專利名稱：分子的快速靈敏檢測的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、工業(yè)、或環(huán)境樣品中顯微和亞顯微靶的鑒定。
概述檢測、計(jì)算、和鑒定低水平的分子靶是常規(guī)醫(yī)學(xué)、工業(yè)、和環(huán)境診斷的基礎(chǔ)。例如，對(duì)樣品進(jìn)行分析從而檢測來自感染劑，癌細(xì)胞，激素、工業(yè)沾染物和污染物的分子。
盡管低水平分子的許多不同和有效的方法已經(jīng)進(jìn)行了商業(yè)化，在檢測中仍然存在缺陷。在2001年的生物恐怖襲擊之后，一些缺陷變得更明顯。例如，存在著對(duì)在暴露點(diǎn)同時(shí)篩選多種類型試劑的快速、超靈敏、經(jīng)濟(jì)和方便用戶的試驗(yàn)的需要。由于缺乏可以由非醫(yī)務(wù)工作者現(xiàn)場進(jìn)行的快速、靈敏和便于使用的診斷試驗(yàn)，健康護(hù)理和工業(yè)都受到了阻礙。
下面的討論集中在常規(guī)的醫(yī)學(xué)診斷上；類似的方法可用于工業(yè)和環(huán)境應(yīng)用。
免疫學(xué)方法免疫學(xué)試驗(yàn)，或免疫測定法，在醫(yī)學(xué)診斷中是普遍存在的?；诳贵w與相應(yīng)靶(稱為抗原)之間的相互作用，免疫測定法可檢測從小(如濫用的藥物)至大(如HIV蛋白)的許多分子。血清學(xué)試驗(yàn)屬于免疫測定法，它不是直接測試抗原，而是測試宿主對(duì)先前與抗原接觸的免疫應(yīng)答—例如，它們可測試宿主對(duì)特定細(xì)胞和病毒的抗體的存在。有很多免疫測定系統(tǒng)都可使用，例如從大型自動(dòng)化中心實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，到可直接進(jìn)行的合法妊娠試驗(yàn)。該試驗(yàn)包括多種形式，如凝集測定法，沉淀素測定法，酶聯(lián)免疫測定法，直接發(fā)熒光測定法，免疫-組織學(xué)試驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合測定法，血清學(xué)試驗(yàn)，免疫-電泳測定法，和快速“帶狀”試驗(yàn)(例如，側(cè)流和流通試驗(yàn))。免疫學(xué)試驗(yàn)可以非常簡單而且快速。因此，絕大多數(shù)理想試驗(yàn)，例如可在醫(yī)生辦公室或由患者在家進(jìn)行的那些，是免疫學(xué)試驗(yàn)。商業(yè)化的快速免疫試驗(yàn)的一個(gè)缺陷是它們不靈敏。
對(duì)商業(yè)化靈敏免疫測定的需要將逐漸增加。人類基因組和蛋白組計(jì)劃的一個(gè)主要回報(bào)將是診斷疾病狀態(tài)，如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)疾病的許多新的標(biāo)記。這些標(biāo)記可以在臨床樣品，如血液、尿和實(shí)體組織中以痕量存在。適用于高豐度蛋白標(biāo)記(如PSA，肌紅蛋白和抗體)的商業(yè)化的快速免疫測定試驗(yàn)對(duì)于檢測絕大部分以低濃度存在的蛋白可能是不夠的。
基因方法基因方法是用于檢測并鑒定細(xì)胞和病毒中核酸分子的普通且有效的工具。近來已經(jīng)發(fā)展了以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)、超靈敏檢測并區(qū)別細(xì)胞和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商業(yè)試驗(yàn)可檢測少數(shù)亞顯微HIV病毒顆粒的核酸(例如，50個(gè)粒子/ml)。擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。
基于核酸擴(kuò)增的試驗(yàn)具有一些缺陷，阻礙了它們在常規(guī)臨床和商業(yè)診斷中的利用。這些試驗(yàn)一般比微生物培養(yǎng)試驗(yàn)更昂貴；需要更高的使用者專業(yè)技術(shù)；涉及費(fèi)力的樣品制備程序；一般需要耗時(shí)的施用步驟；容易受到污染和產(chǎn)生假陽性結(jié)果；具有對(duì)許多臨床樣品中存在的抑制劑敏感的酶促步驟并導(dǎo)致假陰性；并且通常在多路應(yīng)用中具有重復(fù)性的問題。此外，與微生物培養(yǎng)方法相似，這些方法不太適用于檢測重要類型的非核酸靶(例如毒素、激素、濫用的藥物和蛋白)。
生物化學(xué)、化學(xué)、及物理方法靈敏檢測微生物和亞微生物靶的其它技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)，質(zhì)譜，生物傳感器，吸光光譜，熒光偏振，熒光波動(dòng)光譜，電泳，色譜等。由于昂貴和需要專業(yè)技術(shù)，這些方法中的大多數(shù)只用于實(shí)驗(yàn)室中。
證明可以用于臨床診斷實(shí)驗(yàn)室的一種方法是流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)方法根據(jù)它們的物理性質(zhì)以及它們結(jié)合標(biāo)記探針(例如，染料，抗體，或核酸)的能力，可用于定量檢測特定的細(xì)胞類型。單一細(xì)胞或粒子被強(qiáng)迫流過狹窄的通道，每次流過一個(gè)，通過激光束。熒光發(fā)射和大小/形狀的信息是通過分析光譜和由生物體/粒子引起的光散射而搜集的。每分鐘可分析上千單一的細(xì)胞或粒子。例如，流式細(xì)胞術(shù)可用于量化AIDS患者中淋巴細(xì)胞類的群體大小?？蓹z測并鑒定非-細(xì)胞分子，如蛋白或核酸的多路流式細(xì)胞術(shù)方法已經(jīng)由Luminex商業(yè)化(美國專利號(hào)第5,981,180)。流式細(xì)胞術(shù)的缺陷包括昂貴、需要操作者的技術(shù)、不能分析大的樣品體積(限制了靈敏度)。
生物傳感器技術(shù)有希望用于靈敏的分子檢測。生物傳感器使用物理方法將生物事件，例如，抗體與抗原的結(jié)合，轉(zhuǎn)換成可檢測的信號(hào)。其中一種用于分子檢測的普及生物傳感器使用表面等離子共振(Mullett，W.M.等，(2000)Methods 2277-91)。熱BioStar’s光學(xué)免疫測定法(Schultze，D.等(2001)Eur J Clin Microbiol InfectDis 20280-3)利用光干涉原理檢測抗原與抗體的結(jié)合。BARC生物傳感器技術(shù)是磁阻檢測(硬盤存儲(chǔ))單一磁性微粒標(biāo)記的分析物(Edelstein，R.L.等，Biosens Bioelectron 14805-13，2000)。
關(guān)注點(diǎn)(point-of-care)和現(xiàn)場(on-site)方法關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)使得從業(yè)者和消費(fèi)者能夠在專門的中心實(shí)驗(yàn)室外進(jìn)行診斷試驗(yàn)。關(guān)注點(diǎn)診斷是體外診斷中增長最迅速的部分之一。典型的關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)位點(diǎn)包括醫(yī)院中的患者床旁；物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；護(hù)理室；公共和私人健康診所；大學(xué)健康中心；相關(guān)設(shè)施；急救車；工作地點(diǎn)和家里。近年來已經(jīng)引入了許多關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)，其中一些已經(jīng)取得了顯著成功。商業(yè)化的關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)分為幾類，分別檢測(1)代謝物(如葡萄糖和尿素)、無機(jī)分子、藥物和血?dú)猓?2)大分子和激素；以及(3)致病劑(如細(xì)菌、病毒、寄生蟲)。
盡管對(duì)濃度相對(duì)高的分析物(如血糖)已經(jīng)非常成功，開發(fā)中的關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)低豐度靶分子還有一些問題。該困難很大程度取決于兩種相互對(duì)立的產(chǎn)品要求的結(jié)合(1)需要精密的技術(shù)以滿足費(fèi)力的試驗(yàn)規(guī)格，包括超靈敏度，和(2)需要沒有技術(shù)的操作者能夠操作的低成本、方便用戶和便攜的試驗(yàn)。
一些商業(yè)化或正在開發(fā)的超靈敏關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)是用于較不靈敏的商業(yè)化試驗(yàn)的形式改進(jìn)。例如Response Biomedical公司具有商業(yè)化的10分鐘條帶試驗(yàn)(或側(cè)流)，該試驗(yàn)基于其RAMP平臺(tái)，使用熒光染色的微珠標(biāo)記(Brooks，D.E.，et al.(1999).Clin Chem 451676-1678.)。相似地，Biosite′s快速條帶試驗(yàn)檢測濫用的藥物、心臟標(biāo)記和感染劑(Landry，M.L.，et al.(2001).JClin Microbiol 391855-8.)。
很難開發(fā)基于核酸擴(kuò)增的關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)，這是由于其復(fù)雜性和昂貴。一種系統(tǒng)是Cepheid′s Smart Cycler系統(tǒng)。Mayo Clinic和Roche合作開發(fā)了用于炭疽芽孢桿菌的另一種核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(Light Cycler；Makino，S.I.，et al.(2001) Lett Appl Microbiol 33237-40.)。這些系統(tǒng)攜帶了PCR固有的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。擴(kuò)增方法可以帶來極大的分析靈敏度并且可以適當(dāng)快速進(jìn)行，例如，Smart Cycler可以在1小時(shí)得到結(jié)果(Belanger，S.D.，et al.(2002).Journal of ClinicalMicrobiology 401436-40)。分析物限于含有核酸的那些(例如排除蛋白毒素和小分子試驗(yàn))；樣品抑制可以導(dǎo)致假陰性；高度多路試驗(yàn)導(dǎo)致問題；試驗(yàn)需要經(jīng)過訓(xùn)練的人，并且試驗(yàn)是昂貴的。
基于生物傳感器的技術(shù)也是有希望的，因?yàn)樗鼈兛梢越Y(jié)合優(yōu)越的技術(shù)規(guī)格以及低成本和方便用戶。例如，可以檢側(cè)流感病毒等病原體的Thermo Biostar′s OIA技術(shù)依賴于生物傳感器，該傳感器具有光活化表面，該表面在結(jié)合病毒時(shí)由于光干涉的改變而改變顏色(Rodriguez，W.J.，et al.(2002).Pediatr Infect Dis J 21193-6.)。
一些正在出現(xiàn)的技術(shù)致力于改進(jìn)的多路技術(shù)。例如Biosite正在開發(fā)一種高度平行的毛細(xì)管微流免疫測定系統(tǒng)。Somalogic的技術(shù)使用適體陣列分析成百甚至上千個(gè)分析物(Brody，E.N.，et al.(1999).Mol Diagn 4381-8)。Nanogen′s NanoChip(Ewalt，K.L.，et aL(2001).Anal Biochem 289162-72.)電子陣列也用于檢測生物恐怖行動(dòng)的試劑。盡管篩選成百分析物的試驗(yàn)對(duì)藥物發(fā)現(xiàn)具有明確的價(jià)值，還不明確該水平的多路技術(shù)是否對(duì)關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)重要。
用于改進(jìn)關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)的靈敏度的各種新的標(biāo)記/檢測策略也定位于生物戰(zhàn)試劑的試驗(yàn)。Orasure的新的定量濫用的藥物試驗(yàn)使用UPT(向上轉(zhuǎn)換型磷光技術(shù))粒子(Niedbala，R.S.，et al.(2001).AnalBiochem 29322-30.)。海軍的BARC技術(shù)使用磁例子和檢測器敏感性分析樣品中的特定分析物(Edelstein，R.L.，et al.(2000).Biosens Bioelectron 14805-13.)。其它新的標(biāo)記方法包括量子點(diǎn)納米晶體(Quantum Dot；Wang，C.，et al.(2001).Science 2912390-2.)和共振光散射粒子(Genicon；Yguerabide，J.，et al.(2001).J Cell Biochem Suppl Suppl71-81.)，它們也可以潛在改進(jìn)關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)的靈敏度。
分子診斷的未滿足的需要對(duì)通過第一反應(yīng)者在暴露點(diǎn)和通過空氣和水供應(yīng)的常規(guī)自動(dòng)化掃描進(jìn)行的有效生物戰(zhàn)試劑檢測還具有關(guān)鍵的未滿足的需要。類似地，由于缺乏敏感的現(xiàn)場試驗(yàn)，不能在現(xiàn)場檢驗(yàn)臨床患者的性傳播疾病病原體，并且不能快速和靈敏地篩選手術(shù)后患者的血液感染。對(duì)解決該缺陷的新技術(shù)可能變得更急迫，因?yàn)榧膊?包括癌癥、感染性疾病和心血管疾病)的新的診斷標(biāo)記從基因組和蛋白組計(jì)劃不可避免地出現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供快速并靈敏地鑒定醫(yī)學(xué)、工業(yè)、和環(huán)境樣品中的細(xì)胞和病毒靶的有效方法。本發(fā)明標(biāo)記靶分子，然后利用大面積成像檢測它們?；诒景l(fā)明的診斷試驗(yàn)可以是快速、超靈敏、定量、多路、且自動(dòng)化的。該試驗(yàn)可使樣品制備減到最少，而且無需核酸擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)。本試驗(yàn)可檢測多種感染劑(如細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲)和分子(如蛋白、DNA、RNA、激素和藥物)。基于本發(fā)明的試驗(yàn)可提供核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的高水平靈敏度，用戶容易掌握使用，而且可提供免疫測定法的速度，以及由微生物試驗(yàn)提供的低成本及量化。本發(fā)明通過進(jìn)行快速、超靈敏和便攜的試驗(yàn)，解決了關(guān)注點(diǎn)和現(xiàn)場診斷中重要的未滿足的需要。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有診斷技術(shù)的最佳特征，同時(shí)解決了診斷系統(tǒng)中的缺陷。
本發(fā)明能夠快速并低成本檢測低水平靶分子的能力源于聯(lián)合使用高強(qiáng)度標(biāo)記，促進(jìn)快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的形式，和大面積成像的優(yōu)點(diǎn)，該大面積成像使用由現(xiàn)有商業(yè)元件制造的儀器，或根本不用儀器。表1列出本發(fā)明某些優(yōu)點(diǎn)。
表1
本發(fā)明通過標(biāo)記低水平的靶分子，產(chǎn)生高強(qiáng)度信號(hào)而檢測它們。這些復(fù)合物具有兩種功能，即對(duì)特異性靶的親和性和信號(hào)產(chǎn)生。這些功能是通過復(fù)合物上的兩部分實(shí)現(xiàn)的特異性結(jié)合靶分子的類目結(jié)合分子和用于檢測粒子的信號(hào)傳遞部分。產(chǎn)生具有特征性標(biāo)志(如發(fā)射光的特定波長)的高強(qiáng)度信號(hào)的標(biāo)記使得能夠快速和超靈敏檢測并且允許有效區(qū)分來自偽跡的真陽性(例如熒光灰塵粒子)?？墒褂酶鞣N產(chǎn)生信號(hào)的復(fù)合物，包括熒光染色的，光-散射，量子點(diǎn)，磷光體，和酶-涂覆的粒子。這些粒子可產(chǎn)生各類型的信號(hào)，包括熒光，化學(xué)發(fā)光，和比色。同樣，可使用各種分子獲得產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記，包括抗體，核酸，配體，和適體的特異性結(jié)合。
由于本發(fā)明檢測分子，靶的范圍是很寬的，包括可溶性分子和作為更大靶，如病毒、細(xì)菌或動(dòng)物或植物細(xì)胞的一部分的分子。通過使用各種類型的靶特異性分子，包括抗體、核酸、適體s和配體的能力，本發(fā)明解決的診斷問題的范圍得到了擴(kuò)展。
當(dāng)檢測某些臨床，環(huán)境，和制造樣品時(shí)，需要檢測較大體積中的少數(shù)靶和病毒。本發(fā)明檢測大量樣品中低水平靶的能力部分取決于其在不放大的情況下，檢測單一細(xì)胞和病毒的能力。不放大的檢測可檢測大面積中少數(shù)粒子的單一像。大面積成像對(duì)于本發(fā)明有效分析較大樣品體積的能力至關(guān)重要。使用高倍顯微鏡或微流檢測較大體積中的標(biāo)記粒子時(shí)，需要濃縮步驟或?qū)ι锨€(gè)像進(jìn)行分析。使用微束掃描少數(shù)粒子的方法非常浪費(fèi)時(shí)間，且大面積使用時(shí)較為昂貴。
計(jì)算單一顯微標(biāo)記可增加基于本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。與很多用于分析細(xì)胞和病毒靶的大面積成像方法形成對(duì)照，本發(fā)明通常直接將單一信號(hào)與較小的鄰接區(qū)進(jìn)行比較。與求大面積中總信號(hào)和背景積分的方法相比，這種比較可提高含有少數(shù)標(biāo)記靶的樣品的信號(hào)背景比。
檢測單一細(xì)胞或病毒的其它優(yōu)點(diǎn)是在不犧牲速度的前提下，通過適當(dāng)增加檢測形式的大小來增加樣品體積，從而增加試驗(yàn)的靈敏度(具體解釋見43頁實(shí)施例8的結(jié)果部分)。
計(jì)算大面積像中的單一信號(hào)數(shù)還可減少產(chǎn)生假陽性結(jié)果的機(jī)會(huì)。(假陽性結(jié)果是不存在實(shí)際靶時(shí)產(chǎn)生的陽性試驗(yàn)結(jié)果)。與檢測單一積分信號(hào)的方法，如測量樣品中分子(例如，ATP，抗原，或核酸)總量的方法相比，這種計(jì)數(shù)方法是有利的。當(dāng)使用依賴于信號(hào)積分的方法時(shí)，引起信號(hào)的任何人工制品都可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。含有482個(gè)正信號(hào)的樣品，每個(gè)都可產(chǎn)生100個(gè)熒光單位。積分方法的結(jié)果是單一的數(shù)字(48,200個(gè)熒光單位)。產(chǎn)生相似熒光單位數(shù)的人工制品，例如，較大的熒光塵粒是不能區(qū)別的。相反，本發(fā)明可很容易地區(qū)分單一較大的熒光塵粒和482個(gè)正信號(hào)。
使用本發(fā)明構(gòu)造的試驗(yàn)可檢測各種濃度，從非常低的水平到高水平的靶和病毒。本發(fā)明的這種性質(zhì)，其較大的動(dòng)態(tài)范圍，可讓用戶取消樣品的制備步驟(例如，多次稀釋)，而這一步驟常常是具有較小動(dòng)態(tài)范圍的技術(shù)所需的。
基于本發(fā)明的試驗(yàn)可利用各種有效的形式，包括簡單、非-儀器、且低成本的一次性帶狀試驗(yàn)，和精密的自動(dòng)化臺(tái)式系統(tǒng)，用于連續(xù)的不衰減的環(huán)境監(jiān)測。特別重要的是本發(fā)明與使得試驗(yàn)中的反應(yīng)速度(如靶分子與靶特異性標(biāo)記的結(jié)合速度)最大化的形式的相容性。例如，通過本發(fā)明的一些實(shí)施方案，結(jié)合反應(yīng)在多孔膜中迅速發(fā)生。
本發(fā)明可使用的各種檢測方法包括目測，基于膠片的檢測，和電子檢測。檢測方法的范圍對(duì)于提出廣泛的診斷問題和試驗(yàn)地點(diǎn)是有利的。例如，對(duì)于便攜式系統(tǒng)，使體積和重量最小是優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中減少和去除儀器化的實(shí)施方案對(duì)于便攜是特別有用的。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)可從下列說明書和權(quán)利要求書很明顯地看出。
靶分子是指可能存在于樣品中的細(xì)胞或病毒，它的存在是通過本發(fā)明測試的。靶分子可以是不同的分子，或者它們可以與樣品中的其它分子、細(xì)胞或物質(zhì)物理締合。例如，用于檢測真菌病原體白色念珠菌的試驗(yàn)可以檢測生物的基因組特有的三種不同DNA序列。盡管在真菌的基因組中物理締合，這三種序列被認(rèn)為是不同的靶分子。
靶的類目是指共有一個(gè)或多個(gè)特征，且為了使用本發(fā)明構(gòu)造試驗(yàn)的目的，被認(rèn)為相同的多個(gè)靶。例如，對(duì)于被設(shè)計(jì)檢測所有HIV病毒的試驗(yàn)而言，類目只是HIV。這種試驗(yàn)可檢測所有HIV病毒，而不區(qū)分HIV-1和HIV-2變體。在這種情況下，靶的類目包括HIV-1和HIV-2。其它試驗(yàn)的目的可能是區(qū)分HIV-1和HIV-2。在這種情況下，每種類型的HIV被看作是不同的類目。或者，考慮上述靶分子定義中白色念珠菌的三種DNA探針。如果試驗(yàn)的目的是檢測白色念珠菌，對(duì)于試驗(yàn)的目的而言，三種探針被認(rèn)為是相同的，因?yàn)樗鼈兙哂刑禺愋越Y(jié)合白色念珠菌的共同特征。因此，這三種靶分子將被認(rèn)為處于相同的靶分子類目。
靶的非重疊類目是指其并集為空集的靶的類目。也就是說，任一類目都沒有哪個(gè)成員是其它任一組的成員。例如，IL-2、凝血酶、PSA和肌紅蛋白是非重疊類目。
檢測并鑒定多個(gè)類目的試驗(yàn)通常(但并不總是)可檢測靶分子的多個(gè)非重疊類目。例如，設(shè)計(jì)試驗(yàn)來鑒定血液中的HIV，HCV，和HBV病毒。這種試驗(yàn)可區(qū)分靶的三個(gè)非重疊類目，即三種類型的病毒的每一種是一個(gè)類目。
試驗(yàn)的類目復(fù)雜度是指在試驗(yàn)中檢測的靶分子的非重疊類目數(shù)。
類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是指靶分子上的位點(diǎn)，它可在特異性結(jié)合條件下特異性結(jié)合類目結(jié)合分子，而且可把在試驗(yàn)中鑒定的特定類目成員與不是該類目成員，但可能也存在于試驗(yàn)樣品中的靶區(qū)分開來。也就是說，該位點(diǎn)通常存在于一個(gè)類目的所有成員上，而且通常不存在于非重疊類目的任何成員上。類目特異性結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合類目特異性結(jié)合分子。
例如，考慮HIV病毒被膜蛋白上特異性結(jié)合抗體類目結(jié)合分子的表位(抗原位點(diǎn))。靶分子是病毒被膜蛋白，類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是被膜蛋白的表位。
如果試驗(yàn)掃描含有構(gòu)成分類群的靶類目樣品，那么類目特異性結(jié)合位點(diǎn)基本存在與該分類群的所有成員中，但基本不存在于試驗(yàn)樣品中其它分類群的所有成員中。其中一個(gè)例子是結(jié)合特定單克隆抗體的HIV膜蛋白上的位點(diǎn)。
可選擇性地，試驗(yàn)可掃描包括了由不同分類群成員共有的類目特異性結(jié)合位點(diǎn)的樣品。這種類型的類目特異性結(jié)合位點(diǎn)的例子包括各種大分子(例如，DNA)和基因，mRNA，和蛋白，它們可產(chǎn)生抗生素抗性，毒性，或顯示活力。類目特異性結(jié)合位點(diǎn)常常是較大分子或復(fù)合物的一部分。例如，在試驗(yàn)中，可將類目特異性基因組序列用作類目特異性結(jié)合位點(diǎn)。這種類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是更大基因組的一部分，它可含有(1)不是類目特異性的部分；(2)是類目特異性結(jié)合位點(diǎn)，但試驗(yàn)不能掃描的部分；和(3)試驗(yàn)可掃描的、不同類目特異性序列的其它部分。
類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是指在屬于類目成員的靶中以80％，90％，95％，或超過99％存在，但在屬于相同種類所有其它類目成員的靶中，以80％，90％，95％，或超過99％缺少的結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，屬于類目成員的靶可能一般或異常缺少類目特異性結(jié)合位點(diǎn)。同樣，類目特異性結(jié)合位點(diǎn)可一般或異常存在于不屬于類目成員的靶中。例如，認(rèn)為蛋白位點(diǎn)基本存在于所有大腸埃希氏菌中，而不存在于其它細(xì)菌種類中。如果，在上百萬個(gè)細(xì)菌中少于一個(gè)細(xì)胞，導(dǎo)致不產(chǎn)生蛋白的突變，那么標(biāo)記將不存在于大腸埃希氏菌中。然而，這種蛋白位點(diǎn)仍然被認(rèn)為是類目特異性結(jié)合位點(diǎn)?？蛇x擇性地，利用重組DNA技術(shù)或自然方式(例如，利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))可將相同蛋白的基因轉(zhuǎn)移到不同種類細(xì)菌的菌株中。在這種情況下，不屬于大腸埃希氏菌類目成員的細(xì)菌菌株將表達(dá)什么仍然被認(rèn)為是大腸埃希氏菌-特異性結(jié)合位點(diǎn)。
類目結(jié)合分子是指特異性結(jié)合類目特異性結(jié)合位點(diǎn)的分子或分子復(fù)合物。類目結(jié)合分子的例子是與基因組DNA雜交的核酸探針；已經(jīng)被選擇或“推斷”體外特異性結(jié)合蛋白上位點(diǎn)的核酸適體；結(jié)合細(xì)胞抗原或血清蛋白的抗體；以及特異性結(jié)合激素受體或結(jié)合分子，如抗生物素蛋白的配體，如表皮生長因子或生物素。如果它們結(jié)合不同且非重疊的類目特異性結(jié)合位點(diǎn)，那么這兩個(gè)類目結(jié)合分子被認(rèn)為是不同的。根據(jù)它們的分子組成，類目結(jié)合分子可被稱作，例如，類目結(jié)合寡核苷酸，探針，抗體，配體等。
捕獲分子是指與表面，薄膜，或不是顆粒的其它基質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合的類目結(jié)合分子。
特異性結(jié)合靶類目的類目結(jié)合分子是指在規(guī)定的結(jié)合條件下，基本結(jié)合可由試驗(yàn)掃描的類目成員的所有靶，但基本不結(jié)合不屬于該類目成員，但可能存在于樣品中的其它種類靶的類目結(jié)合分子。與不是通過這種類目中的靶結(jié)合的數(shù)目相比，通過所掃描類目中的靶結(jié)合的類目結(jié)合分子數(shù)要高2倍，5倍，10倍，或50倍。
結(jié)合條件是指在試驗(yàn)中使用的、獲得類目結(jié)合分子與類目特異性結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合的條件。例如，當(dāng)類目結(jié)合分子是類因特異性DNA探針時(shí)，特定試驗(yàn)的結(jié)合條件是嚴(yán)格的DNA雜交條件。適宜的嚴(yán)格DNA雜交條件取決于探針的性質(zhì)，這是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的。例如，對(duì)于長度大于500個(gè)堿基的典型DNA探針而言，適宜的結(jié)合條件(在雜交中被稱作“清洗條件”)是65℃，0.2X SSC。對(duì)于抗體與抗原的結(jié)合而言，典型的結(jié)合條件是室溫，PBS-TB。
類目結(jié)合分子的家族是指一組特異性結(jié)合靶特定類目的類目結(jié)合分子。針對(duì)丙型肝炎病毒培養(yǎng)的多克隆抗體制品構(gòu)成類目特異性分子的家族，這是因?yàn)樗刑禺愋越Y(jié)合靶-HCV相同類目的多個(gè)不同抗體。多克隆抗體通常構(gòu)成類目結(jié)合分子的家族，這是因?yàn)樗鼈兺ǔ０ńY(jié)合靶相同類目的多個(gè)不同類目結(jié)合分子。值得注意的是，除非使用親和純化，多克隆抗體制品通常還含有不與靶的選定類目結(jié)合的抗體，而且可含有結(jié)合其它類目的抗體，這是因?yàn)閯?dòng)物的抗體系統(tǒng)是通過動(dòng)物的感染史確定的。因此，優(yōu)選利用親和法純化多克隆抗體。
家族中的類目結(jié)合分子可能與類目中的某些靶結(jié)合，但不與其它靶結(jié)合。例如，HIV-1特異性抗體不與HIV-2交叉反應(yīng)，HIV-2-特異性抗體不與HIV-1交叉反應(yīng)。在不區(qū)分HIV-1或HIV-2的條件下，如果HIV作為試驗(yàn)中的類目被檢測，那么可用具有相同信號(hào)標(biāo)志的信號(hào)傳遞部分標(biāo)記兩種類型抗體的混合物。當(dāng)在試驗(yàn)中使用該家族的類目結(jié)合分子，即兩種抗體制品的混合物時(shí)，不論存在HIV-1還是HIV-2，都可獲得相同的信號(hào)。(值得注意的是，如果使用抗體捕獲本實(shí)施例中檢測區(qū)位點(diǎn)的HIV靶，那么在該位點(diǎn)使用抗-HIV-1和抗-HIV-2捕獲抗體的混合物)。
類目結(jié)合分子家族的其它例子是一組80個(gè)類目特異性基因組DNA序列，它們存在于所有大腸埃希氏菌O157H7菌株中，但不存在于其它種類細(xì)菌的成員中。該家族的類目結(jié)合分子可與適當(dāng)制備的大腸埃希氏菌O157H7細(xì)胞雜交，但是不與細(xì)胞的其它類目雜交。
類目結(jié)合分子的非重疊家族是指這樣的類目結(jié)合分子家族，其中每個(gè)家族特異性結(jié)合一組非重疊類目中的一個(gè)，而且僅僅一個(gè)類目。也就是說，一組類目結(jié)合分子的非重疊家族對(duì)應(yīng)于一組非重疊類目。例如，在掃描4USP有害生物大腸埃希氏菌，沙門氏菌，假單胞菌，和金黃色葡萄球菌的試驗(yàn)中，有4個(gè)非重疊類目。這種試驗(yàn)可摻入4種不同的非-交叉反應(yīng)多克隆抗體，每種抗體對(duì)其中一個(gè)試驗(yàn)類目特異。因此，該試驗(yàn)包括類目結(jié)合分子的4個(gè)非重疊家族。試驗(yàn)中的類目結(jié)合分子的非重疊家族被稱作類目結(jié)合分子的整體(ensemble)(見下面的定義)。
類目結(jié)合分子的整體是指類目結(jié)合分子的一個(gè)或多個(gè)非重疊家族組，對(duì)于特定的試驗(yàn)而言，將它們在混合物中混合。掃描靶的多個(gè)非重疊類目的試驗(yàn)包括每個(gè)類目的一個(gè)類目結(jié)合分子家族。包含這些家族的類目結(jié)合分子的整個(gè)組被稱作整體。例如，可使用5種病毒-特異性單克隆抗體掃描5種類型上呼吸道病毒(RSV，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感和腺病毒)的存在。這5個(gè)單克隆抗體構(gòu)成類目結(jié)合分子的5個(gè)非重疊家族。抗體的聯(lián)合組是類目結(jié)合分子的整體。
整體的類目結(jié)合分子復(fù)雜度是指一個(gè)整體中的不同類目結(jié)合分子或部分的數(shù)目。例如，如果一個(gè)類目結(jié)合分子的整體包括234個(gè)寡核苷酸探針，那么該整體的類目結(jié)合分子復(fù)雜度為234。
整體的家族復(fù)雜度是指一個(gè)整體中的類目結(jié)合分子的非重疊家族數(shù)。家族復(fù)雜度與結(jié)合整體中每個(gè)家族的類目結(jié)合分子所需的最小靶數(shù)相等。試驗(yàn)的家族復(fù)雜度與試驗(yàn)的分類學(xué)復(fù)雜度—即，所掃描樣品的不同類目數(shù)相對(duì)應(yīng)。概言之，家族復(fù)雜度也與試驗(yàn)中使用的不同信號(hào)標(biāo)志的數(shù)目相對(duì)應(yīng)?？紤]設(shè)計(jì)用于檢測四種人細(xì)胞因子蛋白的靶分子特異性抗體的整體粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)。整體的家族復(fù)雜度是4，因?yàn)闆]有小于4的靶分子亞組可以滿足結(jié)合整體中的每一抗體。作為另一個(gè)例子，考慮由3個(gè)探針家族組成的DNA探針整體。其中一個(gè)家族由一組12個(gè)大腸埃希氏菌類目結(jié)合DNA序列組成，另外一個(gè)家族由一組10個(gè)輪狀病毒類目結(jié)合DNA序列組成，另外一個(gè)家族由一組15個(gè)賈第蟲類目結(jié)合DNA序列組成。該探針整體的家族復(fù)雜度為3，這是因?yàn)榻Y(jié)合整體中的所有探針時(shí)，需要不少于3種類型靶的基因組(大腸埃希氏菌，輪狀病毒，和賈第蟲)。
信號(hào)元件是指直接產(chǎn)生可檢測信號(hào)的分子或粒子。術(shù)語“直接產(chǎn)生”是指信號(hào)元件是可檢測信號(hào)的直接來源或決定性調(diào)節(jié)子。因此，如果信號(hào)是由熒光團(tuán)產(chǎn)生的光子，那么熒光團(tuán)是光子的直接來源，并因此是信號(hào)元件。如果信號(hào)是由RLS散射的光子，那么RLS粒子是信號(hào)元件。可選擇性地，如果信號(hào)是從辣根過氧化物酶的產(chǎn)色沉淀產(chǎn)物發(fā)射或散射的光，那么產(chǎn)色產(chǎn)物是信號(hào)元件。
信號(hào)元件的特征在于這種元件不能被分成若干部分，以致每個(gè)部分產(chǎn)生可與整體(特征，而不必是強(qiáng)度方面)比較的信號(hào)。因此，2nM直徑的量子點(diǎn)也是一種信號(hào)元件，隨著分開，它可改變所得毫微晶體的特征(發(fā)射譜)。用熒光染料，如熒光素浸滲的5μm粒子不是信號(hào)元件，這是因?yàn)樗杀环殖扇舾刹糠?，以致每個(gè)部分具有可與完整粒子相比較的信號(hào)特征。相反，分子熒光素是信號(hào)元件。產(chǎn)生信號(hào)的酶(例如，熒光素酶，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶)的可檢測產(chǎn)物也被認(rèn)為是信號(hào)元件。這種信號(hào)元件(或它們的前體，當(dāng)存在前體向信號(hào)元件化學(xué)轉(zhuǎn)化時(shí))可以是擴(kuò)散性物質(zhì)，不溶性產(chǎn)物，和/或不穩(wěn)定的中間體。例如，堿性磷酸酶可將化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star(NEN；目錄號(hào)NEL-601)轉(zhuǎn)化成活化產(chǎn)物，它是發(fā)射光子的信號(hào)元件。
信號(hào)傳遞部分是指含有或產(chǎn)生(在酶情況下)一種或多種信號(hào)元件的分子，粒子，或物質(zhì)，而且它與類目結(jié)合分子偶聯(lián)。信號(hào)傳遞部分可與類目結(jié)合分子共價(jià)或非-共價(jià)和直接或間接(例如，經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)連接物或“化學(xué)鍵”或通過與同一粒子偶聯(lián)的兩個(gè)部分)偶聯(lián)。信號(hào)傳遞部分的例子包括羧化量子點(diǎn)；被修飾用于結(jié)合核酸探針或抗體探針的熒光團(tuán)如Texas Red；涂覆鏈霉抗生物素的熒光聚苯乙烯粒子(其可與生物素化的類目特異性結(jié)合蛋白偶聯(lián))；含有重復(fù)核酸序列的滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物，其中每個(gè)核酸序列都可與用熒光修飾的核苷酸追蹤的若干寡核苷酸雜交，并在5’末端含有類目特異性結(jié)合寡核苷酸。信號(hào)傳遞部分可含有完全不同的元件。例如，在某些情況下，信號(hào)傳遞部分是與類目結(jié)合分子(例如，抗體)偶聯(lián)的酶(例如，堿性磷酸酶)。當(dāng)堿性磷酸酶的底物(例如，分別來源于NEN和Roche的CDP-Star，或BM紫)轉(zhuǎn)化成信號(hào)元件產(chǎn)物(例如，發(fā)射光子的不穩(wěn)定中間體，或可沉淀的產(chǎn)色產(chǎn)物)時(shí)，產(chǎn)生信號(hào)。對(duì)于類目結(jié)合分子，酶信號(hào)傳遞部分，和在不同反應(yīng)時(shí)間所用的底物而言，它是不尋常的。
信號(hào)傳遞部分復(fù)合物是指含有一個(gè)以上信號(hào)傳遞部分和一個(gè)以上類目結(jié)合分子的物質(zhì)實(shí)體。信號(hào)傳遞部分與類目結(jié)合分子在信號(hào)傳遞部分復(fù)合物中的締合必須是穩(wěn)定的(例如，信號(hào)傳遞部分和類目結(jié)合分子的復(fù)合物應(yīng)在4℃的PBS中具有至少1天的平均半衰期)。信號(hào)傳遞部分復(fù)合物的其中一個(gè)例子是涂覆兩種類型的上千個(gè)分子的聚苯乙烯微粒靶特異性抗體和堿性磷酸酶。這種信號(hào)傳遞部分復(fù)合物經(jīng)由偶聯(lián)的抗體類目結(jié)合分子與靶結(jié)合。當(dāng)與產(chǎn)色堿性磷酸酶底物(信號(hào)元件；例如，BM紫，Roche)培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生肉眼可檢測的有色斑點(diǎn)?？蛇x擇性地，相同的信號(hào)傳遞部分復(fù)合物，當(dāng)與化學(xué)發(fā)光或熒光堿性磷酸酶底物培養(yǎng)時(shí)，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或熒光信號(hào)。信號(hào)傳遞部分復(fù)合物的其它例子包括與熒光素標(biāo)記抗體偶聯(lián)的毫微金粒子，與寡核苷酸類目結(jié)合分子及acridinium酯偶聯(lián)的膠乳粒子，它可在加入過氧化氫后化學(xué)發(fā)光。
粒子是指小于50微米的物體或基質(zhì)。一群或一批粒子的大小被定義為粒子樣品最長一對(duì)正交維數(shù)的平均測量值。正交維數(shù)最長那對(duì)是指正交維數(shù)如下的這樣一對(duì)粒子其長度總和是粒子所有這種總和的最大值。如果2個(gè)粒子的樣品分別具有1微米×2微米和2微米×3微米的最長一對(duì)正交維數(shù)，那么最長那對(duì)正交維數(shù)的平均測量值是2微米[(1+2+2+3)/4＝2微米]。粒子樣品最長那對(duì)正交維數(shù)的平均測量值是，例如，小于50微米，小于20微米，或小于5微米。
很多粒子都具有某些固體的性質(zhì)。然而，分子骨架或復(fù)合物，雖然不是剛性的，但也可被定義為粒子。例如，dendrimer或其它支鏈分子結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為是粒子。同樣，脂質(zhì)體是另外一種類型的粒子。粒子可用信號(hào)元件染色或與信號(hào)元件偶聯(lián)。常?？捎眯g(shù)語反映粒子的大小或幾何形狀。例如，術(shù)語納米球，納米粒，或納米珠用于指代沿著任何規(guī)定軸測量時(shí)，小于1微米的粒子。同樣，術(shù)語微球，微?；蛭⒅橛糜谥复刂魏我?guī)定軸測量時(shí)，小于1毫米的粒子。粒子的例子包括膠乳粒，聚丙烯酰胺粒，磁鐵礦微粒，鐵流(磁性納米粒)，量子點(diǎn)等。
標(biāo)記粒子是指可特異性結(jié)合靶分子并產(chǎn)生信號(hào)的粒子。標(biāo)記粒子與信號(hào)傳遞部分和類目結(jié)合分子偶聯(lián)或穩(wěn)定締合。
靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物是指特異性結(jié)合一個(gè)或多個(gè)靶分子的標(biāo)記粒子。
標(biāo)記比是指在接觸步驟過程中，靶分子與標(biāo)記粒子的比例。例如，如果1×107個(gè)標(biāo)記粒子與含有1×108個(gè)靶分子的樣品接觸，那么標(biāo)記比為10。為了計(jì)算標(biāo)記比，僅僅考慮特異性結(jié)合于標(biāo)記粒子的靶分子。例如，物理上不可接近(如掩蔽于細(xì)胞腔室內(nèi))的靶分子不包括在計(jì)算內(nèi)。
信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分的信號(hào)特征是指由信號(hào)元件信號(hào)傳遞部分產(chǎn)生的信號(hào)情況，可用于區(qū)別它與其它信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分。例如，用熒光素和若丹明標(biāo)記的信號(hào)傳遞部分的信號(hào)特征是熒光。無線電詢答器的特征是無線電頻率。光子信號(hào)傳遞特征的例子是熒光，光散射，磷光，反射比，吸光度，化學(xué)發(fā)光，和生物發(fā)光。除后兩者外，所有光子信號(hào)傳遞的特征取決于外部照射(例如，白光源，激光源，或日光)。相反，化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光是不依賴外部光源的信號(hào)特征。
信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分的種類是指信號(hào)的不同性質(zhì)，可用于區(qū)別它與其它信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分。例如，用紅色染料標(biāo)記的脂質(zhì)體就可與帶有不同顏色的脂質(zhì)體區(qū)別開來。紅色是它的種類。對(duì)于傳播特定無線電頻率信號(hào)的微型發(fā)送器而言，將微型傳送器與其它微型傳送器區(qū)別開來的無線電頻率信號(hào)的性質(zhì)構(gòu)成信號(hào)元件的種類。
信號(hào)標(biāo)志是指試驗(yàn)中，結(jié)合靶類目的信號(hào)傳遞部分組合的區(qū)別信號(hào)性質(zhì)。與4種類型抗體結(jié)合的靶，即其中一個(gè)與熒光素分子偶聯(lián)，另外3個(gè)與若丹明分子偶聯(lián)，它們的信號(hào)標(biāo)志由熒光素和若丹明的組合加權(quán)的吸光度和發(fā)射譜描述。
試驗(yàn)或標(biāo)記類目結(jié)合分子整體的信號(hào)復(fù)雜度是指可在試驗(yàn)中或通過與整體結(jié)合而區(qū)別標(biāo)記的靶類目數(shù)?？蛇x擇性地，如果靶的每個(gè)類目成員都存在，信號(hào)復(fù)雜度被定義為預(yù)期出現(xiàn)的不同信號(hào)標(biāo)志數(shù)。對(duì)于某些試驗(yàn)而言，類目結(jié)合分子整體的信號(hào)復(fù)雜度與試驗(yàn)掃描的類目數(shù)相等。掃描多種類目的其它試驗(yàn)所具有的信號(hào)復(fù)雜度只為1。
選擇力是指用于捕獲，分離，移動(dòng)，或匯集靶的力。選擇力的例子包括重力，磁力，電力，離心力，向心力，浮力密度，和壓力。通過將選擇力單獨(dú)作用于靶上可使靶移動(dòng)?？蛇x擇性地，選擇力可特定作用在與選擇部分締合的靶上(見下面的定義)。
應(yīng)用選擇力使靶移動(dòng)的例子包括靶的離心；與磁性粒子結(jié)合的靶的磁性選擇；用金屬粒子標(biāo)記的靶的重力沉降；和利用真空過濾使靶在多孔膜上沉積。選擇力使用的其它例子包括在下面的實(shí)施例中。
選擇部分是指可與類目結(jié)合分子偶聯(lián)并賦予類目結(jié)合分子利用選擇力而被選擇性捕獲，分離，移動(dòng)，或匯集能力的原子，分子，粒子，或其它實(shí)體。當(dāng)類目結(jié)合分子選擇性部分的復(fù)合物與靶特異性結(jié)合時(shí)，通?？衫眠x擇力選擇性捕獲，分離，移動(dòng)，或匯集靶。這里所用的選擇性是指和與選擇部分無關(guān)的實(shí)體相比，利用選擇力優(yōu)先賦予選擇部分和相關(guān)實(shí)體的移動(dòng)靈敏度。
順磁粒子和鐵蛋白是選擇部分的例子。在溶液中滲透的密集二氧化硅粒子是另外一種類型的選擇部分。這種粒子，當(dāng)涂覆類目結(jié)合分子或與靶結(jié)合時(shí)，可使靶在水溶液中滲透，從而將結(jié)合靶與其它樣品的未結(jié)合成分分離。
選擇性特征是指用于捕獲，選擇或移動(dòng)選擇部分的選擇部分的情況。例如，順磁粒子的選擇特征是磁力。迅速滲透在水溶液中的二氧化硅粒子的選擇特征是聚集。
基本處于同一平面上的表面或底物是指可與虛平面平行排列的表面，這樣當(dāng)測量從表面上任何一個(gè)1mm×1mm正方形中的點(diǎn)到虛平面上最近點(diǎn)的距離時(shí)，平均距離的絕對(duì)值小于50微米。
檢測表面是指靶在上面沉積的、大概處于同一平面上的底物表面。在利用光子信號(hào)傳遞特征的實(shí)施方案中，如果檢測表面是光學(xué)透明的，那么檢測可經(jīng)由檢測表面的任何一面進(jìn)行。如果檢測表面是不透明的，那么檢測可經(jīng)由沉積了靶的檢測表面進(jìn)行。
檢測面積是指由本發(fā)明同時(shí)分析的檢測表面或檢測區(qū)的面積。檢測面積的最長線性尺寸通常大于1mm，例如，大于5mm，大于10mm，或大于15mm。例如，由光學(xué)裝置同時(shí)成像的載玻片的一部分可測量0.8cm×0.5cm，其中的光學(xué)裝置包括一個(gè)聚光透鏡和一個(gè)CCD芯片。檢測面積為0.4cm2。
檢測區(qū)是指靶在其中檢測的體積。檢測區(qū)具有與檢測面積相同的尺寸，深度與信號(hào)傳遞部分在其中檢測并鑒定的深度相應(yīng)。因此，檢測區(qū)的深度取決于評(píng)價(jià)正信號(hào)的臨界標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)利用光學(xué)檢測時(shí)，檢測區(qū)深度取決于視野的光學(xué)深度。
檢測面積的最長尺寸是指檢測面積周長上兩個(gè)點(diǎn)之間的最大直線長度。例如，如果檢測面積是0.3cm×0.4cm的長方形，那么檢測面積的最長尺寸是0.5cm的對(duì)角線。如果檢測面積是一個(gè)半-主軸長度為7mm，半-副軸長度為2.5mm的橢圓形，那么檢測面積的最長尺寸是14mm。
大面積檢測或大面積成像是指一種用于檢測顯微靶的方法，其中檢測面積(由檢測裝置同時(shí)分析的面積)大于靶。大面積檢測的檢測面積具有至少1個(gè)≥1mm的線性尺寸。相反，顯微靶基本較小，通常在至少2個(gè)正交維數(shù)中具有小于50μm的測量值。大面積檢測的例子包括用CCD照相機(jī)使一個(gè)9mm直徑的檢測面積成像；通過用CCD線掃描儀掃描而使一個(gè)2cm×1m的長方形成像，其中該掃描儀的長尺寸為1cm；利用在照相膠片上直接曝光而使一個(gè)含有微生物靶的4cm×4cm濾器成像；和在快速側(cè)流帶狀試驗(yàn)中，目測與1cm×3cm試驗(yàn)區(qū)域上的顯微靶相對(duì)應(yīng)的有色斑點(diǎn)。
很多技術(shù)都可掃描含有顯微靶的樣品，但不能利用大面積檢測。例子包括流式細(xì)胞術(shù)；固相激光微束掃描細(xì)胞術(shù)；液相掃描(Tibbe等，Nat Biotechnol 171210-3，1999)；以及利用高倍顯微鏡，使載玻片上的多個(gè)視野成像并檢測。
偶聯(lián)或穩(wěn)定締合是指兩個(gè)實(shí)體之間的締合，其中在4℃的PBS中，締合的平均半衰期最少為1天。例如，被動(dòng)蛋白吸附聚苯乙烯粒子。有很多不同種類的吸附蛋白。某些蛋白與表面穩(wěn)定締合，具有幾個(gè)月的半衰期。其它蛋白，如松散結(jié)合在吸附蛋白外層上的那些，可能并不與粒子穩(wěn)定締合，而且可在幾小時(shí)內(nèi)浸出。
像增強(qiáng)器或映像管是指放大光子信號(hào)傳遞的裝置，見Inoué的專業(yè)詞典，Shinya等，Video microscopythe fundamentals(PlenumPress，New York，1997；p.665)“一種(通過纖維光學(xué)或透鏡)與攝像管連接從而增加靈敏度的裝置”。增強(qiáng)器是一個(gè)在前端具有光電陰極的真空管，它可根據(jù)聚焦在它上面的像發(fā)射電子，它還具有一個(gè)將電子聚焦在后端磷光體上的電子透鏡和/或微通道板，以及一個(gè)增加電子能量的高壓加速器。可以是單級(jí)或多級(jí)的。各種像增強(qiáng)器在同一篇參考文獻(xiàn)的第8章中詳細(xì)描述。
對(duì)檢測面積一部分中的靶同時(shí)檢測是指一步檢測來源于基本處于同一平面的檢測表面部分的信號(hào)。同時(shí)檢測的例子是用CCD芯片、目測、或基于光電二極管的信號(hào)積分來檢測在檢測面積中大面積成像的靶。
靜止期的靶是指不移動(dòng)的靶。例如，固定于載玻片上的靶就處于靜止期。被微量滴定皿孔底上的固定位置中的類目結(jié)合分子捕獲的靶也處于靜止期。甚至是沒被固定在表面上，而且可通過流體動(dòng)力或其它力移動(dòng)的靶也被認(rèn)為處于靜止期，在檢測/成像過程中，以大于10秒的間隔拍攝的連續(xù)像基本可檢測基本處于同一相對(duì)位置的相同靶。流式細(xì)胞術(shù)中的靶不處于靜止期。然而，由與側(cè)流試驗(yàn)的固相試驗(yàn)區(qū)結(jié)合的抗體所捕獲的靶處于靜止期。
均相測定法或均相免疫測定法是指反應(yīng)物沒有從已完成測定法的產(chǎn)物中完全除去的測定法或免疫測定法。
鑒定是指確定屬于其中成員的靶的類目。例如，掃描靶多個(gè)類目的側(cè)流試驗(yàn)中，每個(gè)都可能存在于樣品中。屬于特定類目的靶在結(jié)合了相應(yīng)類目特異性抗體的薄膜區(qū)被捕獲。已知薄膜區(qū)含有捕獲抗體，靶可由發(fā)生捕獲的區(qū)鑒定。
樣品是指可利用本發(fā)明掃描其中是否存在靶的物質(zhì)。
連接依賴性多態(tài)性探針對(duì)表示一組寡核苷酸類目結(jié)合分子(其中該組含一個(gè)以上寡核苷酸)，當(dāng)與基因組雜交時(shí)，在多態(tài)性位點(diǎn)相鄰。探針對(duì)中的一個(gè)寡核苷酸包含與基因組多態(tài)性位點(diǎn)一側(cè)的基因組序列互補(bǔ)的序列，而另一核苷酸包含與多態(tài)性位點(diǎn)另一側(cè)互補(bǔ)的序列。當(dāng)相鄰地與基因組雜交時(shí)，僅僅當(dāng)靶定的位點(diǎn)處的等位基因或基因型與多態(tài)性探針的寡核苷酸的鄰接序列匹配時(shí)，一組這樣的寡核苷酸可以彼此有效連接。連接依賴性多態(tài)性探針對(duì)的結(jié)構(gòu)和用途示于

圖18和19。一般地，合成一組相應(yīng)于特定位點(diǎn)的每個(gè)等位基因的多態(tài)性探針。多態(tài)性探針可以包括各種功能部分，包括，信號(hào)傳遞部分、選擇部分、化學(xué)間隔基或束縛物、標(biāo)志、擴(kuò)增位點(diǎn)和半抗原。對(duì)于SNP探針的使用的例子，見實(shí)施例14和15。
延伸依賴性多態(tài)性探針表示設(shè)計(jì)用于與一種序列雜交的核酸類目結(jié)合分子，以便探針的3’末端位于與有待通過試驗(yàn)檢測的多態(tài)性位點(diǎn)堿基配對(duì)的幾個(gè)核苷酸內(nèi)。延伸依賴性多態(tài)性探針的模板依賴性延伸被用于差別標(biāo)記依賴于多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因的探針。例如，考慮設(shè)計(jì)用于緊鄰地雜交于在模板鏈上具有“A”或“C”的多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸，以便寡核苷酸的3’末端緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)。在適當(dāng)條件下，在DNA聚合酶存在下，用標(biāo)記了發(fā)射綠色的熒光團(tuán)的TTP和標(biāo)記了紅色熒光團(tuán)的dGTP培養(yǎng)雜交體，可以導(dǎo)致依賴于模板鏈的等位基因的探針的差別標(biāo)記。
等位基因特異性雜交探針表示在規(guī)定的條件下與不同的核酸等位基因差別雜交的寡核苷酸類目結(jié)合分子。例如，熟悉本領(lǐng)域的人可以確定12個(gè)堿基的核苷酸可以與精確匹配的DNA片段有效雜交，但是相同寡核苷酸不能與寡核苷酸中12個(gè)堿基中的11個(gè)匹配的DNA片段有效雜交的條件。
接目測是指除了佩戴矯正透鏡外，在不借助儀器的情況下目測。例如，直接目測可用于檢測某些快速側(cè)流試驗(yàn)中，納米金粒子的微紅反射信號(hào)。
光電檢測器是指將光子信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的人造裝置或儀器。光電檢測器的例子包括CCD檢測器，光電倍增管檢測器，和光電二極管檢測器，例如，雪崩光電二極管。
照射是指用電磁輻射照射?？墒褂酶鞣N波長的電磁輻射照射。它包括，例如，用光譜的X-射線，UV，可見，或紅外區(qū)照射，值得注意的是，在可見范圍中，照射不是必需的。
具有光子信號(hào)傳遞特征的信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分是指可通過光子的發(fā)射，反射，散射，折射，吸收，捕獲，或重定向，或光子行為的任何其它調(diào)制或組合而檢測的信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分。具有光子信號(hào)傳遞特征的信號(hào)元件或信號(hào)傳遞部分的一些例子包括熒光團(tuán)Texas Red(熒光信號(hào)特征)；CDP-Star(化學(xué)發(fā)光信號(hào)傳遞特征)；熒光素酶(生物發(fā)光信號(hào)特征)；共振光散射粒子(光散射信號(hào)特征)；BM紫(光吸收或產(chǎn)色信號(hào)傳遞特征)；和正向-轉(zhuǎn)換的磷光體(兩個(gè)較長波長光子的吸收和一個(gè)較短波長光子的發(fā)射)。
‘?dāng)?shù)目’ב溶液名稱’是指這樣一種水溶液，它的溶液濃度為這個(gè)數(shù)目的倍數(shù)(水除外)。例如，10×EE含有10mM EDTA/100mM EPSS(EE，或1×EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE是1mM EDTA/10mM EPPS溶液。在將它們混合之前，用NaOH將兩個(gè)成分的共軛酸調(diào)節(jié)至pH 8.0。
HYB是用于雜交的溶液，含有1M NaCl，50mM EPSS pH 8.0，2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母tRNA(Sigma)。
UBB(通用結(jié)合緩沖液)是用于結(jié)合各種類型類目結(jié)合分子(如抗體及核酸)的混合物的溶液，含有250mM NaCl，50mM EPPS pH 8.0，2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母tNRA(Sigma)。
BB(封閉緩沖液)含有100mM EPPS pH 8.0/150mM NaCl/2％封閉試劑(Boehringer Mannheim)。
PB是0.1M磷酸鈉緩沖液，pH 7.4。
PBS是磷酸鹽-緩沖生理鹽水溶液，含有120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸鹽緩沖液(鈉鹽)pH 7.4。
PBS-B是BSA的0.1％PBS溶液(沒有IgG；Sigma目錄號(hào)A-7638)。
PBS-T是Triton X-100的0.05％PBS溶液(Sigma目錄號(hào)X-100)PBS-TB是PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100。
PBT是PBS/0.1％BSA(沒有IgG；Sigma目錄號(hào)A-7638)/0.05％Tween-20(Sigma目錄號(hào)X-100)LB是用于生長細(xì)菌并按照先前所述(Ausubel 1987，supra)制備的Luria肉湯。
SSC是用HCl調(diào)節(jié)至pH 7.0的150mM NaCl/15mM檸檬酸鈉MES是(2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸)MESB是0.05M MES(2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸)，pH 6.1EDAC是(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基))碳二亞胺連接緩沖液是10mM MgCl2/50mM Tris-HCl/10mM二硫蘇糖醇/1mMATP/25μg/μl牛血清白蛋白。
AP堿性磷酸酶BAL支氣管肺泡的灌洗BSA牛血清白蛋白CCD荷電耦聯(lián)裝置CFTR囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器cfu集落形成單位(與活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌濃度測量值)CMV巨細(xì)胞病毒FITC異硫氰酸熒光素HBV乙型肝炎病毒HCV丙型肝炎病毒HIV人免疫缺損病毒pfu噬斑形成單位(與感染病毒顆粒數(shù)對(duì)應(yīng)的病毒濃度測量值)PNA肽核酸RSV呼吸道合胞病毒TCID50燒瓶50％感染的組織培養(yǎng)感染劑量XhoL是具有序列5′-GGGCCCCCCCTCGATC-3′的寡核苷酸引物。
XhoR是具有序列5′-ATCGATACCGTCGACCTC-3′的寡核苷酸引物。
除非另有說明，寡核苷酸序列是按照5’-3’方向表示的。
除非另有說明，說明書中描述的微生物株是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA獲得的。
附圖簡述圖1.用CCD陣列對(duì)產(chǎn)生信號(hào)的各個(gè)粒子進(jìn)行不放大的大面積成像的原理采用本發(fā)明，用抗IL-2抗體(類目結(jié)合分子)涂覆的熒光標(biāo)記粒子與血液中的IL-2蛋白分子(靶分子)結(jié)合。得到的復(fù)合物與微量滴定皿的孔底部的捕獲抗體結(jié)合。去除未結(jié)合的標(biāo)記粒子。照射時(shí)，捕獲的標(biāo)記粒子發(fā)出熒光，發(fā)射撞擊在CCD芯片像素上的光子。標(biāo)記粒子的數(shù)量和位置由自動(dòng)像分析解釋。該圖通過不包括光學(xué)成分和其它硬件進(jìn)行簡化。
圖2.以微量滴定孔形式檢驗(yàn)血樣該圖表示如何使用對(duì)各個(gè)標(biāo)記粒子的成像來檢測靶分子，在此處是蛋白。
圖3.進(jìn)行大面積成像的CCD成像裝置圖中描述的CCD成像器用于收集在實(shí)施例中描述的大量數(shù)據(jù)(見詳述部分的步驟6)。激發(fā)光是通過將光從高強(qiáng)度白光源(1000瓦Xenon弧光燈，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)引入到液體光導(dǎo)(芯直徑5mm，Model 380，PhotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)中提供的。液體光導(dǎo)可將光傳送給激發(fā)濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)并將濾過的光束(通常直徑為9mm)對(duì)準(zhǔn)含有標(biāo)記靶的檢測表面。該儀器可檢測各種檢測表面(例如，多孔膜，顯微鏡載玻片，微量滴定皿，蓋玻片，和底部平坦，且光學(xué)透明的試管)上的標(biāo)記靶。入射光穿透檢測表面，誘導(dǎo)信號(hào)傳遞部分中的熒光，該信號(hào)傳遞部分經(jīng)由類目結(jié)合分子與靶結(jié)合，并沉積在光學(xué)透明的表面上。發(fā)射熒光的一部分是通過高-收集效率的透鏡系統(tǒng)收集的，并通過發(fā)射濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics)傳輸給CCD照相機(jī)(OrcaII，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
圖4.進(jìn)行不放大的大面積成像的CCD成像系統(tǒng)該圖表示具有角形照射結(jié)構(gòu)的CCD成像器，其中光被傳到收集透鏡側(cè)面斜角處的檢測表面(這里表示為微量滴定平板的孔底)上。選擇適當(dāng)角度從而優(yōu)化收集效率，并避免收集透鏡對(duì)入射光束的阻礙。這種結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)在于源于樣品支持物底部表面的反射沒有被收集透鏡收集，因此不會(huì)造成熒光背景干擾。
圖5.使用電、瞬時(shí)膠片和無輔助的目測進(jìn)行不放大的各個(gè)顯微標(biāo)記粒子的檢測(實(shí)施例1)該圖證明了本發(fā)明使用各種檢測方法，在不放大的條件下檢測大的檢測面積中各個(gè)顯微標(biāo)記粒子的能力。采用瞬時(shí)膠片、CDC照相機(jī)和無輔助的目測檢測堿性磷酸酶涂覆的各個(gè)標(biāo)記粒子。通過肉眼可見的相同顏色的點(diǎn)適于圖像的中心圖片，該圖像是用數(shù)字照相機(jī)采集的。
圖6.用于采用不放大的大面積成像檢測低數(shù)量細(xì)菌的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)(實(shí)施例2)
該圖表示采用不放大的大面積成像進(jìn)行的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。示出了來自多個(gè)測試條的捕獲和對(duì)照線的像，測定中加入了不同數(shù)量的大腸埃希氏菌。柱狀圖說明隨著大腸埃希氏菌的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。該圖證明了檢測樣品中低數(shù)量細(xì)菌的能力。
圖7.用于采用不放大的大面積成像檢測低水平蛋白的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)(實(shí)施例3)該圖示出了用于使用側(cè)流形式和不放大的大面積成像的細(xì)胞因子蛋白IL-2的超靈敏試驗(yàn)的結(jié)果。在該圖中可見來自多個(gè)測試條的捕獲和對(duì)照線的像，測定中加入了不同濃度的IL-2。柱狀圖說明隨著IL-2的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。該圖證明了檢測樣品中低水平蛋白的能力。
圖8.用于采用不放大的大面積成像檢測血清中的低水平蛋白的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)(實(shí)施例4)該圖表示用于血清中的IL-2的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。在該圖中可見來自代表性測試條的捕獲和對(duì)照線的像。最左側(cè)的條表示陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照與中間(20pg/ml)和右側(cè)(200pg/ml)的條進(jìn)行比較時(shí)，很明顯隨著IL-2的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。底部的柱狀圖表示與加入的IL-2量相關(guān)的5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值的信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)誤柱表示重復(fù)信號(hào)之間的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)表示本發(fā)明可以檢測濃度為20pg/ml血清的IL-2，證明該測定檢測甚至是復(fù)雜樣品中極低水平的靶蛋白。
圖9.用于采用不放大的大面積成像多路檢測蛋白和細(xì)菌的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)(實(shí)施例5)該圖表示采用不放大的大面積成像進(jìn)行的多路側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。該圖表示應(yīng)用了含有(從左到右)大腸埃希氏菌和IL-2、單獨(dú)的大腸埃希氏菌、單獨(dú)的IL-2、以及即不含IL-2也不含大腸埃希氏菌的樣品的測試條的捕獲和對(duì)照線的像。該圖證明了靈敏側(cè)流試驗(yàn)可以檢測同一測定中的多個(gè)靶分子。
圖10.利用瞬時(shí)膠片檢測低水平蛋白的超靈敏化學(xué)發(fā)光側(cè)流試驗(yàn)(實(shí)施例7)該圖表示使用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記粒子和瞬時(shí)膠片檢測的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。示出了代表性測試條的捕獲和對(duì)照線。施用了含IL-2(從左到右0，20，200，and 2000pg/ml)的樣品的測試條的比較表明隨著IL-2的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明可以使用瞬時(shí)膠片檢測濃度低至20pg/ml的IL-2。因此，該試驗(yàn)是超靈敏、迅速、容易進(jìn)行并且非常昂貴。
圖11.使用捕獲線選擇靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物的試驗(yàn)設(shè)備的概圖(實(shí)施例8)該圖表示用于該實(shí)施例中的設(shè)備的構(gòu)建。將樣品加載到樣品區(qū)中，在此它側(cè)流進(jìn)入偶聯(lián)物墊。在裝置遠(yuǎn)端的吸附墊牽拉樣品，溶解和固定檢測珠，該樣品流經(jīng)測定線。
圖12.使用捕獲線形式的蛋白的超靈敏試驗(yàn)該圖表示捕獲線試驗(yàn)的結(jié)果。該圖表示來自施用了含IL-2(0、20和200pg/ml)的樣品的試驗(yàn)的捕獲和對(duì)照線的像。結(jié)果表明該試驗(yàn)可以檢測濃度為20pg/ml的IL-2。此外，捕獲線的濃度依賴性斑點(diǎn)狀外觀表明，對(duì)各個(gè)標(biāo)記粒子進(jìn)行了成像。
圖13.使用不放大的大面積成像和固相捕獲免疫測定對(duì)蛋白分子進(jìn)行的靈敏檢測(實(shí)施例9)該圖表示使用結(jié)合于固相以捕獲蛋白的抗體掃描樣品中的人蛋白細(xì)胞因子IL-2的試驗(yàn)。用抗IL-2抗體涂覆微量滴定板的孔。向孔中加入IL-2標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋液。培養(yǎng)1小時(shí)后，洗掉所有未結(jié)合的粒子，向孔中加入抗IL-2涂覆的熒光粒子。洗滌后，在CCD成像儀中進(jìn)行不放大的顯像。陰性對(duì)照(抗腺病毒顆粒組)表明在孔中保留了非常少的粒子。在IL-2組中，可見隨著IL-2標(biāo)準(zhǔn)物的增加，信號(hào)增加。信號(hào)是由于抗IL-2涂覆的孔、IL-2和抗IL-2涂覆的顆粒之間的相互作用。該圖表明測定方法的靈敏度(定義為平均陰性對(duì)照之上和之下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)，其中IL-2濃度與靈敏度相關(guān)。
圖14.使用不放大的大面積成像和液相捕獲對(duì)蛋白分子進(jìn)行的靈敏檢測(實(shí)施例10)該圖表示用“雙珠”液相夾心方法掃描樣品中的人蛋白細(xì)胞因子IL-2的試驗(yàn)的結(jié)果。將IL-2標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋液與抗IL-2涂覆的磁性和熒光粒子混合。培養(yǎng)2小時(shí)后，將磁性粒子和任何結(jié)合的粒子與其它物質(zhì)分離，轉(zhuǎn)移到微量滴定板，并且在在CCD成像儀中進(jìn)行不放大的顯像。陰性對(duì)照(無IL-2粒子組)表明在孔中保留了非常少的粒子。在IL-2組中，可見隨著IL-2標(biāo)準(zhǔn)物的增加，信號(hào)增加。IL-2組表現(xiàn)出由磁性粒子捕獲的成千個(gè)抗IL-2涂覆的熒光粒子，這是由于它們與IL-2的相互作用。該圖表明測定方法的靈敏度(定義為平均陰性對(duì)照之上和之下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)，其中IL-2濃度與靈敏度相關(guān)。
圖15.使用不放大的大面積成像檢測多種人細(xì)胞因子的免疫測定(實(shí)施例11)該圖表示用于在微量滴定皿中超靈敏檢測多種蛋白的免疫測定策略。
圖16.使用不放大的大面積成像檢測總(結(jié)合的+游離的)細(xì)胞因子IL-2的競爭性免疫測定(實(shí)施例12)該圖表示競爭性免疫測定的概要。用抗IL-2捕獲抗體涂覆微量滴定皿孔，該抗體結(jié)合暴露于細(xì)胞因子的游離和結(jié)合形式的表位。該樣品與IL-2生物素偶聯(lián)物混合，該偶聯(lián)物與樣品中的細(xì)胞因子競爭結(jié)合捕獲抗體?；旌衔镏幸舶ńY(jié)合于IL-2生物素偶聯(lián)物的鏈親和素涂覆的熒光粒子。熒光粒子結(jié)合于孔的程度達(dá)到了偶聯(lián)物與樣品中的細(xì)胞因子競爭捕獲抗體位點(diǎn)，這樣，結(jié)合的熒光粒子數(shù)反應(yīng)了樣品中的總細(xì)胞因子濃度?？椎撞康牟环糯蟮拇竺娣e成像量化了熒光粒子結(jié)合于捕獲抗體的程度。
圖17.使用量尺形式和不放大的大面積成像靈敏檢測核酸分子(實(shí)施例13)該圖表示使用量尺形式和不放大的大面積成像檢測病毒DNA的測定的結(jié)果。將生物素化的病毒DNA的稀釋液點(diǎn)樣到尼龍膜上。作為陰性對(duì)照，也點(diǎn)樣非生物素化的病毒DNA。封閉以阻止非特異性結(jié)合后，將膜條帶浸入含有親和素涂覆的紅色熒光珠的溶液。珠溶液通過毛細(xì)作用向膜上遷移，并且在該過程中與濾膜結(jié)合的DNA接觸，洗滌膜，然后通過基于CCD的不放大的大面積成像進(jìn)行分析。圖中的像中的亮點(diǎn)表示從單個(gè)膜條帶上的多個(gè)DNA點(diǎn)獲得的熒光信號(hào)。每個(gè)點(diǎn)中的DNA的拷貝數(shù)表示在每個(gè)像的右側(cè)。左邊的圖表示DNA點(diǎn)如何在量尺上定位。
圖18.使用側(cè)流形式和不放大的大面積成像進(jìn)行不放大的多路SNP分析寡核苷酸連接和加樣該圖示出了實(shí)施例15中描述的試驗(yàn)的前幾個(gè)步驟，試驗(yàn)的最后幾個(gè)步驟示于圖19。成對(duì)的等位基因特異性寡核苷酸與基因組DNA雜交。對(duì)中的一個(gè)成員是生物素化的(圖中具有黃色三角的寡核苷酸)。對(duì)中的另一個(gè)成員具有相應(yīng)于單核苷酸多態(tài)性的末端核苷酸，并且具有獨(dú)特的多態(tài)性特異性寡核苷酸標(biāo)記物(圖中帶有明確的堿基-A，T，G，或C的寡核苷酸)。連接后，將寡核苷酸加樣到側(cè)流色譜條帶。寡核苷酸標(biāo)記物序列雜交于排列在側(cè)流膜上的條帶中的標(biāo)記物互補(bǔ)序列。僅僅相應(yīng)于基因組DNA中的多態(tài)性的標(biāo)記物序列與生物素化的寡核苷酸連接。因此，僅僅相應(yīng)于基因組DNA樣品中的多態(tài)性的標(biāo)記物互補(bǔ)序列的條帶與生物素化的寡核苷酸雜交。
圖19.使用側(cè)流形式和不放大的大面積成像進(jìn)行不放大的多路SNP分析檢測該圖示出了實(shí)施例15中描述的試驗(yàn)的后幾個(gè)步驟，試驗(yàn)的前幾個(gè)步驟示于圖18。如圖18所示，在側(cè)流層析后，生物素分子將與含有相應(yīng)于基因組DNA樣品的基因型的標(biāo)記物的膜上的條帶締合。通過結(jié)合于涂覆了鏈親和素(結(jié)合于生物素部分)和堿性磷酸酶的粒子檢測該條帶的圖樣。加入產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物的堿性磷酸酶的底物后，用CCD成像儀檢測含有生物素化的寡核苷酸的條帶。
發(fā)明詳述發(fā)明概述.本發(fā)明可迅速并節(jié)省成本地掃描含有低水平靶分子的最少加工樣品。本發(fā)明提供的有效特征是由一種新的診斷方法提供的，它結(jié)合了現(xiàn)代高強(qiáng)度標(biāo)記，低成本成像技術(shù)，和不放大的大面積檢測。
圖1圖示了用不放大的成像檢測少量鋪展在大面積上的顯微標(biāo)記物。圖1描述的實(shí)施方案使用數(shù)字相機(jī)(CCD芯片)捕獲比各個(gè)標(biāo)記粒子大很多的面積的像。CCD芯片具有光敏像素元件的陣列。來源于檢測面積中一個(gè)位置上的“正在發(fā)光”粒子的光影響CCD 芯片相應(yīng)位置的像素元件。終端用戶從計(jì)算機(jī)接收有關(guān)樣品中粒子數(shù)的信息，而計(jì)算機(jī)可加工從CCD芯片獲得的像數(shù)據(jù)(即，受照射的像素的數(shù)量和強(qiáng)度)。
為了更好理解本發(fā)明使用的原理，考慮具體的實(shí)施方案是有幫助的。圖1示出了對(duì)血樣中的人蛋白細(xì)胞因子IL-2進(jìn)行定量的方法。用結(jié)合于IL-2分子上的一個(gè)位點(diǎn)的抗體涂覆帶有光學(xué)透明底的微量滴定皿的孔。在孔中加入一滴含有IL-2分子的血液。也向孔中加入熒光粒子(用分子熒光素染色)。也用特異性結(jié)合于IL-2的抗體涂覆這些顆粒(盡管這些抗體結(jié)合于與捕獲抗體結(jié)合的位點(diǎn)不同的位點(diǎn))。血液中的IL-2分子結(jié)合熒光珠和捕獲抗體，在孔底部形成“夾心”。夾心形成的結(jié)果是熒光珠錨定于孔的底部。當(dāng)不存在IL-2時(shí)，不形成夾心，并且沒有熒光珠錨定于孔的底部。血液中的IL-2越多，被IL-2涂覆的珠越多，錨定于孔底部的珠也越多。下一個(gè)步驟是對(duì)這些珠進(jìn)行成像和計(jì)數(shù)。
用熒光素激發(fā)范圍內(nèi)的光照射孔底部(檢測面積)，可以引發(fā)錨定于孔底部的熒光珠發(fā)射熒光。采集粒子的熒光像，不經(jīng)過放大，將發(fā)射的光聚焦在CCD芯片的表面上。每個(gè)粒子的熒光會(huì)撞擊一個(gè)像素或一小簇像素，引起局部電信號(hào)從CCD芯片向計(jì)算機(jī)傳送，并以像文件的形式存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。像分析軟件可通過計(jì)算響應(yīng)粒子所發(fā)出光的像素簇?cái)?shù)而計(jì)算錨定于孔底部的珠數(shù)。
本發(fā)明利用多種類型的形式，包括標(biāo)記方法，類目結(jié)合分子，和檢測方法構(gòu)造試驗(yàn)。然而，該試驗(yàn)有若干共有的重要特征。下面將描述本發(fā)明很多實(shí)施方案共有的步驟和過程。
本發(fā)明的一般方法包括下列步驟步驟1設(shè)計(jì)試驗(yàn)問題，選擇樣品、試驗(yàn)形式和類目結(jié)合分子步驟2制備標(biāo)記粒子步驟3使樣品中的靶分子與標(biāo)記粒子結(jié)合步驟4選擇或捕獲靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物步驟5通過檢測選擇或捕獲的靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物而鑒定并量化樣品中存在的靶分子步驟1設(shè)計(jì)試驗(yàn)問題，選擇樣品、試驗(yàn)形式和類目結(jié)合分子設(shè)計(jì)試驗(yàn)要解答的問題是建立基于本發(fā)明的新檢測方法的第一步。工業(yè)和臨床微生物學(xué)家必須解決的重要問題的一些例子列于表2。明確的試驗(yàn)問題一般確定必須檢驗(yàn)的樣品類型(如環(huán)境水、尿、或藥物成品)。樣品類型和體積是選擇試驗(yàn)形式的重要參數(shù)。
表2
試驗(yàn)形式的選擇是基于一些因素，包括樣品體積、樣品內(nèi)容(即存在顆粒還是細(xì)胞)、靶的類目數(shù)、操作者的技術(shù)水平、價(jià)格限制。例子包括熟悉的側(cè)流和微量滴定皿形式，以及新的形式。下文的實(shí)施例中描述了多種形式。
設(shè)計(jì)了試驗(yàn)問題后，靶分子的類目就明確了。這些是試驗(yàn)檢測的分子。對(duì)于研究樣品中一組小分子(如濫用的藥物)或心血管疾病的蛋白標(biāo)記的試驗(yàn)，靶分子分別簡單地是濫用的藥物或蛋白標(biāo)記。對(duì)于研究樣品中更復(fù)雜靶如細(xì)菌病原體或含有與白血病相關(guān)的含蛋白的白細(xì)胞)的研究(，靶分子是靶的特征性或特異性分子。
一旦明確了靶分子的類目，選擇類目結(jié)合分子。類目結(jié)合分子與靶分子特異性結(jié)合。本發(fā)明支持多種適于不同靶分子的類目結(jié)合分子。例如，抗體可以用作多種靶分子(如激素、糖和蛋白)的類目結(jié)合分子。對(duì)于確定個(gè)體的基因組成，例如，可以使用DNA寡核苷酸。
步驟2制備標(biāo)記粒子在不進(jìn)行光學(xué)放大或不使用昂貴器械的情況下，本發(fā)明檢測各個(gè)顯微靶分子的能力取決于以高信號(hào)強(qiáng)度特異性標(biāo)記靶分子。標(biāo)記是經(jīng)由與類目結(jié)合分子締合使標(biāo)記粒子與靶分子特異性結(jié)合而獲得的。標(biāo)記粒子具有兩種功能信號(hào)產(chǎn)生和特異性結(jié)合。各種粒子組合物、信號(hào)產(chǎn)生部分和類目結(jié)合分子都可以用于制備具有這些功能的標(biāo)記粒子。
為制備結(jié)合于步驟1選擇的靶分子的標(biāo)記粒子，使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(見，例如，Hermanson，G.，BioconjugateTechniques(Academic Press，1996)和下文的具體實(shí)施例)將類目結(jié)合分子偶聯(lián)于粒子。有時(shí)使用相同的一組偶聯(lián)技術(shù)將信號(hào)傳遞部分偶聯(lián)于粒子(例如，用于酶促信號(hào)傳遞部分)。
使用多種類型的信號(hào)傳遞部分使粒子發(fā)射用于給定試驗(yàn)的適當(dāng)類型的強(qiáng)信號(hào)。例如，可以用熒光染料對(duì)聚苯乙烯珠(如1微米直徑)等微粒染色，產(chǎn)生強(qiáng)熒光粒子?？梢詫晒馊旧木郾揭蚁┪⒘?如直徑1微米)摻入幾百萬個(gè)熒光團(tuán)信號(hào)傳遞部分?；蛘?，可以將粒子偶聯(lián)于酶促信號(hào)傳遞部分，如堿性磷酸酶，該部分可以催化熒光、化學(xué)發(fā)光或可見顏色的產(chǎn)物形成。其它類型的標(biāo)記粒子包括量子點(diǎn)和共振光散射粒子。這些小粒子也可以與更大的粒子復(fù)合，以增加信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)復(fù)雜度。
本發(fā)明同時(shí)掃描多種不同靶分子類目的能力來自區(qū)別來源于不同靶分子類目的信號(hào)的能力。本發(fā)明以兩種一般途徑區(qū)別靶分子類目。其中一種方法，也被稱作信號(hào)區(qū)別，是用信號(hào)傳遞部分標(biāo)記類目結(jié)合分子的每個(gè)類目特異性家族，這樣它就具有獨(dú)特的信號(hào)標(biāo)志。產(chǎn)生并檢測大量不同信號(hào)標(biāo)志的能力(即，高信號(hào)復(fù)雜度)可構(gòu)造掃描靶若干類目的試驗(yàn)(即，高度多路的試驗(yàn))。區(qū)別靶多個(gè)類目的其它方法，即幾何區(qū)別，依賴于在檢測面積的不同區(qū)中沉積不同類目的靶?？刹灰蕾囉谛盘?hào)傳遞部分的信號(hào)標(biāo)志的幾何區(qū)別例如用于多路側(cè)流試驗(yàn)。幾何區(qū)別在下面步驟4討論。
本發(fā)明可利用不同類型的信號(hào)特征，包括熒光，散射光，光偏振，無線電波，粒度，磁場，化學(xué)發(fā)光和放射性。信號(hào)傳遞部分的例子和利用各種信號(hào)特征的檢測方案在下面給出。在一個(gè)信號(hào)特征內(nèi)可有多個(gè)信號(hào)傳遞種類。例如，如果信號(hào)特征是熒光，各種特征發(fā)射光譜包括信號(hào)傳遞種類(例如，紅色熒光，綠色熒光，和藍(lán)色熒光)。可選擇性地，作為另一個(gè)例子，認(rèn)為紅色熒光微粒是用不同濃度的相同熒光團(tuán)染色的。熒光也是信號(hào)特征，然而在這種情況下，不同強(qiáng)度的粒子構(gòu)成信號(hào)特征的種類，即，熒光強(qiáng)度是區(qū)分一組粒子與另一組粒子的信號(hào)特征的性質(zhì)。
獲得高信號(hào)復(fù)雜度對(duì)于發(fā)展掃描若干類型靶分子的試驗(yàn)(即，具有高度類目復(fù)雜度的試驗(yàn))很有用。
獲得高信號(hào)復(fù)雜度.混合物中可區(qū)別的標(biāo)記(或信號(hào)傳遞部分)數(shù)被稱作信號(hào)復(fù)雜度。對(duì)于高度多路的試驗(yàn)而言，使用具有高信號(hào)復(fù)雜度的信號(hào)傳遞部分有時(shí)是有利的。可與本發(fā)明聯(lián)合使用產(chǎn)生高信號(hào)復(fù)雜度的3種一般方法是(1)區(qū)別標(biāo)記.(2)組合標(biāo)記.和(3)比例標(biāo)記。
1.對(duì)于區(qū)別標(biāo)記而言，不同探針家族中的探針是用單一信號(hào)傳遞部分標(biāo)記的，其可在所有其它信號(hào)傳遞部分存在的實(shí)驗(yàn)中很容易地檢測。迄今為止，很難獲得高信號(hào)復(fù)雜度的區(qū)別標(biāo)記。這是因?yàn)榻^大多數(shù)標(biāo)記方法使用光學(xué)信號(hào)(例如，產(chǎn)色，熒光，化學(xué)發(fā)光)或放射性標(biāo)記。由于光學(xué)信號(hào)的光譜帶寬和現(xiàn)有儀器可檢測信號(hào)的有限范圍，可使用光學(xué)信號(hào)分辨的信號(hào)復(fù)雜度較小。例如，由于光譜重疊，具有不同發(fā)射光譜的很多熒光團(tuán)的分辨目前是不可能的?？梢杂糜谶M(jìn)行區(qū)別標(biāo)記的一種方法是使用微型轉(zhuǎn)發(fā)器(如美國專利第6,001,571)。每個(gè)微型轉(zhuǎn)發(fā)器發(fā)射不溶的無線電波標(biāo)志。因此，用微型轉(zhuǎn)發(fā)器和其它正在開發(fā)的區(qū)別標(biāo)記方法進(jìn)行標(biāo)記有可能與本發(fā)明結(jié)合使用。
2.本發(fā)明所用獲得高信號(hào)復(fù)雜度的其它方法是應(yīng)用組合標(biāo)記方法。組合標(biāo)記是使用相對(duì)少數(shù)的不同信號(hào)傳遞部分獲得高信號(hào)復(fù)雜度的技術(shù)。使用這種方法，不同組合的信號(hào)傳遞部分與不同的靶結(jié)合。目前，熒光團(tuán)是分子診斷學(xué)的一類有益信號(hào)傳遞部分。然而，由于涉及分析多個(gè)不同熒光團(tuán)的復(fù)雜情況(出現(xiàn)激發(fā)和發(fā)射光譜的大部分重疊)，目前在實(shí)踐中只能摻入大約7種或更少的常規(guī)熒光團(tuán)。然而，組合使用時(shí)，7種熒光團(tuán)可用于產(chǎn)生127種不同的信號(hào)(N個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生2N-1種組合)。高信號(hào)復(fù)雜度還可利用其它類型的信號(hào)傳遞部分，經(jīng)由組合標(biāo)記獲得。例如，用不同染料浸滲的粒子，落在不同離散大小種類中的粒子，或發(fā)射不同無線電信號(hào)的轉(zhuǎn)發(fā)器都可用于該方法中。使用熒光團(tuán)的組合標(biāo)記近來已經(jīng)成功用于人類的染色質(zhì)組型(Speicher等，1996，supra；Schrck等，1996，supra)。用于分析組合標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的儀器和軟件可從市場上購買。
3.高信號(hào)復(fù)雜度還可使用比例標(biāo)記方法獲得(Fulton等，1997，supra)。在比例標(biāo)記中，就像組合標(biāo)記那樣，很多不同類型的信號(hào)傳遞部分可使用相對(duì)少數(shù)的不同信號(hào)元件產(chǎn)生。然而，與組合標(biāo)記相反，比例標(biāo)記中的信號(hào)傳遞部分是通過信號(hào)傳遞元件的比例區(qū)別的。例如，兩個(gè)熒光團(tuán)X和Y，具有不同的激發(fā)/發(fā)射特征，可用于將聚苯乙烯粒子染色。將不同相對(duì)濃度的熒光團(tuán)([X]，[Y])用于不同的粒子組。例如，8種不同濃度的X和8種不同濃度的Y用于將粒子染色時(shí)，所有組合方式(X1Y1，X1Y2，X8Y7，X8Y8)產(chǎn)生64類可區(qū)分的粒子。比例標(biāo)記可將簡化儀器，只需使用少數(shù)信號(hào)類型。除了熒光團(tuán)之外，還可使用包括非-光學(xué)信號(hào)元件的信號(hào)元件，利用比例標(biāo)記方法產(chǎn)生高信號(hào)復(fù)雜度。
步驟3使樣品中的靶分子與標(biāo)記粒子結(jié)合用于使樣品中的靶分子與標(biāo)記粒子結(jié)合的方法和形式取決于樣品類型、靶分子的性質(zhì)和選擇的試驗(yàn)形式。
本發(fā)明的一個(gè)重要特性在于它與快速和簡單的樣品制備過程相容。對(duì)于很多應(yīng)用來說，實(shí)際上不需要樣品制備。這代表了與其它靈敏的診斷方法，如基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)相比的主要優(yōu)越性，基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)需要更費(fèi)力的樣品制備程序，用于去除酶抑制劑。例如，研究樣品中的可溶分子標(biāo)記的試驗(yàn)通常在結(jié)合標(biāo)記粒子之前不需要任何樣品制備。對(duì)于一些試驗(yàn)，其中靶分子是更大的復(fù)合物的一部分或螯合于更大的復(fù)合物中，更大的復(fù)合物可以作為樣品制備步驟的一部分而解離。例如，對(duì)于研究病毒核心蛋白在HIV病毒內(nèi)部的存在的試驗(yàn)，可以使用洗滌劑使病毒顆粒解離。例如，對(duì)于遺傳分析，含有核酸靶分子的細(xì)胞通常被打開(例如通過各種化學(xué)或物理處理)并且雙鏈DNA經(jīng)過變性以允許核酸雜交。
本發(fā)明使用的各種形式具有允許標(biāo)記粒子與樣品中的靶分子快速結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。例如，使大量標(biāo)記粒子與液體樣品中的靶分子結(jié)合使得碰撞比在常規(guī)ELISA形式中發(fā)生得更快，常規(guī)ELISA中靶分子一般在能夠發(fā)生碰撞之前擴(kuò)散到反應(yīng)室的一端。快速結(jié)合動(dòng)力學(xué)也是接觸發(fā)生在多孔膜內(nèi)部的試驗(yàn)形式(如側(cè)流試驗(yàn))的一個(gè)特征。
步驟4選擇或捕獲靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物選擇步驟具有一些重要的功能，包括從未結(jié)合的標(biāo)記粒子分離靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物，使靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物沉積在檢測區(qū)(例如，一些實(shí)施方案的光學(xué)系統(tǒng)的焦面中)中，從靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物去除樣品材料，并且(對(duì)于某些試驗(yàn)形式)將標(biāo)記的靶分子的特定類目局限于檢測面積的不同區(qū)域。
對(duì)于在結(jié)合步驟之前，將樣品固定在固體基質(zhì)上的測定法而言，未結(jié)合的類目結(jié)合分子和信號(hào)傳遞部分通常通過清洗除去。實(shí)例包括使用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)方法的應(yīng)用。
其它試驗(yàn)形式是在液相，例如，微量滴定孔中進(jìn)行的。對(duì)于一些試驗(yàn)，選擇步驟是經(jīng)靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物于微量滴定孔的檢測表面上的捕獲分子相結(jié)合而發(fā)生的。在這些試驗(yàn)中，擴(kuò)散是使捕獲分子接觸的手段。對(duì)于其它應(yīng)用，靶分子/類目結(jié)合分子/信號(hào)傳遞部分復(fù)合物沉積在表面上。使靶復(fù)合物沉積在表面上的方法包括離心，過濾，重力沉降，磁性選擇，或與表面結(jié)合的類目結(jié)合分子，例如，捕獲抗體結(jié)合。在某些情況下(例如，磁性分離)，使用不同的部分，即選擇部分。涂覆了類目特異性抗體的磁性微粒是選擇部分的例子。未結(jié)合的類目結(jié)合分子和信號(hào)傳遞部分通常留存在液相中，而且可除去。如果選擇過程(例如，光學(xué)成像)可選擇性分析具有狹窄視野深度的固體表面，那么有時(shí)無需除去未結(jié)合的物質(zhì)(位于焦面外部)對(duì)于一些應(yīng)用，選擇程序的組合是有用的。例如，可在接觸標(biāo)記粒子前將樣品過濾通過具有確定孔徑的膜。例如，可以使用僅僅允許大小為約0.5-5微米的粒子通過的過濾系統(tǒng)檢測未知細(xì)菌的存在。該試驗(yàn)可以基于結(jié)合于包含酪氨酸的任何蛋白的標(biāo)記粒子。選擇其它大小范圍可以進(jìn)行未知病毒、游離蛋白或真核細(xì)胞的試驗(yàn)。
在關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)中，側(cè)流和流通形式是可論證的最成功的試驗(yàn)形式。這些形式利用吸水薄膜中毛細(xì)流的優(yōu)點(diǎn)。它們通常使用捕獲分子(如表面-結(jié)合的類目結(jié)合分子)選擇靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物。未結(jié)合的標(biāo)記粒子通過毛細(xì)作用流到捕獲區(qū)外面。基于膜的測定法的其它重要優(yōu)點(diǎn)是很容易利用幾何區(qū)別而成為多路。
當(dāng)掃描靶分子的多個(gè)類目時(shí)，幾何區(qū)別是一個(gè)重要的方法(即，在多路試驗(yàn)中)。與高信號(hào)復(fù)雜度的多路試驗(yàn)(見步驟2)相比，幾何區(qū)別具有下列優(yōu)點(diǎn)，即對(duì)于多路試驗(yàn)而言，只需要單一的信號(hào)標(biāo)志。在使用幾何區(qū)別的典型免疫測定法中，不同的類目特異性捕獲抗體沉積在檢測區(qū)的不同范圍中(例如，側(cè)流試驗(yàn)中的不同帶或流通試驗(yàn)或基于微量滴定孔的試驗(yàn)中的不同斑點(diǎn))。因此，靶分子的不同類目在捕獲區(qū)的不同預(yù)定范圍被捕獲。與捕獲抗體類似的其它類型捕獲部分包括抗原，配體，及核酸。其它形式，包括使用微流通道和使用“捕獲線”(用捕獲分子涂覆的材料的細(xì)條帶)的那些也可以使用幾何區(qū)分。
步驟5通過檢測選擇或捕獲的靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物而鑒定并量化樣品中存在的靶分子該步驟使用錨定于檢測區(qū)中的的靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物的大面積成像分析檢測、鑒定并且量化樣品中的靶分子。該步驟本身一般包括成像、像分析和報(bào)道分子產(chǎn)生的步驟。
本發(fā)明可以在不放大的情況下檢測顯微標(biāo)記粒子。該有效的特征受到高強(qiáng)度標(biāo)記方法和高效光學(xué)的支持，以指導(dǎo)微集落發(fā)出的光子進(jìn)入光檢測器陣列的少數(shù)像素。低放大成像促進(jìn)大面積的成像，由此促進(jìn)了掃描大樣品。
使用的成像方法取決于步驟2中選擇的信號(hào)產(chǎn)生的類型。例如，成像過程根據(jù)用于產(chǎn)生信號(hào)的光學(xué)特性或信號(hào)傳遞特征而不同。對(duì)于某些信號(hào)特征(例如，反射、熒光、光散射或吸收)而言，檢測區(qū)中的復(fù)合物必須接受光源的照射。對(duì)于其它(例如，化學(xué)發(fā)光或熱輻射)而言，無需照射。
檢測各個(gè)標(biāo)記粒子是天然定量的并且是超靈敏的?？梢酝ㄟ^人工計(jì)數(shù)照片或數(shù)字像中的各個(gè)標(biāo)記粒子或通過使用數(shù)字化圖像的自動(dòng)圖像分析而完成量化。也可以使用集成樣品的信號(hào)強(qiáng)度量化靶細(xì)胞。信號(hào)集成對(duì)含有高濃度靶細(xì)胞的樣品特別有用。在這些情況下，分辨一致的信號(hào)并不總是可能的。
解碼標(biāo)記粒子的標(biāo)志使得能夠鑒定多種靶細(xì)胞類目。該步驟的重要目的是通過確定靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物的標(biāo)志而鑒定樣品中靶細(xì)胞的類目。
當(dāng)使用熒光作為信號(hào)特征時(shí)，基于CCD照相機(jī)的成像器，如圖1所示，是一種用于大面積成像的有效裝置。這種裝置用于收集下面很多實(shí)施例的數(shù)據(jù)。激發(fā)光是通過從高強(qiáng)度白光源(1000W Xenon弧光燈，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)將光引入到液體光導(dǎo)中(5mm芯直徑，Model 380，PhotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)而提供的。液體光導(dǎo)可將光傳送給激發(fā)濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，并將濾過的光束(直徑9mm或以上)對(duì)準(zhǔn)含有標(biāo)記粒子的檢測表面。該裝置可檢測各種構(gòu)造(例如，多孔膜，顯微鏡載玻片，蓋玻片，或平坦、光學(xué)透明底部的試管或孔)上的標(biāo)記粒子。入射光穿透檢測表面，誘導(dǎo)靶細(xì)胞中的熒光。所發(fā)射熒光的一部分是由高-收集效率的透鏡系統(tǒng)收集的，并通過發(fā)射濾器盤(BioPoint FW，Ludl Electronics)傳輸給CCD照相機(jī)(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。光學(xué)裝置的設(shè)計(jì)和構(gòu)造是與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理和實(shí)踐為基礎(chǔ)的。
本發(fā)明也可以結(jié)合使用其它類型的光檢測器和其它構(gòu)造。成像系統(tǒng)的靈敏度可通過選擇更靈敏的照相機(jī)(例如，冷卻至低溫的照相機(jī)，或使用后面較薄的芯片的照相機(jī))來增加?？蛇x擇性地，檢測靈敏度和分辨率可通過使用線掃描系統(tǒng)(例如，BT Image Array；Hamamatsu)增加。進(jìn)行線掃描時(shí)，線性CCD或光電二極管陣列(例如，1×500或1×1000個(gè)像素)用于捕獲像。一維分辨率與陣列元件數(shù)相對(duì)應(yīng)，而第二維常常通過在線性陣列下垂直移動(dòng)樣品載玻片而捕獲。因?yàn)樵^少，相似靈敏度的線性陣列通常比區(qū)域形式的CCD照相機(jī)要便宜。
圖3所示的儀器可以經(jīng)構(gòu)造而使用X-Y定位平臺(tái)(BioPoint XY，Ludl Electronics)在激發(fā)和收集的光學(xué)器件上移動(dòng)試驗(yàn)樣品而測量多個(gè)樣品。Image-Pro和Image-Pro附件可控制所有的儀器元件及像的獲得。濾器盤是用ScopePro附件(Media Cybernetics，BaltimoreMD)控制的，StagePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)操縱平臺(tái)的定位，而照相機(jī)的控制是通過Hamamatsu Orca II驅(qū)動(dòng)器(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)進(jìn)行的。Image-Pro Plus也可用于像-處理和下面所述的分析。
本發(fā)明使用白光照射的實(shí)施方案利用光譜濾器為每個(gè)熒光團(tuán)提供最佳激發(fā)峰。白光的光譜較大，可選擇各種熒光團(tuán)來消除發(fā)射光譜的重疊。通常使用白光照明裝置獲得的斑點(diǎn)大小，例如，2mm-5mm，對(duì)于大面積成像是適宜的。因?yàn)闉V器更換相對(duì)簡單，而且可以是自動(dòng)化的，因此白光系統(tǒng)非常適宜，可在使用不同熒光團(tuán)組的試驗(yàn)中使用相同的儀器。
圖3所示系統(tǒng)的收集效率是通過插入由兩個(gè)元件組成的、常規(guī)設(shè)計(jì)的收集光學(xué)器件而最大化的，這兩個(gè)元件是收集物鏡和聚焦元件。收集物鏡具有高收集效率(≥f#/1.2)，并輸出相對(duì)準(zhǔn)直的光束。聚焦透鏡可捕獲從收集物鏡輸出的光，并將它聚焦在CCD的檢測表面上。光學(xué)器件被設(shè)計(jì)成兩部分，從而使濾器盤插在收集透鏡的路徑中。對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案而言，例如，對(duì)于某些不需要更換濾器的實(shí)施方案而言，它可包括一個(gè)用于獲得高收集效率的錐形光纖束。光纖束包括收集近樣品光的纖維和光直接對(duì)準(zhǔn)CCD芯片的通道?？蛇x擇性地，本發(fā)明可利用直接近檢測而非常靈敏地檢測信號(hào)，其中樣品直接涂在CCD芯片上，或與CCD芯片緊密接近(對(duì)后面變薄的CCD芯片的后面高度靈敏)。
除了白光、上述多-光譜系統(tǒng)之外，我們還可研制了一種更簡單的單色熒光成像系統(tǒng)，用于不放大的大面積成像。在圖4所示的系統(tǒng)中，激發(fā)光是由532nm的Frequency-Doubled Diode Laser(50mW，Model#BWT-50E，B&W Tek，Newark，DE)提供的。因?yàn)樵摍z測是單色的，因此無需濾器盤。單一的激發(fā)濾器可除去源于激光輸出的諧波光譜(Model HQ532/10x，色度Technology，Brattleboro，VT)，且單一發(fā)射濾器(Model HQ620/60m，色度Technology，Brattleboro，VT)只能允許特異性熒光信號(hào)通過CCD照相機(jī)。這些系統(tǒng)還可使用較之先前所述更便宜的CCD照相機(jī)(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn，CA)來捕獲像。通過插入多個(gè)激光和濾器裝置，這些圖中所示的儀器很容易適合進(jìn)行多色分析。
插入到本發(fā)明中的CCD照相機(jī)通常冷卻至-5℃--50℃，對(duì)于具有最小照相機(jī)干擾累積的10秒-約2分鐘的積分時(shí)間(取決于照相機(jī)的靈敏度)而言足夠。通過長時(shí)間收集熒光團(tuán)發(fā)射的光子，較長的積分時(shí)間通常產(chǎn)生更高的靈敏度。較長的積分時(shí)間對(duì)于線掃描是不適宜的；然而，存在著后面變薄的線性陣列，它具有非常高的量子效率，可增加靈敏度。
本發(fā)明還可利用基于干涉儀的光譜成像檢測和解譯信號(hào)(Schrock，E.，1997，supra)。使用這種技術(shù)，由信號(hào)傳遞部分發(fā)射或散射的光分為兩部分通過棱鏡(不同波長行進(jìn)不同的距離)，從而重組以創(chuàng)造干涉圖樣。干涉圖樣的Fourier分析可相對(duì)于像中的每個(gè)點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)光譜。
對(duì)于包括需要便攜式系統(tǒng)的應(yīng)用的關(guān)注點(diǎn)應(yīng)用，本發(fā)明可以經(jīng)過構(gòu)造而使重量和大小達(dá)到最小。對(duì)于一些實(shí)施方案，可以完全去除儀器(如當(dāng)通過顏色檢測顯現(xiàn)標(biāo)記粒子時(shí))或很大程度簡化(如，通過使用瞬時(shí)膠片代替電子檢測器)。如果需要，可以在用于數(shù)字儲(chǔ)存和數(shù)字像分析的商業(yè)化掃描儀中數(shù)字化收集在膠片上的像?；蛘?，可以通過使用近端成像在沒有光學(xué)系統(tǒng)的條件下使用光檢測器(光檢測器基本對(duì)著檢測區(qū)放置)。為了最大的便攜性，可以通過使用具有非照射依賴性信號(hào)傳遞特征(如化學(xué)發(fā)光)的顆粒而去除光源。
對(duì)于本發(fā)明產(chǎn)生數(shù)字像的實(shí)施方案而言，計(jì)算機(jī)軟件鑒定并且量化靶標(biāo)記粒子。對(duì)于其中使用不同類型的熒光信號(hào)傳遞部分的典型測定而言，軟件添加了適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)特異性像，通過確定每個(gè)靶標(biāo)記粒子發(fā)射哪一種信號(hào)標(biāo)志或組合而鑒定靶細(xì)胞，并且計(jì)數(shù)樣品中存在的每個(gè)靶標(biāo)記粒子類目。該軟件也可以1)校正照射的不均勻性；(2)校正通過去卷曲基質(zhì)的熒光串音；(3)利用印在基質(zhì)上的登記標(biāo)記排列像；(4)基于與查詢表的比較，將ID碼賦給樣品中的每個(gè)成像標(biāo)記粒子；(5)記錄用于樣品鑒定的成像樣品的條形碼；和(6)將輸出的數(shù)據(jù)，像，和條形碼自動(dòng)保存在數(shù)據(jù)庫中，通過網(wǎng)絡(luò)瀏覽器界面查詢。市售的像分析軟件包可用于提供這些功能?？墒褂枚嗌穹治鲕浖?例如，Image-Pro，Media Cybernetics；Metamorph，UniversalImaging，MatLab，The Mathworks)。
這里描述用于分析在下面很多實(shí)施例中收集的熒光數(shù)據(jù)的軟件包和方法。使檢測表面成像，從而測定熒光物體數(shù)和/或總熒光信號(hào)。熒光是通過CCD照相機(jī)從檢測區(qū)域捕獲的，并存儲(chǔ)為TIFF(TaggedImage File Format)像文件，其中包括像素位置和強(qiáng)度的記錄。3種方法都可用于量化測定結(jié)果。成像檢測區(qū)的總積分信號(hào)是通過計(jì)算所有像素的熒光信號(hào)總和測定的。將樣品的積分信號(hào)與陰性對(duì)照的進(jìn)行比較。測量總的積分信號(hào)對(duì)于含多個(gè)靶的樣品特別有效。第2個(gè)方法是計(jì)算檢測區(qū)域中的物體數(shù)。第3個(gè)方法是將熒光物體內(nèi)所含的全部像素的強(qiáng)度積分(與計(jì)算像中所有像素強(qiáng)度的總和相反)。所有像分析都是用Image-Pro v 4.0(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)進(jìn)行的。
使用IPP Image-Pro宏語言，上述工具可同時(shí)自動(dòng)批量處理若干像。此外，還可使用其它用戶自定義的IPP小型程序處理數(shù)據(jù)。例如，可包括或排除低于或高于特定大小(面積)或強(qiáng)度的物體，它是用于除塵的有效工具。其它確定物體定義(如接受和排斥標(biāo)準(zhǔn))的用于像分析的重要參數(shù)根據(jù)應(yīng)用而不同并且應(yīng)該進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化。
可以對(duì)本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)行自動(dòng)化，包括連接上述步驟。考慮用于分析液體樣品，如用于注射的藥水或臨床尿樣的應(yīng)用。所述自動(dòng)化的系統(tǒng)可以自動(dòng)收集樣品，使它們與標(biāo)記粒子接觸，采用選擇步驟，獲得像，分析像，并且報(bào)告結(jié)果?；蛘?，本發(fā)明的各個(gè)功能可以自動(dòng)化。例如，用于將容器自動(dòng)加樣到成像儀器并且從其取出，以及用于自動(dòng)化聚焦的組件可以摻入系統(tǒng)。
實(shí)施例.下面的實(shí)施例為實(shí)行本發(fā)明的各種實(shí)施方案提供了技術(shù)細(xì)節(jié)，它們可與各種應(yīng)用聯(lián)合使用，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1.使用電、瞬時(shí)膠片和無輔助的目測進(jìn)行不放大的各個(gè)顯微標(biāo)記粒子的檢測本發(fā)明量化低水平靶分子的能力部分在于其在不進(jìn)行高度放大的條件下檢測并且計(jì)數(shù)大的檢測面積中各個(gè)顯微靶分子的能力。該實(shí)施例的目的是證明本發(fā)明可以各種檢測手段CCD光檢測器陣列、瞬時(shí)膠片和簡單的目測而完成。
用于這些實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記粒子是用抗體和堿性磷酸酶涂覆的乳膠粒子。用分別產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或有色(紫色)產(chǎn)物的堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光或產(chǎn)色底物處理置于膜上的珠。對(duì)具有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記粒子的膜進(jìn)行電成像或用瞬時(shí)膠片成像，通過肉眼對(duì)具有產(chǎn)色標(biāo)記粒子的膜進(jìn)行成像。
實(shí)驗(yàn)方法通過向鏈親和素涂覆的粒子(108個(gè)粒子；Bangs；0.95um，非熒光；目錄號(hào)CP01N)加入生物素化的堿性磷酸酶(5μl 2.9mg/ml的原液，Pierce；目錄號(hào)29339)和生物素化的山羊抗大腸埃希氏菌0157抗體(5μl 1.0mg/ml的原液，Kirkeguard and Perry Laboratories；目錄號(hào)01-95-90)而制備涂覆了抗體和酶分子的粒子。用PBS使體積成為100μl。培養(yǎng)30分鐘后，洗滌粒子兩次。一次洗滌包括在微量離心機(jī)中以3000g旋轉(zhuǎn)粒子5分鐘，然后棄去上清液并且將粒子重懸于PBS(100μl)中。制備雙涂覆的粒子之后，將珠稀釋至大約50和500個(gè)珠。將每種稀釋液和無珠對(duì)照的三份重復(fù)樣品加入PBS(50ml)，使用真空泵和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)，通過0.2μm孔徑的硝酸纖維素膜進(jìn)行過濾。向一組濾器中加入BM紫堿性磷酸酶底物(500μl；Roche；目錄號(hào)1442074)。將CDP-star(500μl；NEN；目錄號(hào)NEL-601)加入另一組濾器。培養(yǎng)1小時(shí)后，在水中洗滌BM紫膜以去除剩下的BM紫，讓膜風(fēng)干。按照制造商的說明在SpotLight照相機(jī)(Boston Probes；目錄號(hào)DT10000)中封固CDP-star膜，并且曝光于ASA 2000膠片(BostonProbes；目錄號(hào)DT20000)兩分鐘。然后用不放大的大面積成像觀察相同的濾膜。用Image-Pro Plus軟件，4.1版(Media cybernetics)從CCD成像儀捕獲像并且進(jìn)行處理。
結(jié)果.圖5表示可以用產(chǎn)色的或化學(xué)發(fā)光的信號(hào)元件檢測偶聯(lián)于類目特異性結(jié)合分子和酶促信號(hào)傳遞部分的雙功能粒子。甚至肉眼就能夠觀察單個(gè)標(biāo)記粒子的能力是由于每個(gè)標(biāo)記粒子上的大量酶分子。該實(shí)施例證明了本發(fā)明提供簡單、便于用戶、經(jīng)濟(jì)和不使用儀器的超靈敏關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)的可能。
實(shí)施例2.用于采用不放大的大面積成像檢測低數(shù)量細(xì)菌背景和目的該實(shí)施例證明了使用本發(fā)明，采用便于用戶的側(cè)流測定形式和不放大的大面積成像快速檢測低數(shù)量的細(xì)菌。側(cè)流測定已經(jīng)用于診斷工業(yè)20年以上。該簡單的測定依賴于抗原抗體相互作用而檢測特定靶(或分析物)的存在。盡管簡單，在大多數(shù)診斷領(lǐng)域，側(cè)流條帶缺乏與ELISA免疫測定和核酸擴(kuò)增方法競爭的靈敏度。
在該實(shí)施例中，將多種細(xì)菌裂解物(大腸埃希氏菌O157H7)的稀釋液應(yīng)用于包括含有標(biāo)記粒子(涂覆了大腸埃希氏菌O157H7特異性抗體的熒光染色乳膠粒子)的偶聯(lián)物墊、捕獲抗體線和具有結(jié)合于缺乏靶分子的標(biāo)記粒子的捕獲抗體的陽性對(duì)照線的多孔膜條帶上。進(jìn)行試驗(yàn)后，用大面積的不放大成像對(duì)捕獲和對(duì)照線進(jìn)行成像。
實(shí)驗(yàn)方法按照側(cè)流試劑盒(Millipore；High Flow Mid RangeAssembly Kit，目錄號(hào)HFMIDAK015)上提供的說明組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。簡言之，將芯、偶聯(lián)物和樣品墊置于側(cè)流膜上，該膜連接于粘合劑支持卡。通過在膜上(距離芯墊5-10mm)跨越膜條帶施加兩條捕獲抗體線而制備抗體線一條是大腸埃希氏菌O157H7(捕獲線；每8cm長的線含10μl 1mg/ml的溶液，BioTrace affinitypurified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目錄號(hào)01-95-90)，一條是陽性對(duì)照(對(duì)照線，每8cm長的線含10μl 1mg/ml的溶液，Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗山羊IgG，目錄號(hào)115-165-146)。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗大腸埃希氏菌0157H7抗體(BioTrace affinity purified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目錄號(hào)01-95-90)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(BangsLaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01 F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗大腸埃希氏菌抗體涂覆的熒光珠(2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。用PBS系列稀釋甲醛固定的大腸埃希氏菌0157H7細(xì)胞的原液(菌株DEC 3B，Dr.Tom Whittam，Pennsylvania State University，109細(xì)胞/ml)。然后將系列稀釋液(100μl)加入裂解液(100μl 200mM NaOH/1％SDS)并且靜置3分鐘。加入PBS-B(800μl)中和裂解液。將試驗(yàn)樣品(100μl裂解的大腸埃希氏菌稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。樣品通過樣品墊移動(dòng)到偶聯(lián)物墊，在此熒光珠整合到樣品流中。然后使樣品進(jìn)入試驗(yàn)?zāi)?，通過捕獲和對(duì)照線，并且最終進(jìn)入芯墊。進(jìn)行測定(約15分鐘)。然后通過將條帶置于基于CCD成像儀上(描述于發(fā)明詳述部分的第5步并且示于圖3)而對(duì)膜進(jìn)行成像，以便細(xì)菌面對(duì)光源和CCD芯片。使用不放大的大面積成像對(duì)條帶進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
結(jié)果圖6表示用于檢測細(xì)菌的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。該圖表示來自代表性條帶的捕獲線和對(duì)照線的像。最左側(cè)的條帶表示分析不含細(xì)菌的陰性對(duì)照樣品時(shí)的結(jié)果。當(dāng)陰性對(duì)照與分別含有1000和10,000個(gè)大腸埃希氏菌的中間和右側(cè)的條帶進(jìn)行比較時(shí)，很明顯，隨著細(xì)菌的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。底部的柱狀圖表示與加入的大腸埃希氏菌數(shù)量相關(guān)的五次重復(fù)試驗(yàn)的平均值的信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)誤柱代表重復(fù)樣品信號(hào)之間的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)表示1000個(gè)細(xì)菌的檢測限，這比市場上出售的商業(yè)化試驗(yàn)靈敏10-100倍。
實(shí)施例3.用于采用不放大的大面積成像檢測低水平蛋白的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)背景和目的對(duì)于蛋白標(biāo)記的更靈敏快速的試驗(yàn)仍然存在未滿足的需要。該實(shí)施例證明了使用本發(fā)明，采用便于用戶的側(cè)流測定形式、熒光標(biāo)記粒子和不放大的大面積成像快速檢測低水平的蛋白(IL-2)。由于發(fā)現(xiàn)了人類疾病(例如癌癥和心血管疾病)的新標(biāo)記，檢測和量化樣品中的低水平靶分子變得更重要。
實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)施例2所述組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。在距離芯墊5-10mm處將抗體施加于膜，制備IL-2特異性捕獲線(Pharmingen，目錄號(hào)554424)和陰性對(duì)照線(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目錄號(hào)115-165-146)。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗IL-2抗體(Pharmingen；目錄號(hào)554426)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(BangsLaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗IL-2抗體涂覆的熒光珠(2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。用PBS系列稀釋IL-2原液(Pharmingen；重組小鼠IL-2，目錄號(hào)550069)。將試驗(yàn)樣品(100μl IL-2稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。進(jìn)行測定(約15分鐘)后按實(shí)施例2的方法進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
結(jié)果圖7表示用于檢測Il-2的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。該圖中可見來自代表性條帶的捕獲線和對(duì)照線的像。最左側(cè)的條帶表示陰性對(duì)照(無IL-2)。當(dāng)陰性對(duì)照與中間和右側(cè)的條帶，即分別含有2pg/ml和20pg/ml IL-2的樣品進(jìn)行比較時(shí)，很明顯，隨著IL-2的量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。底部的柱狀圖表示與加入的Il-2的量相關(guān)的五次重復(fù)試驗(yàn)的平均值的信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)誤柱代表重復(fù)樣品信號(hào)之間的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)表示該試驗(yàn)檢測水平為2pg/ml的Il-2，這比市場上出售的商業(yè)化試驗(yàn)靈敏10-100倍。
實(shí)施例4.用于采用不放大的大面積成像檢測血清中的低水平蛋白的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)背景和目的檢測復(fù)雜樣品中的靶分子對(duì)許多應(yīng)用是重要的。該實(shí)施例證明了使用本發(fā)明，采用便于用戶的側(cè)流測定形式和不放大的大面積成像快速檢測血清中的低水平的IL-2。在下面描述的實(shí)驗(yàn)中，用熒光標(biāo)記粒子檢測血清中的IL-2。
實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)施例3所述組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。在距離芯墊5-10mm處將抗體施加于膜，制備IL-2特異性捕獲線(Pharmingen，單克隆抗IL-2，目錄號(hào)554424)和對(duì)照線(Jackson Immuno ResearchLaboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目錄號(hào)115-165-146)。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗IL-2抗體(Pharmingen；目錄號(hào)554426)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗IL-2抗體涂覆的熒光珠(2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。用血清(Fitzgerald Laboratories；正常山羊血清，目錄號(hào)88-NG22)系列稀釋IL-2原液(Pharmingen；重組小鼠IL-2，目錄號(hào)550069)。將試驗(yàn)樣品(100μl IL-2稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。進(jìn)行測定(約15分鐘)后按實(shí)施例2的方法進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
結(jié)果該圖表示用于血清中的IL-2的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。在該圖中可見來自代表性測試條的捕獲和對(duì)照線的像。最左側(cè)的條表示陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照與中間(20pg/ml)和右側(cè)(200pg/ml)的條進(jìn)行比較時(shí)，很明顯隨著IL-2的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。底部的柱狀圖表示與加入的IL-2量相關(guān)的5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值的信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)誤柱表示重復(fù)信號(hào)之間的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)表示本發(fā)明可以檢測濃度為20pg/ml血清的IL-2，證明該測定檢測甚至是復(fù)雜樣品中極低水平的靶蛋白。
實(shí)施例5.用于采用不放大的大面積成像多路檢測蛋白和細(xì)菌的超靈敏側(cè)流試驗(yàn)背景和目的對(duì)檢測一組靶分子的存在的試驗(yàn)的需要是常見的。其例子是研究樣品中導(dǎo)致性傳播疾病的各種微生物、濫用的藥物、各組生物戰(zhàn)試劑。該實(shí)施例證明了采用便于用戶的側(cè)流測定形式、熒光標(biāo)記粒子和不放大的大面積成像快速和同時(shí)檢測低水平的大腸埃希氏菌和IL-2。
實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)施例2所述組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。在距離芯墊5-10mm處將抗體施加于膜，制備大腸埃希氏菌0157H7(BioTrace affinitypurified；Kirkegaard & Perry Laboratories，目錄號(hào)01-95-90)和IL-2(Pharmingen，目錄號(hào)554424)捕獲線和陰性對(duì)照線(JacksonImmuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目錄號(hào)115-165-146)。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。將IL-2(參照實(shí)施例3制備IL-2珠)和大腸埃希氏菌(參照實(shí)施例2制備大腸埃希氏菌珠)的熒光珠(各2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。將試驗(yàn)樣品(100μl大腸埃希氏菌或IL-2稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。進(jìn)行測定(約15分鐘)后按實(shí)施例2的方法進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
結(jié)果該圖表示采用不放大的大面積成像進(jìn)行的多路側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。該圖表示應(yīng)用了含有(從左到右)大腸埃希氏菌和IL-2、單獨(dú)的大腸埃希氏菌、單獨(dú)的IL-2、以及即不含IL-2也不含大腸埃希氏菌的樣品的測試條的捕獲和對(duì)照線的像。該圖證明了靈敏側(cè)流試驗(yàn)可以檢測同一測定中的多個(gè)靶分子。
實(shí)施例6.利用瞬時(shí)膠片檢測低水平蛋白的超靈敏化學(xué)發(fā)光側(cè)流試驗(yàn)?zāi)康脑搶?shí)施例證明了如何使用本發(fā)明，采用便于用戶的側(cè)流測定形式和不放大的大面積成像快速檢測低數(shù)量的病毒顆粒。在下文描述的實(shí)驗(yàn)中，采用熒光標(biāo)記粒子和大面積成像檢測含有裂解的流感病毒稀釋液的樣品。(實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)施例2所述組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。在距離芯墊5-10mm處將甲型流感特異性捕獲線(QED，目錄號(hào)1302)和對(duì)照線JacksonImmuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目錄號(hào)115-165-146)施加于膜而制備抗體線。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗甲型流感抗體(Virostat；目錄號(hào)1307)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗甲型流感抗體涂覆的熒光珠(2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。裂解純化的甲型流感的原液(Advanced Biotechnologies Inc甲型流感/PR/8/34(H1N1)，目錄號(hào)10-210-000)(Aoyagi，K.，C.Ohue，et al.(1999).J ClinMicrobiol 37(6)1802-8)，然后用PBS系列稀釋。將試驗(yàn)樣品(100μl IL-2稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。進(jìn)行測定(約15分鐘)后按實(shí)施例2的方法進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
實(shí)施例7.利用瞬時(shí)膠片檢測低水平蛋白的超靈敏化學(xué)發(fā)光側(cè)流試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)超靈敏的關(guān)注點(diǎn)試驗(yàn)仍然存在未滿足的需要。理想地，這些試驗(yàn)是便攜的，并且不需要昂貴的儀器。該實(shí)施例證明了用經(jīng)濟(jì)的瞬時(shí)膠片檢測、高強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光標(biāo)記粒子和便于用戶的側(cè)流形式檢測低水平的細(xì)胞因子蛋白IL-2。
實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)施例2所述組裝側(cè)流試驗(yàn)條帶。在幾片膜上(距離芯墊5-10mm)施加IL-2特異性捕獲線(Pharmingen；目錄號(hào)554424)和對(duì)照線Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG，目錄號(hào)115-165-146)而制備抗體線。在使用前使線干燥(至少15分鐘)。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml原液)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)、生物素標(biāo)記的AP(10μl mg/ml原液)和PBS(70μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗IL-2抗體(Pharmingen；目錄號(hào)554426)和生物素堿性磷酸酶(Pierce；目錄號(hào)29339)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(Bangs LaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗IL-2抗體涂覆的AP珠(2μl)加入每個(gè)條帶的偶聯(lián)物墊。用血清PBS系列稀釋IL-2原液(Pharmingen；重組小鼠IL-2，目錄號(hào)550069)。將試驗(yàn)樣品(100μl IL-2稀釋液)與PBS-TB(50μl)混合并且加入試驗(yàn)條帶的樣品墊中。進(jìn)行測定(約15分鐘)后，用化學(xué)發(fā)光檢測試劑(Pierce；Lumiphos，目錄號(hào)34150)浸漬條帶。短時(shí)間培養(yǎng)后(約5分鐘)，用瞬時(shí)膠片(VWR；Polaroid Polapan Type667，目錄號(hào)GRP0617538)對(duì)條帶成像。然后掃描瞬時(shí)膠片(HewlettPackard；HP scanjet 7400c，目錄號(hào)C7713A)。
結(jié)果圖10表示使用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記粒子和瞬時(shí)膠片檢測的側(cè)流試驗(yàn)的結(jié)果。示出了代表性測試條的捕獲和對(duì)照線。施用了含IL-2(從左到右0，20，200，and 2000pg/ml)的樣品的測試條的比較表明隨著IL-2的數(shù)量增加，來自捕獲線的信號(hào)也增加。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明可以使用瞬時(shí)膠片檢測濃度低至20pg/ml的IL-2。因此，該試驗(yàn)是超靈敏、迅速、容易進(jìn)行并且非常昂貴。
變化形式可以使用其它膠片(包括正常照像膠片和X線膠片)?？梢允褂帽阋说氖惺蹝呙鑳x對(duì)曝光過的膠片進(jìn)行數(shù)字化，產(chǎn)生可以用像分析軟件分析的像。可以使用堿性磷酸酶以外的其它化學(xué)發(fā)光試劑，如辣根過氧化物酶?？梢允褂迷S多其它的化學(xué)發(fā)光底物，包括CDP-star(Applied Biosystems；目錄號(hào)T2307)或SignalSignal West Pico(Pierce；目錄號(hào)34080)。也可以使用BM紫(Roche；目錄號(hào)1442074)等產(chǎn)生底物對(duì)比色測定進(jìn)行顯影。
實(shí)施例8.用于使用不放大的大面積成像檢測低水平蛋白的超靈敏、不基于膜的側(cè)流測定該實(shí)施例描述用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案對(duì)蛋白進(jìn)行快速和超靈敏的檢測，該實(shí)施方案使用多孔的“捕獲線”，而不是傳統(tǒng)的側(cè)流條帶。該形式使膜的消耗最少，粒子必須通過該膜進(jìn)入檢測區(qū)。捕獲線形式具有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)，兩者均增加了試驗(yàn)的靈敏度(1)有效處理了更大的樣品體積，和(2)可以使用更大的標(biāo)記粒子，該粒子具有甚至更強(qiáng)的信號(hào)。
圖11表示用于該實(shí)施例中的裝置的構(gòu)建。將樣品加載到樣品區(qū)中，在此它側(cè)流進(jìn)入偶聯(lián)物墊。在裝置遠(yuǎn)端的吸附墊牽拉樣品，溶解和固定檢測珠，該樣品流經(jīng)測定線。在下文描述的實(shí)驗(yàn)中，將IL-2的稀釋液施加到載玻片上，該載玻片包括含有IL-2的特異性熒光標(biāo)記粒子的偶聯(lián)物墊、結(jié)合IL-2的捕獲線和陽性對(duì)照線。
實(shí)驗(yàn)方法按下文在玻璃載玻片上組裝試驗(yàn)(見圖11)。將抗體條帶施加到兩片(3mm×25mm)側(cè)流膜上(Millipore；Hi-Flow Plus，目錄號(hào)HF13502)。捕獲線條帶含有捕獲抗體(Pharmingen；單克隆抗-IL-2，目錄號(hào)554424，每8cm長的線含10μl 1mg/ml的溶液)和對(duì)照抗體((Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗小鼠IgG， 目錄號(hào)115-165-146，每8cm長的線含10μl 1mg/ml的溶液)。干燥(15min)后，將線置于距離載玻片(VWR；目錄號(hào)48300-025)末端10mm(對(duì)照線)和13mm(捕獲線)處。切下一片(3mm×25mm)玻璃纖維網(wǎng)(Millipore；玻璃纖維偶聯(lián)物墊，目錄號(hào)HFMIDAK015的部分)，置于距離載玻片末端20mm處。將一片吸附紙(50mm×25mm)置于載玻片末端。將第二個(gè)載玻片置于捕獲線、玻璃纖維和吸附紙頂端，這樣載玻片的一端直接位于玻璃纖維片上，另一端重疊在吸附紙上。通過混合珠(10μl 1.23×1011/ml)、抗體(10μl 1.0μg/ml原液)和PBS(80μl)并且攪拌(1.5小時(shí)/室溫)，用生物素抗IL-2抗體(Pharmingen；目錄號(hào)554426)標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的熒光珠(BangsLaboratoriesInc.，目錄號(hào)CP01F-5121)。然后離心(5000g，10min)珠，并且重懸于PBS-B(100μl)。將抗IL-2抗體涂覆的熒光珠(2μl)加入每個(gè)測定載玻片的偶聯(lián)物墊。用PBS-B系列稀釋IL-2原液(Pharmingen；重組小鼠IL-2，目錄號(hào)550069)(終濃度為0，20，200pg/ml)。將試驗(yàn)樣品(1ml 0，20和200pg/ml的稀釋液)加入試驗(yàn)載玻片的加樣區(qū)。進(jìn)行測定(約15分鐘)后按實(shí)施例2的方法進(jìn)行成像。用Image-Pro軟件分析像。
結(jié)果圖12表示捕獲線試驗(yàn)的結(jié)果。該圖表示來自施用了含IL-2(0、20和200pg/ml)的樣品的試驗(yàn)的捕獲和對(duì)照線的像。結(jié)果表明該試驗(yàn)可以檢測濃度為20pg/ml的IL-2。此外，捕獲線的濃度依賴性斑點(diǎn)狀外觀表明，對(duì)各個(gè)標(biāo)記粒子進(jìn)行了成像。
該試驗(yàn)采用一般加樣到常規(guī)側(cè)流裝置上的樣品體積的5-10倍體積，但是該測定與在前面的實(shí)施例中進(jìn)行的常規(guī)“低體積”側(cè)流試驗(yàn)基本相同的時(shí)間內(nèi)完成。通過增加捕獲線的長度，甚至可以分析更大的體積。通過延長捕獲線增加靈敏度的能力是本發(fā)明檢測各個(gè)標(biāo)記粒子的能力的副產(chǎn)品。當(dāng)檢測各個(gè)標(biāo)記粒子時(shí)，增加捕獲性的長度和增加樣品體積，產(chǎn)生了更多信號(hào)而不增加背景(回想可以在與含有陽性信號(hào)的區(qū)域大小相似的區(qū)域中測量相關(guān)的背景強(qiáng)度)。現(xiàn)反，增加捕獲線的大小不改進(jìn)測量積分信號(hào)強(qiáng)度的試驗(yàn)，因?yàn)楸尘暗脑黾优c信號(hào)的增加成比例。
實(shí)施例9.使用不放大的大面積成像和固相捕獲免疫測定對(duì)蛋白分子進(jìn)行的靈敏檢測概述在該實(shí)施例中，用不放大的大面積成像檢測IL-2蛋白靶實(shí)體。用吸附到抗體涂覆的微量滴定皿孔的表面的抗體捕獲IL-2分子。然后將涂覆了不同抗IL-2抗體的熒光粒子結(jié)合于表面固定的IL-2分子。用不放大的大面積成像檢測各個(gè)粒子IL-2復(fù)合物。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用生物素化的BSA(Sigma；目錄號(hào)A-8549；50μl溶于2M碳酸氫鈉的200μg/m生物素化的BSA，pH 10)涂覆96孔板(光學(xué)透明的塑料底；Greiner America，Inc；目錄號(hào)55896)。將板室溫下培養(yǎng)過夜。第二天通過向每個(gè)孔加入PBS(200μl)然后吸出而“洗滌”孔。然后進(jìn)一步用鏈親和素/PBS溶液(Jackson Labs；目錄號(hào)016-000-084；50μl 100μg/ml的溶液)涂覆生物素化的BSA涂覆的孔，并且在室溫下培養(yǎng)過夜。第二天，按上述方法洗滌孔。然后用生物素化的大鼠抗小鼠IL-2抗體(50μl 0.5mg/ml的溶液；Pharmingen；目錄號(hào)554426)涂覆生物素鏈親和素涂覆的孔。蓋上孔，在室溫下振蕩3.5小時(shí)。培養(yǎng)后，用PBS-B(Sigma；目錄號(hào)A-7638)/0.05％triton X 100(Sigma/X-100)洗滌孔三次。然后用BlockAid(150μl；Molecular Probes；目錄號(hào)B-10710)封閉孔，隨后在室溫下培養(yǎng)40分鐘。傾去Block Aid，向每個(gè)孔中加入ELISA稀釋液(50μl；Pharmingen；目錄號(hào)2728KD)。用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液(Pharmingen；目錄號(hào)2708KD)以10倍增加系列稀釋IL-2標(biāo)準(zhǔn)物(150pg/ml；Pharmingen；目錄號(hào)27316E)，向分開的孔中加入50μl每種稀釋液。將板在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后向每個(gè)孔中加入抗體涂覆的紅色熒光粒子(106；Molecular probes；1μm；硫酸酯；580/605nm；目錄號(hào)F-8851)，這些粒子通過被動(dòng)吸附而涂覆了大鼠抗小鼠IL-2抗體(Pharmingen；目錄號(hào)18161D)。為將抗體被動(dòng)吸附至珠的表面硫酸基團(tuán)，通過離心(5min；10,200xg；Eppendorf Centrifuge Model5417C，Eppendorf Swinging Bucket Rotor Model A-12-11)并且重懸粒子沉淀(1ml PBS/.15M NaCl)而重復(fù)(重復(fù)3次)洗滌粒子(62.5μl；2％固體；Molecular Probes目錄號(hào)F8851，1μm，紅色熒光(580/605))。將粒子沉淀重懸于PBS(125μl；達(dá)到濃度為1％固體)，然后在渦旋下逐滴加入純化的抗體(1.25nmol，達(dá)到1nmol抗體/mg粒子的比例)。25℃在旋轉(zhuǎn)下培養(yǎng)懸浮液2小時(shí)，然后在4℃培養(yǎng)過夜。洗滌粒子(按上述方法重復(fù)3次，但離心后重懸于PBS-TB)，重懸于PBS-TB(200μl)，旋轉(zhuǎn)下培養(yǎng)(30分鐘，25℃)。按上述方法洗滌粒子兩次，并且重懸于PBS-TB(125μl，達(dá)到濃度為1％固體)。加入被動(dòng)涂覆的珠(107)后，讓孔在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。用1X ELISA洗滌溶液(200μl；來自于20X原液的稀釋；目錄號(hào)2605KC)洗滌板6次，然后用水洗滌1次。通過在GPS成像儀上用Texas Red濾光器裝置(色度激發(fā)560/55nm，發(fā)射645/75nm)對(duì)紅色熒光粒子成像而檢測熒光。按實(shí)施例2所述用Image-Pro Plus軟件，4.1版(Media cybernetics)捕獲和處理來自CCD成像儀的像。使用裝有同樣的濾光裝置的AxioplanII熒光顯微鏡(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)證明成像儀上檢測的陽性信號(hào)是粒子。
結(jié)果圖13表示固相捕獲測定中的I1-2檢測。隨著IL-2的濃度減少，抗IL-2抗體涂覆的熒光粒子(白色點(diǎn))的數(shù)量也減少。與沒有IL-2的陰性對(duì)照相比，該測定的靈敏度(定義為平均陰性對(duì)照之上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)為大約1.5pg/ml。該結(jié)果與IL-2的ELISA試驗(yàn)相似。
實(shí)施例10.使用不放大的大面積成像和液相捕獲對(duì)蛋白分子進(jìn)行的靈敏檢測概述在該實(shí)施例中，如同前一實(shí)施例，用不放大的大面積成像檢測IL-2蛋白靶實(shí)體。但是，此處將IL-2分子結(jié)合于液相中的抗體涂覆的粒子對(duì)。如同前面的實(shí)施例，一個(gè)粒子是熒光的，另一個(gè)粒子是磁性的。用磁力將粒子分析物復(fù)合物沉積在平面檢測區(qū)中。按照前面的方法用不放大的大面積成像對(duì)這些復(fù)合物進(jìn)行成像。
實(shí)驗(yàn)程序通過將帶有活性甲苯磺?；拇判粤Ｗ优悸?lián)于抗IL-2的單克隆抗體(大鼠抗-IL-2，Pharmingen；目錄號(hào)18161 D)而制備抗IL-2磁性顆粒。在微量離心管(1.5ml)中用PB(重復(fù)3次洗滌，每次1ml)洗滌磁性粒子(30mg/ml；100μl；Dynal，Oslo，Norway，Dynaparticles M-280 Tosylactivated目錄號(hào)140.03)，采用粒子的磁性分離，然后去除上清液(除特別指出，此實(shí)施例中的所有磁性分離是采用Polysciences Inc.；目錄號(hào)8MB4111 S的裝置進(jìn)行的)。將粒子重懸于PB(70μl)。在微量離心管(1.5ml)中混合抗IL-2的單克隆抗體(60μg；Pharmingen；目錄號(hào)18161D)，短暫渦旋。旋轉(zhuǎn)下(除非特別指出，約30rpm)將反應(yīng)在37℃培養(yǎng)20分鐘。20分鐘后加入BSA(無IgG)至0.1％的終濃度，旋轉(zhuǎn)下在37℃培養(yǎng)過夜。用PBS-B洗滌磁性粒子2次(每次1ml，采用磁性分離)。將磁性粒子重懸于緩沖液(補(bǔ)加了0.1％(w/v)BSA(無IgG)的0.2M Tris pH 8.5)，并且旋轉(zhuǎn)下在37℃培養(yǎng)4小時(shí)。最后，將磁性顆粒洗滌兩次(在PBS-B中，采用磁性分離)并且重懸(終濃度為PBS-B中含1％固體)。制備磁珠后，以10倍增加系列稀釋IL-2標(biāo)準(zhǔn)物(150pg/ml；Pharmingen；目錄號(hào)27316E)。向分開的1.5ml試管中將20μl每種稀釋液與涂覆了大鼠抗IL-2抗體的磁性粒子和涂覆了(見實(shí)施例9的被動(dòng)吸附涂覆)生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IL-2(Pharmingen；目錄號(hào)554426)的紅色熒光粒子(108個(gè)粒子；Molecular Probes；1μl；硫酸酯；580/605nm；目錄號(hào)F-8851)混合。將粒子I1-2懸浮液(120μl)與BlockAid(60μl；Molecular Probes；目錄號(hào)B-10710)混合，并且超聲處理30秒(設(shè)置8，550 Sonic Dismembrator；Misonix)。超聲處理后，加入額外的Block Aid(60μl)，然后混合試管。然后在攪拌下室溫培養(yǎng)試管1小時(shí)。培養(yǎng)后，在PBS-TB中洗滌試管3次。一次洗滌包括磁性分離將磁性粒子IL-2熒光粒子夾心牽拉至試管的一側(cè)，然后吸出上清液。每次洗滌后，加入PBS-TB(50μl)。將等分物加入光學(xué)透明的塑料底平板(Greiner America，Inc.；目錄號(hào)655896)。通過在GPS成像儀上用Texas Red濾光器裝置(色度激發(fā)560/55nm，發(fā)射645/75nm)對(duì)紅色熒光粒子成像而檢測熒光。按實(shí)施例2所述用Image-Pro Plus軟件，4.1版(Media cybernetics)捕獲和處理來自CCD成像儀的像。使用裝有同樣的濾光裝置的Axioplan II熒光顯微鏡(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)證明成像儀上檢測的陽性信號(hào)是粒子。
結(jié)果圖14表示固相測定中的Il-2檢測。隨著IL-2的濃度減少，抗IL-2抗體涂覆的熒光粒子(白色點(diǎn))的數(shù)量也減少。與沒有IL-2的陰性對(duì)照相比，該測定的靈敏度(定義為平均陰性對(duì)照之上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)為大約1.5pg/ml。
實(shí)施例11.使用不放大的大面積成像檢測多種人細(xì)胞因子的免疫測定細(xì)胞因子是細(xì)胞-細(xì)胞聯(lián)系的關(guān)鍵介導(dǎo)物，并且在作為免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的協(xié)調(diào)中是關(guān)鍵的。這些蛋白的復(fù)雜組合和低濃度是致病微環(huán)境的特征。因此，研究和臨床分析中需要細(xì)胞因子的靈敏多路檢測方法。在該實(shí)施例中，用本發(fā)明構(gòu)造這樣的試驗(yàn)。在實(shí)施例中，在不放大的條件下檢測各個(gè)蛋白分子。用連接于微量滴定板孔的抗體捕獲蛋白分子，然后如實(shí)施例9所述通過結(jié)合于高強(qiáng)度熒光粒子而對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。
圖15描述了檢驗(yàn)四種細(xì)胞因子的測定的示意圖粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)。該實(shí)施例中開發(fā)的試驗(yàn)在形式上類似于前面的試驗(yàn)(多路病毒檢測)，只是有以下顯著區(qū)別。由于蛋白分子(與病毒不同)是該測定的靶，捕獲抗體(連接于孔表面)和檢測抗體(連接于熒光粒子)必須識(shí)別靶上的不重疊表位。
涂覆熒光粒子和具有抗細(xì)胞因子的孔按照以前的描述(Carson，R.T.，et al.，J Immunol Methods 22741-52，1999)從商業(yè)來源獲得標(biāo)準(zhǔn)抗細(xì)胞因子抗體對(duì)(具有不重疊的表位)。
通過被動(dòng)吸附使抗體在每孔的4個(gè)相鄰的補(bǔ)體點(diǎn)結(jié)合于微量滴定皿孔(每抗體1個(gè)點(diǎn))。將每個(gè)抗病毒抗體點(diǎn)樣(1μl；1μg/μl)至96孔微量滴定板(Greiner America；目錄號(hào)55896)的一個(gè)孔，并且在濕化培養(yǎng)室(Boekel Slide Moat；model 240000)中室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。然后洗滌孔并且按實(shí)施例9所述封閉(注意在此實(shí)施例中，還可以將抗體的等摩爾混合物作為均相混合物結(jié)合于孔)。
按照前面實(shí)施例的描述，通過用抗細(xì)胞因子檢測抗體涂覆具有不同發(fā)射光譜的熒光染色的聚苯乙烯粒子而制備顏色編碼的細(xì)胞因子特異性熒光粒子(詳述見Carson et al，1999，supra)。熒光粒子編碼如下GM-CSF特異性粒子黃色-綠色；IL-2特異性粒子橙色；IL-4特異性粒子深紅色；TNF-α粒子紅外的。按照前面實(shí)施例所述混合并且制備4中類型的抗體涂覆的粒子。如前面實(shí)施例所述，也可以使用每種病毒的相同類型的熒光粒子。
標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將細(xì)胞因子的濃度與積分測定信號(hào)相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將含有濃度為10pg/ml-10μg/ml的各個(gè)細(xì)胞因子的10倍稀釋液的樣品(200μl，溶于PBS-TB；重復(fù)三份)加入含有點(diǎn)樣的捕獲抗體的各個(gè)微量滴定皿孔。30分鐘后，用PBS-TB(200μl，4X)洗滌孔。將混合的細(xì)胞因子特異性粒子(200μl)加入孔中，并且在離心機(jī)(Beckman Allegra 6；GH-3.8轉(zhuǎn)子；1200g)短暫旋轉(zhuǎn)，以便用粒子涂覆孔的底面。在室溫下溫育粒子10分鐘后，通過洗滌(用200μlPBS-TB洗滌3次，通過反復(fù)吸取5次而攪動(dòng)每份洗滌溶液)除去未結(jié)合的粒子。然后，確定結(jié)合于每個(gè)點(diǎn)的粒子的數(shù)目、顏色和累積強(qiáng)度。然后按實(shí)施例2所述用CCD成像儀對(duì)孔進(jìn)行成像和分析，但是用適當(dāng)?shù)臑V過裝置獲得多個(gè)像(黃綠色激發(fā)色度HQ480/40x和發(fā)射色度HQ535/50m；橙色激發(fā)色度HQ535/50X和發(fā)射色度HG610/75m；深紅色激發(fā)色度HQ560/55x和發(fā)射色度HQ645/75m；紅外激發(fā)色度HQ710/75x和發(fā)射色度HQ810/90m)。通過結(jié)合的粒子所粘附的點(diǎn)鑒定病毒。通過以下事實(shí)提供額外的診斷依據(jù)如果測定成功，僅有預(yù)計(jì)顏色的粒子粘附于特定的點(diǎn)。
檢測未鑒定樣品中的細(xì)胞因子將含有，或可能含有細(xì)胞因子GM-CSF，IL-2，IL-4，和/或TNF-α的樣品(200μl)加入含有點(diǎn)樣的捕獲抗體的微量滴定皿孔。按上文所述處理并分析樣品。通過內(nèi)插比較相應(yīng)于4種細(xì)胞因子特異性捕獲抗體點(diǎn)的定量信號(hào)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線而估計(jì)細(xì)胞因子的濃度。
實(shí)施例12.使用不放大的大面積成像檢測總(結(jié)合的+游離的)細(xì)胞因子IL-2的競爭性免疫測定當(dāng)靶實(shí)體不含有非重疊類目特異性結(jié)合位點(diǎn)(如表位)時(shí)，使用競爭性免疫測定。對(duì)于小分子分析物如濫用的藥物(如可卡因)、化學(xué)污染物(如PCBs)、或激素(如三碘甲腺氨酸)通常如此。當(dāng)靶分子上僅有一個(gè)表位可接近抗體時(shí)，例如，當(dāng)小分子蛋白激素或細(xì)胞因子結(jié)合于并且很大程度被較大的結(jié)合蛋白或受體吞入時(shí)，競爭性免疫測定也是有用的。
競爭性免疫測定測量靶實(shí)體的類似物的捕獲，所述類似物與靶實(shí)體不同，它具有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)并且因此可以使用基本的免疫測定程序進(jìn)行測量。樣品中的靶實(shí)體可以與類似物競爭捕獲位點(diǎn)。因此，類似物的捕獲程度是樣品中靶實(shí)體的濃度的函數(shù)。
該實(shí)施例描述了用本發(fā)明構(gòu)造的測定，它使用競爭性免疫測定形式檢測總細(xì)胞因子IL-2(即結(jié)合的IL-2+游離的IL-2)。圖16展示了競爭性免疫測定的示意圖。
IL-2的競爭性免疫測定采用市售試劑盒(Chemicon；目錄號(hào)CYT111)，并且按照制造商推薦的方案進(jìn)行IL-2的競爭性免疫測定，進(jìn)行了以下改變。試劑盒是多種導(dǎo)致微量滴定皿中的溶液有色的免疫測定的代表。顏色強(qiáng)度表示樣品中分析物的量，并且是結(jié)合的酶抗體偶聯(lián)物的累積作用的結(jié)果。用本發(fā)明構(gòu)造的試驗(yàn)與經(jīng)典的競爭性免疫測定不同。首先，通過與熒光鏈親和素涂覆的粒子結(jié)合而對(duì)各個(gè)靶(在此情況下是IL-2生物素偶聯(lián)物)成像。其次，通過光學(xué)透明的孔底部對(duì)結(jié)合的熒光粒子成像，而不是從孔上對(duì)顏色改變進(jìn)行分光光度測定。盡管熒光粒子是顯微水平的(約1μm)，是在不放大的條件下進(jìn)行成像的。
由于平坦的、光學(xué)透明的孔底部是各個(gè)成像結(jié)合事件需要的，因此用適當(dāng)?shù)奈⒘康味ò逄娲惺墼噭┖兄刑峁┑牡诙贵w涂覆的板。按照以前的描述(Coliganet al.，1994，section 6.22.1，supra)用小鼠抗白介素-2抗體(Chemicon；# MAB1018)涂覆具有光學(xué)透明的底部的96孔微量滴定板。
在市售試劑盒中，用鏈親和素堿性磷酸酶偶聯(lián)物通過產(chǎn)色的堿性磷酸酶底物的反應(yīng)檢測結(jié)合的IL-2生物素偶聯(lián)物。在此實(shí)施例中，用鏈親和素涂覆的熒光粒子(Molecular Probes；目錄號(hào)8775；1μm直徑；熒光紅色)替代鏈親和素堿性磷酸酶偶聯(lián)物。
按照市售試劑盒制造商的推薦處理標(biāo)準(zhǔn)物(包含在市售試劑盒中)和未知成分的競爭性免疫測定，具有以下例外。在具有光學(xué)透明的孔底部的板中處理樣品(見上文)。當(dāng)按照制造商的方案應(yīng)當(dāng)加入鏈親和素堿性磷酸酶偶聯(lián)物時(shí)，加入鏈親和素涂覆的熒光粒子(100μl；PBS-T中的107粒子/ml)。然后按照實(shí)施例11所述進(jìn)行測定和成像。按照熒光粒子的光學(xué)特性(激發(fā)/發(fā)射580/605)選擇用于使孔成像的激發(fā)(色度HQ560/55x)和發(fā)射(色度HQ645/75m)濾光器。
實(shí)施例13.使用量尺形式和不放大的大面積成像靈敏檢測核酸分子概述在此實(shí)施例中，用不放大的大面積成像檢測特異性結(jié)合于親和素標(biāo)記的熒光珠的生物素化的DNA。用簡單但靈敏的量尺測定獲得熒光珠與結(jié)合于尼龍膜的生物素化λDNA的快速結(jié)合。該測定形式具有用于關(guān)注點(diǎn)遺傳試驗(yàn)的可能。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將生物素化λDNA以10倍稀釋液(1g-10pg)點(diǎn)樣在尼龍膜(0.2 Am孔；Pall Biodyne A；目錄號(hào)28152-409)上。將陰性對(duì)照樣品(1μg非生物素化λDNA)沉積在相同的濾膜上。采用紫外線交聯(lián)劑(Stratagene)將DNA交聯(lián)于膜。通過用BB緩沖液(50μl)室溫下飽和膜30分鐘而封閉膜。然后使膜干燥。封閉后，將膜的一端浸入1.5ml試管中含1012親和素涂覆的Texas red熒光珠(0.45μm；Spherotech；目錄號(hào)VFP-0562-5)的溶液。通過毛細(xì)作用使溶液向膜上移動(dòng)，直到它到達(dá)峰高度，即條帶長度的約3/4。將DNA點(diǎn)置于條帶上，以便它們在溶液的峰高度以下的適當(dāng)位置。然后室溫下在PBS-TB(35ml)中洗滌膜。通過聯(lián)合使用CCD成像儀和適于檢測紅色熒光珠的Texas Red濾光器裝置(色度；激發(fā)560/55nm，發(fā)射645/75nm)而檢測熒光。用Image Pro Plus軟件，4.1版(Media cybernetics)捕獲和處理CCD成像儀的像。通過使用裝備了同樣的濾光器裝置的Axioplan II熒光顯微鏡(Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY)證明成像儀上檢測的陽性信號(hào)是珠子。
結(jié)果圖17表示用不放大的大面積成像檢測點(diǎn)中的低至約106個(gè)分子的水平的DNA分子。含有100pg生物素化λDNA的點(diǎn)比含有1μg非生物素化λDNA的陰性對(duì)照具有明顯更強(qiáng)的信號(hào)。在圖中可見預(yù)期的劑量反應(yīng)。隨著點(diǎn)中的DNA增加，熒光珠的數(shù)量也增加(圖中的白色點(diǎn))。
變化形式該試驗(yàn)的一個(gè)重要的變化形式是使用特異性雜交探針作為類目結(jié)合分子?？梢园凑掌渌鼘?shí)施例的描述直接或間接標(biāo)記所述探針。類似地，以此測定形式，可以開發(fā)用于測量RNA分子的特定類目的表達(dá)的試驗(yàn)。
實(shí)施例14.用于對(duì)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因型分析的試驗(yàn)在應(yīng)用(如醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè))和基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域，檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是一種重要的現(xiàn)代遺傳學(xué)應(yīng)用。該實(shí)施例描述了將本發(fā)明用于建立使用均相的，不放大的形式，在導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞貧血的常見突變的位點(diǎn)測定患者的基因型的新試驗(yàn)。該試驗(yàn)使用寡核苷酸連接測定，其中用磁性粒子標(biāo)記探針之一，用熒光粒子標(biāo)記另一探針。
用于寡核苷酸連接測定的標(biāo)記探針在該測定中使用寡核苷酸連接測定，該寡核苷酸連接測定使用兩個(gè)寡核苷酸部分“恒定”寡核苷酸和“等位基因特異性”寡核苷酸，用于對(duì)SNPs進(jìn)行基因型分析。用磁性粒子在3’末端對(duì)恒定的靶核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。用熒光粒子在5’端對(duì)等位基因特異性寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記(不同的等位基因使用不同顏色的粒子)。將恒定寡核苷酸設(shè)計(jì)為與基因座的一條鏈雜交，這樣寡核苷酸的5’末端與多態(tài)性核苷酸鄰近?！暗任换蛱禺愋浴惫押塑账崤c基因座雜交，這樣它的3’末端的核苷酸(相應(yīng)于單核苷酸多態(tài)性)鄰接于恒定核苷酸的5’末端的核苷酸，前提是兩者都與互補(bǔ)核酸鏈雜交。
恒定寡核苷酸按照制造商的說明，用3’氨基修飾(Midland Certified ScientificReagent Co.)合成恒定寡核苷酸(pGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCGCTCTAGAACTAGTGGATC(T)50-NH2)，并且使用多核苷酸激酶(New England Biolabs)在5’末端進(jìn)行酶促磷酸化。用5’氨基修合成鐮狀細(xì)胞和野生型等位基因特異性寡核苷酸NH2-(T)50CGCTCTAGAACTAGTGGATCATGGTGCACCTGACTCCTGT和NH2-(T)50CGCTCTAGMCTAGTGGATCATGGTGCACCTGACTCCTGA。注意寡核苷酸分為兩部分一部分(在氨基酸修飾遠(yuǎn)端，加下劃線)雜交于球蛋白基于，另一部分(氨基修飾近端)作為間隔基或束縛物。將間隔基插入結(jié)合于粒子(通過氨基)的寡核苷酸末端和與基因組DNA雜交的寡核苷酸部分之間將改進(jìn)雜交效率。
使寡核苷酸與粒子結(jié)合按照前面的描述(實(shí)施例10)，使用甲苯磺?；鶎⒔?jīng)末端氨基修飾的寡核苷酸與粒子共價(jià)連接。通過3’氨基將恒定寡核苷酸與甲苯磺?；罨拇判粤Ｗ?2.8μm；Dynal；目錄號(hào)140.03)連接。通過5’氨基，將鐮狀細(xì)胞等位基因特異性寡核苷酸與紅色熒光粒子(200nm；Molecular Probes；目錄號(hào)F-8811)連接，將野生型等位基因特異性寡核苷酸與綠色熒光粒子(200nm；MolecularProbes；目錄號(hào)F-8810)連接。連接后，洗滌并且封閉，以終濃度2％混合寡核苷酸涂覆的粒子。
均相寡核苷酸連接測定從血塊黃層部分純化人DNA(Sambrook，J，etal.，Molecular Cloning A Laboratory Manual(ColdSpring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，2001))。通過在100℃加熱3分鐘而變性純化的人基因組DNA(12μl EE中的1μg)，在冰浴上快速冷卻，然后與5μl寡核苷酸涂覆的粒子混合物和2μl 10×連接緩沖液(New England Biolabs)混合，并且在50℃退火1小時(shí)。加入T4 DNA連接酶(1μl 400μ/μl；New England Biolabs)，并且讓連接反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時(shí)。將陰性對(duì)照樣品置于皿的另一個(gè)孔中。陰性對(duì)照的組成與實(shí)驗(yàn)樣品一樣，只是用EE替代了人DNA。按照與實(shí)驗(yàn)樣品相同的方法處理陰性對(duì)照。通過加入EE(120μl)將樣品稀釋到200μl。將黑色墨水(50μl；Black No.17，Pelikan，Hanover，Germany)加入具有光學(xué)透明底部的96孔微量滴定皿(Greiner Labs；目錄號(hào)665097)的孔中。將微量滴定皿置于平坦的磁鐵(Dexter Magnetics，LifeSep，96F)上15分鐘。然后輕輕將皿移至CCD成像儀上的一個(gè)位置(圖3)，成功對(duì)含有測定樣品和對(duì)照的孔底部進(jìn)行成像。然后按照實(shí)施例2，用像分析軟件包(image-Pro Plus software，4.1版；MediaCybernetics)分析像。陰性對(duì)照樣品底部成像的綠色和紅色粒子數(shù)代表背景粒子計(jì)數(shù)。用在實(shí)驗(yàn)樣品底部上成像的相似顏色的粒子數(shù)減去這些數(shù)。紅色粒子與綠色粒子的比值確定了鐮狀細(xì)胞基因座上的基因型。如果綠色粒子(野生型等位基因)與紅色粒子(突變型等位基因)的比值大(＜90％)，該基因型是純合的野生型。如果該比值小(＜10％)，該基因型是純合的鐮狀細(xì)胞等位基因。最后，如果該比值是大約1∶1，該基因型是雜合的鐮狀細(xì)胞等位基因。
變化形式可以引入該方案的多種變化形式?；蚪MDNA或細(xì)胞RNA的擴(kuò)增也可以用作模板，寡核苷酸探針在連接前與其退火。也可以使用其它標(biāo)記策略。例如，可以用半抗原(如生物素或洋地黃毒苷)替代選擇部分(實(shí)施例中的磁性粒子)，通過使用鏈親和素或抗洋地黃毒苷抗體作為捕獲試劑，所述半抗原可以作為選擇部分起作用(例如，固定在表面或磁性粒子上)。類似地，信號(hào)部分可以具有一個(gè)或多個(gè)信號(hào)傳遞特征(如熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、無線電頻率、大小等)。如同選擇部分，信號(hào)傳遞部分可以直接(如共價(jià))或間接連接于等位基因特異性寡核苷酸。例如，可以用生物素和熒光標(biāo)記的鏈親和素修飾等位基因特異性寡核苷酸，生物素和熒光標(biāo)記的鏈親和素可以間接結(jié)合，并且用作信號(hào)傳遞部分。或者，可以用標(biāo)記序列涂覆信號(hào)傳遞部分，如熒光粒子或選擇部分，如磁性粒子，所述標(biāo)記序列允許粒子通過核酸雜交與雜交于基因組DNA的寡核苷酸上的標(biāo)記互補(bǔ)體部分結(jié)合。在此后一種情況下，標(biāo)記是間接的，此時(shí)可以構(gòu)建測定方法，其中首先進(jìn)行與基因組DNA的連接，然后將標(biāo)記和/或信號(hào)傳遞部分與寡核苷酸(連接的或未連接的)進(jìn)行締合。當(dāng)使用可以空間或動(dòng)力學(xué)上降低連接反應(yīng)效率的大的標(biāo)記部分時(shí)，該方法可以是有利的。最后，可以使用基因組或細(xì)胞RNA作為連接反應(yīng)發(fā)生的模板。
實(shí)施例15.使用側(cè)流形式和不放大的大面積成像進(jìn)行不放大的多路SNP分析現(xiàn)代醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)是迅速獲得患者的基因組圖形。遺傳標(biāo)記可以是疾病(如乳腺癌或亨廷頓氏病)的早期預(yù)示或可以表示患者可能對(duì)哪些藥物有良好的反應(yīng)。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是醫(yī)學(xué)上重要的遺傳學(xué)標(biāo)記，因?yàn)樗鼈冊诨蚪M中是充足的，并且許多人類遺傳疾病是由點(diǎn)突變導(dǎo)致的。
開發(fā)快速、高度多路和便宜的技術(shù)是應(yīng)用醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的當(dāng)前目標(biāo)。在該實(shí)施例中，用本發(fā)明建立具有這些屬性的試驗(yàn)。該測定(不需要DNA擴(kuò)增)掃描人類DNA樣品中3個(gè)不同基因(β球蛋白、α胰蛋白酶和囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物(CFTR))中的核苷酸多態(tài)性基因型。技術(shù)概述.如同前面的實(shí)施例，該測定使用寡核苷酸連接測定檢驗(yàn)SNP等位基因。但是，在該實(shí)施例中，用側(cè)流試驗(yàn)檢測連接的產(chǎn)物。該形式促進(jìn)僅僅用單信號(hào)傳遞部分檢測多種靶分子(在此處是SNPs)。以此形式檢測許多靶SNP等位基因的能力來自于通過它們與固定在膜上的已知位點(diǎn)的不同捕獲寡核苷酸的雜交而區(qū)分靶的可能。
該試驗(yàn)可以分成兩個(gè)階段，示于圖18和圖19。第一個(gè)階段是寡核苷酸連接測定(圖18上部)。如前面的實(shí)施例，設(shè)計(jì)用于等位基因特異性連接的寡核苷酸對(duì)與變性的基因組DNA雜交并且連接。在此測定的第二階段，將單鏈產(chǎn)物應(yīng)用于側(cè)流裝置，其中它們遇到互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸標(biāo)記并且與其雜交(圖18下部)。通過發(fā)射高強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光信號(hào)的結(jié)合的粒子使用CCD成像儀對(duì)各個(gè)捕獲的寡核苷酸進(jìn)行成像(圖19)。
寡核苷酸在此實(shí)施例中，將核苷酸多態(tài)性的基因型分為3種基因β球蛋白，α抗胰蛋白酶和CFTR。對(duì)每個(gè)基因座合成一組寡核苷酸，以進(jìn)行基因型分析。如前面的實(shí)施例，每組含有一個(gè)恒定寡核苷酸和一個(gè)或多個(gè)等位基因特異性寡核苷酸。當(dāng)與基因組DNA的相應(yīng)鏈雜交時(shí)，連接恒定寡核苷酸和與連接的核苷酸多態(tài)性互補(bǔ)的等位基因特異性寡核苷酸。
按照前面實(shí)施例對(duì)寡核苷酸組進(jìn)行類似的設(shè)計(jì)，但有以下不同。每個(gè)等位基因特異性寡核苷酸分為兩部分，一部分相應(yīng)于基因組序列，如前面所述。但是，在該實(shí)施例中，等位基因特異性寡核苷酸是用鄰近的獨(dú)特標(biāo)記序列合成的。
為促進(jìn)單個(gè)反應(yīng)中的多個(gè)探針的相同雜交，設(shè)計(jì)寡核苷酸使功能片段的解鏈溫度(Tm，見定義)與它們的互補(bǔ)序列基本相同。多個(gè)分成兩部分的寡核苷酸優(yōu)選長度為約20個(gè)核苷酸，Tm等于60℃±2℃。以前曾經(jīng)描述過具有類似于表3中的寡核苷酸的靶突變和寡核苷酸連接測定(Nickerson，D.A.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 878923-7，1990)。
表3.用于實(shí)施例15中的核苷酸多態(tài)性基因型分析的寡核苷酸a命名(Nickerson，etal.，1990 supra)。
b以5’-3’方向?qū)懗龅墓押塑账嵝蛄?；b＝生物素；p＝5’磷酸c基因組序列加下劃線；未加下劃線的序列是標(biāo)記序列。
d捕獲寡核苷酸與等位基因特異性寡核苷酸中的標(biāo)記序列部分(即等位基因特異性寡核苷酸中未加下劃線的片段)互補(bǔ)。
使捕獲寡核苷酸與膜結(jié)合按照以前的描述(Rule，G.S.，et al.，Clinical Chemistry 421206-9，1996)將捕獲寡核苷酸(表3)應(yīng)用于塑料襯墊的硝酸纖維素濾膜(3μm孔徑，Schleicher & Schuell)并與其結(jié)合，但是在本實(shí)施例中，使用了多個(gè)捕獲寡核苷酸。如Rule等的描述，將第1條線應(yīng)用于距離濾膜底緣1cm處。將后續(xù)的捕獲寡核苷酸線應(yīng)用于3mm(離開濾膜的底緣和前面的線)間隔的平行線。將濾膜切成0.5mm×8cm的條帶(寡核苷酸線與長軸垂直)。
寡核苷酸連接測定將寡核苷酸混合物(1nM，每種寡核苷酸)和人基因組DNA(1μg)混合于14μl連接緩沖液(見定義)中。通過在熱循環(huán)儀(Perkin Elmer，GoneAmp PCR System 9700)中加熱至95℃(3分鐘)使混合物變性，然后冷卻(5％的最大下降速度)至37℃。向反應(yīng)中加入T4 DNA連接酶(1μl 400μ/μl酶；New England Biolabs；酶濃度表示為粘附末端單位)，然后在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。
終止反應(yīng)，通過在熱板上加熱至100℃1分鐘而使DNA變性。通過浸入冰浴迅速使樣品冷卻至0℃，然后周HYB(見定義)稀釋至150μl。
使堿性磷酸酶與親和素涂覆的粒子結(jié)合用生物素化的堿性磷酸酶(Pierce；#29339)涂覆鏈親和素涂覆的粒子(0.95μm直徑，BangsLabs；#CP01 N)，使得只有最大數(shù)目約一半的堿性磷酸酶分子進(jìn)行結(jié)合。所述粒子保留了通過游離的鏈親和素部分結(jié)合生物素化的靶分子的能力。通過在每個(gè)粒子約1×104生物素化的堿性磷酸酶分子的比值下培養(yǎng)鏈親和素涂覆的粒子而完成部分涂覆。通過確定生物素化的堿性磷酸酶與飽和粒子上的生物素化的堿性磷酸酶結(jié)合位點(diǎn)所需的粒子的最小比值而經(jīng)驗(yàn)確定每批粒子的比值。然后用該比值的一部分(如1/2)涂覆粒子。生物素化的堿性磷酸酶與飽和粒子所需的粒子數(shù)是通過用固定數(shù)目的粒子結(jié)合生物素化堿性磷酸酶的系列稀釋液，通過旋轉(zhuǎn)過濾(spinX；Costar；#8161)除去游離的生物素化堿性磷酸酶，回收粒子，并且用CDP-star(CDP-star；NEN)和X線膜發(fā)光繪圖法測量尼龍濾膜(GeneScreen；NEN)上的信號(hào)粒子的化學(xué)發(fā)光信號(hào)而確定的。
采用前面所確定的生物素化堿性磷酸酶粒子比(如104)，用生物素化堿性磷酸酶部分涂覆鏈親和素涂覆的粒子(2×109個(gè)粒子)。涂覆反應(yīng)(100μl)在EEN/0.1BSA中室溫下進(jìn)行1小時(shí)。使用旋轉(zhuǎn)過濾(spinX；Costar；#8161)洗滌(3×500μl EEN)粒子并且收集于EEN(200μl)中。
色譜和檢測根據(jù)Rule等的方法(1996，supra)在37℃進(jìn)行色譜。將寡核苷酸連接測定(150μl)置于10×75mm的聚苯乙烯試管中。然后將硝酸纖維素條帶置于試管中，以便條帶的底部(第一個(gè)寡核苷酸條帶應(yīng)用于底緣上方1cm)位于寡核苷酸連接測定溶液中。20分鐘后，從試管中取出條帶，并且在HYB溶液(50℃)中洗滌3次(每次5分鐘)。用粒子(1ml EEN中的108個(gè)生物素化堿性磷酸酶涂覆的粒子)覆蓋濾膜，并且在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。從濾膜上洗去游離粒子(劇烈攪拌下用5×10ml EEN進(jìn)行洗滌)。用CDP-Star(NEN)覆蓋濾膜，并且用X線膠片進(jìn)行發(fā)光繪圖。曝光前，用熒光帶(GlogoswII AutoradMarkers，Stratagene目錄號(hào)420201)區(qū)別標(biāo)記濾膜的角，以便曝光的X線膠片用模板進(jìn)行登記排列，該模板表示各種SNP線在濾膜上的位置。粒子與單個(gè)捕獲的SNP分子的結(jié)合所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)表示靶DNA中特定SNP基因型的存在。
其它實(shí)施方案可以使用其它類型的標(biāo)記，包括熒光和光散射標(biāo)記。類似地，可以使用多種儀器檢測信號(hào)(如CCD照相機(jī)、產(chǎn)生檢測、瞬時(shí)膠片等)。也可以使用其它類型的基質(zhì)，如不吸水的基質(zhì)(如玻璃載玻片)。也可以使用流通試驗(yàn)形式。該測定也可以使用微流形式(例如使用Flow-Thru ChipTMsystem；Gene-logic)而不是使用側(cè)流測定中的吸水濾膜。在此情況下，將捕獲探針固定在微型機(jī)械化的通道壁上的可尋址的幾何形狀上(即已知順序)，(連接和未連接的)寡核苷酸探針經(jīng)過該通道流通。
其它實(shí)施方案本申請引用的所有專利，專利申請，和出版物都引入此處作為參考。根據(jù)這里公開的本發(fā)明說明書和實(shí)施例，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是顯而易見的。說明書和實(shí)施例僅僅用于舉例說明，本發(fā)明的真正范圍和精神由下面的權(quán)利要求來表示。適于這里所述方法的其它實(shí)施方案的例子可在2002年9月6日提交的，名稱為“細(xì)胞和病毒的快速靈敏檢測”的美國申請?zhí)枺撸撸撸撸撸?，?002年9月6日提交的，名稱為“復(fù)制細(xì)胞的快速靈敏檢測”的美國申請?zhí)枺撸撸撸咧姓业?，這兩篇文獻(xiàn)也引入此處作為參考。
其它實(shí)施方案描述于權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中靶分子的方法，其中所述方法包括以下步驟a.使所述靶分子與標(biāo)記粒子接觸，其中標(biāo)記比小于100，和b.同時(shí)檢測檢測區(qū)中的各個(gè)靶分子標(biāo)記粒子復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述復(fù)合物以小于10個(gè)復(fù)合物/mm2檢測面積的密度隨機(jī)分散在檢測區(qū)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶分子以小于1個(gè)復(fù)合物/mm2檢測面積的密度隨機(jī)分散在檢測區(qū)中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測無需放大超過5X。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述檢測無需放大超過2X。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述檢測無需放大超過1X。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述檢測無需放大超過0.2X。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子是蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子是核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于100kD。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于10kD。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述靶分子的分子量小于1kD。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測并鑒定靶分子的一個(gè)以上非重疊類目。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是特異性結(jié)合天然或重組的抗體或適體的位點(diǎn)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是特異性結(jié)合DNA，RNA，或PNA探針的位點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子上的所述類目特異性結(jié)合位點(diǎn)是包括單核苷酸多態(tài)性的核酸多態(tài)性或與包括單核苷酸多態(tài)性的核酸多態(tài)性緊鄰。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品含有從多細(xì)胞生物獲得的液體或組織。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述樣品含有動(dòng)物的體液或組織。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述樣品來源于人類。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述樣品來源于非人脊椎動(dòng)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述樣品是下列的一員、或來源于呼吸道，泌尿生殖道，生殖道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尿液，血液，皮膚，血漿，血清，唾液，創(chuàng)傷組織，創(chuàng)傷滲出物，活組織檢查物，糞便，和實(shí)體組織的樣品。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品來源于植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是通過從環(huán)境空氣或水，或與環(huán)境接觸的表面，物體，或生物采集樣品而獲得的。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品選自、來源于、或從下列成分獲得在藥物，化妝品，血液，或表面或內(nèi)部用于人或動(dòng)物中的其它產(chǎn)品的制造過程中的原料，成品或半成品；食品或飲料制造過程中的原料，成品或半成品；醫(yī)療或體外診斷裝置制造過程中的原料，半成品或成品；化學(xué)品；工業(yè)表面；儀器；和機(jī)械。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇法用于將所述復(fù)合物沉積在所述檢測表面上，且其中所述選擇法是磁性選擇，離心，沉降，和過濾。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述方法包括使樣品接觸與類目結(jié)合分子偶聯(lián)的磁性粒子。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中在不使用選擇部分的情況下，利用所述選擇法中的一種使靶分子沉積在所述檢測區(qū)中。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述靶分子與靶分子特異性選擇部分在液體中接觸，該靶分子特異性選擇部分的平均密度大于所述液體的平均密度，且隨后利用重力，離心力，或向心力在所述檢測表面上沉積。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中處理所述樣品使其液化和/或均化。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在液相中。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在液相和固相之間的界面上。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中處理所述樣品，從而將所述靶分子之外的物質(zhì)或物體除去。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述接觸之前，將所述靶分子固定在所述檢測表面上。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子通過與檢測區(qū)的基質(zhì)或底物結(jié)合的類目結(jié)合分子而特異性結(jié)合在檢測區(qū)中。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶分子通過與檢測區(qū)的基質(zhì)或底物形成化學(xué)鍵而特異性結(jié)合在檢測區(qū)中。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中利用選自風(fēng)干、熱固定、和化學(xué)固定法的方法將所述靶固定在所述檢測區(qū)中。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中處理所述樣品，從而使所述靶分子上的類目特異性結(jié)合位點(diǎn)更容易與所述類目結(jié)合分子接觸。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述檢測之前，除去所述復(fù)合物中的未結(jié)合標(biāo)記粒子。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子具有光子信號(hào)傳遞特征，且其中可加入膠態(tài)或可溶性物質(zhì)來吸收由不在所述檢測區(qū)中的標(biāo)記粒子發(fā)射的信號(hào)。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品細(xì)分成用于平行測試靶的不同非重疊類目的存在的各個(gè)等分試樣。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中使每份等分試樣與標(biāo)記粒子群接觸，而所述標(biāo)記粒子群與類目結(jié)合分子的不同非重疊家族偶聯(lián)。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述樣品與特異性結(jié)合靶實(shí)體的非重疊類目的類目結(jié)合分子不同家族連續(xù)接觸。
43.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測區(qū)選自固體玻璃，固體塑料，微量滴定平板孔的表面，吸水薄膜，塑料帶，毛細(xì)管的表面，微流室的表面和微流通道的表面。
44.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括側(cè)流色譜法。
45.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法自動(dòng)在一系列樣品上重復(fù)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述樣品可自動(dòng)加樣到包括所述檢測工具的儀器上。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述樣品可自動(dòng)沉積在一系列檢測區(qū)中，其中所述一系列檢測區(qū)在物理上關(guān)聯(lián)，并可自動(dòng)連續(xù)加樣到包括所述檢測工具的儀器上。
48.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物產(chǎn)生可檢測信號(hào)。
49.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法檢測由于所述復(fù)合物的照射而發(fā)射，散射，反射，或吸收的光。
50.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測熒光。
51.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測化學(xué)發(fā)光。
52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物的工具包括一束或多束激光。
53.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物的工具包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)光二極管。
54.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物的工具包括白光源。
55.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物的工具包括一個(gè)或多個(gè)濾光器，該濾光器適合用波長適于檢測所述復(fù)合物的光照射所述樣品。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述復(fù)合物的工具包括一個(gè)或多個(gè)濾光器，該濾光器適合用波長適于檢測所述標(biāo)記粒子的光照射所述樣品。
57.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于檢測所述發(fā)射、散射、透射、或吸收光的工具包括濾光器，該濾光器適于檢測源于所述標(biāo)記粒子的照射的信號(hào)。
58.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測不使用照射。
59.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測熱輻射。
60.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測吸光度。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述吸光度是指紅外區(qū)中的。
62.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測熒光偏振。
63.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測光反射。
64.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測光散射。
65.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測是檢測拉曼散射。
66.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于20微米。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于10微米。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于5微米。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于1微米。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于100nm。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子小于10nm。
72.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子是膠乳粒子，二氧化硅粒子，量子點(diǎn)，共振光散射粒子，向上轉(zhuǎn)換型磷光體，或主要由金或銀組成的粒子。
73.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子由酶促信號(hào)傳遞部分涂覆。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括平均密度為每立方微米粒子體積大于或等于2個(gè)酶促信號(hào)傳遞部分的酶促信號(hào)傳遞部分。
75.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括信號(hào)傳遞部分，所述信號(hào)傳遞部分是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
76.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子與以前接觸過樣品的類目結(jié)合分子結(jié)合。
77.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括信號(hào)傳遞部分，所述信號(hào)傳遞部分選自有機(jī)熒光團(tuán)，上調(diào)型磷光體，鑭系元素，量子點(diǎn)，以及從非熒光底物產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的酶。
78.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括信號(hào)傳遞部分，所述信號(hào)傳遞部分是用具有熒光信號(hào)特征并且選自下組的信號(hào)傳遞部分染色或偶聯(lián)的粒子有機(jī)熒光團(tuán)，上調(diào)型磷光體，鑭系元素，量子點(diǎn)，以及從非熒光底物產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的酶。
79.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括具有熒光信號(hào)傳遞特征的信號(hào)傳遞部分。
80.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括具有化學(xué)發(fā)光信號(hào)傳遞特征的信號(hào)傳遞部分。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述分子是acridinium酯。
82.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括具有產(chǎn)色信號(hào)傳遞特征的信號(hào)傳遞部分。
83.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括具有光散射信號(hào)傳遞特征的信號(hào)傳遞部分。
84.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述信號(hào)傳遞部分具有光散射信號(hào)傳遞特征。
85.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使所述樣品在類目結(jié)合分子和靶分子上的類目特異性結(jié)合位點(diǎn)之間能夠形成復(fù)合物的條件下與包括類目結(jié)合分子的標(biāo)記粒子接觸。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括抗體。
87.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括適體。
88.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括核酸或肽核酸。
89.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括配體。
90.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括分子量小于100kD的分子。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括分子量小于10kD的分子。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子包括分子量小于1kD的分子。
93.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記粒子包括不同的群體，其中每個(gè)群體與類目結(jié)合分子的不同非重疊家族偶聯(lián)。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述每個(gè)家族特異性結(jié)合靶分子的類目，該靶分子的類目特異性結(jié)合類目結(jié)合分子的家族，而該類目結(jié)合分子的家族與檢測區(qū)的一部分穩(wěn)定結(jié)合，其中與檢測區(qū)結(jié)合的所述每個(gè)家族結(jié)合不同的位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)可通過所述檢測區(qū)別。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中每個(gè)所述標(biāo)記粒子的群體具有相同的信號(hào)傳遞種類和信號(hào)傳遞標(biāo)志。
96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述每個(gè)群體具有不同的信號(hào)傳遞標(biāo)志或信號(hào)傳遞種類。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述方法包括適于區(qū)別所述標(biāo)記粒子的群體的信號(hào)標(biāo)志的濾光器。
98.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子家族的家族復(fù)雜度大于1。
99.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子家族的家族復(fù)雜度≥5。
100.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子家族的家族復(fù)雜度≥10。
101.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述類目結(jié)合分子家族的家族復(fù)雜度≥20。
102.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測發(fā)生在容器中，該容器是條形碼或用于自動(dòng)追蹤樣品的等同標(biāo)記。
103.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測發(fā)生在具有登記標(biāo)記的表面上，便于多個(gè)像在同一表面上排列。
104.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法可檢測檢測區(qū)的指定區(qū)域中的對(duì)照標(biāo)記或?qū)φ占?xì)胞。
105.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于檢測所述發(fā)射，散射，透射，或吸收光的工具包括濾光器，該濾光器適于檢測源于所述復(fù)合物的照射的信號(hào)。
106.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電檢測器的使用。
107.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電陣列檢測器的使用。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中所述光電檢測器包括CCD或CMOS檢測器。
109.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述用于檢測發(fā)射，散射，或吸收光的工具不包括像增強(qiáng)器。
110.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電倍增管檢測器的使用。
111.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括光電二極管檢測器的使用。
112.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測和鑒定所述靶分子的工具包括光敏膠片。
113.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括直接目測。
114.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶分子的數(shù)目是通過分析由所述檢測獲得的像而從所述檢測推斷的。
115.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶分子的類目是使用像分析軟件根據(jù)所述檢測推斷的。
116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中所述像分析軟件還包括用于分辨由所述復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)與其它信號(hào)的功能。
全文摘要
本發(fā)明提供快速并靈敏地鑒定醫(yī)學(xué)、工業(yè)、和環(huán)境樣品中的細(xì)胞和病毒靶的有效方法。本發(fā)明標(biāo)記靶分子，然后利用大面積成像檢測它們?；诒景l(fā)明的診斷試驗(yàn)可以是快速、超靈敏、定量、多路、且自動(dòng)化的。該試驗(yàn)可使樣品制備減到最少，而且無需核酸擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1582394SQ02822021
公開日2005年2月16日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者D·斯特勞斯 申請人:基因描繪系統(tǒng)有限公司