專利名稱：使用硅膠或復(fù)合硅膠載體的酶固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將D-氨基酸氧化酶(DAOD)或戊二酸單酰基-7-氨基頭孢烷酸?；D(zhuǎn)移酶(G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶)固定在硅膠或復(fù)合硅膠載體上的方法。
背景技術(shù)：
酶指在生物化學(xué)反應(yīng)中完成催化作用的蛋白質(zhì)，且一般由于在提取后不穩(wěn)定而不能用于有機(jī)溶劑中或高溫下。因此，酶反應(yīng)通常通過簡單的分批法進(jìn)行，其中將底物和可溶性酶混合并在常溫下培養(yǎng)。但是，為了回收活性酶，必須從反應(yīng)混合物中分離酶，但這在技術(shù)上是極難的任務(wù)。一般使用通過pH改變或熱處理從反應(yīng)混合物中分離酶和污染的蛋白質(zhì)的方法(Progress in Chemical Industry，25(9)，596(1985))，但這種方法由于反應(yīng)后活性酶的喪失而不經(jīng)濟(jì)。
為了解決所述問題，已對(duì)這樣的方法進(jìn)行了研究，其中酶的催化活性可以通過將酶物理限制或定位于某空間而重復(fù)地呈現(xiàn)，而代表性的實(shí)例為固定化酶。例如，韓國專利申請(qǐng)1987-13473公開了通過載體表面上的氨基和酶分子的氨基之間經(jīng)多功能交聯(lián)劑的縮合反應(yīng)而形成席夫堿的方法。另一方面，韓國專利申請(qǐng)1991-123834公開了將G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶固定在具有戊二醛氨基(glutaraldehydroaminogroup)的樹脂Doulite A7和Doulite A568上的方法。但是通過所述方法得到的載體存在由于載體表面積小而難以獲得高活性固定化酶的問題。另一方面，韓國專利申請(qǐng)1996-703112公開了將DAOD和G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶固定在其中引入了戊二醛氨基的有機(jī)硅氧烷聚合物上的方法。但是，在重復(fù)使用由所述方法制備的固定化酶的情況下，有機(jī)硅氧烷聚合物，載體，破裂并無法用作載體，導(dǎo)致過濾性降低，從而不可能重復(fù)使用。
如上可見，在有機(jī)物質(zhì)用作載體的情況下，其表現(xiàn)出容易控制微結(jié)構(gòu)且酶的固定特征優(yōu)良的優(yōu)點(diǎn)，但在長期使用的情況下表現(xiàn)出由于載體本身膨脹或弱化而使載體的獨(dú)特特征改變的缺點(diǎn)。相反，在無機(jī)物質(zhì)用作載體時(shí)，它表現(xiàn)出優(yōu)良的耐熱性、耐久性、耐化學(xué)性，并已知因載體表面上大量存在硅烷醇基團(tuán)而具有優(yōu)良的固定特征。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)出使用硅膠或復(fù)合硅膠，無機(jī)材料，作為載體，固定DAOD和G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的方法。
本發(fā)明的目的在于提供固定化酶的制備方法，通過該方法，使酶通過固定在硅膠或復(fù)合硅膠載體上而即使在長期重復(fù)使用的情況下仍保留活性。本發(fā)明的另一目的是提供由所述制備方法得到的固定在載體上的酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及將D-氨基酸氧化酶(DAOD)或戊二酸單?；?7-氨基頭孢烷酸?；D(zhuǎn)移酶(G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶)固定在硅膠或復(fù)合硅膠載體上的方法。DAOD是Trigonopsis variabilis的突變體的發(fā)酵產(chǎn)物，而G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶是大腸桿菌(E coli)重組體的發(fā)酵產(chǎn)物。
作為用于本發(fā)明的載體，硅膠或復(fù)合硅膠是優(yōu)選的。作為所述復(fù)合硅膠，可以列舉TiO2復(fù)合硅膠、Al2O3復(fù)合硅膠和ZrO2復(fù)合硅膠。對(duì)于所述載體，孔徑優(yōu)選在100-1000的范圍內(nèi)。在孔徑為1000?；蚋叩那闆r下，每體積載體的酶活性由于載體表面積小而低，而在孔徑為100?；蚋〉那闆r下，由于孔徑小于酶大小而不能將酶充分固定在孔中。優(yōu)選載體的粒徑為40-80目。
為了將酶固定在所述載體上，首選需要通過向其表面引入氨基而活化載體。以下的反應(yīng)式1代表用于活化載體的方法。也就是說，可以通過載體表面上存在的硅烷醇基團(tuán)和氨基烷基硅烷衍生物之間的硅烷偶聯(lián)反應(yīng)使下式1的載體和下式2的氨基烷基硅烷衍生物反應(yīng)而獲得其中引入了氨基的下式3的活化載體。
其中，R代表甲基或乙基；m、n和o獨(dú)立地代表0-3的整數(shù)；而載體代表硅膠或復(fù)合硅膠。
作為所述式2的氨基烷基硅烷衍生物，可以列舉β-氨基乙基-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、氨基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷和γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
載體的活化方法可以如下詳細(xì)解釋。也就是說，將式1的硅膠或復(fù)合硅膠加入有機(jī)溶劑中，加入式2的氨基烷基硅烷衍生物，并在回流下進(jìn)行硅烷偶聯(lián)反應(yīng)，優(yōu)選在100-110℃下進(jìn)行，以形成其中引入了氨基的式3的水不溶性載體。所述氨基烷基硅烷衍生物的量優(yōu)選為載體的1-20重量％，優(yōu)選為2-15重量％。
另一方面，可以通過使如上得到的活化載體與交聯(lián)劑反應(yīng)而固定酶。以下的反應(yīng)式2顯示了酶的固定方法。也就是說，使其中引入了氨基的載體(式3)與具有醛基的交聯(lián)劑(式4)反應(yīng)，得到下式5的化合物，然后使其與具有氨基的酶(式6)反應(yīng)，以將酶固定在載體上。
其中，m、n和o獨(dú)立地代表0-3的整數(shù)；載體代表硅膠或復(fù)合硅膠；而酶代表DAOD或G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶。
作為式4的交聯(lián)劑，可以使用聚醛如戊二醛、雙醛淀粉和琥珀醛，其中優(yōu)選戊二醛。
詳細(xì)的酶固定方法如下。首先，使其中引入了氨基的式3的載體與式4的交聯(lián)劑反應(yīng)，形成式5的化合物。交聯(lián)劑的量優(yōu)選為載體的20-50重量％。反應(yīng)于0-30℃在攪拌下進(jìn)行0.5-4小時(shí)。然后使式5的化合物與式6的酶反應(yīng)，以將酶固定在載體上。優(yōu)選的酶溶液濃度為30-70U/mL。反應(yīng)于10-30℃進(jìn)行0.5-15小時(shí)，優(yōu)選在攪拌下進(jìn)行1-7小時(shí)。反應(yīng)溶液的pH值和溫度應(yīng)該控制在不導(dǎo)致酶活性降低的范圍內(nèi)。
優(yōu)選固定化酶的量為50-200U/kg載體。交聯(lián)反應(yīng)之后，優(yōu)選通過用適宜的緩沖液充分洗滌酶固定的載體而消除沒有完全結(jié)合的可除去的酶和過量的交聯(lián)劑。
此外，本發(fā)明提供固定在載體上的酶，所述酶可以由下式7代表。
其中，載體代表硅膠或復(fù)合硅膠；而酶代表DAOD或G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。以下的實(shí)施例具體解釋本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不受實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1硅膠的活化將100g硅膠加入1000mL甲苯中，并將混合物攪拌30分鐘。加入10gβ-氨基乙基-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷，并在110℃下回流攪拌3小時(shí)，過濾得到活化硅膠。
實(shí)施例2DAOD的固定將如實(shí)施例1所述活化的40-80目硅膠(50g)加入200mL 1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中，并緩慢加入20g戊二醛。將所述反應(yīng)混合物于20℃下攪拌2小時(shí)，并過濾。加入含有DAOD(50U/mL)的水溶液(150mL)，于10℃下攪拌3小時(shí)，過濾得到固定化DAOD。
實(shí)施例3G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶的固定將如實(shí)施例1所述活化的40-80目硅膠(30g)加入500mL 1M磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，并緩慢加入10g戊二醛。將所述反應(yīng)混合物于20℃下攪拌2小時(shí)，并過濾。加入含有G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(40U/mL)的水溶液(100mL)，于10℃下攪拌3小時(shí)，過濾得到固定化G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶。
實(shí)驗(yàn)例1根據(jù)孔徑測(cè)定DAOD的活性和半衰期-DAOD效力測(cè)定將100mL底物[溶于100mM KPO4緩沖液的20mM頭孢菌素C溶液(pH 8.0)]置于100mL錐形瓶中，用氧飽和，加入300mg DAOD并攪拌。此時(shí)，測(cè)定由DAOD消耗的氧的量，以確定DAOD活性，并在25℃下用D.O計(jì)測(cè)定所消耗的氧。DAOD活性單位(U)代表每分鐘產(chǎn)生1μmole G1-7-ACA的酶的量。
-半衰期測(cè)定將1.2kU DAOD加入1000mL頭孢菌素C溶液(將20g純度為78％的頭孢菌素C溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中)中并攪拌。將溫度保持在25℃，并通過加入5％NH4OH而將pH值保持在7.5。此時(shí)，引入氧(0.1vvm，體積/溶液體積/分鐘)，并將內(nèi)部壓力保持在1kgf/cm2。當(dāng)根據(jù)HPLC分析頭孢菌素C至G1-7-ACA的轉(zhuǎn)化達(dá)到95％時(shí)終止反應(yīng)，并通過測(cè)定DAOD效力而確定半衰期。
取決于硅膠孔徑的DAOD的初始活性和半衰期的測(cè)定結(jié)果如表1所示。
表1.

根據(jù)表1，可以看出固定化DAOD酶的初始活性和半衰期大大地受硅膠載體孔徑的影響，而適當(dāng)?shù)目讖綖?00-1000。
實(shí)驗(yàn)例2取決于孔徑的G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶的活性和半衰期的測(cè)定-G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的效力測(cè)定將50mL底物[溶于5mM KPO4緩沖液中的52mM G1-7-ACA溶液(pH 8.0)]和150mg G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶加入100mL反應(yīng)器中，并攪拌。通過加入0.1M NaOH而將pH值保持在8.0-10，保持15分鐘。此時(shí)，測(cè)定所消耗的NaOH的量，以確定G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的活性，并將溫度保持在37℃。G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的活性單位(U)代表每分鐘產(chǎn)生1μmol 7-ACA的酶的量。
-半衰期測(cè)定將4.8kU G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶加入1000mL G1-7-ACA溶液(將25g純度為95％的G1-7-ACA溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中)中并攪拌。在大氣壓下將溫度保持在25℃，并通過加入5％NH4OH而將pH值保持為8.0。當(dāng)根據(jù)HPLC分析G1-7-ACA至7-ACA的轉(zhuǎn)化達(dá)到95％時(shí)終止反應(yīng)，并通過測(cè)定G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的效力確定半衰期。
取決于硅膠孔徑的G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的初始活性和半衰期的測(cè)定結(jié)果如表2所示。
表2.

由表2可以看出，固定化G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的初始活性和半衰期大大地受硅膠載體孔徑的影響，而適宜的孔徑為100-1000。
實(shí)驗(yàn)例3取決于硅膠種類的G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的活性和半衰期的測(cè)定根據(jù)與實(shí)施例3相同的方法，將G1-7-ACA固定在孔徑為100-300的復(fù)合硅膠上，并如實(shí)驗(yàn)例2確定固定化G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的初始活性和半衰期。結(jié)果如表3所示。
表3.

由表3可以看出，即使在使用復(fù)合硅膠的情況下，初始活性和半衰期也是優(yōu)良的。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的固定在載體上的酶，在DAOD的情況下活性為64-70U/g，在G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶的情況下為108-118U/g，高于現(xiàn)有技術(shù)的情況(韓國專利申請(qǐng)1991-23834第24頁的表1和表2)，在DAOD的情況下半衰期98倍或更大，在G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的情況下是139倍或更大，非常穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.將D-氨基酸氧化酶或戊二酸單?；?7-氨基頭孢烷酸酰基轉(zhuǎn)移酶固定在硅膠或復(fù)合硅膠載體上的方法。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述載體的孔徑為100-1000。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中所述載體的粒徑為40-80目。
4.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于使下式1的硅膠或復(fù)合硅膠與下式2的氨基烷基硅烷衍生物反應(yīng)，形成下式3的活化載體，然后將酶固定在該活化載體上 (RO)3Si——(CH2)n(N)m(CH2)o-NH22 其中，R代表甲基或乙基；m、n和o獨(dú)立地代表0-3的整數(shù)；而載體代表硅膠或復(fù)合硅膠。
5.如權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述氨基烷基硅烷衍生物為至少一種選自以下的組分β-氨基乙基-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、氨基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷和γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
6.如權(quán)利要求4方法，其特征在于所述氨基烷基硅烷衍生物的量為載體的1-20重量％。
7.如權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述固定如下進(jìn)行使式3的載體與式4的交聯(lián)劑反應(yīng)，形成式5的化合物，然后使此化合物與式6的酶反應(yīng) OHC-A-CHO4 H2N-酶6其中，m、n和o獨(dú)立地代表0-3的整數(shù)；載體代表硅膠或復(fù)合硅膠；而酶代表DAOD或G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶。
8.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述交聯(lián)劑為聚醛如戊二醛、雙醛淀粉和琥珀醛。
9.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述交聯(lián)劑的量為載體的20-50重量％。
10.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述酶在濃度為30-70U/mL的水溶液中。
11.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述活化載體和所述交聯(lián)劑的反應(yīng)于0-30℃在攪拌下進(jìn)行2-4小時(shí)。
12.如權(quán)利要求7的方法，其特征在于與酶的反應(yīng)通過于10-30℃攪拌0.5-15小時(shí)而進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于固定化酶的量為50-200U/kg載體。
14.固定在載體上的酶，所述酶可以由下式7表示 其中，載體代表硅膠或復(fù)合硅膠；而酶代表DAOD或G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及將D－氨基酸氧化酶(DAOD)或戊二酸單?；?－氨基頭孢烷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(G1－7－ACA?；D(zhuǎn)移酶)固定在硅膠或復(fù)合硅膠載體上的方法，而根據(jù)本發(fā)明制備的固定化酶具有優(yōu)良的初始活性和活性半衰期。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1564865SQ02819542
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月6日
發(fā)明者金正優(yōu), 申相圭, 黃鶴淵, 崔相镕, 尹鐘贊 申請(qǐng)人:鐘根堂生物制藥株式會(huì)社