效數(shù)字，該有效數(shù)字用作對(duì)每一個(gè)HLA等位基因的多重比較的校正因子。校正因子對(duì)于正關(guān)聯(lián)性的范圍為5.0(HLA-B37)-92.2(HLA-B7)，對(duì)于負(fù)關(guān)聯(lián)性為0.8-42.8。在該校正后仍然有14個(gè)關(guān)聯(lián)性的P≤0.05(圖2，框中的HLA關(guān)聯(lián)性)。
也將隨機(jī)化的數(shù)據(jù)組用于生成對(duì)所有模型中所有位置的所有HLA關(guān)聯(lián)性的顯著性的總體檢驗(yàn)，其中考慮了多重比較。該檢驗(yàn)具有P-值≤0.001。
分子HLA亞分型可增加多態(tài)與HLA等位基因之間的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)度血清學(xué)定義的I型HLA等位基因具有亞型，該亞型由基于DNA序列的高分辨率分型定義，且在影響表位結(jié)合的肽結(jié)合區(qū)中具有氨基酸序列差異。對(duì)于這些等位基因，可以預(yù)期CTL逃避突變與分子亞型的關(guān)聯(lián)性將比與寬HLA等位基因的更密切。作為例子，檢查了2個(gè)與寬HLA等位基因的強(qiáng)關(guān)聯(lián)，該HLA等位基因具有充分體現(xiàn)的斷裂點(diǎn)、位于已知CTL表位的位點(diǎn)中且在分子水平上該表位的HLA限制性是已知的。與HLA-B5的存在相關(guān)聯(lián)的位置135(I135x，其中I是一致氨基酸異亮氨酸而x是任何其他氨基酸)的多態(tài)是發(fā)表的表位中殘基上最強(qiáng)的正HLA關(guān)聯(lián)性(OR＝17，P＜0.001)。位于特定地受限于HLA-B*3501的表位中的D177x與HLA-B35相關(guān)聯(lián)(OR＝4，P＜0.001)(圖2)。
I135x與HLA-B*5101相關(guān)聯(lián)異亮氨酸是一致性HIV-1 RT序列的位置135的氨基酸。它是已知的HLA-B5(*5101)限制的8聚體CTL表位RT(128-135 IIIB)的第8個(gè)氨基酸和錨定殘基。表位中其他7個(gè)氨基酸殘基中的6個(gè)是RT蛋白質(zhì)重要的穩(wěn)定性殘基且在群體中是相對(duì)不變化的(圖1、圖2)。在所有52個(gè)HLA-B5陽(yáng)性患者中，44個(gè)(85％)在位置135具有異亮氨酸的替代。在421個(gè)非-HLA-B5個(gè)體中，僅有123個(gè)(29％)具有該改變(P＜0.0001，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))。
在具有HLA-B5等位基因的群體中進(jìn)行DNA測(cè)序以對(duì)所有52個(gè)個(gè)體進(jìn)行亞分型(圖3)。一個(gè)HLA-B5患者不具有進(jìn)行高分辨率HLA分型所必需的足夠DNA樣品。剩余的51個(gè)HLA-B5患者中的40個(gè)具有HLA-B*5101亞型。這些40個(gè)HLA-B*5101患者中除1個(gè)之外(98％)均具有I135x(在25個(gè)病例中為I135T、5個(gè)病例中為I135V、剩余的9個(gè)病例中為I135L/M/R或混合種類(lèi))。相反，群體中432個(gè)非-HLA-B*5101患者中僅有127個(gè)(29％)具有I135x(P＜0.0001，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))。對(duì)于大多數(shù)常見(jiàn)的從異亮氨酸到蘇氨酸的替代，突變表位(TAFTIPST)的解離值的預(yù)測(cè)半衰期與一致序列的(TAFTIPSI)440相比為11，從而顯示在體內(nèi)與HLA分子的結(jié)合取消了。該替代已顯示在使目標(biāo)細(xì)胞敏化以在體外由CTL進(jìn)行50％的裂解(SD50)所需要的肽濃度必須有100-倍的增加(N.V.Sipsas等人，J Clin Invest 99，752-762(1997))。與一致表位相比，位置135上較不常見(jiàn)的異亮氨酸到纈氨酸的替代導(dǎo)致SD50的10-倍增加(N.V.Sipsas等人，J Clin Invest 99，752-762(1997))。
在位置135上與一致序列無(wú)差別的單個(gè)HLA-B*5101患者是在急性HIV血清轉(zhuǎn)變中給予高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)的患者。該患者在病毒傳播期間顯示6.5log拷貝/mL的血漿HIV RNA濃度(病毒負(fù)載)和陰性HIV抗體檢驗(yàn)。他不具有血清轉(zhuǎn)變疾病的癥狀。在HAART治療開(kāi)始后，病毒負(fù)載在以后6個(gè)月中逐漸降低到不可探測(cè)的水平，且進(jìn)一步的10個(gè)月治療中保持不可探測(cè)的水平直到現(xiàn)在。
具有HLA-B*5108亞型的1個(gè)患者和具有HLA-B*5201亞型的8個(gè)患者中的4個(gè)都不具有I135x，從而提示這些亞型可能不與RT(128-135 IIIB)表位結(jié)合。這兩個(gè)亞型與HLA-B*5101僅有2個(gè)氨基酸的差異(HLA-B*5108在HLA氨基酸序列的位置152和156，HLA-B*5201在位置63和67)(IMGT/HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)；http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla)。剩余的2個(gè)患者通過(guò)測(cè)序顯示為HLA-B*5301(圖3)。
D177x與HLA-B*3501相關(guān)聯(lián)HLA-B35亞型HLA-B*3501與HLA-B*3502、-B*3503、-B*3504在肽結(jié)合區(qū)僅有1個(gè)或2個(gè)氨基酸的差異，而這些亞型的不同表位特異性對(duì)HIV-1感染的臨床發(fā)展具有驚人的作用。表位RT(175-183)與HLA-B*3501結(jié)合，且含有與對(duì)于其他HLA-B35亞型預(yù)測(cè)的不同的結(jié)合基元(http//www.uni-teubingen.de/uni/kxi)。與416個(gè)非-HLA-B35個(gè)體中有84個(gè)(20％)相比，在研究群體中57個(gè)HLA-B35陽(yáng)性的個(gè)體中，26個(gè)(46％)具有D177x(P＜0.0001，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))。然而，與440個(gè)非-HLA-B*3501患者中有86個(gè)(20％)相比，33個(gè)HLA-B*3501患者中有19個(gè)(58％)具有D177x(P＜0.0001，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))。因而，考慮了HLA-B35的分子亞型后，多態(tài)的單變量相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)從2.7增加到4.7。在HIV-1 RT、I69x、D121x和D123x中對(duì)其他HLA-B35相關(guān)聯(lián)的多態(tài)重復(fù)進(jìn)行上述分析，在所有情況下，通過(guò)考慮HLA-B35的分子亞型增強(qiáng)了所述關(guān)聯(lián)性。
HIV-1 RT中的HLA-特異性多態(tài)是隨時(shí)間選擇的為了確定HLA-特異性多態(tài)隨時(shí)間選擇是否是可證明的，對(duì)所有個(gè)體初始序列檢查了最近的HIV-1 RT序列中存在的HLA-特異性變異的數(shù)量。對(duì)于64個(gè)HLA-特異性多態(tài)中的61個(gè)，具有特定氨基酸多態(tài)的個(gè)體數(shù)目隨觀(guān)察時(shí)間增加。在這些病例的52個(gè)中，與所有其他無(wú)等位基因的相比，在那些具有與多態(tài)相關(guān)聯(lián)的HLA等位基因的個(gè)體中該增加是顯著更高的(P＝0.008，符號(hào)檢驗(yàn)法(sign test))，如表1所示。

表1HIV-1 RT中的HLA-特異性多態(tài)與在其他位置的次級(jí)變化相關(guān)聯(lián)。
HIV-1 p24表位中初級(jí)CTL逃避突變已顯示可在病毒中誘導(dǎo)可能的補(bǔ)償突變。為了確定與初級(jí)(推定的)CTL逃避突變伴隨的次級(jí)或補(bǔ)償突變?cè)谌后w水平上是否是明顯的，將在HIV-1 RT所有“其他”位置上的多態(tài)連同HLA等位基因一起包括進(jìn)來(lái)作為所有多變量Logistic回歸模型中的協(xié)變量。64個(gè)陽(yáng)性HLA-特異性多態(tài)中除2個(gè)之外都與其他位置上的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)相關(guān)聯(lián)。
HIV-1 RT多態(tài)和HLA等位基因之間的負(fù)關(guān)聯(lián)性。
在前文所述的多重Logistic回歸模型中，在25個(gè)殘基上多態(tài)是HLA-特異性的但具有OR＜1，從而顯示“負(fù)”關(guān)聯(lián)性。例如，在HIV-1 RT的位置32、101、122、169和210中一致氨基酸的改變與HLA-A2的存在負(fù)關(guān)聯(lián)(在所有情況下P≤0.05)。這意味著與群體中所有非-HLA-A2個(gè)體相比，HLA-A2個(gè)體顯著更不可能在這些位點(diǎn)上發(fā)生一致序列的變化。將陰性的OR取倒數(shù)(1/OR)以得到比值比＞1的值，該值表示不具有多態(tài)(圖2，C框)。HLA-A2是我們?nèi)后w中最常見(jiàn)的HLA-A等位基因，且具有25個(gè)負(fù)關(guān)聯(lián)性中的5個(gè)(與64個(gè)正關(guān)聯(lián)性中的3個(gè)相比)。類(lèi)似地，與非-HLA-B7個(gè)體相比，具有HLA-B7的個(gè)體更可能在位置118、178和208上具有一致氨基酸。根據(jù)這一分析，探測(cè)負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力低于探測(cè)正關(guān)聯(lián)性的能力。例如，在10.9的平均HLA頻率和4.0％的平均多態(tài)時(shí)，探測(cè)2.0的OR(即正關(guān)聯(lián)性)的能力為30％，但探測(cè)等價(jià)的0.5OR的負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力僅為5.6％。
HIV-1 RT中的HLA-特異性多態(tài)與較高的治療前病毒負(fù)載相關(guān)聯(lián)。
由于HIV-1病毒負(fù)載已顯示與HIV-特異性CTL反應(yīng)成反比例，所以進(jìn)行了研究以確定推定的CTL逃避突變的存在是否與增加的病毒負(fù)載相關(guān)聯(lián)。選擇單個(gè)HLA特異性多態(tài)進(jìn)行了檢查?？紤]了錨定殘基上的多態(tài)。HLA-A11相關(guān)聯(lián)的K166x位于HLA-A11表位RT(158-166 LAI)的錨定位置，且具有或不具有多態(tài)的HLA-A11組具有足以進(jìn)行比較的數(shù)目。為了排除抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的作用，僅對(duì)在治療前具有HIV-1 RT序列和病毒負(fù)載結(jié)果的患者進(jìn)行了分析。將在HIV-1 RT測(cè)序后獲得的最接近的治療前病毒負(fù)載測(cè)量在所有組之間進(jìn)行比較。在HLA-A11個(gè)體中(n＝19)，那些具有K166x的個(gè)體中的治療前病毒負(fù)載中數(shù)為5.54+/-0.46log cps/mL血漿(中值+/-SD)，而在無(wú)K166x的那些個(gè)體中為4.31+/-0.82log cps/mL(n＝15，P＝0.045，Wilcoxon)。無(wú)K166x的HLA-A11個(gè)體中的病毒負(fù)載中數(shù)與非-HLA-A11個(gè)體中的無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
位于CTL表位中但不在初級(jí)錨定位置上的第二個(gè)推定的CTL逃避突變顯示相似的作用。具有S162x的HLA-B7患者(n＝18)中治療前的病毒負(fù)載中值(5.41+/-1.04log cps/mL)顯著高于那些無(wú)S162x患者中的(n＝15，4.57+/-0.83log cps/mL，P＝0.046，Wilcoxon)。對(duì)于HLA-A11和HLA-B7兩組，在那些具有和不具有這些推定的CTL逃避突變的組之間，平均的CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)和患有AIDS的個(gè)體的基線(xiàn)百分比無(wú)顯著差異。
然后對(duì)在群體水平上影響病毒負(fù)載的因素進(jìn)行了全球分析。實(shí)施了Cox proportional hazards model，其中治療前的病毒負(fù)載是結(jié)果，且所有HLA等位基因和HLA-特異性多態(tài)是離散的協(xié)變量。當(dāng)將HLA等位基因和多態(tài)包括進(jìn)來(lái)作為相互作用條件時(shí)(即多態(tài)和其正關(guān)聯(lián)的HLA等位基因，或者一致氨基酸和負(fù)關(guān)聯(lián)的HLA等位基因)，則改善了模型的總體顯著性值。前一個(gè)模型的對(duì)數(shù)似然值(likelihood)為-32.0765，自由度為40，后一個(gè)模型的對(duì)數(shù)似然值為-15.4165，自由度為25。模型中的改善是用x2分布計(jì)算的，取特殊值為上述對(duì)數(shù)似然值差的2倍，自由度為上述自由度的差(33.32-x(15)，得到了0.004的P-值)。這提示在這些分析中推定地鑒定的病毒CTL逃避突變?cè)趥€(gè)體中的存在以比HLA等位基因或病毒多態(tài)本身更高的程度解釋了群體中病毒負(fù)載的可變性。
HIV-1 RT中的HLA-DRB1等位基因特異性多態(tài)—病毒逃避抗-HIVCD4 T輔助細(xì)胞反應(yīng)的證據(jù)？我們重復(fù)了多態(tài)的Logistic回歸模型，將HLA-DRB1寬等位基因作為協(xié)變量，也考慮了HLA-A和-B等位基因和其他位置的多態(tài)。在本分析中僅包括了群體中具有DRB1等位基因的患者，該DRB1等位基因由基于DNA序列的分型所確定。在位置20和227之間有13個(gè)與HLA-DRB1等位基因顯著相關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，在HIV-1 RT的該區(qū)段僅對(duì)5個(gè)T輔助細(xì)胞表位進(jìn)行了作圖(A.S.De Groot等人，J ofInfectious Diseases 164，1058-1065(1991)；S.H.Van der Burg等人，J Immunol 162，152-160(1999)；F.Manca等人，J of Acq.Imm.Def.Syn. & Hum.R9，227-237(1995)；F.Manca等人，EurJ Immunol 25，1217-1223(1995))，且僅對(duì)一個(gè)表位，即RT(171-190)確定了HLA-DRB1等位基因特異性(S.H.Van der Burg等人，J Immunol162，152-160(1999))。5個(gè)已知的CD4 T輔助細(xì)胞表位中的4個(gè)涵蓋在此處描述的模型中發(fā)現(xiàn)的HLA-DRB1等位基因-特異性多態(tài)位點(diǎn)。這些分析在RT(171-190)中沒(méi)有探測(cè)到HLA-DRB1關(guān)聯(lián)性。有10個(gè)HLA-DRB1相關(guān)聯(lián)的多態(tài)不位于已知的T輔助細(xì)胞表位中。
討論根據(jù)這些分析，HIV-1 RT在分離群體中是相對(duì)保守的，然而，即使在穩(wěn)定的地理隔離的HIV感染人群中也有HIV-1 RT的序列多樣性。在該研究中將群體一致序列用作總體上與該群體最適合的假定野生型序列，且該序列幾乎與B進(jìn)化枝參考序列HXB2-RT相同。然而，在該研究群體中，該一致序列的改變即使在HIV-1 RT的某一區(qū)段中也是明顯的。在此處給出的發(fā)現(xiàn)提示該多樣性是至少兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的進(jìn)化壓力的凈結(jié)果，該進(jìn)化壓力選擇或防止每一個(gè)氨基酸的改變。最重要的是維持病毒功能完整性的需要。受到這一基本限制束縛，病毒多態(tài)的強(qiáng)預(yù)報(bào)器是宿主HLA。
在HIV-1 RT中有64個(gè)(經(jīng)常簇聚的)與特定HLA-A或HLA-B等位基因相關(guān)聯(lián)的多態(tài)。多態(tài)存在于發(fā)表的CTL表位中或其附近的位點(diǎn)上，且與已知限定這些表位的HLA等位基因相關(guān)聯(lián)。該相關(guān)性自身是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，且?guī)讉€(gè)相關(guān)性在對(duì)整個(gè)分子的多重比較進(jìn)行嚴(yán)格校正之后仍然是顯著的。特定例子如HLA-B*5101相關(guān)聯(lián)的I135x的詳細(xì)特征高度提示了CTL逃避突變影響HLA-肽的結(jié)合。CTL表位的非主要錨定殘基上的多態(tài)如HLA-B*3501相關(guān)聯(lián)的D177x、HLA-B7相關(guān)聯(lián)的S162x和其他可賦予病毒生存優(yōu)勢(shì)，這是通過(guò)破壞T細(xì)胞受體-肽識(shí)別、對(duì)前體蛋白質(zhì)的表位加工或通過(guò)誘導(dǎo)拮抗性CTL反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CTL表位側(cè)面殘基上的5個(gè)HLA-特異性多態(tài)可能顯示了通過(guò)阻斷蛋白體肽的切割而導(dǎo)致病毒逃避。這種逃避形式特別難以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行鑒定，該技術(shù)僅應(yīng)用表位肽測(cè)量CTL反應(yīng)。隨時(shí)間而增加的HLA-特異性多態(tài)與其他位置上的次級(jí)改變相關(guān)聯(lián)，且是群體水平上病毒負(fù)載的預(yù)兆。假定存在對(duì)其他HIV-1基因中表位的多克隆免疫反應(yīng)和對(duì)病毒負(fù)載的其他獨(dú)立的影響如CCR5多態(tài)，那么單個(gè)殘基改變對(duì)病毒負(fù)載的作用尤其是顯著的。這些數(shù)據(jù)一起提示在此處于HIV-1 RT中鑒定的HLA-特異性多態(tài)代表個(gè)體中體內(nèi)CTL逃避突變的凈作用。位于發(fā)表的CTL表位外的那些多態(tài)可暗示新的或推定的CTL表位定位于何處。非常強(qiáng)的(具有高的OR)并且是簇聚的或在對(duì)多重比較進(jìn)行校正后仍然顯著的(如2，在框中顯示)HLA關(guān)聯(lián)性極可能代表尚未定義的CTL表位中的病毒逃避突變。
CTL逃避突變已在具有HLA-B8(最常見(jiàn)的)、HLA-B44、HLA-B27、HLA-A11和HLA-A3的個(gè)體中進(jìn)行了充分的表征，該個(gè)體由于窄范圍的寡克隆CTL反應(yīng)因而是更加易于逃避的。這些數(shù)據(jù)提示CTL逃避突變是常見(jiàn)和廣泛分布的，該突變由限制于比已在個(gè)體病例中研究的更廣范圍的HLA等位基因的反應(yīng)進(jìn)行選擇。盡管在該研究中許多HLA-特異性多態(tài)隨時(shí)間而增加，但一些存在于治療前的初始HIV-1 RT序列中且可反映病毒的效應(yīng)，而且已成為在傳播中或在急性感染的早期CTL反應(yīng)中被選擇的變體(圖1)。通過(guò)在高度病毒血癥的急性感染中應(yīng)用HAART可區(qū)分無(wú)I135x的單個(gè)HLA-B*5101患者。該患者在感染的最初時(shí)期不顯示癥狀，從而提示他尚未開(kāi)始CTL反應(yīng)。假定免疫選擇壓力減少或消除，從而說(shuō)明I135x是在急性CTL反應(yīng)中選擇的，而不是在HLA-B*5101個(gè)體中在傳播或慢性感染中選擇的。對(duì)CTL逃避變體的保護(hù)可有助于HAART在急性HIV感染中的作用，從而導(dǎo)致更強(qiáng)的慢性抑制性CTL反應(yīng)，該反應(yīng)迄今為止主要?dú)w因于HIV-1特異性CD4 T輔助細(xì)胞的保持。
HLA等位基因也與某些殘基上缺少多態(tài)相關(guān)聯(lián)，包括在不具有功能限制的殘基上(圖2)，且這些關(guān)聯(lián)性獨(dú)立地對(duì)病毒負(fù)載的綜合模型有貢獻(xiàn)。與在個(gè)體中導(dǎo)致可證實(shí)的逃避的時(shí)間依賴(lài)性正免疫選擇不同，負(fù)免疫選擇有利于體內(nèi)野生型病毒的保持，從而僅在群體水平上是明顯的?？赡艿氖且恢滦蛄谢蛞吧筒《驹嫉剡m應(yīng)最經(jīng)常遇到的CTL反應(yīng)(即那些受限于宿主群體中最常見(jiàn)或進(jìn)化上保守的HLA等位基因的)。對(duì)于HIV-1，這將至少部分地說(shuō)明HIV-1進(jìn)化枝的差異。群體適應(yīng)也可解釋在免疫逃避的重要作用的研究中為什么沒(méi)有證明限制于常見(jiàn)等位基因HLA-A*0201的CTL表位中逃避多態(tài)的選擇，以及為什么在HIV-1中僅對(duì)令人驚訝地少的HLA-A2和HLA-A1限定的表位進(jìn)行了作圖。此外，對(duì)暴露于HIV-1的血清陰性的個(gè)體的研究提示CTL反應(yīng)可改變病毒感染性和對(duì)確立的初級(jí)HIV-1感染的易感性。與天然HIV-1抗性或易感性相關(guān)聯(lián)的I型HLA等位基因在人種不同的群體中有差異。這在一定程度上可反映不同群體中共有的HLA等位基因中的差異和“群體適應(yīng)的”一致病毒可適應(yīng)于個(gè)體的程度。
此處對(duì)HIV-1 RT中13個(gè)HLA-DRB1特異性多態(tài)的證明(對(duì)HLA-A和HLA-B關(guān)聯(lián)性和次級(jí)多態(tài)進(jìn)行了調(diào)整)可支持人HIV-1感染中CD4 T輔助細(xì)胞逃避突變的概率。在HIV-1 RT中發(fā)表了相對(duì)少的T輔助細(xì)胞表位，且其II型HLA限定性未定義，從而難以估計(jì)這些結(jié)果是否與逃避突變的T輔助細(xì)胞選擇相一致。然而，II型HLA限定的CD4 T輔助細(xì)胞反應(yīng)在HIV-1控制中有重要的作用，且在II型HLA等位基因和HIV疾病易感性和進(jìn)展(包括在HAART后)之間有幾個(gè)已報(bào)道的關(guān)聯(lián)性。
本研究中基于群體的方法揭示了正選擇力和負(fù)選擇力如何在單個(gè)殘基上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)以驅(qū)動(dòng)最初的和當(dāng)前的病毒體內(nèi)進(jìn)化?？紤]到在這種分析中減少觀(guān)察到顯著HLA關(guān)聯(lián)性的可能性的因素，這些結(jié)果尤其是值得注意的。首先，探測(cè)關(guān)聯(lián)性的能力對(duì)于所有HLA等位基因/病毒殘基組合不是恒定的。需要大數(shù)目的個(gè)體以觀(guān)察到在某些殘基上的任何多態(tài)，該殘基處于針對(duì)突變的免疫壓力下但具有強(qiáng)的功能限制，或者具有任何稀有的與HLA等位基因的關(guān)聯(lián)性。正式的能力計(jì)算法的應(yīng)用鑒定了那些不可排除的HLA關(guān)聯(lián)性，且需要檢查較大的數(shù)據(jù)組。其次，HLA等位基因的分子亞型預(yù)測(cè)了其體內(nèi)結(jié)合性質(zhì)，如通過(guò)高分辨率的HLA分型增強(qiáng)HLA-B5和I135x及HLA-A35和D177x之間的關(guān)聯(lián)性所示的。其他具有相似頻率的多重?cái)嗔训牡任换?如HLA-A10或HLA-A19)可具有不可探測(cè)的關(guān)聯(lián)性，這是因?yàn)閮H僅考慮了寬的等位基因。此外，在相同病毒殘基上具有相反作用的分子斷裂(split)將消除與寬等位基因的任何關(guān)聯(lián)性。最后，發(fā)表的表位更可能位于保守區(qū)域中，這是因?yàn)檠芯績(jī)A向于應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室參考種類(lèi)作為目標(biāo)抗原，且保守區(qū)域更可能具有可測(cè)量的體內(nèi)免疫反應(yīng)。相反，該方法優(yōu)先探測(cè)可變區(qū)中推定的免疫表位，從而使其與標(biāo)準(zhǔn)的表位作圖方法互補(bǔ)?；颊邤?shù)目的不足、基于分子的HLA分型的缺乏和保守區(qū)中已知表位的缺乏均可導(dǎo)致免疫表位中未探測(cè)到“預(yù)期的”HLA-特異性多態(tài)，且可導(dǎo)致在一些情況下低估已證明的關(guān)聯(lián)性的強(qiáng)度(OR)。
作為與多個(gè)變量(HLA等位基因)和在多個(gè)殘基上進(jìn)行比較的結(jié)果，隨機(jī)關(guān)聯(lián)性的生成可潛在地妨礙這種分析，盡管能力計(jì)算法和其他篩選程序在相當(dāng)程度上限制了檢查的等位基因和位置數(shù)目。在多變量Logistic回歸模型中生成的P-值對(duì)檢查的殘基數(shù)目校正的程度將依賴(lài)于基因的大小，其中該基因是任意選擇來(lái)進(jìn)行研究的。通過(guò)該校正，該方法將喪失探測(cè)與選擇的基因區(qū)域大小成正比例的關(guān)聯(lián)性的能力，從而降低錯(cuò)誤的正關(guān)聯(lián)性(較高的特異性)但可能會(huì)丟失真正的正關(guān)聯(lián)性(較低的靈敏性)。這些HIV-1 RT分析提供了未對(duì)多重比較進(jìn)行校正的P-值的等級(jí)，從而反映了關(guān)聯(lián)性強(qiáng)度的等級(jí)。獨(dú)立的生物學(xué)確定性(validation)而不是統(tǒng)計(jì)學(xué)平均值將最好地確定怎樣的p-值截止點(diǎn)(cut-offs)對(duì)于靈敏性或特異性是最適的。如果要進(jìn)行校正(以得到高特異性)，那么進(jìn)行的隨機(jī)化程序使得能夠估計(jì)整個(gè)分析中有效的獨(dú)立比較的數(shù)目。那些具有可經(jīng)受該嚴(yán)格校正的P-值的HLA關(guān)聯(lián)性已通過(guò)這些方法而變得突出(圖2，框中的關(guān)聯(lián)性)。這些高度可靠的關(guān)聯(lián)性代表在HIV-1 RT中對(duì)新表位進(jìn)行作圖的起始點(diǎn)。
根據(jù)某些HLA和HIV-1疾病進(jìn)展之間已知的關(guān)聯(lián)性，HLA等位基因頻率可在群體水平上影響“野生型”HIV-1的適應(yīng)。然而，體內(nèi)進(jìn)化在具有不同HLA的個(gè)體中進(jìn)行。該分析顯示具有其相應(yīng)HLA-特異性病毒多態(tài)(或一致序列)的HLA等位基因的存在比HLA等位基因自身更加是病毒負(fù)載的前兆。它也表明CTL反應(yīng)的寬度確定了病毒逃避的風(fēng)險(xiǎn)以及由此導(dǎo)致的臨床發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。窄的單特異性反應(yīng)(如在HLA-B*5701長(zhǎng)期非發(fā)展型個(gè)體(non-progressors)中觀(guān)察到的)可為保護(hù)性的，但也可在具有有害HLA等位基因HLA-B8的個(gè)體中增加病毒逃避的風(fēng)險(xiǎn)。已顯示3個(gè)I型HLA座位雜合性的增加可預(yù)示AIDS的緩慢進(jìn)展，其中所述增加可預(yù)示更寬的多克隆反應(yīng)。成功的病毒CTL逃避突變依賴(lài)于在適當(dāng)?shù)臍埢鶎?duì)突變具有低的功能障礙，因而它可能是宿主表位特異性CTL反應(yīng)的寬度和那些表位上的重要的病毒功能限制性之間的平衡結(jié)果。因此，窄的CTL反應(yīng)如果針對(duì)保守的表位則可為保護(hù)性的，但如果針對(duì)易于變異的表位則不是保護(hù)性的或可為有害的。因此一次對(duì)推定的表位范圍和觀(guān)察到的該表位在群體中的多態(tài)進(jìn)行作圖的能力是非常有用的。將來(lái)對(duì)HIV-1 RT的分析也應(yīng)在模型中整合反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑作為協(xié)變量，以檢查藥物誘導(dǎo)的初級(jí)或補(bǔ)償突變和HLA-關(guān)聯(lián)的初級(jí)或次級(jí)多態(tài)之間的相互作用。如果免疫壓力和抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物在病毒序列中的位點(diǎn)上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，那么在患者中可觀(guān)察到對(duì)藥物抗性和反應(yīng)的增強(qiáng)或減弱趨勢(shì)，具體依賴(lài)于其HLA基因型。如果對(duì)免疫壓力和藥物壓力之間的協(xié)同或拮抗相互作用有了更好的理解，那么可改進(jìn)抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的個(gè)體化。正是因?yàn)檫@些方法已鑒定了HIV-1 RT中推定的免疫表位的位置，所以可用相同的途徑對(duì)其他HIV-1蛋白質(zhì)或來(lái)自其他微生物的蛋白質(zhì)中的候選表位進(jìn)行篩選，然后在體外或體內(nèi)用表位特異性免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法對(duì)其進(jìn)行證實(shí)。在HIV包膜中，也可考慮與抗-HIV抗體反應(yīng)、CCR5和CXCR4基因型及任何其他基因多態(tài)相關(guān)聯(lián)的作用，其中該基因編碼導(dǎo)向包膜蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。
實(shí)施例2
HIV-1 RT和蛋白酶氨基酸序列兩者中的多態(tài)在本研究中用上述方法檢查了HIV-1蛋白酶。特別地，本方法檢查了在HIV-1 RT和蛋白酶兩者中，宿主CTL壓力和藥物壓力在特定的位點(diǎn)是競(jìng)爭(zhēng)還是協(xié)同，從而以特異于給定HLA類(lèi)型個(gè)體的方式影響藥物抗性途徑。
對(duì)從HIV-1感染的550個(gè)個(gè)體獲得的大批HIV-1 RT和蛋白酶原病毒DNA序列進(jìn)行了分析。一次性檢查了單個(gè)氨基酸位置。確定了每一個(gè)位置的一致氨基酸，并將其與存在于每一個(gè)個(gè)體自身病毒序列的相應(yīng)位置的氨基酸進(jìn)行了比較。實(shí)施了對(duì)單個(gè)殘基(如HIV-1 RT的殘基184，一致序列中為甲硫氨酸)的多變量分析，其中目標(biāo)結(jié)果是特定多態(tài)(M184V)的存在與否或一致序列的任何改變(M184x)。然后確定了該結(jié)果和協(xié)變量(如個(gè)體所用的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物和/或其HLA類(lèi)型)之間關(guān)聯(lián)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。應(yīng)用如前所述的模型選擇步驟，對(duì)構(gòu)成全長(zhǎng)HIV-1 RT和蛋白酶蛋白質(zhì)的每一個(gè)殘基重復(fù)該過(guò)程。
研究群體研究群體取自在文中別處描述的西澳大利亞(WA)HIV群體研究。記錄了所有抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的起止日期。從1983年開(kāi)始在初次實(shí)驗(yàn)時(shí)已常規(guī)地進(jìn)行HLA-A和HLA-B基因分型。從1995年開(kāi)始在初次實(shí)驗(yàn)時(shí)(如果可能則在治療之前)和在抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的常規(guī)臨床管理中對(duì)HIV-1 RT原病毒DNA進(jìn)行了測(cè)序。HIV-1蛋白酶測(cè)序開(kāi)始于1997年。本研究中的總?cè)后w包含550個(gè)個(gè)體。所有個(gè)體均具有至少1個(gè)記錄的HIV-1 RT序列，且419個(gè)個(gè)體具有可用于分析的蛋白酶序列。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有分析均如上所述進(jìn)行。將具有標(biāo)準(zhǔn)HXB2編碼和比對(duì)的HIV-1 RT(20-227)和蛋白酶(1-99)的群體一致序列用作所有分析中的參考序列。在HIV-1 RT中，群體一致序列與B進(jìn)化枝參考序列HIV-1 HXB2在除122(賴(lài)氨酸而不是谷氨酸)和214(苯丙氨酸而不是亮氨酸)之外的所有位置上匹配。在HIV-1蛋白酶中，一致序列在位置37(天冬酰胺而不是絲氨酸)和63(脯氨酸而不是賴(lài)氨酸)上不同。
進(jìn)行能力計(jì)算以將分析僅局限于那些位置、藥物和HLA等位基因上，對(duì)于這些位置、藥物和HLA等位基因至少有30％的能力以探測(cè)OR＞2(正關(guān)聯(lián)性)或＜0.5(負(fù)關(guān)聯(lián)性)且p-值＜0.05。然后估計(jì)單獨(dú)的協(xié)變量與突變/替代的單變量關(guān)聯(lián)性，且如果p-值＞0.1，即將其去除，然后進(jìn)行正向選擇和反向消除程序。對(duì)每一個(gè)關(guān)聯(lián)性確定精確的p-值。最后，運(yùn)用隨機(jī)化或靴帶法(bootstrap)確定校正因子以使最終(HLA)關(guān)聯(lián)性根據(jù)多重比較進(jìn)行調(diào)節(jié)。
HLA基因分型所有HLA-A和-B寬等位基因均用標(biāo)準(zhǔn)NIH技術(shù)通過(guò)微量細(xì)胞毒測(cè)定法進(jìn)行分型。
HIV-1 RT和蛋白酶測(cè)序從棕黃層(buffy coat)提取HIV-1 DNA(QIAMP DNA blood mini kit；Qiagen，Hilden，德國(guó))，且通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增RT的密碼子20-227。進(jìn)行第二輪嵌套PCR，并將PCR產(chǎn)物用Bresatec_純化柱進(jìn)行純化并用373 ABI DNA測(cè)序儀在正向和反向測(cè)序。利用軟件包Factura和MT Navigator(PE Biosystems)手工對(duì)原始序列進(jìn)行編輯。
在群體水平上對(duì)HIV-1序列中抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性突變進(jìn)行選擇。
對(duì)于本檢查僅選擇充分表征的藥物抗性突變。在群體中273個(gè)具有可用的治療前HIV-1 RT序列的個(gè)體中，12個(gè)(4.4％)含有HIV-1 RT初級(jí)和/或次級(jí)突變抗性突變。在168個(gè)具有可用的治療前蛋白酶序列的個(gè)體中，49個(gè)(29.2％)具有蛋白酶初級(jí)抗性突變。對(duì)于那些具有已知血清轉(zhuǎn)變?nèi)掌诘膫€(gè)體，從血清轉(zhuǎn)變到治療前初始序列的平均時(shí)間為5.7年。
然后檢查所收集的整個(gè)群體的序列。這些個(gè)體中的288個(gè)(52.4％)在過(guò)去或現(xiàn)在已用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物進(jìn)行了治療，52.0％使用了NRTIs、8.2％使用了NNRTIs和16.4％使用了PIs。對(duì)于一次在一個(gè)位置實(shí)施的每一個(gè)Logistic回歸模型，僅將藥物抗性特征性的特定氨基酸替代認(rèn)為是結(jié)果(outcome)。對(duì)每一個(gè)個(gè)體的所有后續(xù)序列進(jìn)行了分析，該分析對(duì)于每一個(gè)體進(jìn)行的平均跨度時(shí)間為1.9年。將最早存在的抗性突變記錄為正結(jié)果，將所有后續(xù)的序列棄去，并將在結(jié)果出現(xiàn)之前的所有藥物處理均輸入作為協(xié)變量。如果在任何序列中未發(fā)展突變則將結(jié)果記錄為負(fù)的。
在33.6％的被試者中于治療后HIV-1 RT序列中探測(cè)到了初級(jí)和/或次級(jí)藥物抗性突變。以足以在Logistic回歸分析中進(jìn)行檢查的頻率被探測(cè)到的突變包括M41L、D67N、K70R、L74V、K103N、Y181C/I、M184V、G190A/S、L210W、T215Y和K219Q/E，同時(shí)K65R、75、V108I、Q151M和P225H僅是很少被探測(cè)到或未被探測(cè)到(＜序列的4.0％)，因此幾乎沒(méi)有能力被檢查。對(duì)于檢查的所有抗性突變，與在群體水平上選擇突變相關(guān)聯(lián)的藥物相應(yīng)于那些用來(lái)選擇突變的來(lái)自其他研究的已知藥物(表2)。例如，拉米夫定的應(yīng)用與具有OR為19的M184V的發(fā)展相關(guān)(p＜0.001)。2’，3’-雙脫氧胞苷的應(yīng)用獨(dú)立地增加了發(fā)展M184V的風(fēng)險(xiǎn)(OR＝3，p＝0.004)。在研究群體中未探測(cè)到L74V或M184V和阿巴卡韋應(yīng)用之間的正關(guān)聯(lián)性。沒(méi)有足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)能力探測(cè)應(yīng)用地拉韋定和突變之間的關(guān)聯(lián)性，這是因?yàn)樵撛噭┖苌偈褂谩?br> 表2-在模型中檢查的HIV-1 RT中的氨基酸替代，及它們發(fā)表的原因性抗反轉(zhuǎn)錄病毒試劑和在該研究中在群體水平上與這些替代相關(guān)聯(lián)的。OR-幾率、ZDV-疊氮胸苷、ddI-2’，3’-雙脫氧肌苷、3TC-拉米夫定、d4T-雙脫氧胸苷、ABC-阿巴卡韋、NRTI-核苷類(lèi)似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、NNRTI-非核苷類(lèi)似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。

利用治療后蛋白酶的測(cè)序，在24.1％的個(gè)體中探測(cè)到了初級(jí)PI抗性突變(D30N、M46I/L、G48V、V82A/T/F、L90M)，而在30.3％的個(gè)體中探測(cè)到了次級(jí)PI抗性突變(L10I、I54V/L、A71V/T、73、V77I、I84V、N88S)。在單獨(dú)的PI和初級(jí)PI抗性突變之間預(yù)測(cè)的關(guān)聯(lián)性中除2個(gè)(D30N和奈非那韋、G48V和沙奎那韋)之外全部在研究群體中是明顯的(表3)。沒(méi)有足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)能力來(lái)探測(cè)應(yīng)用氨普那韋或洛匹那韋和突變之間的關(guān)聯(lián)性。
在群體水平上對(duì)HIV-1序列中CTL逃避突變的選擇將如上所述的模型對(duì)HIV-1 RT和蛋白酶中的所有氨基酸進(jìn)行重復(fù)，并將所有個(gè)體的HLA-A和-B(寬的)血清型連同藥物處理一起作為協(xié)變量。在已知為初級(jí)或次級(jí)藥物抗性突變位點(diǎn)的那些位置上，將特征性的藥物抗性氨基酸替代指定為結(jié)果。在所有其他位置上，任何非一致氨基酸則為結(jié)果。
表3-檢查的HIV-1蛋白酶中的氨基酸替代。PI-蛋白酶抑制劑

表4-HIV-1 RT中對(duì)于模型中那些具有最強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的HLA等位基因的特征性HLA-特異性氨基酸替代。％-在其病毒序列中具有替代的HLA類(lèi)型個(gè)體的百分比。

HIV-1 RT
將這些模型中與特異性HLA-A或HLA-B等位基因呈正關(guān)聯(lián)的所有63個(gè)多態(tài)(OR＞1)(在所有情況下p≤0.05)根據(jù)每一個(gè)殘基上多態(tài)的總比率和已知的CTL表位而在HIV-1 RT圖上進(jìn)行作圖(圖2)。對(duì)于這些HLA-特異性多態(tài)關(guān)聯(lián)性中的16個(gè)，該多態(tài)位于具有相應(yīng)HLA限制性的CTL表位中或其側(cè)面，與CTL逃避突變一致，且在序列上有14個(gè)關(guān)聯(lián)性的簇聚。HLA-相關(guān)聯(lián)的多態(tài)在CTL表位中的4個(gè)主要錨定位置和9個(gè)非主要錨定位置上是明顯的，且3個(gè)位于具有相應(yīng)HLA限制性的CTL表位的側(cè)面。然后確定了存在于那些具有最強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的HLA等位基因中的特征性氨基酸替代(表4)。32個(gè)負(fù)HLA關(guān)聯(lián)性(OR＜1)也是明顯的一顯示相對(duì)于所有其他的等位基因，在存在這些HLA等位基因時(shí)多態(tài)或一致序列的改變是顯著更不可能的。
HIV-1蛋白酶在HIV-1蛋白酶中有48個(gè)由本模型探測(cè)的HLA等位基因特異性多態(tài)(圖4)。對(duì)于8個(gè)HLA等位基因有簇聚的多態(tài)，包括那些與HLA-B5在位置12、13、14和16相關(guān)聯(lián)的。在僅有的2個(gè)發(fā)表的CTL表位中或其側(cè)面存在HLA相關(guān)聯(lián)的多態(tài)，盡管沒(méi)有一個(gè)多態(tài)相應(yīng)于預(yù)測(cè)的HLA限定的表位(基于結(jié)合基元)。存在于群體中的最強(qiáng)的HLA關(guān)聯(lián)性及其特征性氨基酸替代在表5中顯示。探測(cè)到了23個(gè)負(fù)HLA關(guān)聯(lián)性。
表5-HIV-1蛋白酶中對(duì)于模型中那些具有最強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的HLA等位基因的特征性HLA-特異性氨基酸替代。

宿主HLA和抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性突變之間的相互作用在HIV-1 RT中有4個(gè)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性突變(M41L、K70R、T210W和T215Y/F)，而在蛋白酶中有7個(gè)(L10I/R、M46I/L、A71V/T、73、V77I、V82A/T/F和L90M)，在該突變處HLA等位基因獨(dú)立地增加了突變概率(圖2和4，B框)。例如，與所有其他HLA-A或-B等位基因相比，具有HLA-A28的個(gè)體中發(fā)展M41L的幾率顯著增加了(OR＝41，p＜0.001)。為了更詳細(xì)地檢查該觀(guān)察內(nèi)容，我們分析了群體中在治療后的任何時(shí)間暴露于疊氮胸苷和進(jìn)行HIV-1 RT測(cè)序的所有個(gè)體(n＝265)。該個(gè)體組中HLA-A28的普遍性(8.0％)與總?cè)后w中的(8.3％)相當(dāng)。然而，與那些未發(fā)展M41L替代的207個(gè)個(gè)體(7.7％，RR＝1.69，p＝0.30，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))相比，在58個(gè)用疊氮胸苷治療的具有M41L替代的個(gè)體中有HLA-A28的過(guò)度表現(xiàn)(12.1％)。對(duì)所有接受奈非那韋治療和進(jìn)行HIV-1蛋白酶測(cè)序的個(gè)體進(jìn)行了相似的分析(n＝133)。在接受奈非那韋之后，與Logistic回歸模型中L90M相關(guān)聯(lián)的HLA-B13的出現(xiàn)(OR＝13，p＜0.001，圖4)在具有L90M的個(gè)體中為40.0％，而在無(wú)L90M的個(gè)體中為18.7％(RR＝2.96，p＝0.12，F(xiàn)isher精確性檢驗(yàn))。
HLA等位基因降低了2個(gè)初級(jí)RT抑制劑抗性多態(tài)K103N(HLA-A19，1/OR＝4，p＝0.04)和M184V(HLA-B16，1/OR＝4，p＝0.03)和1個(gè)次級(jí)PI抗性突變L10I/R/V(HLA-A10，1/OR＝4，p＝0.024)的幾率(圖2和4，C框)，增加了具有這些特定HLA等位基因的個(gè)體中拮抗性選擇壓力的概率，其中該個(gè)體用誘導(dǎo)這些突變的藥物進(jìn)行了治療。
討論本研究的發(fā)現(xiàn)支持HIV-1體內(nèi)適應(yīng)的高度動(dòng)態(tài)的宿主特異性模型，其中宿主CTL反應(yīng)和抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療在單個(gè)病毒殘基水平上充當(dāng)連續(xù)的、競(jìng)爭(zhēng)性的或平行的相互作用進(jìn)化壓力。
研究的群體中常見(jiàn)的已知藥物抗性突變的分布與在其他較大和較小觀(guān)察性研究中發(fā)現(xiàn)的相當(dāng)，包括那些在首次應(yīng)用藥物的個(gè)體中所觀(guān)察到的。幾乎所有的初級(jí)藥物抗性突變和大多數(shù)次級(jí)藥物抗性突變?cè)谌后w中都是明顯的藥物相關(guān)聯(lián)的多態(tài)，且在所有這些情況中，藥物關(guān)聯(lián)性相應(yīng)于已知的原因性抗反轉(zhuǎn)錄病毒試劑。未探測(cè)到D30N和奈非那韋及G48V和沙奎那韋之間預(yù)期的關(guān)聯(lián)性，盡管對(duì)于兩個(gè)突變均有探測(cè)具有OR＞2的顯著藥物關(guān)聯(lián)性的能力(至少30％)。顯著地，G48V已報(bào)道最頻繁地體內(nèi)存在于接受了高劑量沙奎那韋單一治療的患者中，該單一治療幾乎從未用于本研究群體中。在大多數(shù)情況中，將沙奎那韋與利托那韋一起應(yīng)用。應(yīng)用基于群體的方法不能探測(cè)已知的藥物相關(guān)聯(lián)的多態(tài)可能是由于統(tǒng)計(jì)學(xué)能力的缺乏，如果藥物應(yīng)用或?qū)λ幬锏牟《緦W(xué)失效在群體中很少發(fā)生或者如果突變主要在體外而不是體內(nèi)進(jìn)行選擇。該方法可用于將來(lái)新的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物，作為一種系統(tǒng)的途徑以對(duì)由該藥物誘導(dǎo)的最頻繁的體內(nèi)藥物抗性突變進(jìn)行表征，即使體外推定的抗性位點(diǎn)是未知的。
在證實(shí)對(duì)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物的預(yù)期選擇作用的相同模型中，群體中幾個(gè)病毒殘基的序列多樣性顯著受宿主個(gè)體的HLA特征影響。以前，HIV-1 RT中的幾個(gè)HLA等位基因特異性多態(tài)已顯示相應(yīng)于已知或可能的CTL逃避位點(diǎn)、與寬血清型相比對(duì)細(xì)分的HLA亞型更加特異、隨時(shí)間增加頻率并預(yù)期較高的血漿病毒負(fù)載。在本研究中通過(guò)調(diào)整藥物誘導(dǎo)的改變進(jìn)一步對(duì)HIV-1 RT序列多樣性模型進(jìn)行精細(xì)修改，留下了我們認(rèn)為是推定的CTL逃避突變的22個(gè)多態(tài)核心組(表4)。迄今，HIV-1蛋白酶基因中的CTL逃避突變尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，且目前僅發(fā)表了2個(gè)CTL表位。然而，基于HLA-B5結(jié)合基元，蛋白酶(RPLVTIKI；位置8-15)是預(yù)測(cè)的CTL表位，且我們發(fā)現(xiàn)在HLA-B5和位置12、13、14和16的多態(tài)簇之間有強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性(圖4)。在幾個(gè)研究中已注意到蛋白酶基因的可觀(guān)的天然多態(tài)，且其中至少一些可能是CTL-驅(qū)動(dòng)的(圖4，表5)。表4和5中所示的HIV-1 RT和蛋白酶中選擇的多態(tài)具有下面關(guān)鍵特征的一個(gè)或全部它們與HLA等位基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)性非常強(qiáng)，且在對(duì)藥物相關(guān)聯(lián)的改變、其他位置上的多態(tài)(即可能的次級(jí)突變)和/或多重比較進(jìn)行調(diào)整后仍然是顯著的(p＜0.05)，它們處于具有相應(yīng)HLA限制性的已知CTL表位中或與其他與相同HLA等位基因相關(guān)聯(lián)的多態(tài)簇聚。在所有情況中，在具有HLA等位基因和等位基因相關(guān)聯(lián)的多態(tài)的個(gè)體中有1個(gè)或2個(gè)主要的氨基酸替代，這預(yù)期是CTL反應(yīng)所選擇的功能突變。在I135T/V的情況中，其他人已顯示該替代可消除HLA在體外與病毒表位的結(jié)合。因而，正如將藥物抗性突變認(rèn)為是暴露于特定的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物的“特征”或信號(hào)，這些氨基酸替代是特定HLA等位基因的特征且在藥物治療的個(gè)體中是明顯的。
持續(xù)抑制HIV-1復(fù)制的有效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療已顯示與抗-HIV CTL反應(yīng)的減少相一致，從而提示CTL逃避不大可能發(fā)生。證實(shí)CTL逃避在個(gè)體中隨時(shí)間固定的研究都是在未治療個(gè)體中進(jìn)行的。在本研究群體中，個(gè)體更可能在病毒學(xué)控制失敗(virological failure)中而不是當(dāng)成功進(jìn)行病毒學(xué)控制時(shí)進(jìn)行HIV-1 RT和/或蛋白酶測(cè)序。盡管我們不能確定每一個(gè)HLA-特異性多態(tài)一般首次出現(xiàn)的時(shí)間，但對(duì)病毒序列的獨(dú)立的HLA和藥物相關(guān)聯(lián)的作用的證實(shí)暗示CTL在一些個(gè)體中抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療期間或之后仍將施加選擇壓力。
很少有這樣的病毒殘基，在該殘基上CTL壓力和藥物壓力在驅(qū)動(dòng)野生型氨基酸的改變或不改變中起競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同作用。這提高了抗-HIV CTL反應(yīng)可解釋體外/體內(nèi)藥物抗性模式不一致、基因型和表型抗性不一致和不同個(gè)體中藥物抗性突變可變發(fā)生率的可能性。因此CTL壓力和藥物壓力之間的相互作用與目前治療策略的許多方面均有密切關(guān)系，如不同抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療法的比較、結(jié)構(gòu)性治療診斷(structured treatmentinterruptions)(STI)和不同的治療起始時(shí)間。逐步認(rèn)識(shí)到；對(duì)這些問(wèn)題的研究的設(shè)計(jì)和解釋受限于對(duì)什么決定這些疾病中個(gè)體間生物學(xué)可變性的不完全理解。我們迄今的發(fā)現(xiàn)表明HLA分型和病毒基因分型可提供設(shè)計(jì)將來(lái)臨床研究的信息。例如，預(yù)期STI不能增強(qiáng)個(gè)體中HIV特異性的CTL反應(yīng)，其中該個(gè)體已在體內(nèi)逃避了那些反應(yīng)。由于預(yù)期能夠鑒定具有或不具有對(duì)其HLA的關(guān)鍵逃避突變的個(gè)體，這將使得STI能夠給予那些最可能從中獲利的個(gè)體。類(lèi)似地，個(gè)體化的藥物選擇和治療時(shí)間選擇的研究可由該數(shù)據(jù)提供信息?；A(chǔ)和定期的治療后RT和蛋白酶抗性基因分型目前已變?yōu)槭顾幬镏委熥钸m化的標(biāo)準(zhǔn)，同樣地，對(duì)重要逃避突變的病毒基因分型在將來(lái)可大大增強(qiáng)抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的個(gè)體化。
實(shí)施例3群體水平上HIV-1對(duì)HLA-限定的免疫反應(yīng)的適應(yīng)的證據(jù)HIV-1 RT中的多態(tài)率和功能限制對(duì)HIV-1 RT中單個(gè)殘基上的多態(tài)率和該殘基已知的功能特征之間的關(guān)系進(jìn)行了檢查(1)。HIV-1 RT中重要催化殘基(n＝3，0.53％)、穩(wěn)定性殘基(n＝37，1.06％)和有功能的殘基(n＝11，3.05％)上的多態(tài)率低于外部殘基(n＝10，5.95％)上的多態(tài)率(P＝0.0009，Wilcoxon)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 能力計(jì)算方法、協(xié)變量選擇程序和隨機(jī)化程序在下文中詳細(xì)描述。
在單個(gè)氨基酸上分析的步驟—以HIV-1 RT位置135為例將在HIV-1 RT位置135上對(duì)群體序列一致氨基酸(異亮氨酸)的任何替代即I135x設(shè)定為結(jié)果/反應(yīng)變量。起始的協(xié)變量/解釋性變量為存在于所有個(gè)體中的HLA-A和-B等位基因(n＝473)A1、A2、A3、A9、A10、A11、A19、A28、A31、A36、B5、B7、B8、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B21、B22、B27、B35、B37、B40、B41、B42、B55、B56、B58、B60和B61。對(duì)血清學(xué)定義的寬等位基因而不是由基于高分辨率DNA序列的分型定義的亞型進(jìn)行了考慮，從而可包括群體中所有個(gè)體的數(shù)據(jù)。此外，對(duì)于HIV-1 RT中幾個(gè)已發(fā)表的CTL表位，高分辨率分型水平的HLA限定表位是未知的。
步驟1-能力計(jì)算正式的能力計(jì)算在開(kāi)始即有效排除了任何這樣的HLA等位基因/位置組合，即對(duì)于該組合沒(méi)有實(shí)際檢查關(guān)聯(lián)性的足夠統(tǒng)計(jì)學(xué)能力(由于多態(tài)的稀少、HLA的稀少或兩者)。這在相當(dāng)大程度上限制了協(xié)變量的數(shù)目，并因此限制了在模型中進(jìn)行的比較的數(shù)目。能力計(jì)算也正式地鑒定了哪些關(guān)聯(lián)性不能由我們的分析排除且需要在較大數(shù)據(jù)組中進(jìn)行檢查。將標(biāo)準(zhǔn)公式用于能力計(jì)算中(2)。將具有每一個(gè)HLA等位基因和具有I135x的患者數(shù)目用于計(jì)算探測(cè)具有比值比(OR)為2(正關(guān)聯(lián)性)或0.5(負(fù)關(guān)聯(lián)性)的關(guān)聯(lián)性的能力。將具有低于30％的能力的HLA等位基因去除。在位置135去除的等位基因?yàn)锳31、A36、B42、B55、B56、B58和B61。重要的是要注意我們探測(cè)負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力低于探測(cè)正關(guān)聯(lián)性的能力。例如，在10.9的平均HLA頻率和4.0％的平均多態(tài)時(shí)，探測(cè)2.0的OR(即正關(guān)聯(lián)性)的能力為30％，但探測(cè)等價(jià)的0.5 OR的負(fù)關(guān)聯(lián)性的能力僅為5.6％。
步驟2對(duì)具有和不具有每一個(gè)HLA等位基因及具有和不具有I135x的個(gè)體數(shù)目進(jìn)行了計(jì)算。為了去除可導(dǎo)致不穩(wěn)定的Logistic回歸模型的協(xié)變量，如果在任何比較群體中個(gè)體少于5個(gè)則將HLA等位基因去除。在位置135去除的等位基因?yàn)镠LA-B37、B41和B60。
步驟3然后用Fisher精確性檢驗(yàn)單獨(dú)估計(jì)與I135x相關(guān)聯(lián)的協(xié)變量，且僅將那些具有單變量P-值≤0.1的包括進(jìn)來(lái)用于將來(lái)的分析。去除的等位基因?yàn)锳1、A2、A3、A9、A11、A19、A28、B7、B8、B13、B14、B15、B16、B21、B22、B27和B35。
步驟4-正向選擇如果保留的協(xié)變量數(shù)目超過(guò)個(gè)體數(shù)目的10％，則將應(yīng)用Logistic回歸模型進(jìn)行正向選擇以選擇在分析中待保留的協(xié)變量?；趯?duì)添加的協(xié)變量的最小P-值對(duì)協(xié)變量進(jìn)行選擇直到數(shù)目等于患者數(shù)目的10％。在位置135，協(xié)變量的數(shù)目低于患者數(shù)目的10％，所以不需進(jìn)行選擇。
步驟5-反向消除然后實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的反向消除程序。使Logistic回歸模型適應(yīng)于剩余的協(xié)變量。如果在考慮了其他包括的協(xié)變量之后，協(xié)變量的任一P-值大于0.1，則將具有最大P-值的協(xié)變量去除并使Logistic模型再適化。將此過(guò)程重復(fù)直到所有協(xié)變量均具有低于0.1的P-值。在位置135，這去除了HLA等位基因B12、B17和B40。
步驟6-精確的P-值為了容納相對(duì)小的樣本，“精確的”P(pán)-值基于隨機(jī)化檢驗(yàn)而不是通常的大樣本估計(jì)(3)。在該程序中，使最終的協(xié)變量組在個(gè)體中隨機(jī)排列，并對(duì)每一個(gè)排列計(jì)算與I135x相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。對(duì)每一個(gè)模型生成了1000個(gè)隨機(jī)的排列，并且P-值基于檢驗(yàn)值的適當(dāng)百分比的程度比基于實(shí)際數(shù)據(jù)的百分比的程度更大。對(duì)每一個(gè)協(xié)變量計(jì)算了該協(xié)變量在隨機(jī)數(shù)據(jù)組中具有的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量相對(duì)于實(shí)際數(shù)據(jù)中具有的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的倍數(shù)比例。該比例給出了隨機(jī)化的(精確的)P-值。將具有大于0.05的精確P-值的關(guān)聯(lián)性依次去除，并將那些P-值低于0.05的認(rèn)為是顯著的。在位置135，這去除了等位基因HLA-A10和-B18，剩余HLA-B5作為與I135x的顯著關(guān)聯(lián)性。
對(duì)多重比較的校正為了突出顯著的HLA關(guān)聯(lián)性，該關(guān)聯(lián)性的P-值對(duì)在整個(gè)分析中進(jìn)行的比較數(shù)目進(jìn)行了校正(即一個(gè)較高特異性但較低靈敏性的非常低的P-值截止點(diǎn))，對(duì)每一個(gè)HLA等位基因生成了校正因子。分別考慮正關(guān)聯(lián)性和負(fù)關(guān)聯(lián)性。如上所述從最初的數(shù)據(jù)組中生成了1000個(gè)隨機(jī)化的數(shù)據(jù)組。然后對(duì)每一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行完整選擇過(guò)程(包括初始模型縮減程序)，并計(jì)算每一個(gè)HLA等位基因所有位置上的顯著關(guān)聯(lián)性總數(shù)目。例如，對(duì)于HLA-A2，在每個(gè)隨機(jī)數(shù)據(jù)組中所有殘基上平均有1.827個(gè)正HLA-A2關(guān)聯(lián)性。將該數(shù)字除以0.05得到HLA-A2的多重比較校正因子(x)。該校正因子是實(shí)施的“獨(dú)立”檢驗(yàn)的估計(jì)的等價(jià)數(shù)字。將校正因子應(yīng)用于用Bonferroni校正公式[即p*＝1-(1-p)x，其中p是來(lái)自應(yīng)用實(shí)際數(shù)據(jù)的模型的P-值，x是校正因子，且p*是校正的P-值]在實(shí)際數(shù)據(jù)中計(jì)算的P-值。
實(shí)際數(shù)據(jù)對(duì)隨機(jī)化數(shù)據(jù)的總P-值通過(guò)考慮在每一個(gè)位置上的單獨(dú)檢驗(yàn)的總和相對(duì)于從隨機(jī)化的數(shù)據(jù)組中獲得的該總和值的極端性而獲得所有位置上所有關(guān)聯(lián)性的總P-值。對(duì)應(yīng)用實(shí)際數(shù)據(jù)的所有等位基因進(jìn)行的所有模型的所有檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的總和進(jìn)行了計(jì)算。對(duì)隨機(jī)化的數(shù)據(jù)組進(jìn)行相同的計(jì)算。對(duì)于1000個(gè)隨機(jī)數(shù)據(jù)組，該數(shù)字均不大于實(shí)際數(shù)據(jù)，從而給出總P-值＜1/1000或＜0.001。
“已知”的CTL表位中關(guān)聯(lián)性的顯著性我們進(jìn)行了分析以確定在“相應(yīng)的”已知CTL表位(即限制于相同HLA等位基因的)中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)至少15個(gè)顯著正關(guān)聯(lián)性的概率。如果顯著的HLA關(guān)聯(lián)性在殘基中隨機(jī)發(fā)生，那么HLA關(guān)聯(lián)性在限定于該等位基因的已知CTL表位中發(fā)生的概率等于處于該表位中的所有殘基的相對(duì)比例。于是已知表位中的顯著關(guān)聯(lián)性的總數(shù)目是不相等的二項(xiàng)式變量的總和，該變量的分布可通過(guò)例如模擬進(jìn)行估計(jì)。與15個(gè)觀(guān)察值相比，基于隨機(jī)假說(shuō)在已知的表位中僅預(yù)期有4.27個(gè)顯著的正關(guān)聯(lián)性。對(duì)此估計(jì)的P-值為＜0.001。
實(shí)施例4對(duì)CTL表位鑒定的證實(shí)應(yīng)用在此處描述的方法，本發(fā)明者能夠鑒定各種CTL表位。自從提交臨時(shí)申請(qǐng)和提交完整申請(qǐng)以來(lái)，其他研究組已獨(dú)立地報(bào)道了許多這種表位，如在HIV反轉(zhuǎn)錄酶位置117和126之間已描述了HLA-A11限定的CTL表位(B.Sriwanthana等人，Hum Retroviruses 17，719-34(2001))。臨時(shí)申請(qǐng)鑒定了HIV反轉(zhuǎn)錄酶位置122的HLA-A11關(guān)聯(lián)性。在隨后發(fā)表的CTL表位中同樣也鑒定了下面的關(guān)聯(lián)性HLA-A3限定的CTL表位RT中位于101的HLA-A3(93-101；C.Brander和P.Goulder，HIV MolecularImmunology Database.B.T.M.Korber等人，Eds.New Mexico 2001)；HLA-A*3002表位中位于178的HLA-A19(30)(173-181；C.Brander和P.Goulder，HIV Molecular Immunology Database，B.T.M.Korber等人，Eds.New Mexico，2001；和P.Gouder等人，J.Virol 75(3)，1339-47(2001))和HLA-B*4001限定的CTL表位中位于207的HLA-B40(202-210；C.Brander和P.Goulder，HIV Molecular ImmunologyDatabase，B.T.M.Korber等人，Eds.New Mexico 2001)。
實(shí)施例5治療劑開(kāi)發(fā)HIV及祖先反轉(zhuǎn)錄病毒已在來(lái)自HLA(或MHC)限定的免疫反應(yīng)的強(qiáng)大選擇壓力下進(jìn)行了進(jìn)化。HIV具有高度動(dòng)態(tài)的和易于出錯(cuò)的復(fù)制現(xiàn)象，且該HLA限定的選擇壓力的證據(jù)可在單獨(dú)的患者和在群體水平上觀(guān)察到。在研究的473個(gè)西澳大利亞患者中，沒(méi)有兩個(gè)患者具有相同的HIV反轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列。多態(tài)在具有較低功能性或結(jié)構(gòu)限制的位點(diǎn)上是最明顯的，且經(jīng)常與特定的宿主I型HLA等位基因相關(guān)聯(lián)。在這些HLA-相關(guān)聯(lián)的病毒多態(tài)上具有逃避突變的患者具有較高的HIV病毒負(fù)載。該信息顯示了在感染后何種HIV肽(表位)可刺激針對(duì)病毒的最強(qiáng)保護(hù)性免疫反應(yīng)。如果在暴露于病毒前在疫苗中給予，那么這些相同的表位則應(yīng)該提供最強(qiáng)的保護(hù)。
由預(yù)防性HIV疫苗提供的保護(hù)作用將依賴(lài)于由該治療劑引起的HLA限定的免疫反應(yīng)的寬度和強(qiáng)度及感染性HIV序列逃避那些反應(yīng)的程度。目的是(1.)治療劑誘導(dǎo)最大數(shù)目和最大強(qiáng)度的HLA-限定的CTL反應(yīng)；和(2.)在治療劑表位和入侵病毒表位之間具有最大數(shù)目的相同匹配(或者病毒表位至少與治療劑表位足夠相似，從而仍然可由治療劑誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)識(shí)別)。
傳統(tǒng)的方法已嘗試包括保守的表位—在所有HIV變體中不變地存在的長(zhǎng)度為8-12個(gè)氨基酸的病毒蛋白質(zhì)片段。然而，在此處提供的研究顯示病毒及其祖先已在來(lái)自HLA-限定的免疫反應(yīng)的強(qiáng)大選擇壓力下進(jìn)行了進(jìn)化，因此不太可能具有由共同的HLA類(lèi)型識(shí)別的保守表位。
對(duì)具有全長(zhǎng)測(cè)序的前80個(gè)患者的初步分析揭示了所有蛋白質(zhì)中的HLA特異性關(guān)聯(lián)性，以及在這些殘基的逃避與較高的治療前病毒負(fù)載相關(guān)聯(lián)。最強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性及其與HIV病毒負(fù)載的關(guān)系在表6中顯示。圖5顯示病毒對(duì)HLA-限定的反應(yīng)的適應(yīng)程度和病毒負(fù)載之間的關(guān)系。HLA-限定的關(guān)聯(lián)性的數(shù)目和強(qiáng)度及這些解釋治療前病毒負(fù)載中可變性的程度將增加，因?yàn)榭梢垣@得大量患者的數(shù)據(jù)。
表6

圖5顯示了病毒對(duì)HLA-限定的反應(yīng)的適應(yīng)程度和病毒負(fù)載之間的關(guān)系。
進(jìn)行模擬以確定不同預(yù)防性疫苗候選物的可能功效，其是通過(guò)假定使具有與HIV陽(yáng)性西澳大利亞群體相同HLA多樣性的HIV陰性目標(biāo)群體暴露于與在西澳大利亞HIV陽(yáng)性群體中觀(guān)察到的相同的病毒多樣性中而實(shí)現(xiàn)的。換句話(huà)說(shuō)，對(duì)具有與249個(gè)HIV陽(yáng)性西澳大利亞患者相同HLA類(lèi)型的假設(shè)的249個(gè)HIV陰性患者群體進(jìn)行了檢查。對(duì)第一個(gè)HIV陰性患者暴露于在第一個(gè)HIV感染患者中測(cè)序的病毒的概率進(jìn)行考慮，然后對(duì)暴露于第二個(gè)HIV陽(yáng)性患者中的病毒進(jìn)行考慮，依此類(lèi)推直到考慮了所有80個(gè)病毒序列。將該過(guò)程對(duì)第二個(gè)假設(shè)的HIV陰性患者進(jìn)行重復(fù)，依此類(lèi)推直到考慮了所有249個(gè)HIV陰性被試者。
在圖6所示的第一個(gè)分析中，本發(fā)明者對(duì)每一個(gè)潛在的治療性候選物計(jì)算了在該治療劑中存在多少有利的氨基酸殘基(即在陽(yáng)性HLA關(guān)聯(lián)性的一致序列以及治療劑和入侵病毒之間的匹配，或者在陰性HLA關(guān)聯(lián)性的第二最常見(jiàn)的殘基以及該第二最常見(jiàn)的殘基和入侵病毒之間的匹配)。下文所示的最適化的疫苗序列在除那些具有主要的陰性HLA關(guān)聯(lián)性的殘基之外的所有殘基上應(yīng)用群體一致序列，而在具有主要的陰性HLA關(guān)聯(lián)性的情況中應(yīng)用群體中第二最常見(jiàn)的殘基。
最適的治療劑序列(基因加下劃線(xiàn)。這些基因編碼的蛋白質(zhì)為斜體。Gag、pol和envelope編碼幾個(gè)蛋白質(zhì)。其他基因僅編碼一種具有與該基因相同名稱(chēng)的蛋白質(zhì)。)(i)Gag(p17、p24、p2、p7、p1、p6)(SEQ ID NO2)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的Gag(p17、p24、p2、p7、p1、p6)氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELKSLYNTVATLYCVHQRIEVKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGNSSQVSQNYPIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFR
DYVDKFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNSATIMMQRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRFGEETTTPSQKQEPIDKELYPLASLRSLFGNDPSSQ(ii)Pol(整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶)(SEQ ID NO3)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的Pol(整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶)氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)FFRENLAFPQGKAREFSSEQTRANSPTRRELQVWGEDNNSTSEAGADRQGTVSFSFPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQIIIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQLGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLIDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGVVKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLKWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYAGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKIATESIVIWGKTPKFKLPIQKETWEAWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTDRGRQKVVSLTDTTNQKTELQAIHLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVSQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAMASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKIILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKTIHTDNGSNFTSTTVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVVESMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTKELQKQITKIQNFRVYYRDSRDPLWKGPAKLLWKGEGAWIQDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVASRQDED
(iii)vif(SEQ ID NO4)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的vif氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MENRWQVMIVWQVDRMRIRTWKSLVKHHMYISKKAKGWFYRHHYESTHPRISSEVHIPLGDAKLVITTYWGLHTGERDWHLGQGVSIEWRKRRYSTQVDPDLADQLIHLYYFDCFSESAIRNAILGHIVSPRCEYQAGHNKVGSLQYLALAALITPKKIKPPLPSVTKLTEDRWNKPQKTKGHRGSHTMNGH(iv)vpr(SEQ ID NO5)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的vpr氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MEQAPEDQGPQREPYNEWTLELLEELKSEAVRHFPRIWLHGLGQHIYETYGDTWAGVEAIIRILQQLLFIHFRIGCQHSRIGITRQRRARNGASRS(v)tat(SEQ ID NO6)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的tat氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFIKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPVD(vi)rev(SEQ ID NO7)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的rev基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MAGRSGDSDEELLKTVRLIKFLYQSNPPPSPEGTRQARRNRRRRWRERQRQIRSISGWILSTYLGRPAEPVPLQLPPLERLTLDCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPAVLESGTKE*
(vii)Vpu(SEQ ID NO8)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的vpu氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MQPLEILAIVALVVAAIIAIVVWTIVFIEYRKILRQRKIDRLIDRIRERAEDSGNESEGEESALVEMGVEMGHHAPWDVDDL(viii)envelope(gp120、gp41)(SEQ ID NO9)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的envelope(gp120、gp41)氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MRVKGNNQHLWKWGWKWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEWLENVTENFNMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTDLNNDTNTNNTSGSNNMEKGEIKNCSFNITTSIRDKMQKEYALFYKLDWPIDNDNTSYRLISCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNDKKFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPWSTQLLLNGSLAEEEVVI RSENFTNNAKTIIVQLNESVEINCTRPNNNTRKSISIHIGPGRAFYATGEIGDIRQAHCNISRAEWNNTLKQIVKKLREQFGKNKTIVFNQSSGGDPEIVMHSFNCGGEFFYCNTTQLFNSTWNNSTWNTEESNNTEGNETITLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAPPIRGQIRCSSNITGLLLTRDGGNNNNKTETFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRWQREKRAVGIGAMFLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNTSWSNKSLNKIWDNMTWMEWEKEINNYTGIIYNLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDISKWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSSRLVDGFLAIIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEILKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRIIEVVQRACRAILHIPRRIRQGVERALL
(ix)nef(SEQ ID NO10)關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的nef氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)MGGKWSKSSMVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSFFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSQHGMDDPEREVLMWKFDSRLAFRHMARELHPEYYKDC在圖6所示的第二個(gè)分析中，應(yīng)用如在表6所示的病毒負(fù)載柱狀圖中估計(jì)的變化中所闡明的病毒結(jié)果計(jì)算估計(jì)的HLA-限定的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，該免疫反應(yīng)可由每一種治療劑誘導(dǎo)并針對(duì)每一個(gè)潛在的入侵病毒。
通常所研究的群體中一致序列的應(yīng)用減少但不消除由病毒多樣性引起的問(wèn)題，并且包含最大數(shù)目的HLA-A、B或C特異性病毒多態(tài)(特別是那些與基于逃避的病毒負(fù)載的較大增加相關(guān)聯(lián)的)預(yù)期可改善HLA-限定的反應(yīng)。
如此處在西澳大利亞群體中證明的可用全長(zhǎng)測(cè)序進(jìn)行治療劑設(shè)計(jì)以確定在治療劑中包括的最適的病毒部分。一旦設(shè)計(jì)了治療劑，那么可在進(jìn)行疫苗接種的目標(biāo)群體中重復(fù)這些分析(如美國(guó)、非洲或歐洲群體)，但這次在目標(biāo)群體中僅僅需要對(duì)在治療劑中包括的病毒的部分進(jìn)行測(cè)序以估計(jì)該群體中疫苗的功效(即具有不同的病毒和HLA多樣性)。
實(shí)施例6治療劑制備應(yīng)用上述在特定的目標(biāo)群體中估計(jì)潛在的疫苗候選物的治療功效的模型，確定了對(duì)于目標(biāo)HIV感染的西澳大利亞群體的單個(gè)最適氨基酸序列。在該情況中，HLA類(lèi)型和攻擊的病毒對(duì)于每一個(gè)患者均是已知的，因此人們可僅考慮HIV感染的群體且可使治療劑中非逃避的HLA-特異性殘基的數(shù)目最適化(即在正關(guān)聯(lián)性處的一致序列和在負(fù)關(guān)聯(lián)性處的第二最常見(jiàn)的殘基)。應(yīng)用這些技術(shù)，可在這樣和相似的群體中預(yù)防HIV感染時(shí)選擇上述序列(即蛋白質(zhì)Gag(p17、p24、p2、p7、p1、p6)(SEQID NO2)、Pol(整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶)(SEQ ID NO3)、vif(SEQ ID NO4)、vpr(SEQ ID NO5)、tat(SEQ ID NO6)、rev(SEQ ID NO7)、vpu(SEQ ID NO8)、envelope(gp120、gp41)(SEQID NO9)和nef(SEQ ID NO10))。
1.治療HIV特異性免疫反應(yīng)的治療劑在治療開(kāi)始時(shí)，從每一個(gè)患者中獲取血液樣品以用于HIV測(cè)序和HLA分型，從而應(yīng)用源自我們基于群體的分析的HLA-病毒多態(tài)關(guān)聯(lián)性確定已逃避了HLA-限定的免疫反應(yīng)的那些殘基和因此的那些病毒群體。
盡管疫苗接種最好應(yīng)對(duì)那些尚未逃避的殘基和因此的病毒群體進(jìn)行個(gè)體化，但對(duì)于基于單一群體的疫苗，應(yīng)用了如下疫苗，該疫苗用治療前序列的正關(guān)聯(lián)性的一致殘基和在具有與常見(jiàn)等位基因主要負(fù)關(guān)聯(lián)性的殘基的第二最常見(jiàn)殘基進(jìn)行最適化。根據(jù)該例子，通過(guò)向患者引入一個(gè)或多個(gè)載體的方法對(duì)患者進(jìn)行免疫接種，該載體適合于表達(dá)疫苗的最適蛋白質(zhì)序列。盡管該載體可表達(dá)所有下述蛋白質(zhì)Gag(p17、p24、p2、p7、p1、p6)(SEQ ID NO2)、Pol(整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶)(SEQ ID NO3)、vif(SEQ ID NO4)、vpr(SEQ ID NO5)、tat(SEQ ID NO6)、rev(SEQ ID NO7)、vpu(SEQ ID NO8)、enyelope(gp120、gp41)(SEQ ID NO9)和nef(SEQ ID NO10)，但該疫苗優(yōu)選地僅包含以下蛋白質(zhì)Gag(p17、p24、p2、p7、p1、p6)(SEQ IDNO2)、Pol(整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶)(SEQ ID NO3)和nef(SEQID NO10)。
疫苗向患者中的送遞可用禽痘病毒載體(或任何其他適合于將蛋白質(zhì)序列送遞入患者中的載體)實(shí)現(xiàn)。這是通過(guò)眾所周知和標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，該技術(shù)包括編碼用于疫苗中的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的分離。然后將核苷酸序列插入到載體(如禽痘病毒)中，然后以導(dǎo)致該蛋白質(zhì)在患者中表達(dá)的方式和濃度送遞入患者中。
如果選擇用于疫苗中的HIV序列不編碼提及的特定序列，那么可用分子生物學(xué)中眾所周知的和充分理解的技術(shù)對(duì)該序列進(jìn)行修飾(參見(jiàn)Ausubel，F(xiàn).、Brent，R.、Kingston，R.E.、Moore，D.D.、Seidman，J.G.、Smith，J.A.、Struhl，K.，Current protocols in molecular biology.Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences，New York，在此處將其內(nèi)容引入作為參考)，該技術(shù)包括例如定點(diǎn)誘變技術(shù)。
2.在有效的高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中當(dāng)HIV抗原消退時(shí)維持HIV特異性免疫反應(yīng)的疫苗根據(jù)本方法，在治療開(kāi)始時(shí)從每一個(gè)患者中獲取血液樣品以用于HIV測(cè)序和HLA分型，從而應(yīng)用源自我們基于群體的分析的HLA-病毒多態(tài)關(guān)聯(lián)性確定已逃避了HLA-限定的免疫反應(yīng)的那些殘基和因此的那些病毒群體。用于實(shí)施本分析的方法在上文描述。
然后將患者暴露于HAART中以抑制HIV復(fù)制，從而降低維持HIV抗原特異性免疫反應(yīng)的HIV抗原的可利用性。HAART治療中應(yīng)用的方案依賴(lài)于待治療的患者。醫(yī)生將基于患者中感染的水平、患者的健康等采用適當(dāng)?shù)姆桨浮?br> 在HAART治療過(guò)程中，對(duì)病毒負(fù)載進(jìn)行了定時(shí)監(jiān)控以測(cè)量治療作用。一旦病毒負(fù)載充分地消退了，則根據(jù)前面的例子將患者置于疫苗接種規(guī)程中，該規(guī)程導(dǎo)致禽痘病毒載體向患者中的送遞，該載體編碼一種或多種應(yīng)用于由上述方法鑒定的最適化疫苗中的蛋白質(zhì)。送遞入患者中的治療劑優(yōu)選至少編碼如在此處描述的pol、gag和nef蛋白質(zhì)，然而應(yīng)理解的是治療劑的精確組成將依賴(lài)于治療醫(yī)生的確切需要而變化。
3在高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中防止或延遲患者中抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性突變發(fā)生的疫苗。
抗反轉(zhuǎn)錄病毒組合治療(ART)已導(dǎo)致了HIV-1死亡率降低60％，并對(duì)那些感染者提供了極大的希望。然而藥物抗性的發(fā)展是它在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家提供長(zhǎng)期利益的主要障礙。目前治療后對(duì)HIV藥物的抗性是常見(jiàn)的，其中美國(guó)和象牙海岸的研究證明超過(guò)50％的受治療的患者對(duì)HIV具有一些抗性。
疫苗接種旨在防止疾病狀態(tài)的發(fā)生，且在整體上已對(duì)整個(gè)社會(huì)和人類(lèi)提供了無(wú)數(shù)利益。僅在最近才對(duì)在那些已由特定疾病感染的中進(jìn)行疫苗接種的作用進(jìn)行估計(jì)，尤其是與HIV-1相關(guān)的。在那些已由HIV-1感染的個(gè)體中防止或延遲藥物抗性發(fā)展的疫苗可對(duì)患有該疾病的數(shù)百萬(wàn)人提供顯著的利益。
HIV感染的患者中治療性疫苗的臨床優(yōu)勢(shì)迄今是令人失望的，這潛在地是因?yàn)榛颊咭驯┞队谝呙缈乖?，且疫苗表位逃避HLA-限定的免疫反應(yīng)的程度是可變的?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒抗性突變對(duì)于患者是有害的，但在該情況中該患者尚未暴露于該抗原。應(yīng)用充分免疫原性的疫苗如DNA/禽痘病毒致敏/強(qiáng)化疫苗能夠提供高水平的T細(xì)胞免疫原性。治療性疫苗已根據(jù)下面的原則進(jìn)行了設(shè)計(jì)1.編碼共同的抗性突變2.編碼推定的“適合性突變”，其中這些突變不與共同的關(guān)鍵突變相干涉3.盡可能應(yīng)用完整蛋白質(zhì)，但避免長(zhǎng)的野生型氨基酸片段，這是因?yàn)閷?duì)野生型序列的反應(yīng)是相對(duì)不想要的4.應(yīng)用實(shí)施例1中描述的最優(yōu)的一致序列樣序列作為主鏈(即不是抗反轉(zhuǎn)錄病毒抗性突變的殘基上的氨基酸)?？赡艿脑?huà)(如蛋白酶)應(yīng)用已知可正確折疊的主鏈(如真實(shí)的分離物)，這是因?yàn)榭乖€(wěn)定性可更好。
5.在抗性突變密切靠近時(shí)(＜4個(gè)氨基酸)，生成僅表達(dá)單個(gè)抗性表位的分離片段，這是因?yàn)閷?duì)含有2個(gè)抗性突變的表位的反應(yīng)是相對(duì)不想要的6.對(duì)于含有單個(gè)突變的片段，在每一側(cè)編碼7個(gè)氨基酸以增強(qiáng)發(fā)展CD8T細(xì)胞對(duì)編碼的突變的反應(yīng)和降低對(duì)野生型序列反應(yīng)的可能性
7.然而，編碼盡可能少的分離片段，這是因?yàn)閷?duì)2個(gè)片段的重疊氨基酸序列(無(wú)關(guān)表位)的反應(yīng)是不想要的8.盡可能多地分離含有相同編碼序列的片段，從而減少構(gòu)建過(guò)程中的重組可能性應(yīng)用這些原則已發(fā)展了下面的治療劑序列(如在圖7和8中闡明的)蛋白酶疫苗關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的蛋白酶氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)最適的CTL和藥物疫苗PQITLWQRPIVTIKIGGQLREALLDTGADNTVLEEMNLPGRWKPKIIGGVGGFIKVRQYDQIPIEICGH KAIGTVLVGPTPANIIGRNLMTQIGCTLNFGRWKPKMIVGIGGLIKVRQY DQLVGPTPVNVIGRNLLTQ(SEQ ID NO11)具有群體一致氨基酸序列的相同肽PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQIPIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQLVGPTPVNIIGRNLLTQ(SEQ ID NO12)RT疫苗關(guān)于前述的分析，已闡明了下面的RT氨基酸序列，該序列預(yù)期可對(duì)在本研究中檢查的群體提供最適的CTL誘導(dǎo)的治療性保護(hù)最適的CTL和藥物疫苗LVEICTELEKEGKISTPVFAIKRKDSTRWRKLVDFDIVIYQYVDDLYVGSHLLKWGFYTPDKKHQICTEMEKDGKISKIGAIKKKDSDKWRKVVDFRELN
QLGIPHPGGLKKNKSVTVLDVGDAYFSIPLDKDFRYQYNVLPMGWKGSPAQNPDIVICQYMDDLYVASDLEIGQHRTKIEELRQHLWKWGFFTPDQKHQKEPP(SEQ ID NO13)具有群體一致氨基酸序列的相同肽LVEICTEMEKEGKISTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFDIVIYQYMDDLYVGSHLLKWGFTTPDKKHQICTEMEKEGKISKIGAIKKKDSTKWRKLVDFRELNQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRYQYNVLPQGWKGSPAQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKI EELRQHLLKWGFTTPDKKHQKEPP(SEQ ID NO14)目的是當(dāng)出現(xiàn)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物抗性突變時(shí)使治療劑構(gòu)建體與生成的新表位匹配。
理想地將對(duì)每一個(gè)患者中自身的病毒進(jìn)行測(cè)序，并在治療劑構(gòu)建體(即對(duì)每一個(gè)患者個(gè)體化的疫苗)中應(yīng)用除特征性藥物抗性突變引入特性之外在各方面均相同的病毒。然而，這種方法這時(shí)將是費(fèi)力且不實(shí)際的(每一個(gè)疫苗必須單獨(dú)檢驗(yàn)和獲得批準(zhǔn))。與上述方法相似但不相同的治療劑模型可用于確定目標(biāo)HIV感染的西澳大利亞群體中的單個(gè)最優(yōu)氨基酸序列。在該情況中，HLA類(lèi)型和攻擊的病毒對(duì)于每一個(gè)患者均是已知的，因此我們僅考慮HIV感染的群體，且使疫苗中非逃避的HLA-特異性殘基的數(shù)目最優(yōu)化(即在正關(guān)聯(lián)處的一致序列和在負(fù)關(guān)聯(lián)處的第二最常見(jiàn)殘基)。
根據(jù)該例子，通過(guò)向患者引入一個(gè)或多個(gè)載體的方法對(duì)患者進(jìn)行免疫接種，該載體適合于表達(dá)疫苗的最優(yōu)蛋白質(zhì)序列。
除非另有說(shuō)明，涉及核酸技術(shù)的反應(yīng)和操作均如通常描述于Sambrook等人，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press的方法那樣進(jìn)行。
首先構(gòu)建含有編碼上述蛋白酶和RT氨基酸序列的cDNA的禽痘病毒載體。應(yīng)以下面的方式將編碼前述氨基酸序列的cDNA序列插入，以確保該序列當(dāng)引入到患者中時(shí)將表達(dá)。該載體也可含有所有實(shí)現(xiàn)該序列想要的轉(zhuǎn)錄所必需的所有表達(dá)元件。在載體中也可包含其他有利的特征，如以不同形式回收核酸的機(jī)制。
然后將構(gòu)建的載體通過(guò)本領(lǐng)域中各種公知的方法中的任何一種引入到細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化的方法可發(fā)現(xiàn)于Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1992)；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1989)；Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)；Vega等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)和Gilboa等人(1986)中，且包括例如穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔和用重組病毒載體的感染。
實(shí)施例7用于治療HIV感染的治療性氨基酸序列的額外特定例子根據(jù)實(shí)施例1和2中的方法揭示了下面的氨基酸序列，該氨基酸序列提供了對(duì)具有提及的特定HLA關(guān)聯(lián)性的HIV感染個(gè)體進(jìn)行特定治療的手段。
(i)FLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAM(SEQ ID NO15)和HLA-B*4402蛋白質(zhì)整合酶在具有HLA-B*4402的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置11發(fā)生一致氨基酸谷氨酸(E)的氨基酸殘基改變，該改變頻率大于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝166，P-值＜0.0001)。此外，在整合酶位置11具有谷氨酸之外的氨基酸的HLA-B*4402陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有谷氨酸的HLA-B*4402陽(yáng)性患者相比，具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置11包括一致氨基酸谷氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸天冬氨酸(D)相比可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列FLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAM(SEQ ID NO15)如果包括于治療劑中則可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列FLDGIDKAQEDHEKYHSNWRAM(SEQ ID NO16)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列FLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAM(SEQ ID NO15)預(yù)期含有HLA-B*4402限定的CTL表位。
(ii)GKWSKSSMVGWPAVRERMRRAEP(SEQ ID NO17)和HLA-C*0701蛋白質(zhì)nef在具有HLA-C*0701的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置14發(fā)生一致氨基酸脯氨酸(P)的氨基酸殘基改變，該改變頻率大于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝6.8，P-值＝0.0001)。此外，在nef位置14具有脯氨酸之外的氨基酸的HLA-C*0701陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有脯氨酸的HLA-C*0701陽(yáng)性患者相比，具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置14包括一致氨基酸脯氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸絲氨酸(S)相比可提供對(duì)HLA-C*0701陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列GKWSKSSMVGWPAVRERMRRAEP(SEQ ID NO17)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-C*0701陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列GKWSKSSMVGWSAVRERMRRAEP(SEQ ID NO18)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列GKWSKSSMVGWPAVRERMRRAEP(SEQ ID NO17)預(yù)期含有HLA-C*0701限定的CTL表位。
(iii)AQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYK(SEQ ID NO19)和HLA-B*0702蛋白質(zhì)nef在具有HLA-B*0702的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置71發(fā)生一致氨基酸精氨酸(R)的氨基酸殘基改變，所述改變頻率大于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝19.4，P-值＝0.0002)。此外，在nef位置71具有精氨酸之外的氨基酸的HLA-B*0702陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有精氨酸的HLA-B*0702陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置71包括一致氨基酸精氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸賴(lài)氨酸(K)相比可提供對(duì)HLA-B*0702陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列AQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYK(SEQ ID NO19)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-B*0702陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列AQEEEEVGFPVKPQVPLRPMTYK(SEQ ID NO20)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列AQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYK(SEQ ID NO19)預(yù)期含有HLA-B*0702限定的CTL表位。
(iv)SFRFGEETTTPSQKQEPIDKENY(SEQ ID NO21)和HLA-B*4402蛋白質(zhì)p6在具有HLA-B*4402的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置25發(fā)生一致氨基酸絲氨酸(S)的氨基酸殘基改變，所述改變頻率大于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝66.3，P-值＝0.0003)。此外，在p6位置25具有絲氨酸之外的氨基酸的HLA-B*4402陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有絲氨酸的HLA-B*4402陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置25包括一致氨基酸絲氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸脯氨酸(P)相比，可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列SFRFGEETTTPSQKQEPIDKENY(SEQ ID NO21)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列SFRFGEETTTPPQKQEPIDKENY(SEQ ID NO22)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列SFRFGEETTTPSQKQEPIDKENY(SEQ ID NO21)預(yù)期含有HLA-B*4402限定的CTL表位。
(v)RIGCQHSRIGIIRQRRARNGASR(SEQ ID NO23)和HLA-DRB1-0701
蛋白質(zhì)vpr在具有HLA-DRB1-0701的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更不經(jīng)常地在位置84發(fā)生一致氨基酸蘇氨酸(T)的氨基酸殘基改變，該改變頻率低于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝0.03，P-值＝0.0005)。此外，在vpr位置84具有蘇氨酸之外的氨基酸的HLA-DRB1-0701陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有蘇氨酸的HLA-DRB1-0701陽(yáng)性患者相比，具有降低的病毒負(fù)載。因此，在位置84包括在HLA-DRB1-0701患者中發(fā)現(xiàn)的除一致氨基酸之外最常見(jiàn)的氨基酸異亮氨酸(I)的治療劑與一致氨基酸蘇氨酸相比可提供對(duì)HLA-DRB1-0701陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列RIGCQHSRIGIIRQRRARNGASR(SEQ ID NO23)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-DRB1-0701陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列RIGCQHSRIGITRQRRARNGASR(SEQ ID NO24)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列RIGCQHSRIGIIRQRRARNGASR(SEQ IDNO23)預(yù)期含有HLA-DRB1-0701限定的CTL表位。
(vi)KTIHTDNGSNFTSTTVKAACWWA(SEQ ID NO25)和HLA-C*0501蛋白質(zhì)整合酶在具有HLA-C*0501的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置122發(fā)生一致氨基酸蘇氨酸(T)的氨基酸殘基改變，該改變頻率高于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝17.2，P-值＝0.0005)。此外，在整合酶位置122具有蘇氨酸外的氨基酸的HLA-C*0501陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有蘇氨酸的HLA-C*0501陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置122包括一致氨基酸蘇氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸異亮氨酸(I)相比，可提供對(duì)HLA-C*0501陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列KTIHTDNGSNFTSTTVKAACWWA(SEQ ID NO25)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-C*0501陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列KTIHTDNGSNFISTTVKAACWWA(SEQ ID NO26)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列KTIHTDNGSNFTSTTVKAACWWA(SEQ IDNO25)預(yù)期含有HLA-C*0501限定的CTL表位。
(vii)TGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIG(SEQ ID NO27)和HLA-DRB1-1302蛋白質(zhì)蛋白酶在具有HLA-DRB1-1302的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置37發(fā)生一致氨基酸天冬酰胺(N)的氨基酸殘基改變，該改變頻率高于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝20.0，P-值＝0.0006)。此外，在蛋白酶位置37具有天冬酰胺之外的氨基酸的HLA-DRB1-1302陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有天冬酰胺的HLA-DRB1-1302陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置37包括一致氨基酸天冬酰胺的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸絲氨酸(S)相比，可提供對(duì)HLA-DRB1-1302陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列TGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIG(SEQ ID NO27)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-DRB1-1302陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列TGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIG(SEQ ID NO28)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列TGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIG(SEQ IDNO27)預(yù)期含有HLA-C*0701限定的CTL表位。
(viii)GEETTTPSQKQEPIDKENYPLAS(SEQ ID NO29)和HLA-A*2402蛋白質(zhì)p6在具有HLA-A*2402的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置29發(fā)生一致氨基酸谷氨酸(E)的氨基酸殘基改變，該改變頻率高于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝9.4，P-值＝0.0008)。此外，在p6位置29具有谷氨酸之外的氨基酸的HLA-A*2402陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有谷氨酸的HLA-A*2402陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置29包括一致氨基酸谷氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸甘氨酸(G)相比可提供對(duì)HLA-A*2402陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列GEETTTPSQKQEPIDKENYPLAS(SEQ ID NO29)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-A*2402陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列GEETTTPSQKQGPIDKENYPLAS(SEQ ID NO30)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列GEETTTPSQKQEPIDKENYPLAS(SEQ ID NO29)預(yù)期含有HLA-A*2402限定的CTL表位。
(ix)WPVKTIHTDNGSNFTSTTVKAAC(SEQ ID NO31)和HLA-B*4402蛋白質(zhì)整合酶在具有HLA-B*4402的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置119發(fā)生一致氨基酸絲氨酸(S)的氨基酸殘基改變，該改變頻率高于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝273.6，P-值＝0.0009)。此外，在整合酶位置119具有絲氨酸之外的氨基酸的HLA-B*4402陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有絲氨酸的HLA-B*4402陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置119包括一致氨基酸絲氨酸的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸脯氨酸(P)相比可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列WPVKTIHTDNGSNFTSTTVKAAC(SEQ ID NO31)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-B*4402陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列WPVKTIHTDNGPNFTSTTVKAAC(SEQ ID NO32)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列WPVKTIHTDNGSNFTSTTVKAAC(SEQ IDNO31)預(yù)期含有HLA-B*4402限定的CTL表位。
(x)MQRGNFRNQRKTVKCFNCGK(SEQ ID NO33)和HLA-B*1801蛋白質(zhì)p7在具有HLA-B*1801的個(gè)體中比無(wú)該HLA等位基因的患者中更經(jīng)常地在位置9發(fā)生一致氨基酸谷氨酰胺(Q)的氨基酸殘基改變，該改變頻率高于隨機(jī)突變(在對(duì)其他HLA等位基因進(jìn)行調(diào)整后比值比＝30.5，P-值＝0.0010)。此外，在p7位置9具有谷氨酰胺之外的氨基酸的HLA-B*1801陽(yáng)性個(gè)體與那些在該位置具有谷氨酰胺的HLA-B*1801陽(yáng)性患者相比具有增加的病毒負(fù)載。因此，在位置9包括一致氨基酸谷氨酰胺的治療劑與這些患者中在該位置最常見(jiàn)的其他氨基酸脯氨酸(P)相比可提供對(duì)HLA-B*1801陽(yáng)性患者的保護(hù)。因此，氨基酸序列MQRGNFRNQRKTVKCFNCGK(SEQ ID NO33)如果包含于治療劑中則可提供對(duì)HLA-B*1801陽(yáng)性患者的保護(hù)，而序列MQRGNFRNPRKTVKCFNCGK(SEQ IDNO34)應(yīng)提供較少的保護(hù)(如果有任何保護(hù)的話(huà))。氨基酸序列MQRGNFRNQRKTVKCFNCGK(SEQ ID NO33)預(yù)期含有HLA-B*1801限定的CTL表位。
根據(jù)在此處公開(kāi)的程序，可制備包含一種或多種上述序列的治療組合物，且該組合物預(yù)期可用于治療具有鑒定的特定HLA關(guān)聯(lián)性的HIV感染患者。
鑒定的氨基酸序列可從商業(yè)上購(gòu)得，或者可根據(jù)蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中公知的且在此處不再贅述的眾所周知的技術(shù)制備。
實(shí)施例8HIV疫苗的臨床試驗(yàn)—在具有藥物抗性病毒的HIV-1陽(yáng)性患者中對(duì)針對(duì)突變表位的CD8和CD4 T-細(xì)胞反應(yīng)的估計(jì)。
本實(shí)施例描述了促進(jìn)HIV疫苗臨床試驗(yàn)的方案。進(jìn)行臨床試驗(yàn)的各種要素(包括患者的治療和監(jiān)控)根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是公知的。通常，在此處描述的治療劑的臨床研究應(yīng)由以下步驟組成向人類(lèi)被試者給予一種或多種在此處描述的多肽以估計(jì)安全性和細(xì)胞的、抗體的、體液的和其他臨床的反應(yīng)。將介紹下面的信息作為用于HIV疫苗臨床試驗(yàn)的一般指南。關(guān)于臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的信息也可獲得于American Foundation for AIDS Research’s HIV Experimental VaccineDirectory，第1卷，No.2，1998年6月。
根據(jù)WHO對(duì)臨床研究中參加者所限定的正常體檢和正常實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，被試者必須為健康的。被試者必須能夠理解并簽署同意書(shū)。被試者也必須具有正常的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)以及血紅蛋白和血細(xì)胞比容。被試者必須具有正常的下列參數(shù)值尿分析、BUN、肌酸酐、膽紅素、SGOT、SGPT、堿性磷酸酶、鈣、葡萄糖、CPK、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)和正常的血清免疫球蛋白特征。
以下是排除標(biāo)準(zhǔn)HIV-血清陽(yáng)性狀態(tài)；活性藥物或酒精濫用；不能提供同意書(shū)；可影響免疫功能的藥物，用于急性病癥如頭痛或外傷的低劑量的非處方強(qiáng)度的NSAIDS、阿司匹林或?qū)σ阴０被?acetaminophen)除外；在主要研究者看來(lái)可干擾完成研究或估計(jì)結(jié)果的任何情況。
該研究將為雙盲隨機(jī)化的。安慰劑為不具有滅活病毒顆粒的疫苗溶液。被試者將隨機(jī)分配到上述的一個(gè)疫苗途徑中。
劑量范圍給藥的劑量在約1.0μg-約50mg，隨后為約1.0μg-50mg的強(qiáng)化劑量，以研究其臨床安全性和免疫原性。
給藥對(duì)于每一個(gè)要檢驗(yàn)的給藥，該給藥方案為在0、30、60日給予一個(gè)劑量，在180日給予強(qiáng)化劑量。給藥途徑將為肌內(nèi)給藥。額外的給藥途徑可包括皮下、口腔、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)/肌內(nèi)、直腸內(nèi)/肌內(nèi)、鼻內(nèi)/皮下、直腸內(nèi)/皮下。
每一個(gè)給藥途徑的被試者數(shù)目對(duì)于每一個(gè)劑量水平，每一個(gè)給藥途徑中將有12個(gè)被試者。在這12個(gè)被試者中，8個(gè)將接受疫苗，而4個(gè)將接受不含滅活病毒顆粒的溶液。
臨床安全性的終點(diǎn)是沒(méi)有臨床、免疫學(xué)和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)改變的證據(jù)。免疫學(xué)功效的終點(diǎn)是產(chǎn)生對(duì)抗HIV的有效細(xì)胞、體液和抗體反應(yīng)的血清轉(zhuǎn)變。有效的免疫學(xué)細(xì)胞反應(yīng)可用對(duì)抗不同HIV進(jìn)化枝的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行研究。
根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，在此處公開(kāi)和請(qǐng)求專(zhuān)利保護(hù)的所有組合物和方法均無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)即可制備和實(shí)施。盡管本發(fā)明的組合物和方法已用優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可對(duì)在此處描述的組合物和方法及方法中的步驟和步驟順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特定地，顯而易見(jiàn)的是可用某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑替代在此處描述的試劑而同時(shí)實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。所有這種對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的替代和修飾均認(rèn)為在由附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
實(shí)施例9在具有特定HLA類(lèi)型的HIV感染患者中用于估計(jì)HIV對(duì)HLA-限定的免疫反應(yīng)的適應(yīng)的診斷應(yīng)用從前述基于群體的分析和在圖1-4和表6中獲得的信息可用于確定患者中依賴(lài)于其HLA類(lèi)型要測(cè)序的特定氨基酸序列，從而估計(jì)其HIV病毒逃避HLA-限定的免疫反應(yīng)的程度。該信息可用于使應(yīng)用的治療個(gè)體化并指導(dǎo)該治療的時(shí)間安排和類(lèi)型。通常，該治療目的應(yīng)防止HIV進(jìn)一步從HLA-限定的免疫反應(yīng)逃避或適應(yīng)于該免疫反應(yīng)。
根據(jù)本實(shí)施例，用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)合成技術(shù)合成了在實(shí)施例6中鑒定的序列。這種技術(shù)描述于Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；Ausubel，F(xiàn).，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.，Current Protocols in Molecular Biology.GreenePublishing Associates/Wiley Intersciences，New York。
一旦對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了測(cè)序，則根據(jù)首先在Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)中描述的方法，將它們方便地用于生成抗體。
然后將由上述方法制備的抗體用于如在Ausubel的第11章描述的ELISA測(cè)定，在此處將其公開(kāi)內(nèi)容引入作為參考。
根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，在此處公開(kāi)和請(qǐng)求專(zhuān)利保護(hù)的所有組合物和方法均無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)即可制備和實(shí)施。盡管本發(fā)明的組合物和方法已在優(yōu)選的實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是可對(duì)在此處描述的組合物和方法及方法中的步驟和步驟順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更特定地，顯而易見(jiàn)的是可用某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑替代在此處描述的試劑而同時(shí)實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。所有這種對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的替代和修飾均認(rèn)為在由附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
序列表<110>Epipop Pty Ltd<120>鑒定和開(kāi)發(fā)治療劑的方法<130>107263<160>35<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>163<212>PRT<213>HIV<400>1Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp1 5 10 15Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu20 25 30Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val35 40 45Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe50 55 60Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro65 70 75 80Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser85 90 95Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg
100 105 110Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr115 120 125Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu130 135 140Leu Arg Gln His Leu Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys145 150 155 160His Gln Lys<210>2<211>500<212>PRT<213>HIV<400>2Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp1 5 10 15Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys20 25 30His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro35 40 45Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu50 55 60Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn65 70 75 80
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1 5 10 15Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys20<210>22<211>23<212>PRT<213>HIV<400>22Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu1 5 10 15Pro Ile Asp Lys Glu Asn Tyr20<210>23<211>23<212>PRT<213>HIV<400>23Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gln Lys Gln Glu1 5 10 15Pro Ile Asp Lys Glu Asn Tyr20<210>24<211>23<212>PRT<213>HIV<400>24
Arg Ile Gly Cys Gln His Ser Arg Ile Gly Ile Ile Arg Gln Arg Arg1 5 10 15Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg20<210>25<211>23<212>PRT<213>HIV<400>25Arg Ile Gly Cys Gln His Ser Arg Ile Gly Ile Thr Arg Gln Arg Arg1 5 10 15Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg20<210>26<211>23<212>PRT<213>HIV<400>26Lys Thr Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Ser Thr Thr Val1 5 10 15Lys Ala Ala Cys Trp Trp Ala20<210>27<211>23<212>PRT<213>HIV<400>27
Lys Thr Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Ile Ser Thr Thr Val1 5 10 15Lys Ala Ala Cys Trp Trp Ala20<210>28<211>23<212>PRT<213>HIV<400>28Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg1 5 10 15Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly20<210>29<211>23<212>PRT<213>HIV<400>29Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser Leu Pro Gly Arg1 5 10 15Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly20<210>30<211>23<212>PRT<213>HIV
<400>30Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys1 5 10 15Glu Asn Tyr Pro Leu Ala Ser20<210>31<211>23<212>PRT<213>HIV<400>31Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Gly Pro Ile Asp Lys1 5 10 15Glu Asn Tyr Pro Leu Ala Ser20<210>32<211>23<212>PRT<213>HIV<400>32Trp Pro Val Lys Thr Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Ser1 5 10 15Thr Thr Val Lys Ala Ala Cys20<210>33<211>23<212>PRT<213>HIV
<400>33Trp Pro Val Lys Thr Ile His Thr Asp Asn Gly Pro Asn Phe Thr Ser1 5 10 15Thr Thr Val Lys Ala Ala Cys20<210>34<211>20<212>PRT<213>HIV<400>34Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe1 5 10 15Asn Cys Gly Lys20<210>35<211>20<212>PRT<213>HIV<400>35Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Pro Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe1 5 10 15Asn Cys Gly Lys20
權(quán)利要求
1.一種確定宿主基因中的變異對(duì)具有蛋白質(zhì)替代的微生物的選擇的影響的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇被特定微生物感染的患者或動(dòng)物群體，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的內(nèi)在多態(tài)標(biāo)記對(duì)該群體中的所有個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在群體中于來(lái)自步驟(a)中鑒定的每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中多核苷酸和/或多肽的至少部分序列；(c)在群體中確定步驟(b)中分析的序列中每一個(gè)殘基位置上的一致(即最頻繁的)氨基酸；(d)對(duì)在步驟(a)和步驟(b)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以確定步驟(a)中的宿主多態(tài)序列如何在步驟(b)中確定的序列中的第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上增加或降低微生物多態(tài)的概率；(e)對(duì)步驟(b)中鑒定的每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)并比較獲得的數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(d)中應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是單變量的或多變量的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中將獲得的數(shù)據(jù)在多重Logistic回歸模型中進(jìn)行分型，其中在該模型中步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)可用作解釋性協(xié)變量，而將步驟(b)中獲得的數(shù)據(jù)用作結(jié)果變量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中對(duì)于目標(biāo)結(jié)果，可向多態(tài)分配一個(gè)值如一(1)，且可向無(wú)多態(tài)分配另一個(gè)值如零(0)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中選擇的多態(tài)序列與被感染動(dòng)物對(duì)感染其的微生物的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中宿主內(nèi)部多態(tài)標(biāo)記核酸序列是那些形成HLA的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中HLA類(lèi)型標(biāo)記可為I型HLA(A、B或C)或II型HLA(DR、DQ)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述標(biāo)記序列對(duì)于微生物是特異性的，這在于它編碼受體或活性地參與宿主-微生物相互作用的其他蛋白質(zhì)，如趨化因子受體，例如參與HIV結(jié)合的CCR5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的方法在檢查在宿主中展示病原性狀的大量生物所面臨的選擇壓力中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中該生物包括但不局限于細(xì)菌、真菌、分枝菌屬、病毒和病毒樣顆粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，用于檢查已進(jìn)行改變以快速進(jìn)化的微生物，該微生物包括HIV和AIDS相關(guān)的病毒和肝炎相關(guān)的病毒，如HCV和HBV。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括DNA直接測(cè)序或如RFLP、SNP、SSO、SSP、串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)(VNTR)等的分析方法。
13.一種鑒定宿主多態(tài)標(biāo)記序列中的變異和第二個(gè)變量如治療藥物或疫苗對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響和相互作用的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇被微生物感染的患者或動(dòng)物群體，其中的一些接受了第二個(gè)變量作為對(duì)該微生物的部分治療，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的宿主內(nèi)部多態(tài)標(biāo)記序列對(duì)所述群體中的個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在用第二個(gè)變量處理之前和之中，在群體每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中的部分或全長(zhǎng)多核苷酸和/或多肽序列，該多核苷酸和/或多肽序列是第二個(gè)變量的潛在或已知的靶標(biāo)，另外以相似的時(shí)間間隔在相似的但未經(jīng)治療的個(gè)體中進(jìn)行上述操作；(c)確定在步驟(b)中確定的時(shí)間點(diǎn)之間步驟(b)中檢查的序列中每一個(gè)殘基上是否發(fā)生了變化(“突變”)；(d)對(duì)在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)、治療和未治療的序列中用第二個(gè)變量處理與否的作用以及步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定步驟(a)中的多態(tài)序列和用第二個(gè)變量的處理如何影響步驟(c)中第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上突變的概率；(e)對(duì)步驟(c)中確定的序列中每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)。
14.一種確定宿主多態(tài)標(biāo)記序列的變異和治療藥物對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響和相互作用的方法，該方法包含以下步驟(a)選擇被微生物感染的患者或動(dòng)物群體，其中的一些接受了至少一種意欲治療存在的微生物的藥物，并根據(jù)至少一個(gè)選定的參與宿主對(duì)微生物反應(yīng)的宿主內(nèi)部多態(tài)標(biāo)記序列對(duì)所述群體中的個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)；(b)在用第二個(gè)變量處理之前和之中，在群體每一個(gè)類(lèi)型的足夠數(shù)目個(gè)體中鑒定和確定微生物中的部分或全長(zhǎng)多核苷酸和/或多肽序列，該多核苷酸和/或多肽序列是所述藥物的潛在或已知的靶標(biāo)，另外以相似的時(shí)間間隔在相似的但未經(jīng)治療的個(gè)體中進(jìn)行上述操作；(c)確定在步驟(b)中確定的時(shí)間點(diǎn)之間步驟(b)中檢查的序列中每一個(gè)殘基上是否發(fā)生了變化(“突變”)；(d)對(duì)在步驟(a)中獲得的數(shù)據(jù)、治療和未治療的序列之間用第二個(gè)變量處理與否的作用以及步驟(c)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確定步驟(a)中的多態(tài)序列和藥物處理如何影響步驟(c)中第一個(gè)目標(biāo)氨基酸殘基上突變的概率；(e)對(duì)步驟(c)中確定的序列中每一個(gè)氨基酸重復(fù)步驟(d)。
15.一種包含以下步驟的方法(a)對(duì)被HIV感染的宿主群體進(jìn)行HLA測(cè)序；(b)對(duì)每一個(gè)患者中主要的HIV種類(lèi)進(jìn)行全長(zhǎng)或部分測(cè)序；(c)通過(guò)在病毒的每一個(gè)殘基位置確定最常見(jiàn)的氨基酸殘基以確定HIV的一致序列；(d)在每一個(gè)生物殘基上(i)對(duì)每一個(gè)個(gè)體(患者)確定目標(biāo)HIV氨基酸殘基與一致殘基相比是相同的(“非突變的”)還是不同的(“突變的”)；(ii)進(jìn)行多變量回歸模型，對(duì)于目標(biāo)結(jié)果，對(duì)突變的氨基酸分配值(1)或?qū)Ψ峭蛔兊陌被岱峙渲?0)；和(iii)在多變量模型中檢查合適的潛在解釋性協(xié)變量以尋找與目標(biāo)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中解釋性協(xié)變量是患者個(gè)體的HLA等位基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中解釋性協(xié)變量是由宿主攝取的并導(dǎo)向目標(biāo)蛋白質(zhì)的治療劑藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中治療劑藥物是反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物或蛋白酶抑制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中解釋性協(xié)變量是在宿主蛋白質(zhì)中其他位置上的突變。
20.一種設(shè)計(jì)能夠在患者中誘導(dǎo)特定的T-細(xì)胞反應(yīng)的治療劑的方法，該方法包含以下步驟(a)實(shí)施如上所述權(quán)利要求1的方法；和(b)分析數(shù)據(jù)以鑒定作為該群體感染結(jié)果而在病毒群體中出現(xiàn)的多態(tài)，該多態(tài)是HLA相關(guān)聯(lián)的；和(c)制備包括在步驟(b)中鑒定的多態(tài)的治療劑。
21.一種鑒定T細(xì)胞表位的方法，該方法包含以下步驟(a)實(shí)施如上所述權(quán)利要求1的方法；和(b)分析數(shù)據(jù)以鑒定作為該群體感染結(jié)果而在病毒群體中出現(xiàn)的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)是HLA相關(guān)聯(lián)的。
22.一種設(shè)計(jì)疫苗以防止或延遲在用對(duì)微生物特異性的特定藥物治療的患者中出現(xiàn)藥物抗性的方法，其中該藥物在核苷酸或氨基酸水平影響微生物的復(fù)制，該方法包含以下步驟(a)實(shí)施如上所述權(quán)利要求1的方法；和(b)分析數(shù)據(jù)以鑒定已用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的感染個(gè)體中在病毒群體中發(fā)生的多態(tài)頻率，其中該多態(tài)頻率是在微生物中藥物具有活性的核苷酸或氨基酸序列區(qū)域中確定的；和(c)設(shè)計(jì)一種或多種治療劑，該治療劑促進(jìn)對(duì)含有展示一種或多種所鑒定多態(tài)的病毒群體的細(xì)胞的T-細(xì)胞反應(yīng)。
22.多肽序列，其選自SEQ ID NO2-10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33。
23.治療劑，含有選自SEQ ID NO2-10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33的氨基酸序列。
24.能夠在患者中表達(dá)氨基酸序列的載體構(gòu)建體，其包含能夠表達(dá)含有SEQ ID NO2-10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33的氨基酸序列的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及鑒定和確定生物活性氨基酸序列的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供了確定宿主基因中的變異對(duì)具有特定氨基酸變體的微生物的選擇的影響的方法，該方法的目的是為了設(shè)計(jì)治療藥物或疫苗或使這種治療個(gè)體化。本發(fā)明也提供了鑒定HLA等位基因特異性微生物序列多態(tài)的方法，該多態(tài)由HLA限定的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生。它也提供了診斷和治療方法，該方法可用于測(cè)量或治療微生物感染或預(yù)防微生物感染。
文檔編號(hào)C12N9/50GK1602202SQ02824790
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月23日
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