專(zhuān)利名稱(chēng)：具有c型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域的支架結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了一體系，其與產(chǎn)生源自含有所謂的C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(C-type lectin like domain，CTLD)的蛋白的配基結(jié)合蛋白單位的隨機(jī)化文庫(kù)有關(guān)，并且其中的C型凝集素的糖識(shí)別域(carbohydraterecognition domain，CRD)代表了此族蛋白結(jié)構(gòu)域的一個(gè)范例。
背景技術(shù)：
C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)是在從多種動(dòng)物中分離的蛋白中鑒定到的蛋白結(jié)構(gòu)域族(綜述參見(jiàn)Drickamer and Taylor(1993)andDrickamer(1999))。最初，CTLD結(jié)構(gòu)域被鑒定為所謂的C型凝集素(鈣依賴(lài)型糖結(jié)合蛋白)普遍存在的結(jié)構(gòu)域，并命名為“糖識(shí)別域”(“CRD“)。最近，逐漸發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域?yàn)槎喾N真核蛋白所共有，其中有一些并不結(jié)合糖部分，因此將此規(guī)范的結(jié)構(gòu)域命名為CTLD。
已經(jīng)報(bào)道CTLD結(jié)合包括糖、脂、蛋白甚至冰在內(nèi)的多種化合物[Aspberg et al.(1997)，Bettler et al.(1992)，Ewart et al.(1998)，Graversen et al.(1998)，Mizumo et al.(1997)，Sano et al.(1998)，及Tormo et al.(1999)]。在一些蛋白中只有一個(gè)拷貝的CTLD，而其它蛋白中含有兩到多個(gè)結(jié)構(gòu)域拷貝。在生理功能單位中，常?？赏ㄟ^(guò)將單拷貝CTLD組裝成較大的結(jié)構(gòu)，從而引起CTLD數(shù)目增加。
CTLD有約120個(gè)氨基酸殘基，并且特征性的含有兩或三個(gè)鏈內(nèi)二硫橋。雖然來(lái)自不同蛋白的CTLD間在氨基酸序列水平的相似性相對(duì)較低，但大量CTLD的3D結(jié)構(gòu)是高度保守的，結(jié)構(gòu)可變性基本上限定于所謂的環(huán)區(qū)，常常限定于多達(dá)5個(gè)環(huán)。一些CTLD含有一或兩個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，并且絕大多數(shù)與鈣相互作用的側(cè)鏈定位于環(huán)區(qū)。
在有3D結(jié)構(gòu)信息可供利用的CTLD基礎(chǔ)上，已經(jīng)推斷出規(guī)范的CTLD的結(jié)構(gòu)特征為7個(gè)主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件(也即5個(gè)β-鏈和兩個(gè)α-螺旋)以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5順序存在(

圖1以及其中給出的參考資料)。在所有已進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)確定的CTLD中，β-鏈?zhǔn)且詢(xún)蓚€(gè)反平行β-折疊片排列的，其中一個(gè)包括β1和β5，另一個(gè)包括β2、β3和β4。額外的β-鏈β0常常位于序列中的β1之前，并且，若存在的話(huà)，則形成與β1、β5-折疊片相整合的額外的鏈。此外，到目前為止，在所有定性的CTLD中總能發(fā)現(xiàn)兩個(gè)二硫橋，其中一個(gè)二硫橋連接α1和β5(CI-CIV，圖1)，另一個(gè)二硫橋連接β3與連接β4和β5的多肽區(qū)段(CII-CIII，圖1)。在CTLD 3D結(jié)構(gòu)中，這些保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為大量從核心中伸出的環(huán)形成致密的支架，而這些環(huán)在本文中統(tǒng)稱(chēng)為環(huán)區(qū)。在CTLD的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，這些環(huán)組織成兩個(gè)區(qū)段環(huán)區(qū)段A(LSA)和環(huán)區(qū)段B(LSB)。LSA代表連接β2和β3的長(zhǎng)多肽區(qū)段，其常常缺乏規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有多達(dá)4個(gè)環(huán)。LSB表示將β-鏈β3和β4連接的多肽區(qū)段。已經(jīng)證明，LSA中的殘基與β4中的單殘基一起確定了包括四柄蛋白(tetranectin)的CTLD在內(nèi)的多種CTLD的Ca2+和配基結(jié)合位點(diǎn)。例如，包括單或多殘基替代在內(nèi)的誘變研究已經(jīng)證明，可利用CTLD結(jié)構(gòu)域來(lái)對(duì)結(jié)合特異性、Ca2+靈敏性和/或親和性的變化進(jìn)行調(diào)節(jié)[Weis and Drickamer(1996)，Chiba et al.(1999)，Graversen et al.(2000)]。
如上所指出的，CTLD間的整體序列相似性非常有限，這可通過(guò)利用蛋白科學(xué)領(lǐng)域中通用的比對(duì)方法和分析工具將預(yù)期的CTLD序列與圖1中給出的進(jìn)行了結(jié)構(gòu)定性的CTLD組進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行評(píng)定。在這樣的比對(duì)中，一般預(yù)期CTLD中22-30％的殘基與至少一個(gè)結(jié)構(gòu)定性的CTLD中的相應(yīng)殘基相同。圖1中展示的序列比對(duì)是嚴(yán)格利用真實(shí)的3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行闡述的，因此，框架中相應(yīng)的結(jié)構(gòu)元件的多肽區(qū)段也展示出強(qiáng)序列相似性這一事實(shí)提供了一組直接的且可很容易的從序列比對(duì)中進(jìn)行推斷的序列-結(jié)構(gòu)標(biāo)記。
其表明，即使沒(méi)有獲得精確的3D結(jié)構(gòu)信息的CTLD也可用作新CTLD文庫(kù)構(gòu)建中的框架。在沒(méi)有獲得精確的3D結(jié)構(gòu)信息的CTLD基礎(chǔ)上制備用于構(gòu)建這樣的新CTLD文庫(kù)的原料所涉及的特定的附加步驟如下(1)將圖1中的序列與新CTLD的序列進(jìn)行排列；以及(2)在序列比對(duì)的引導(dǎo)下確定框架結(jié)構(gòu)元件的近似定位，觀察是否需對(duì)序列比對(duì)進(jìn)行微小調(diào)整以保證在兩個(gè)保守二硫橋(圖1中的CI-CIV和CII-CIII)形成中涉及的四個(gè)規(guī)范的半胱氨酸殘基的精確比對(duì)。這些步驟的主要目的是對(duì)位于與β2-、β3-和β4-鏈相對(duì)應(yīng)的區(qū)段序列側(cè)翼的新CTLD的環(huán)區(qū)進(jìn)行序列定位鑒定。為了提供進(jìn)一步的指導(dǎo)，下表1中以典型的四肽序列給出了29個(gè)真正的CTLD的序列分析結(jié)果、它們的作為CTLD β2-和β3-鏈的組成部分的共有序列、β4-鏈的精確定位以及闡明的序列特定。
表1 β2、β3和β4共有元件分析CTLD β2 --- LSA ---β3 LSB β4IX-AW I G LR W - - - Q G KVKQCNS E W S D G S S V S - - Y E N W I E - - - - - - - - A E S K T - - - - - - - - - - -C L G LE KET D F RK W V N IY CMGLW I G LT D Q - - N G P - - W R W V D G T D F E K G F K N W A P - - - - - - - - L Q P D N W F G H G L G G G E DC A H IT T G - - GF W N D DV CLITW I G LH D P K K N R R - - W H W S S G S L V S - - Y K S W G I - - - - - - - - G A P S S V N P - - - - - G Y -C V S LTSS T G F QK W K D VP CCHLW I G LT D E N Q E G E - - W Q W V D G T D T R S S F T F W K E - - - - - - - - G E P N N R G F - - - - - N E DC A H VW T S - - GQ W N D VY CIGE-FCRW I G LR N L D L K G E F I W V - - D G S H V D - - Y S N W A P - - - - - - - - G E P T S R S Q - - - - - G E DC V M MR G S - - GR W N D AF CTCL-1W I G LT D K D S E G T - - W K W V D G T P L T - - T A F W S T - - - - - - - - D E P N D G A V N - - - - G E DC V S LY YHTQPEF KN W N D LA CKUCRW I G LT D Q G T E G N - - W R W V D G T P F DYVQS R R F W R K - - - - - - - - G Q P D W R H G N G E - - R E DC V H LQ - - - - RM W N D MA CCD94W I G LS Y S E E H T A - - W L W E N G S A L S Q - Y L S F E T - - - - - - - - - - - - F N T K N - - - - - - -C I A YN P N - - GN A L D ES CCPCPW I G LN D R T I E G D F R W S - - D G H P M Q - - F E N W R P - - - - - - - - N Q P D N F F A A - - - - G E DC V V MI W H E K GE W N D VP CPAPW I G LH DPTQGTEPN G E G - W E W S S S D V M N - - Y F A W E R - - - - - - - - N - P S T I S S P G H - - - - -C A S LS RST A F LR W K D YN CNEUW I G LN D R I V E Q D - - F Q W T D N T G L Q - - Y E N W R E - - - - - - - - N Q P D N F F A G - - - - G E DC V V LV S H E I GK W N D VP CESLW I G IR K V N N V - - - - W V W - V G T Q K P L T EEAKN W A P - - - - - - - - G E P N N R Q K - - - - - D E DC V E IYIKREKD V GM W N D ER CNKg2AW I G VF R N S S H H P - - W V T M N G L A F K H E I K D S D N A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E L NC A V LQ V - - - NR L K S AQ CGP120W M G LS D L N Q E G T - - W Q W V D G S PLL P S - FKQ Y W N R - - - - - - - - G E P N N V G - - - - - - E E DC A E FS G N - - G -W N D DK CMMRW I G LF R N V - E G T - - W L W I N N S P V S - - F V N W N T - - - - - - - - G D P S G E - - - - - - - R N DC V A LH A S S - GF W S N IH CTNW L G LN D M A A E G T - - - - W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T - - - - - A Q P D G G K - - - - - - T E NC A V LS G A A N GK W F D KR CSCGFW L G VH D R R A E G L - - Y L F E N G Q R V S - - F F A W HRSPRPELGAQPSASPHPLSPDQ P N G G T - - - - - - L E NC V A QA S D D - GS W W D HD CPLCW L G AS D L N I E G R - - W L W - E G Q R R M N - Y T N W S P - - - - - - - - G Q P D N A G G - - - - - I E HC L E LRRD L G N YL W N D YQ CH1-ASRW M G LH D - - Q N G P - - W K W V D G T D Y E T G F K N W R P - - - - - - - - E Q P D D W Y G H G L G G G E DC A H FT D D - - GR W N D DV CIX-BW M G LS N V W N Q C N - - W Q W S N A A M L R - - Y K A W A E - - - - - - - - E S Y - - - - - - - - - - - - -C V Y FK S T N - NK W R S RA CLY49AW V G LS Y D N K K K D - - W A W I D N R P S K L A L N T R K Y - - - - - - - - N I R D G G - - - - - - - - - -C M L LS K T - - -R L D N GN CTU14W V G AD N - L Q D G A Y N F N W N D G V S L P T D S D L W S P - - - - - - - - N E P S N P Q S W Q L - - - - -C V Q IW S K Y - NL L D D VG CrSP-AY L G MI E D Q T P G D - - F H Y L D G A S V N - - Y T N W Y P - - - - - - - - G E P R G Q G - - - - - - K E KC V E MY T D - - GT W N D RG CBCONY L S MN D I S T E G R - - F T Y P T G E I L V - - Y S N W A D - - - - - - - - G E P N N S D E G Q - - - P E NC V E IF P D - - GK W N D VP CBCL43Y L S MN D I S K E G K - - F T Y P T G G S L D - - Y S N W A P - - - - - - - - G E P N N R A K D E G - - P E NC L E IY S D - - GN W N D IE CMBP-AF L G IT D E V T E G Q - - F M Y V T G G R L T - - Y S N W K K - - - - - - - - D E P N D H G S - - - - - G E DC V T IV D N - - GL W N D IS CSP-DF L S MT D S K T E G K - - F T Y P T G E S L V - - Y S N W A P - - - - - - - - G E P N D D G G - - - - - S E DC V E IF T N - - GK W N D RA CCL-L1F I G VN D L E R E G Q - - Y M F T D N T P L Q N - Y S N W N E - - - - - - - - G E P S D P Y G - - - - - H E DC V E ML S S - - GR W N D TE CDCIRF V G LS D P - - E G Q R H W Q W V D Q T P - - - - Y NESSTFWHP - - - - - - - - R E P S D P N - - - - - - - E RC V V LNFRKSPKRW G -W N D VN C
注LSA，環(huán)區(qū)段A；LSB，環(huán)區(qū)段B。
序列取自Berglund and Petersen(1992)[TN，四柄蛋白]；Bertrand et al.(1996)[LIT，胰石蛋白]；Mann et al.(2000)[MGL，鼠巨噬細(xì)胞半乳糖凝集素，KUCR，Kupffer細(xì)胞受體，NEU，小雞neurocan，PLC，perlucin，H1-ASR，唾液酸糖蛋白受體]；Mio et al.(1998)[CPCP，軟骨蛋白多糖核心蛋白，IGE-FCR，IgE Fc受體，PAP，與胰腺炎相關(guān)的蛋白，MMR，鼠巨噬細(xì)胞受體，NKG2，天然殺傷基團(tuán)，SCGF，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子]；Mizuno et al.(1997)[IX-A和B，IX/X因子結(jié)合蛋白，MBP，甘露糖結(jié)合蛋白]；Ohtani et al.(1999)[BCON，牛膠固素，BCL43，牛CL43，CL-Ll，膠原凝集素肝1，SP-A，表面活性劑蛋白A，SP-D，表面活性劑蛋白D]；Poget et al.(1999)[ESL，內(nèi)皮細(xì)胞選擇素，TU14，有被膜c型凝集素]；Tormo et al.(1999)[CD94，CD94 NK受體結(jié)構(gòu)域，LY49A，LY49A NK受體結(jié)構(gòu)域]；Zhang et al.(2000)[CHL，小雞肝臟凝集素，TCL-1，鱒魚(yú)c型凝集素，GP120，HIV gp 120結(jié)合性c型凝集素，DCIR，樹(shù)突細(xì)胞免疫受體]
在29個(gè)β2-鏈中，14個(gè)與共有序列WIGX相一致(其中12個(gè)為WIGL序列，1個(gè)為WIGI序列，1個(gè)為WIGV序列)；3個(gè)與共有序列WLGX相一致(其中1個(gè)為WLGL序列，1個(gè)為WLGV序列，1個(gè)為WLGA序列)；3個(gè)為WMGL序列；3個(gè)與共有序列YLXM相一致(其中2個(gè)為YLSM序列，1個(gè)為YLGM序列)；2個(gè)與共有序列WVGX相一致(其中1個(gè)為WVGL序列，而1個(gè)為WVGA序列)；以及在該總匯中剩余的4個(gè)β2-鏈的序列分別為FLGI、FVGL、FIGV和FLSM序列。
因此，我們得出結(jié)論，四殘基β2共有序列(″β2cseq″)可表述如下殘基1芳香族殘基，最優(yōu)選Trp，次優(yōu)選Phe，最次優(yōu)選Tyr。
殘基2脂肪族或非極性殘基，最優(yōu)選Ile，次優(yōu)選Leu或Met，最次優(yōu)選Val。
殘基3脂肪族或親水殘基，最優(yōu)選Gly，最次優(yōu)選Ser。
殘基4脂肪族或非極性殘基，最優(yōu)選Leu，次優(yōu)選Met、Val或Ile。
相應(yīng)的，β2共有序列總結(jié)如下β2cseq(W，Y，F(xiàn))-(I，L，V，M)-(G，S)-(L，M，V，I)，其中下劃線(xiàn)殘基表示在該序列位置上最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的殘基。
所有進(jìn)行分析的29個(gè)β3-鏈?zhǔn)且詫?duì)所有已知CTLD序列來(lái)講經(jīng)典的CysII起始的，在29個(gè)β3-鏈中，5個(gè)與共有序列CVXI相一致(其中3個(gè)為CVEI序列，1個(gè)為CVTI序列，1個(gè)為CVQI序列)；4個(gè)與共有序列CVXM相一致(其中2個(gè)為CVEM序列，1個(gè)為CVVM序列，1個(gè)為CVMM序列)；6個(gè)與共有序列CVXL相一致(其中2個(gè)為CVVL序列，2個(gè)為CVSL序列，1個(gè)為CVHL序列，1個(gè)為CVAL序列)；3個(gè)與共有序列CAXL相一致(其中2個(gè)為CAVL序列，1個(gè)為CASL序列)；2個(gè)與共有序列CAXF相一致(其中1個(gè)為CAHF序列，1個(gè)為CAEF序列)；2個(gè)與共有序列CLXL相一致(其中1個(gè)為CLEL序列，1個(gè)為CLGL序列)；并且在總匯中剩余的7個(gè)β3-鏈序列分別為CVYF、CVAQ、CAHV、CAHI、CLEI、CIAY和CMLL序列。
因此，我們得出結(jié)論，四殘基β3共有序列(″β3cseq″)可表述如下殘基1Cys，即CTLD的經(jīng)典CysII殘基殘基2脂肪族或非極性殘基，最優(yōu)選Val，次優(yōu)選Ala或Leu，最次優(yōu)選Ile或Met殘基3最普遍的為芳香族或帶電殘基，最優(yōu)選Glu。
殘基4最普遍的為脂肪族、非極性或芳香族殘基，最優(yōu)選Leu或Ile，次優(yōu)選Met或Phe，最次優(yōu)選Tyr或Val。
相應(yīng)的，β3共有序列總結(jié)如下β3cseq(C)-(V，A，L，I，M)-(E，X)-(L，I，M，F(xiàn)，Y，V)，其中下劃線(xiàn)殘基指在該序列位置上最經(jīng)常出現(xiàn)的殘基。
從已知的CTLD(圖1)的3D結(jié)構(gòu)中觀察到，β4-鏈最經(jīng)常包含在一級(jí)結(jié)構(gòu)中定位于相對(duì)于所有已知CTLD的經(jīng)典CysIII為-6--2位點(diǎn)上的5個(gè)殘基，較少包含定位于相對(duì)于所有已知CTLD的經(jīng)典CysIII為-5--2位點(diǎn)上的4個(gè)殘基。定位在相對(duì)于CysIII為-3位的殘基與定位在此位點(diǎn)上的CTLD中的位點(diǎn)2鈣離子的協(xié)調(diào)有關(guān)，此觀點(diǎn)依據(jù)的是如下觀察結(jié)果在表1中分析的29個(gè)CTLD序列中，其中27個(gè)CTLD在此位點(diǎn)具有Asp殘基或Asn殘基，而兩個(gè)CTLD在此位點(diǎn)具有Ser殘基。從已知的CTLD 3D結(jié)構(gòu)中，我們也注意到，相對(duì)于CysIII殘基而定位于位點(diǎn)-5的殘基與CTLD支架的疏水核心形成相關(guān)。此觀點(diǎn)依據(jù)的是如下觀察結(jié)果在分析的29個(gè)CTLD序列中，25個(gè)CTLD在此位點(diǎn)上具有Trp殘基，3個(gè)具有Leu殘基，1個(gè)是Ala殘基。進(jìn)行分析的29個(gè)CTLD中有18個(gè)CTLD序列在位置-4上具有Asn殘基。此外，29個(gè)β4-鏈區(qū)段中，有19個(gè)區(qū)段的前面都存在Gly殘基。
相對(duì)于β4-鏈中經(jīng)典的CysIII殘基為位點(diǎn)-5、-4和-3上的29個(gè)中央三殘基基序中22個(gè)為序列WXD(18個(gè)為WND，2個(gè)為WKD，1個(gè)為WFD，1個(gè)為WWD)，2個(gè)為序列WXN(1個(gè)為WVN，1個(gè)為WSN)，在分析中，剩余的5個(gè)基序(WRS，LDD，LDN，LKS和ALD)每個(gè)均出現(xiàn)一次。
現(xiàn)在，我們發(fā)現(xiàn)，CTLD結(jié)構(gòu)域族中的每個(gè)成員代表了一個(gè)構(gòu)建蛋白質(zhì)文庫(kù)的具有吸引力的機(jī)會(huì)，利用篩選或選擇方法就可從這些文庫(kù)中鑒定并分離對(duì)新配基靶具有親和力的成員?？赏ㄟ^(guò)將其中CTLD的環(huán)區(qū)被一或多個(gè)隨機(jī)化多肽區(qū)段取代的CTLD框架結(jié)構(gòu)相混合來(lái)構(gòu)建這些文庫(kù)。
其中四柄蛋白或四柄蛋白的CTLD結(jié)構(gòu)域用作支架的這樣一個(gè)體系尤其引起注意，這不僅僅是因?yàn)樗谋鞍自w的三聚復(fù)合體的穩(wěn)定性非常高(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.WO 98/56906 A2)。
四柄蛋白為從人血漿中分離并發(fā)現(xiàn)存在于某些組織的細(xì)胞外基質(zhì)中的三聚體糖蛋白[Holtet et al.(1997)，Nielsen et al.(1997)]。已知四柄蛋白可與鈣、多糖復(fù)合體、纖溶酶原、纖維蛋白原/纖維蛋白以及脫輔基脂蛋白(a)相結(jié)合。其與纖溶酶原和脫輔基脂蛋白(a)的相互作用由其中所謂的kringle 4蛋白結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。已知此相互作用對(duì)鈣和賴(lài)氨酸衍生物敏感[Graversen et al.(1998)]。
已經(jīng)對(duì)人四柄蛋白基因進(jìn)行了定性，并且對(duì)人和鼠四柄蛋白cDNA克隆進(jìn)行了分離。人和鼠成熟蛋白都包含有181個(gè)氨基酸殘基(圖2)。在兩個(gè)單獨(dú)的研究中，獨(dú)立的對(duì)完全長(zhǎng)度的重組人四柄蛋白和分離的四柄蛋白CTLD的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確定[Nielsen et al.(1997)和Kastrup et al.(1998)]。四柄蛋白為兩或可能三結(jié)構(gòu)域蛋白，也即多肽鏈的主要部分包括CTLD(氨基酸殘基Gly53-Val181)，而Leu26-Lys52區(qū)編碼可通過(guò)形成均聚的平行卷曲螺旋來(lái)控制蛋白質(zhì)的三聚作用的α-螺旋。Glu1-Glu25多肽區(qū)段含有多糖復(fù)合體結(jié)合位點(diǎn)(Lys6-Lys15)[Lorentsen et al.(2000)]，似乎有助于三聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[Holtet et al.(1997)]。已經(jīng)證明，定位于環(huán)4中的兩個(gè)氨基酸殘基Lys148和Glu150以及Asp165(定位于β4中)在纖溶酶原kringle 4的結(jié)合中具有關(guān)鍵作用，而殘基Ile140(環(huán)3中)、Lys166和Arg167(β4中)具有一定的重要性[Graversen et al.(1998)]。已經(jīng)證明，利用芳香族殘基替代Thr149(環(huán)4中)可顯著增加四柄蛋白對(duì)kringle 4的親和力，并可將對(duì)纖溶酶原kringle 2的親和力提高到與野生型四柄蛋白對(duì)kringle 4的親和力相當(dāng)?shù)乃缴蟍Graversen et al.(2000)]。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的為提供產(chǎn)生有用的且具有能夠高親和性和高特異性結(jié)合感興趣物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)的有用蛋白產(chǎn)物的新且可實(shí)施的方法。
本發(fā)明描述了一種方法，其中這樣的新的、有用的蛋白產(chǎn)物可通過(guò)應(yīng)用重組抗體領(lǐng)域中普遍應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)組合蛋白質(zhì)化學(xué)方法產(chǎn)生隨機(jī)化蛋白組件組合文庫(kù)來(lái)方便的獲得，其中每個(gè)蛋白組件都含有與CTLD的核心結(jié)構(gòu)基本相同的核心結(jié)構(gòu)。
天然CTLD中結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)型的變化表明，它們的共同核心結(jié)構(gòu)能夠適應(yīng)配基結(jié)合位點(diǎn)的基本不同的構(gòu)型。因此，CTLD尤其適于用作構(gòu)建具有所需結(jié)合特性的新且有用的蛋白產(chǎn)物的基礎(chǔ)。
就實(shí)際應(yīng)用而言，新的人工CTLD蛋白產(chǎn)物可用于其中目前抗體產(chǎn)物在技術(shù)生化檢驗(yàn)體系或者體內(nèi)或體外醫(yī)學(xué)診斷檢驗(yàn)體系中作為關(guān)鍵試劑的應(yīng)用中，或在治療組合物中作為活性成分。
就其用作體外檢驗(yàn)體系的成分而言，人工CTLD蛋白產(chǎn)物較抗體衍生物優(yōu)選，這是因?yàn)樾碌鞍桩a(chǎn)物中的每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都定位于單個(gè)結(jié)構(gòu)自主的蛋白結(jié)構(gòu)域中。CTLD結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍姿庾饔镁哂锌剐裕⑶以贑TLD的N-或C-末端添加其它蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浞€(wěn)定性及配基結(jié)合位點(diǎn)的應(yīng)用沒(méi)有損害。因此，CTLD結(jié)合組件可便利的用作構(gòu)建組件分子裝置的構(gòu)件，所述裝置例如是除了適當(dāng)?shù)膱?bào)告分子如過(guò)氧化物酶、磷酸酯酶或任何其它信號(hào)介導(dǎo)部分之外還存在有相同的或不同特異性的復(fù)合CTLD的裝置。
就用作用于體內(nèi)診斷或治療目的的組合物的必需成分的體內(nèi)用途而言，在人CTLD基礎(chǔ)上構(gòu)建的人工CTLD蛋白產(chǎn)物實(shí)際上與已經(jīng)存在于體內(nèi)的相應(yīng)的天然CTLD蛋白相同，因此預(yù)期其在患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)將相當(dāng)?shù)汀蜟TLD的質(zhì)量約為最小的功能性抗體衍生物，即單鏈Fv衍生物的一半，由于其可提供更好的組織穿透與分布，以及在循環(huán)系統(tǒng)中有更短的半衰期，因此這種小尺寸在某些應(yīng)用中是有利的。CTLD蛋白的多價(jià)體，如相應(yīng)于完全的四柄蛋白三聚體或進(jìn)一步多聚化的膠原凝集素，如甘露糖結(jié)合蛋白的形式，可提供增強(qiáng)的結(jié)合能力、親合性及更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)特殊的優(yōu)點(diǎn)源自哺乳動(dòng)物四柄蛋白，以鼠和人四柄蛋白為例，具有基本相同的結(jié)構(gòu)這一事實(shí)。這種種間保守性具有很高的應(yīng)用重要性，因?yàn)槠湓试S在如鼠和人四柄蛋白衍生物間直接交換確定配基結(jié)合特異性的多肽區(qū)段。四柄蛋白衍生物間物種遺傳背景的溫和交換的隨意性與眾所周知的實(shí)行鼠抗體衍生物″人源化″時(shí)相應(yīng)形成了鮮明的對(duì)比。
本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)為有通用且簡(jiǎn)單的方法可用于將最初篩選的蛋白衍生物可靠地轉(zhuǎn)化為最終蛋白產(chǎn)物的可用性，無(wú)需重新定型，此最終產(chǎn)物即可在細(xì)菌(如大腸桿菌)中進(jìn)行小規(guī)模和大規(guī)模生產(chǎn)(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO94/18227 A2)。
可通過(guò)簡(jiǎn)單且通用的方法在同一功能蛋白單位中包含多個(gè)相同的或不同結(jié)合位點(diǎn)，因而使得可借助相互作用的親合性利用甚至比較弱的親和力，或構(gòu)建雙-或異功能分子組合(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.WO 98/56906 A2)。
有可能在含有CTLD中的一或多個(gè)保存的金屬結(jié)合位點(diǎn)的組合文庫(kù)中通過(guò)添加或去除二價(jià)金屬離子(如鈣離子)來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)合。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了大量新穎且有用的蛋白，其中每個(gè)蛋白都具有C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)，該蛋白包含有模型CTLD的變體，其中α-螺旋和β-鏈以及連接區(qū)段比較保守，使得CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本維持不變，而通過(guò)氨基酸替代、缺失、插入或它們的結(jié)合來(lái)進(jìn)行環(huán)區(qū)改變，前提為該蛋白不是下表2中所列的C型類(lèi)凝集素蛋白或C型凝集素的任何已知的CTLD環(huán)衍生物。
表2已知的β2、β3、β4、LSA和LSB CTLD衍生物表2ALSA衍生物(β2和β3共有元件標(biāo)有下劃線(xiàn))CTLD Mut. LSA序列(單字母簡(jiǎn)寫(xiě)) 參考文獻(xiàn)hTN TND116AW L G LN A M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNE120AW L G LN D M A A A G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNK134AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y A N W E T E I T A Q P D G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNI140AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E A T A Q P D G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNQ143AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A A P D G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TND145AW I G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P A G G K T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNK148AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G A T E NC A V LGraversen et al.(1998)TNK148MW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G M T E NC A V LGraversen et al.(2000)TNK148RW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G R T E NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149FW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K F E NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149MW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K M E NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149RW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K R E NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149YW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K Y E NC A V LGraversen et al.(2000)TNE150AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T A NC A V LGraversen et al.(1998)TNE150DW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T D NC A V LGraversen et al.(2000)TNE150QW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T Q NC A V LGraversen et al.(2000)TNN151AW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K T E AC A V LGraversen et al.(1998)TNK148R，T149YW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G R Y E NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149Y，E150QW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K Y Q NC A V LGraversen et al.(2000)TNT149Y，D165NW L G LN D M A A E G T W V D M T G A R I A Y K N W E T E I T A Q P D G G K Y E NC A V LGraversen et al.(2000)rMBP QPDF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D Q P D D H G S G E DC V T IDrickamer(1992)N187DF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D E P D D H G S G E DC V T IIobst et al.(1994)H189AF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D E P N D A G S G E DC V T IIobst et al.(1994)H189GF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D E P N D G G S G E DC V T IIobst et al.(1994)QPDWF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D Q P D D W G S G E DC V T IIobst & Drickamer(1994)QPDWGF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D Q P D D W Y G HGLGG G E DC V T IIobst & Drickamer(1994)QPDWG/Y/AF L G IT D E V T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D Q P D D W A G HGLGG G E DC V T IIobst & Drickamer(1994)
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R197DY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G E P D G Q G K E KC V E MPattanajitvilai et al.(1998)R197NY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G E P N G Q G K E KC V E MPattanajitvilai et al.(1998)E195QY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G Q P R G Q G K E KC V E MTsunezawa et al.(1998)K201AY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G E P R G Q G A E KC V E MTsunezawa et al.(1998)K203AY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G E P R G Q G K E AC V E MTsunezawa et al.(1998)E197A，K201A，K203AY L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G A P R G Q G A E AC V E MTsunezawa et al.(1998)ad3Y L G MI E D Q T P G D F H Y L D G A S V N Y T N W Y P G E P N N N G G A E NC V E ISano et al.(1998)ad4Y L G MI E D Q T E G K F T Y P T G E A L V Y S N W A P G E P N N N G G A E NC V E ISano et al.(1998)rat ama4Y L G MI E D Q T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D E P R G Q G K E KC V E MChiba et al.(1999)hSP-A R199AY V G LT E G P S P G D F R Y S D G T P V N Y T N W Y R G E P A G A G K E QC V E MTsunezawa et al.(1998)K201AY V G LT E G P S P G D F R Y S D G T P V N Y T N W Y R G E P A G R G A E QC V E MTsunezawa et al.(1998)hum ama4Y V G LT E G P T E G Q F M Y V T G G R L T Y S N W K K D E P R G R G K E QC V E MChiba et al.(1999)rSP-D E321Q，N323DF L S MT D V G T E G K F T Y P T G E A L V Y S N W A P G Q P D N N G G A E NC V E IOgasawara & Voelker(1995)h-esl K67AW I G IR K V N N V W V W V G T Q A P L T E E A K N W A P G E P N N R Q K D E DC V E IErbe et al.
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R84A，K86AW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N A Q A D E DC V E IErbe et al.
R84AW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N A Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)R84KW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N K Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)R84K，D89GW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N K Q K D E GC V E IKogan et al.(1995)A77KW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W K P G E P N N R Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)A77K，P78KW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W K K G E P N N R Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)A77K，P78K，R84AW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W K K G E P N N A Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)D87EW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N R Q K E E DC V E IKogan et al.(1995)D87NW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N R Q K N E DC V E IKogan et al.(1995)D89NW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N R Q K D E NC V E IKogan et al.(1995)D89EW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W A P G E P N N R Q K D E EC V E IKogan et al.(1995)A77K，E80Q，N82DW I G IR K V N N V W V W V G T Q K P L T E E A K N W K P G Q P D N R Q K D E DC V E IKogan et al.(1995)h-psl A77KW I G IR K N N K T W T W V G T K K A L T N E A E N W K D N E P N N K R N N E DC V E IRevelle et al.(1996)A77K，E80D，N82DW I G IR K N N K T W T W V G T K K A L T N E A E N W K D N Q P D N K R N N E DC V E IRevelle et aL.(1996)MGR 2A/RWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W R P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAHFIobst & Drickamer(1996)2K/GWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P G Q P D N W Y G H G L G G G E DCAHFIobst & Drickamer(1996)2A/R，2K/GWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W R P G Q P D N W Y G H G L G G G E DCAHFIobst & Drickamer(1996)
4F/IWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAHIIobst & Drickamer(1996)4H/AWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAAFIobst & Drickamer(1996)4H/EWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAEFIobst & Drickamer(1996)4H/QWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAQFIobst & Drickamer(1996)4H/NWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCANFIobst & Drickamer(1996)4H/YWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAYFIobst & Drickamer(1996)4H/DWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCADFIobst & Drickamer(1996)4H/KWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W A P K Q P D N W Y G H G L G G G E DCAYFIobst & Drickamer(1996)2A/R，2K/G，4H/AWIGLT D Q N G P W R W V D G T D Y E K G F T H W R P G Q P D N W Y G H G L G G G E DCAAFIobst & Drickamer(1996)RHL4H/AWIGLT D Q N G P W K W V D G T D Y E T G F K N W R P G Q P D D W Y G H G L G G G E DCAAFIobst & Drickamer(1996)CHLR173AW I G LT D E N Q E G E W Q W V D G T D T R S S F T F W K E G E P N N A G F N E DC A H VBurrows et al.(1997)G174AW L G LT D E N Q E G E W Q W V D G T D T R S S F T F W K E G E P N N R A F N E DC A H VBurrows et al.(1997)F175AW I G LT D E N Q E G E W Q W V D G T D T R S S F T F W K E G E P N N R G A N E DC A H VBurrows et al.(1997)N176AW I G LT D E N Q E G E W Q W V D G T D T R S S F T F W K E G E P N N R G F A E DC A H VBurrows et al.(1997)
表2BLSB衍生物(β3和β4共有元件由下劃線(xiàn)表示)CTLD Mut. LSB序列(單字母簡(jiǎn)寫(xiě)) 參考文獻(xiàn)hTN TNK163AC A V LS G A A N GA W F D KR C Graversen et al.(1998)TNK166AC A V LS G A A N GK W F D AR C Graversen et al.(1998)TNR167AC A V LS G A A N GK W F D KA C Graversen et al.(1998)TNF164LC A V LS G A A N GK W L D KR C Graversen et al.(1998)TND165AC A V LS G A A N GK W F A KR C Graversen et al.(1998)TND165EC A V LS G A A N GK W F E KR C Graversen et al.(2000)TND165NC A V LS G A A N GK W F N KR C Graversen et al.(2000)rMBP I207VC V T IV D N GL W N D VS C Iobst et al.(1994)I207LC V T IV D N GL W N D LS C Iobst et al.(1994)I207AC V T IV D N GL W N D AS C Iobst et al.(1994)I207EC V T IV D N GL W N D ES C Torgensen et al.(1996)Region 4EC V T IV Y I K R E K D N GL W N D IS C Torgensen et al.(1996)Region 4PC V T IV Y I K S P S D N GL W N D IS C Torgensen et al.(1996)207VYC V T IV D N GL W N D VY C Burrows et al.(1997)β34C A H VW T S GQ W N D VY C Burrows et al.(1997)h-esl Y94FC V E IF I K R E K D V GM W N D ER C Kogan et al.(1995)Y94RC V E IR I K R E K D V GM W N D ER C Kogan et al.(1995)Y94DC V E ID I K R E K D V GM W N D ER C Kogan et al.(1995)Y94AC V E IA I K R E K D V GM W N D ER C Kogan et al.(1995)Y94SC V E IS I K R E K D V GM W N D ER C Kogan et al.(1995)E107DC V E IY I K R E K D V GM W N D DR C Kogan et al.(1995)E107AC V E IY I K R E K D V GM W N D AR C Kogan et al.(1995)E107NC V E IY I K R E K D V GM W N D NR C Kogan et al.(1995)E107KC V E IY I K R E K D V GM W N D KR C Kogan et al.(1995)E107QC V E IY I K R E K D V GM W N D QR C Kogan et al.(1995)R97DC V E IY I K D E K D V GM W N D ER C Revelle et al.(1996)R97SC V E IY I K S E K D V GM W N D ER C Revelle et al.(1996)
R97EC V E IY I K E E K D V GM W N D ER C Revelle et al.(1996)h-psl K96QC V E IY I Q S P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)K96RC V E IY I R S P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)K96EC V E IY I E S P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)S97AC V E IY I K A P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)S97DC V E IY I K D P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)S97RC V E IY I K R P S A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)REKC V E IY I K R E K A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)S99DC V E IY I K S P D A P GM W N D EH C Revelle et al.(1996)CHL V191AC A H VW T S GQ W N D AY C Burrows et al.(1997)Y192AC A H VW T S GQ W N D VA C Burrows et al.(1997)表2C其它TN CTLD衍生物CTLDMut. 序列(單字母代碼)參考文獻(xiàn)hTN TNRl69A S G A A N G K W F D K R C A D Q Graversen et al.(1998)TNS85GC I S R G G T L G T P Q T Jaquinod et al.(1999)注hTN人四柄蛋白；rMBP 大鼠甘露糖結(jié)合蛋白；rSP-A大鼠表面活性劑蛋白A；hSP-A人表面活性劑蛋白A；rSP-D大鼠表面活性劑蛋白D；h-esl人e-選擇蛋白h-psl人p-選擇蛋白MGR 巨噬細(xì)胞半乳糖受體RHL 大鼠肝凝集素CHL 雞肝凝集素正常的，利用具有與表1中例示的二級(jí)結(jié)構(gòu)排列相一致的3D結(jié)構(gòu)定義模型CTLD，其特征為有下列主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的順序依次排列的5個(gè)β-鏈和2個(gè)α-螺旋，β-鏈排列在兩個(gè)反向平行β-折疊片中，一個(gè)包含β1和β5，另一個(gè)包含β2、β3和β4，至少兩個(gè)二硫橋，一個(gè)連接α1和β5，一個(gè)連接β3和連接β4與β5的多肽區(qū)段，由兩多肽區(qū)段組成的環(huán)區(qū)，環(huán)區(qū)段A(LSA)連接β2和β3，一般包括15-70個(gè)，更為少見(jiàn)地包括5-14個(gè)氨基酸殘基，環(huán)區(qū)段B(LSB)連接β3和β4，并且一般包括5-12個(gè)，更為少見(jiàn)地包括2-4個(gè)氨基酸殘基。
然而，沒(méi)有獲得精確的3D結(jié)構(gòu)的CTLD也可用作模型CTLD，這種CTLD限定為展示與以前認(rèn)定的CTLD族成員具有序列相似性，表現(xiàn)為有至少22％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少30％的氨基酸序列同一性，并且含有對(duì)確定保守的二硫橋拓?fù)鋵W(xué)所必需的半胱氨酸殘基(也即CysI，CysII，CysIII和CysIV)。隨后，可通過(guò)與圖1中展示的CTLD匯總進(jìn)行序列比對(duì)檢驗(yàn)來(lái)鑒定由環(huán)區(qū)段LSA和LSB組成的環(huán)區(qū)及其側(cè)翼β-鏈結(jié)構(gòu)元件，鑒定出β2-和β3-鏈的序列定位，并通過(guò)將這些序列與四殘基共有序列β2cseq和β3cseq及一般定位在相對(duì)于保守的CysIII殘基為-6--2位點(diǎn)、更為少見(jiàn)地定位于-5--2位點(diǎn)的β4鏈區(qū)段、以及表1中闡明和發(fā)明背景部分?jǐn)⑹龅?5和-3位點(diǎn)處的特征殘基進(jìn)行對(duì)比而提供進(jìn)一步的確證。
同樣的考慮適用于確定在模型CTLD中是否α-螺旋和β-鏈以及連接區(qū)段足夠保守而能使CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本維持不變。
比較理想的是在模型CTLD的α-螺旋和/或β-鏈和/或連接區(qū)段中替代、缺失或插入多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基。特別的，雖然CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變可以因在編碼CTLD的核苷酸序列中導(dǎo)入一或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)而在模型CTLD的β-鏈中進(jìn)行多達(dá)4個(gè)殘基的改變，所述識(shí)別位點(diǎn)可促進(jìn)對(duì)部分或整個(gè)環(huán)區(qū)的切除以及插入改變后的氨基酸序列，同時(shí)基本維持CTLD的支架結(jié)構(gòu)。
尤其感興趣的是其中的模型CTLD為四柄蛋白的CTLD的蛋白質(zhì)。其CTLD可用作模型CTLD的眾所周知的四柄蛋白為人四柄蛋白和鼠四柄蛋白。因此，按照本發(fā)明，這些蛋白包含這些模型CTLD的變體。
按照本發(fā)明的蛋白可包含CTLD變體的N-末端和/或C-末端延伸，這樣的延伸可含有如效應(yīng)劑、酶、以及進(jìn)一步的結(jié)合和/或多聚化功能。特別的，該延伸可為天然C型類(lèi)凝集素蛋白、C型凝集素或其缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性變體的非CTLD部分。
按照本發(fā)明的蛋白也可為包含CTLD變體，如天然四柄蛋白三聚體衍生物的部分的多聚體。
在一個(gè)優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供了具有C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，這些蛋白包含有其中的α-螺旋和β-鏈保守到CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變的程度的模型CTLD變體，但CTLD的環(huán)區(qū)或部分環(huán)區(qū)進(jìn)行了針對(duì)氨基酸序列和/或氨基酸數(shù)目的隨機(jī)化。
構(gòu)成這樣一個(gè)文庫(kù)的蛋白包括按照本發(fā)明的上述蛋白進(jìn)行定義的模型CTLD的變體，這些變體可包括針對(duì)這些蛋白已經(jīng)說(shuō)明的改變。
特別的，按照本發(fā)明的組合文庫(kù)可包括其中的模型CTLD為四柄蛋白CTLD，如人四柄蛋白或鼠四柄蛋白CTLD的蛋白。
按照本發(fā)明的組合文庫(kù)可由包含CTLD變體的N-末端和/或C-末端延伸的蛋白組成，并且這些延伸可含有如效應(yīng)物、酶以及進(jìn)一步的結(jié)合和/或多聚化功能。特別的，該延伸可為天然C型類(lèi)凝集素蛋白或C型凝集素或其缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的“可溶性”變體的非CTLD部分。
按照本發(fā)明的組合文庫(kù)也可由作為包含CTLD變體的部分的多聚體，如天然四柄蛋白三聚體衍生物的蛋白質(zhì)組成。
本發(fā)明也提供了天然四柄蛋白的衍生物以及編碼這些衍生物的核酸，所述衍生物中，其CTLD的α-螺旋和/或β-鏈和/或連接區(qū)段中有多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，以及更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基發(fā)生替代、缺失或插入。特定的衍生物源自SEQ ID No02，04，09，11，13，15，29，31，36和38；而包含編碼特定四柄蛋白衍生物的核苷酸插入物的核酸源自SEQ ID No12，14，35和37。
本發(fā)明包括構(gòu)建適于制備本發(fā)明中的組合文庫(kù)的四柄蛋白衍生物的方法，其中已經(jīng)對(duì)編碼四柄蛋白衍生物的核酸進(jìn)行了修飾，以在編碼β2、β3或β4的核酸區(qū)段中或在屬于編碼β2、β3或β4的核酸區(qū)段的任何核苷酸序列的上游或下游多達(dá)30個(gè)核苷酸處產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明也包括編碼四柄蛋白或其衍生物的核苷酸序列的應(yīng)用，用于通過(guò)對(duì)編碼其CTLD環(huán)區(qū)的所有或部分核酸序列進(jìn)行隨機(jī)化而制備編碼相關(guān)蛋白的核苷酸序列的文庫(kù)，其中四柄蛋白CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變，此外，本發(fā)明提供了包含任何編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列的核酸。
特別的，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明組合文庫(kù)的蛋白的核酸文庫(kù)，其中一起構(gòu)成該核酸文庫(kù)的核酸組合中的成員能夠在展示體系中表達(dá)，而此展示體系能在可展示代表所展示表達(dá)產(chǎn)物的特性的表型的實(shí)體和它們相應(yīng)的基因型間提供邏輯、物理或化學(xué)的關(guān)系。
在這樣的文庫(kù)中，展示體系可選自(I)噬菌體展示體系如(1)絲狀噬菌體fd，其中的核酸文庫(kù)插入到(a)噬菌粒載體，(b)噬菌體的病毒基因組(c)以純化的單或雙鏈形式存在的純化的病毒核酸，或(2)噬菌體λ，其中文庫(kù)插入到(a)純化的噬菌體λDNA，或(b)λ噬菌體顆粒中的核酸；或(II)病毒展示體系，其中核酸文庫(kù)插入到真核病毒如桿狀病毒的病毒核酸中；或(III)基于細(xì)胞的展示體系，其中核酸文庫(kù)插入到或緊鄰能夠整合到宿主基因組中或整合到能夠在細(xì)胞中維持并表達(dá)自己且適于在下列細(xì)胞的細(xì)胞表面進(jìn)行細(xì)胞表面展示的染色體外元件的核酸載體中；(a)細(xì)菌細(xì)胞，(b)酵母細(xì)胞，或(c)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；或(IV)適于與核糖體相關(guān)聯(lián)的展示的核酸實(shí)體，核酸文庫(kù)插入其中；或(V)適于與質(zhì)粒相關(guān)聯(lián)的展示的質(zhì)粒，核酸文庫(kù)插入其中。
眾所周知的且有用的展示體系為Amersham Pharmacia Biotech提供的、具有噬菌粒載體″pCANTAB 5E″的“重組噬菌體抗體體系”(編號(hào)為no.27-9401-01)此外，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明蛋白的方法，其中所述蛋白包含至少一或多個(gè)相同或不同的、已通過(guò)篩選或選擇而從一或多個(gè)CTLD文庫(kù)中分離出來(lái)的具有新穎的環(huán)區(qū)序列的CTLD結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^(guò)誘變對(duì)至少一個(gè)這樣的CTLD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)一步修飾；含有至少一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域的蛋白可以是通過(guò)化學(xué)或酶促偶聯(lián)或交聯(lián)而從兩或更多個(gè)組件組裝成的。
另外，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明組合文庫(kù)的方法，其包含下列步驟1)將編碼包含模型CTLD的蛋白的核酸插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，2)如果必要，通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，該識(shí)別位點(diǎn)適當(dāng)?shù)亩ㄎ辉谖挥诨蚪咏幋aCTLD環(huán)區(qū)或其部分的序列末端的序列中，3)利用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切除編碼環(huán)區(qū)或其部分的DNA區(qū)段，4)將DNA區(qū)段混合物連接到經(jīng)限制性消化的載體上，及5)誘導(dǎo)載體在適當(dāng)培養(yǎng)基中表達(dá)具有CTLD的支架結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化蛋白。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了篩選可與特定靶相結(jié)合的本發(fā)明組合文庫(kù)的方法，其包括下列步驟1)表達(dá)按照權(quán)利要求59-61中的任一權(quán)利要求的核酸文庫(kù)以在展示體系中展示蛋白質(zhì)文庫(kù)；2)將展示的實(shí)體樣品與適當(dāng)標(biāo)記的靶物質(zhì)進(jìn)行接觸，其中期望分離對(duì)該靶物質(zhì)的CTLD衍生的展示親和性；3)利用其上綴合或物理性吸附或附著有所述靶物質(zhì)的標(biāo)記作為載體或其它親和純化形式，通過(guò)基于親和性的選擇性提取收獲對(duì)該靶物質(zhì)展示親和性的展示實(shí)體亞群，此方法在本領(lǐng)域中通常稱(chēng)為“親和淘選(panning)”，隨后對(duì)該亞文庫(kù)進(jìn)行重?cái)U(kuò)增；4)通過(guò)重復(fù)多輪淘選和重?cái)U(kuò)增分離越來(lái)越好的結(jié)合物，直至獲得少量的良好的候選結(jié)合物，5)如果需要，以單克隆形式分離每個(gè)良好的候選結(jié)合物，并對(duì)其進(jìn)行普通的功能和結(jié)構(gòu)定性，從而為最終篩選一或多個(gè)優(yōu)選的產(chǎn)物克隆作準(zhǔn)備。
在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了以想要的替代物種相容性框架方式使本發(fā)明蛋白或選擇自本發(fā)明組合文庫(kù)并含有展示所需結(jié)合性質(zhì)的CTLD變體的蛋白質(zhì)重定型的方法，包括利用PCR技術(shù)、定點(diǎn)誘變或限制性酶消化從編碼該蛋白的核酸中切出編碼替代環(huán)區(qū)多肽及任何所需的單框架突變的核酸區(qū)段，以及將該核酸區(qū)段插入到含有編碼所要的替代CTLD框架之核酸序列的展示或蛋白表達(dá)載體中。
圖表簡(jiǎn)述圖1展示了10個(gè)已知3D結(jié)構(gòu)的CTLD的氨基酸序列比對(duì)。主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的序列定位指示在每一序列之上，依次以數(shù)字序號(hào)標(biāo)記，如″αN″指α-螺旋號(hào)N，而″βM″指β-鏈號(hào)M。
指出了CTLD的兩個(gè)保守二硫橋形成中涉及的四個(gè)半胱氨酸并在圖中分別以″CI″，″CII″，″CIII″和″CIV″列舉出來(lái)。這兩個(gè)保守二硫橋分別為CI-CIV和CII-CIII。
這10個(gè)C型凝集素為hTN 人四柄蛋白[Nielsen et al.(1997)]；MBP 甘露糖結(jié)合蛋白[Weis et al.(1991)；Sheriff etal.(1994)]；SP-D 表面活性劑蛋白D[H kansson et al.(1999)]；LY49A NK受體LY49A[Tormo et al.(1999)]；H1-ASR唾液酸糖蛋白受體的H1亞單位[Meier et al.(2000)]；MMR-4 巨噬細(xì)胞甘露糖受體結(jié)構(gòu)域4[Feinberg et al.(2000)]；
IX-A和IX-B分別為凝血因子IX/X-結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域AB[Mizuno et al.(1997)]；Lit 胰石蛋白(lithostatine)[Bertrand et al.(1996)]；TU14 有被膜的C型凝集素[Poget et al.(1999)]。
圖2展示了成熟人和鼠四柄蛋白編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，其中指示出已知二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。
hTN人四柄蛋白；核苷酸序列得自Berglund和Petersen(1992)。
mTN鼠四柄蛋白；核苷酸序列得自S rensen et al.(1995)。二級(jí)結(jié)構(gòu)元件得自Nielsen et al.(1997)。
″α″指α-螺旋；″β″指β-鏈；″L″指環(huán)。
圖3展示了人和鼠tlec編碼區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列的比對(duì)。
htlec源自hTN的序列；mtlec源自mTN的序列。標(biāo)出了Bgl II、Kpn I和Mun I的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。
圖4展示了人和鼠tCTLD編碼區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列的比對(duì)。
htCTLD源自hTN的序列；mtCTLD源自mTN的序列。標(biāo)出了Bgl II、Kpn I和Mun I的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。
圖5展示了pT7H6FX-htlec表達(dá)質(zhì)粒的略圖。其中FX-htlec區(qū)段插入到pT7H6[Christensen et al.(1991)]中Bam HI和Hind III克隆位點(diǎn)間。
圖6展示了利用pT7H6FX-htlec制備的H6FX-htlec融合蛋白的FX-htlec部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖7展示了pT7H6FX-htCTLD表達(dá)質(zhì)粒的略圖。其中FX-htCTLD區(qū)段插入到pT7H6[Christensen et al.(1991)]中Bam HI和Hind III克隆位點(diǎn)間。
圖8展示了利用pT7H6FX-htCTLD制備的H6FX-htCTLD融合蛋白的FX-htCTLD部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖9展示了pPhTN噬菌粒的略圖。其中PhTN區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中SfiI和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖10展示了利用pPhTN制備的PhTN-gene III融合蛋白的PhTN部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖11展示了pPhTN3噬菌粒的略圖。其中PhTN3區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖12展示了利用pPhTN3制備的PhTN3-gene III融合蛋白的PhTN3部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖13展示了pPhtlec噬菌粒的略圖。其中Phtlec區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中SfiI和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖14展示了利用pPhtlec制備的Phtlec-gene III融合蛋白的Phtlec部分的氨基酸序列(單字母編碼)。
圖15展示了pPhtCTLD噬菌粒的略圖。其中PhtCTLD區(qū)段插入到噬菌粒CANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖16展示了利用pPhtCTLD制備的PhtCTLD-gene III融合蛋白的PhtCTLD部分的氨基酸序列(單字母編碼)。
圖17展示了pUC-mtlec的略圖。
圖18展示了pT7H6FX-mtlec表達(dá)質(zhì)粒的略圖。其中FX-mtlec區(qū)段插入到pT7H6[Christensen et al.(1991)]中Bam HI和Hind III克隆位點(diǎn)間。
圖19展示了利用pT7H6FX-mtlec制備的H6FX-mtlec融合蛋白的FX-mtlec部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖20展示了pT7H6FX-mtCTLD表達(dá)質(zhì)粒的略圖。其中FX-mtCTLD區(qū)段插入到pT7H6[Christensen et al.(1991)]中Bam HI和Hind III克隆位點(diǎn)間。
圖21展示了利用pT7H6FX-mtCTLD制備的H6FX-mtCTLD融合蛋白的FX-mtCTLD部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖22展示了pPmtlec噬菌粒的略圖。其中Pmtlec區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖23展示了利用pPmtlec制備的Pmtlec-gene III融合蛋白的Pmtlec部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖24展示了pPmtCTLD噬菌粒的略圖。其中PmtCTLD區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖25展示了利用pPmtCTLD制備的PmtCTLD-gene III融合蛋白的PmtCTLD部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖26展示了對(duì)與抗四柄蛋白或BSA結(jié)合的Phtlec-、PhTN3-和M13KO7輔助噬菌體進(jìn)行的ELISA-type分析。Panel A以3％脫脂乳/5mM EDTA作為封閉劑進(jìn)行分析。Panel B以3％脫脂乳作為封閉劑進(jìn)行分析。
圖27展示了對(duì)與纖溶酶原(Plg)和BSA結(jié)合的Phtlec-、PhTN3-及M13KO7輔助噬菌體進(jìn)行的ELISA-type分析。Panel A以3％脫脂乳/5mM EDTA作為封閉劑進(jìn)行分析。Panel B以3％脫脂乳作為封閉劑進(jìn)行分析。
圖28展示了對(duì)選自第二輪篩選且與纖溶酶原(Plg)結(jié)合的B系列和C系列多克隆群相比于背景的ELISA-type分析。
圖29在ELISA-type檢驗(yàn)中對(duì)從第三輪篩選中分離得到的12個(gè)克隆中的噬菌體與母雞卵白溶菌酶、人β2-微球蛋白和背景的結(jié)合進(jìn)行分析。
圖30展示了利用pPrMBP制備的PrMBP-gene III融合蛋白的PrMBP部分的氨基酸序列(單字母代碼)。
圖31展示了pPrMBP噬菌粒的略圖。其中PrMBP區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖32展示了利用pPhSP-D制備的PhSP-D-gene III融合蛋白的PhSP-D部分的氨基酸序列(單字母編碼)。
圖33展示了pPhSP-D噬菌粒的略圖。其中PhSP-D區(qū)段插入到噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech，代碼27-9401-01)中Sfi I和Not I限制性位點(diǎn)間。
圖34.在ELISA-type檢驗(yàn)中，對(duì)從#1系列第三輪篩選中分離得到的48個(gè)克隆中的噬菌體與母雞卵白溶菌酶和A-HA的結(jié)合進(jìn)行分析。
圖35.在ELISA-type檢驗(yàn)中，對(duì)從#4系列第三輪篩選中分離得到的48個(gè)克隆中的噬菌體與母雞卵白溶菌酶和A-HA的結(jié)合進(jìn)行分析。
發(fā)明詳述I.定義術(shù)語(yǔ)“C型類(lèi)凝集素蛋白”和“C型凝集素”指任何真核物種中存在的、或在任何真核物種的基因組中編碼的任何蛋白，這些蛋白含有一或多個(gè)CTLD或含有結(jié)合糖配基的CTLD亞群即CRD的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。此定義特定的包括膜附著的C型類(lèi)凝集素蛋白和C型凝集素、“可溶性”C型類(lèi)凝集素蛋白和缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的C型凝集素、其中一或多個(gè)氨基酸殘基已通過(guò)體內(nèi)糖基化作用或任何其它的合成后修飾作用進(jìn)行了改變的C型凝集素、以及通過(guò)對(duì)C型類(lèi)凝集素蛋白和C型凝集素進(jìn)行化學(xué)修飾得到的任何產(chǎn)物。
在權(quán)利要求和整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，某些改變是通過(guò)參照CTLD結(jié)構(gòu)域或含有CTLD的蛋白的氨基酸殘基號(hào)來(lái)定義的。視具體情況而定，氨基酸編號(hào)開(kāi)始于CTLD或者天然或人工的含有CTLD的蛋白產(chǎn)物的第一個(gè)N-末端氨基酸，在每種情況下都要通過(guò)包含在本說(shuō)明書(shū)上下文中的明確的外部參考或內(nèi)部參考數(shù)字對(duì)它們進(jìn)行表示。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“氨基酸殘基”指所有的天然L-α-氨基酸。此定義包括正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸和高半胱氨酸。這些氨基酸以單字母或三字母命名來(lái)標(biāo)出
Asp D天冬氨酸 Ile I異亮氨酸Thr T蘇氨酸Leu L亮氨酸Ser S絲氨酸Tyr Y酪氨酸Glu E谷氨酸Phe F苯丙氨酸Pro P脯氨酸His H組氨酸Gly G甘氨酸Lys K賴(lài)氨酸Ala A丙氨酸Arg R精氨酸Cys C半胱氨酸 Trp W色氨酸Val V纈氨酸Gln Q谷氨酰胺Met M蛋氨酸Asn N天冬酰胺Nle J正亮氨酸 Orn O鳥(niǎo)氨酸Hcy U高半胱氨酸Xxx X任何L-α-氨基酸。
可按照側(cè)鏈的化學(xué)組成和特性對(duì)天然L-α-氨基酸進(jìn)行分類(lèi)。廣泛的將它們分為兩類(lèi)，帶電荷和不帶電荷。將這些組中的每個(gè)組分為更小的亞組，以對(duì)這些氨基酸進(jìn)行更精確的分類(lèi)A.帶電荷氨基酸酸性氨基酸殘基Asp，Glu堿性氨基酸殘基Lys，Arg，His，OrnB.不帶電荷的氨基酸親水性氨基酸殘基Ser，Thr，Asn，Gln脂肪族氨基酸殘基Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Nle非極性氨基酸殘基Cys，Met，Pro，Hcy芳香族氨基酸殘基Phe，Tyr，Trp術(shù)語(yǔ)“氨基酸改變”和“改變”指CTLD氨基酸序列中的氨基酸替代、缺失或插入或它們的任何結(jié)合。在本發(fā)明的CTLD變體中，這樣的改變是發(fā)生在CTLD氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上。此處的替代變體是那些去除了天然CTLD序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基及有插入到其相同位置中的不同氨基酸的變體。這些替代可為分子中僅僅有一個(gè)氨基酸替代的單替代，或它們也可為相同分子中具有一或多個(gè)氨基酸替代的多重替代。
本文中，替代變體的命名包括字母、隨后的數(shù)字、以及再后的字母。第一個(gè)(最左端)字母指天然(未改變的)CTLD或含有CTLD的蛋白中的氨基酸。數(shù)字表示進(jìn)行氨基酸替代處的氨基酸位置，第二個(gè)(最右端的)字母指用來(lái)替代天然氨基酸的氨基酸。如上所提及的，視情況而定，編號(hào)從“1”開(kāi)始，指CTLD或含有CTLD的蛋白的N-末端氨基酸序列。多重改變?cè)诿幸远禾?hào)(，)分開(kāi)，以便于對(duì)它們進(jìn)行閱讀。
術(shù)語(yǔ)“編碼……的核酸分子”、“編碼……的DNA序列”以及“編碼……的DNA”指沿脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸順序確定了沿多肽鏈的氨基酸的順序。因此DNA序列編碼了這些氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“突變隨機(jī)化的序列”、“隨機(jī)化的多肽區(qū)段”、“隨機(jī)化的氨基酸序列”、“隨機(jī)化的寡核苷酸”和“突變隨機(jī)化的序列”以及文中應(yīng)用的任何類(lèi)似術(shù)語(yǔ)指隨機(jī)化序列、多肽或核酸，多肽或核酸序列或區(qū)段的組合，其中一或多個(gè)序列位點(diǎn)上的氨基酸殘基或核苷酸可能在多肽或核酸組合的不同成員間有不同，這樣每個(gè)序列位點(diǎn)上的氨基酸殘基或核苷酸屬于可包括所有可能的氨基酸殘基或核苷酸或它們的任何限定亞群在內(nèi)的一組氨基酸殘基或核苷酸。該術(shù)語(yǔ)經(jīng)常用于指各成員間氨基酸殘基或核苷酸數(shù)目都相同的組合，但也可用于指其中的每個(gè)組合成員的氨基酸殘基或核苷酸數(shù)目可為適當(dāng)整數(shù)范圍內(nèi)的任何整數(shù)的組合。
II.組合CTLD文庫(kù)的構(gòu)建和應(yīng)用在推定的結(jié)合組件或具有推定的酶活性的組件方面，已描述了用于展示表型的幾個(gè)體系。這些體系包括噬菌體展示(如絲狀噬菌體fd[Dunn(1996)，Griffiths amd Duncan(1998)，Marks et al.(1992)]、噬菌體λ[Mikawa et al.(1996)])、在真核病毒(如桿狀病毒[Ernst et al.(2000)])上展示、細(xì)胞展示(如在細(xì)菌細(xì)胞[Benhar et al.(2000)]、酵母細(xì)胞[Boder and Wittrup(1997)]、及哺乳動(dòng)物細(xì)胞[Whitehorn et al.(1995)]上展示)、與核糖體連接的展示[Schaffitzel et al.(1999)]以及與質(zhì)粒連接的展示[Gates et al.(1996)]。
噬菌體展示是表型展示和將此與表型相聯(lián)系的最普通的方法。此展示法是通過(guò)將編碼支架蛋白或感興趣的蛋白的閱讀框架插入到表面暴露的噬菌體蛋白的結(jié)構(gòu)域內(nèi)區(qū)段中實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)證明絲狀噬菌體fd(如M13)對(duì)于此應(yīng)用目的是最有用的。多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)最經(jīng)常的插入到fd基因III蛋白的″輸出″信號(hào)和結(jié)構(gòu)域1間或插入到fd-噬菌體基因III蛋白的結(jié)構(gòu)域2和結(jié)構(gòu)域3間的所謂鉸鏈區(qū)中。人抗體是新結(jié)合單位分離中最常用的蛋白，但也可應(yīng)用其它蛋白和結(jié)構(gòu)域(如人生長(zhǎng)激素[Bass et al.(1990)]，堿性磷酸酶[McCafferty et al.(1991)]，β-內(nèi)酰胺酶抑制性蛋白[Huang et al.(2000)]，及與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)的抗原4[Hufton et al.(2000)]。
抗體經(jīng)常以scFv或Fab融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)和遞呈。已經(jīng)應(yīng)用了三種策略。其中或者可將特定抗體用作產(chǎn)生抗原結(jié)合隙內(nèi)的突變隨機(jī)化序列文庫(kù)的支架[如Fuji et al.(1998)]，或者將代表未免疫的宿主[如Nissim et al.(1994)]或免疫后的宿主[如Cyr和Hudspeth(2000)]中的抗體編碼基因的大組合的文庫(kù)克隆到fd噬菌體載體中。
制備用于產(chǎn)生CTLD文庫(kù)的展示體系的一般方法基本包括(1)如果能夠獲得3D結(jié)構(gòu)信息，則可通過(guò)參考選定的CTLD的3D結(jié)構(gòu)信息來(lái)確定環(huán)區(qū)的定位，或者如果不能獲得3D結(jié)構(gòu)信息，則可通過(guò)與圖1中的序列進(jìn)行序列比對(duì)，并在對(duì)相應(yīng)于上文也公開(kāi)的β2和β3共有序列元件及β4鏈特征的序列元件鑒定進(jìn)行進(jìn)一步確證的幫助下確定β2-、β3-和β4鏈的序列定位；(2)在先或并不先在編碼β2、β3和β4的序列附近插入核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)的情況下在蛋白展示載體體系中對(duì)編碼選定的CTLD的核酸區(qū)段進(jìn)行亞克隆；及(3)利用從由大多數(shù)核酸區(qū)段組成的組合中隨機(jī)選擇的成員區(qū)段替代編碼選定的CTLD的環(huán)區(qū)的部分或全部的核酸區(qū)段，前者的核酸區(qū)段在插入到編碼接受框架的核酸環(huán)境中后將會(huì)利用隨機(jī)選擇的核酸區(qū)段替代編碼原始環(huán)區(qū)多肽區(qū)段的核酸區(qū)段。每個(gè)編碼替代原始環(huán)區(qū)段和整個(gè)環(huán)區(qū)的新多肽的克隆核酸區(qū)段將在其新序列中確定的閱讀框架中進(jìn)行閱讀。
利用任何普通的核酸分子克隆方法，例如適當(dāng)設(shè)計(jì)的、其中化學(xué)合成的核酸拷貝編輯到接受核酸中且不要求插入任何核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)的PCR操作來(lái)在特定位點(diǎn)將核酸區(qū)段插入到接受核酸中?？商娲缘?，利用核酸分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶限制性位點(diǎn)工程化到可將適當(dāng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸區(qū)段插入其中的靶核酸中，就可促進(jìn)核酸區(qū)段的插入/切除作用。
顯然的，從為方便起見(jiàn)已將限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)插入其中的CTLD文庫(kù)中分離的有趣CTLD變體可含有突變的或額外的、并且不僅不與原始CTLD中的殘基一致、而且對(duì)維持CTLD變體有益的新親和性并不重要的氨基酸殘基。如果需要，如需要盡可能使產(chǎn)物變成非免疫原性時(shí)，可通過(guò)特定克隆中的回復(fù)突變或缺失對(duì)這些殘基進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖兓蛉コ?br> 通過(guò)在核酸區(qū)段化學(xué)合成的每一步中，使逐步合成法添加純核苷酸單體的預(yù)定組合或添加任何核苷酸單體組合的混合物，這樣就可利用普通的化學(xué)合成方法獲得由多數(shù)核酸區(qū)段組成的組合。這樣就可能產(chǎn)生任何水平的序列簡(jiǎn)并性，包括從單個(gè)獨(dú)特的核酸序列到最復(fù)雜混合物其完全或不完全代表了4N的最大量的獨(dú)特序列，其中N為序列中的核苷酸數(shù)目。
替代性的，可通過(guò)對(duì)高分子量核酸組合物，如從任何生物體中提取的基因組核酸進(jìn)行化學(xué)、物理和酶法斷裂，產(chǎn)生核酸區(qū)段混合物，由此制備由多數(shù)核酸區(qū)段組成的復(fù)雜組合。如此處所描述的，為了使這些核酸區(qū)段混合物能用于產(chǎn)生分子組合，一般要對(duì)起始切割步驟中獲得的粗區(qū)段混合物進(jìn)行大小分級(jí)分離以獲得適當(dāng)分子量大小范圍的區(qū)段，而隨后一般將這些區(qū)段連接到適當(dāng)?shù)倪B接體對(duì)上，該連接體對(duì)設(shè)計(jì)成可促進(jìn)大小限制性寡核苷酸區(qū)段的連接體包埋混合物插入到接受核酸載體中。
為了促進(jìn)四柄蛋白中CTLD組合文庫(kù)的構(gòu)建，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的模型CTLD中，設(shè)計(jì)定位在編碼人和鼠四柄蛋白β2、β3和β4的核酸序列附近的合適的限制性位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)可以制定一個(gè)下文詳述的設(shè)計(jì)策略，通過(guò)其可將相同的核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)導(dǎo)入到兩序列中的相應(yīng)位點(diǎn)，從而可很容易的從重組鼠CTLD中切出令人感興趣的環(huán)區(qū)變體并將環(huán)區(qū)變體正確插入到人四柄蛋白CTLD框架中，或相反操作也可實(shí)現(xiàn)。
對(duì)編碼成熟的人四柄蛋白的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明(圖2)，在涉及編碼的β2 Glu109、Ile110和Trp111殘基在內(nèi)的326-331(AGATCT)位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)了限制性核酸內(nèi)切酶Bgl II的識(shí)別位點(diǎn)，在涉及編碼的氨基酸殘基Gly128和Ala129(定位在環(huán)2中的C末端)在內(nèi)的382-387(GGCGCC)位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)了限制性核酸內(nèi)切酶Kas I的識(shí)別位點(diǎn)。
在編碼人四柄蛋白的核苷酸序列中通過(guò)定點(diǎn)誘變將G513突變成A并將C514突變成T，可在其中導(dǎo)入定位在511-516位點(diǎn)間的Mun I限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在編碼鼠四柄蛋白的核苷酸序列中將G513突變成A，則可在其中定位在與人四柄蛋白中的Mun I位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)上導(dǎo)入Mun I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，并且不影響編碼啟動(dòng)子的氨基酸序列。在編碼鼠四柄蛋白的核苷酸序列中，通過(guò)定點(diǎn)誘變獲得的C327到G和G386到C的突變可在其中分別導(dǎo)入Bgl II和KasI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。此外，在編碼鼠四柄蛋白的核苷酸序列中的A325可突變?yōu)镚。這三種突變可分別將Asn109替代為Glu，將Gly129替代為Ala，從而影響編碼的氨基酸序列?，F(xiàn)在，已知限制性核酸內(nèi)切酶Kas I展示顯著的位點(diǎn)傾向性，并且僅僅緩慢切割四柄蛋白編碼區(qū)。因此，優(yōu)選的是用另一限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)替代Kas I位點(diǎn)(如限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別序列為GGTACC)。圖3展示了得到的四柄蛋白衍生物、人四柄蛋白凝集素(htlec)和鼠四柄蛋白凝集素(mtlec)的核苷酸和氨基酸序列?？珊苋菀椎膶⒕幋ahtlec和mtlec啟動(dòng)子的核苷酸序列亞克隆到能夠?qū)ο噙B接的核苷酸序列進(jìn)行蛋白展示的裝置中(如噬菌粒載體)和亞克隆到設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行蛋白異源表達(dá)的質(zhì)粒中[如pT7H6，Christensen et al.(1991)]。也構(gòu)建了其它僅僅編碼htlec或mtlec的突變CTLD(分別為htCTLD和mtCTLD)的衍生物，并將它們亞克隆到噬菌粒載體和表達(dá)質(zhì)粒中，圖4中展示了這些CTLD衍生物的核苷酸序列和氨基酸序列。
通過(guò)將隨機(jī)化寡核苷酸連接到經(jīng)適當(dāng)限制性消化、編碼htlec、mtlec、htCTLD或mtCTLD衍生物的噬菌粒載體中，使在四柄蛋白和CTLD衍生物組中存在共同的一套限制性核酸內(nèi)切酶Bgl II、Kas I或Kpn I、及Mun I識(shí)別位點(diǎn)，可用于產(chǎn)生在一或多個(gè)環(huán)中及包含凝集素配基結(jié)合區(qū)的β4中的單殘基位點(diǎn)上具有隨機(jī)化氨基酸序列的蛋白質(zhì)文庫(kù)。
在對(duì)特定靶(如真核細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、特定蛋白、多糖、其它多聚物、有機(jī)化合物等)進(jìn)行多輪篩選后，可從特定噬菌體分離DNA，確定編碼配基結(jié)合區(qū)的區(qū)段的核苷酸序列，從噬菌粒DNA中切出并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)难苌锉磉_(dá)載體中，用于所需產(chǎn)物的異源生產(chǎn)。優(yōu)選在原核細(xì)胞中進(jìn)行的異源生產(chǎn)，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道了有效的四柄蛋白及其衍生物的分離和重折疊方法(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)WO 94/18227 A2)。
以四柄蛋白作為支架結(jié)構(gòu)，通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)獲得的特別的優(yōu)點(diǎn)為，鼠和人四柄蛋白支架的結(jié)構(gòu)幾乎是完全相同的，從而可在保留功能性的情況下使環(huán)區(qū)在鼠和人四柄蛋白衍生物自由交換。在描述的四柄蛋白衍生物載體體系中，可很容易的實(shí)現(xiàn)鼠和人框架間的環(huán)區(qū)交換，并且，鑒于甚至在遺傳水平上人和鼠序列間的高水平同源性，預(yù)期此體系可延伸到包括在醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)方面相關(guān)的其它物種(如大鼠、年齡大的和新出生的猴、狗、牛、綿羊、山羊等)。當(dāng)從這些物種中最終將四柄蛋白克隆出來(lái)并且/或進(jìn)行了序列分析，那此策略延伸到包括更多的物種就成為可能。
由于C型凝集素配基結(jié)合區(qū)代表了與抗體的抗原結(jié)合隙相比有所不同的拓?fù)鋵W(xué)單位，我們?cè)O(shè)想選定的結(jié)合特異性相對(duì)于抗體將會(huì)具有不同的性質(zhì)。此外，我們?cè)O(shè)想，在對(duì)糖基或多糖結(jié)合的特異性方面，四柄蛋白衍生物相對(duì)于抗體會(huì)具有優(yōu)勢(shì)。在選擇針對(duì)某些天然或合成有機(jī)化合物的結(jié)合特異性方面，四柄蛋白衍生物也具有優(yōu)勢(shì)。
已知幾種CTLD可結(jié)合鈣離子，并且與其它配基的結(jié)合常常依賴(lài)鈣(例如C型凝集素的膠原凝集素族，其中結(jié)合在位點(diǎn)2中的鈣離子直接參與對(duì)糖配基的結(jié)合[Weis和Drickamer(1996)])或?qū)︹}敏感(如四柄蛋白，其中鈣離子的結(jié)合與原本已知和纖溶酶原kringle 4的結(jié)合相關(guān)的多個(gè)側(cè)鏈相關(guān)[Graversen et al.(1998)])。
C型類(lèi)凝集素蛋白族特征性的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)包含定位在環(huán)1、環(huán)4和β鏈4中的殘基，并且依賴(lài)于脯氨酸殘基(在結(jié)構(gòu)中常常橫跨環(huán)3和環(huán)4)的存在，當(dāng)進(jìn)行結(jié)合時(shí)該殘基肯定處于順式構(gòu)象。此外，已知鈣離子的結(jié)合可增強(qiáng)CTLD環(huán)區(qū)中的結(jié)構(gòu)改變[Ng et al.(1998a，b)]。因此我們?cè)O(shè)想，可通過(guò)添加或去除二價(jià)金屬離子(如鈣離子)來(lái)調(diào)節(jié)具有保留的CTLD金屬結(jié)合位點(diǎn)的組合文庫(kù)成員與特定靶配基進(jìn)行的結(jié)合，這是因?yàn)榻饘匐x子可直接參與結(jié)合(因?yàn)榕浠鶠楦?jìng)爭(zhēng)性配基)，或因?yàn)榻饘匐x子的結(jié)合增強(qiáng)了推定的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排。
在產(chǎn)生具有非常高的結(jié)合親和力的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，也可利用包括四柄蛋白在內(nèi)的C型凝集素和C型類(lèi)凝集素蛋白家族的幾個(gè)成員的三聚性質(zhì)，以及伴隨的結(jié)合親和力。
正如我們從上述公開(kāi)內(nèi)容中可領(lǐng)會(huì)的，本發(fā)明具有寬泛的范圍和寬應(yīng)用領(lǐng)域。因此，僅僅以例解而不是限制來(lái)給出用來(lái)描述其多種實(shí)施方案的下列實(shí)施例。
實(shí)施例1構(gòu)建四柄蛋白來(lái)源的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒和噬菌粒利用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)并如操作指南所述進(jìn)行操作，從表達(dá)質(zhì)粒pT7H6-rTN 123[Holtet et al.(1997)]開(kāi)始進(jìn)行4個(gè)連續(xù)的系列定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)，構(gòu)建了編碼完全長(zhǎng)度H6FX-htlec融合蛋白的FX-htlec(SEQ ID NO01)部分的表達(dá)質(zhì)粒pT7H6FX-htlec。由DNA Technology(Aarhus，Denmark)提供導(dǎo)入所需突變的錯(cuò)配引物對(duì)。圖5展示了獲得的pT7H6FX-htlec表達(dá)質(zhì)粒的略圖，并且SEQ ID NO01給出了編碼FX-htlec的插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖6展示了H6FX-htlec融合蛋白的FX-htlec部分的氨基酸序列并在SEQ ID NO02中給出。
通過(guò)擴(kuò)增并亞克隆到質(zhì)粒pT7H6中(也即以表達(dá)質(zhì)粒pT7H6-htlec為模板，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增，其它方面，如引物、條件及亞克隆方法如構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pT7H6TN3中所描述的)[Holtetet al.(1997)]，構(gòu)建了編碼H6FX-htCTLD融合蛋白的FX-htCTLD(SEQ ID NO03)部分的表達(dá)質(zhì)粒pT7H6FX-htCTLD。圖7展示了獲得的pT7H6FX-htCTLD表達(dá)質(zhì)粒的略圖，并且SEQ ID NO03給出了編碼FX-htCTLD的插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖8展示了H6FX-htCTLD融合蛋白的FX-htCTLD部分的氨基酸序列并以SEQID NO04給出。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)分別將從表達(dá)質(zhì)粒pT7H6-rTN 123(利用寡核苷酸引物5-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCACCAACCCAGAAGC-3’[SEQ ID NO05]和5’-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ ID NO06])和pT7H6FX-htCTLD(利用寡核苷酸引物5’-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCTGCAGACGGTC-3’[SEQ ID NO07]和5’-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ ID NO06])擴(kuò)增得到的并經(jīng)Sfi I和Not I限制性消化的DNA區(qū)段連接到Amersham Pharmacia Biotech提供(代碼27-9401-01)的預(yù)先經(jīng)Sfi I和Not I切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pPhTN和pPhTN3。圖9和圖11分別給出了獲得的pPhTN和pPhTN3噬菌粒的略圖，并且SEQ ID NO08和SEQ ID NO10分別給出了PhTN和PhTN3插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖10(SEQ ID NO09)和圖12(SEQ ID NO11)分別展示了PhTN和PhTN3插入?yún)^(qū)段編碼的氨基酸序列。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)分別將從表達(dá)質(zhì)粒pT7H6FX-htlec(利用寡核苷酸引物5-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCACCAACCCAGAAGC-3’[SEQ ID NO05]和5’-CCTGCGGCC-GCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ ID NO06])及pT7H6FX-htCTLD(利用寡核苷酸引物5’-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCTGCAGACGGTC-3’[SEQ ID NO07]和5’-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ IDNO06])擴(kuò)增得到的并經(jīng)Sfi I和Not I限制性消化的DNA區(qū)段連接到Amersham Pharmacia Biotech(代碼27-9401-01)提供的預(yù)先經(jīng)Sfi I和Not I切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pPhtlec和pPhtCTLD。圖13和15分別展示了獲得的pPhtlec和pPhtCTLD噬菌粒的略圖，并且SEQ ID NO12和SEQ ID NO14分別給出了Phtlec和PhtCTLD插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖14(SEQ ID NO13)和圖16(SEQ ID NO15)分別展示了Phtlec和PhtCTLD插入?yún)^(qū)段編碼的氨基酸序列。
以下列方式，利用四個(gè)連續(xù)的DNA亞區(qū)段亞克隆，構(gòu)建了含有相應(yīng)于鼠四柄蛋白衍生物mtlec(圖3和SEQ ID NO16)的核苷酸序列的質(zhì)?？寺UC-mtlec首先，將兩個(gè)寡核苷酸5’-CGGAATTCGAGTCACCCACTCCCAAGGCCAAGAAGGCTGCAAATGCCAAGAAAGATTTGGTGAGCTCAAAGATGTTC-3’(SEQID NO17)和5’-GCGGATCCAGGCCTGCTTCTCCTTCAGCAGGGCCACCTCCTGGGCCAGGACATCCATCCTGTTCTTGAGCTCCTCGAACATCTTTGAGCTCACC-3’(SEQ ID NO18)退火，進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)后，利用限制性核酸內(nèi)切酶Eco RI(GAATTC)和Bam HI(GGATCC)進(jìn)行切割，將其連接到預(yù)先經(jīng)Eco RI和Bam HI切割的pUC18質(zhì)粒DNA中。然后，將一對(duì)寡核苷酸5’-GCAGGCCTTACAGACTGTGTGCCTGAAGGGCACCAAGGTGAACTTGAAGTGCCTCCTGGCCTTCACCCAACCGAAGACCTTCCATGAGGCGAGCGAG-3’(SEQ ID NO19)和5’-CCGCATGCTTCGAACAGCGCCTCGTTCTCTAGCTCTGACTGCGGGGTGCCCAGCGTGCCCCCTTGCGAGATGCAGTCCTCGCTCGCCTCATGG-3’(SEQ IDNO20)退火，進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)后，利用限制性核酸內(nèi)切酶Stu I(AGGCCT)和Sph I(GCATGC)進(jìn)行切割，再連接到第一次連接產(chǎn)生的預(yù)先經(jīng)Stu I和Sph I切割的質(zhì)粒中。接著，將寡核苷酸對(duì)5’-GGTTCGAATACGCGCGCCACAGCGTGGGCAACGATGCGGAGATCTAAATGCTCCCAATTGC-3’(SEQ ID NO21)和5’-CCAAGCTTCACAATGGCAAACTGGCAGATGTAGGGCAATTGGGAGCATTTAGATC-3’(SEQ ID NO22)退火，進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)后，利用限制性核酸內(nèi)切酶BstBI(TTCGAA)和HindIII(AAGCTT)進(jìn)行切割，再連接到第二次連接產(chǎn)生的預(yù)先經(jīng)BstB I和Hind III切割的質(zhì)粒中。第四，將寡核苷酸對(duì)5’-CGGAGATCTGGCTGGGCCTCAACGACATGGCCGCGGAAGGCGCCTGGGTGGACATGACCGGTACCCTCCTGGCCTACAAGAACTGG-3’(SEQ ID NO23)和5’-GGGCAATTGATCGCGGCATCGCTTGTCGAACCTCTTGCCGTTGGCTGCGCCAGACAGGGCGGCGCAGTTCTCGGCTTTGCCGCCGTCGGGTTGCGTCGTGATCTCCGTCTCCCAGTTCTTGTAGGCCAGG-3’(SEQID NO24)退火，進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)后，利用限制性核酸內(nèi)切酶Bgl II(AGATCT)和Mun I(CAATTG)進(jìn)行切割，之后連接到第三次連接產(chǎn)生的預(yù)先經(jīng)Bgl II和Mun I切割的質(zhì)粒中。圖17展示了pUC-mtlec質(zhì)粒的略圖，而SEQ ID NO16給出了獲得的Eco RI到Hind III插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將分別利用寡核苷酸引物對(duì)5-CTGGGATCCATCCAGGGTCGCGAGTCACCCACTCCCAAGG-3’(SEQ ID NO25)和5’-CCGAAGCTTACACAATGGCAAACTGGC-3’(SEQ ID NO26)及寡核苷酸引物對(duì)5’-CTGGGATCCATCCAGGGTCGCGCCTTACAGACTGTGGTC-3’(SEQ ID NO27)和5’-CCGAAGCTTACACAATGGCAAACTGGC-3’(SEQ ID NO26)從pUC-mtlec質(zhì)粒擴(kuò)增得到的經(jīng)Bam HI和Hind III限制性消化的DNA區(qū)段連接到預(yù)先經(jīng)Bam HI和Hind III切割的pT7H6載體中，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pT7H6FX-mtlec和pT7H6FX-mtCTLD。圖18和20分別展示了表達(dá)質(zhì)粒pT7H6FX-mtlec和pT7H6FX-mtCTLD的略圖，并且SEQ ID NO28和SEQ ID NO30分別給出了FX-mtlec和FX-mtCTLD插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖19(SEQ ID NO29)和圖21(SEQ IDNO31)分別展示了融合蛋白H6FX-mtlec和H6FX-mtCTLD融合蛋白的FX-mtlec和FX-mtCTLD部分的氨基酸序列。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將經(jīng)Sfi I和Not I限制性消化的DNA區(qū)段(分別利用寡核苷酸引物對(duì)5’-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGTCACCCACTCCCAAGG-3’[SEQ ID NO32]和5’-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ ID NO33]以及寡核苷酸引物對(duì)5’-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCTTACAGACTGTGGTC-3’[SEQ ID NO34]和5’-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3’[SEQ ID NO33]從pUC-mtlec質(zhì)粒擴(kuò)增得到的)連接到Amersham Pharmacia Biotech(代碼27-9401-01)提供的預(yù)先經(jīng)Sfi I和Not I切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pPmtlec和pPmtCTLD。圖22和24分別展示了pPmtlec和pPmtCTLD質(zhì)粒的略圖，SEQ ID NO35和SEQ ID NO37分別給出了Pmtlec和PmtCTLD插入?yún)^(qū)段的核苷酸序列。圖23(SEQID NO36)和圖25(SEQ ID NO38)分別展示了Pmtlec和PmtCTLD插入編碼的氨基酸序列。
實(shí)施例2Phtlec和PhTN3在噬菌體上成功展示的證實(shí)為了驗(yàn)證Phtlec和PhTN3 Gene III融合蛋白確實(shí)能夠利用重組噬菌體顆粒進(jìn)行展示，所以將噬菌粒pPhtlec和pPhTN3(實(shí)施例1中描述的)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1細(xì)胞中，并且利用輔助噬菌體M13KO7感染來(lái)制得重組噬菌體。利用聚乙二醇(PEG8000)沉淀對(duì)重組噬菌體進(jìn)行分離，并對(duì)Phtlec和PhTN3噬菌體制品及輔助噬菌體樣品進(jìn)行ELISA-型“三明治”檢驗(yàn)，其中Maxisorb(Nunc)多孔平板的孔首先在抗人四柄蛋白和牛血清白蛋白(BSA)中孵育，并在脫脂乳或脫脂乳/EDTA中進(jìn)行封閉。簡(jiǎn)單來(lái)講，在37℃下、添加有2％葡萄糖和100mg/L氨芐青霉素的2×TY-培養(yǎng)基中培養(yǎng)pPhtlec和pPhTN3噬菌粒轉(zhuǎn)化的TG1細(xì)胞培養(yǎng)物，直至其A600達(dá)到0.5。到那時(shí)，向其中添加輔助噬菌體M13KO7至濃度為5×109pfu/mL。在37℃下將培養(yǎng)物另外培養(yǎng)30分鐘，隨后離心收獲細(xì)胞，并將其重新懸浮到相同培養(yǎng)體積的、添加有50mg/L卡那霉素和100mg/L氨芐青霉素的2×TY培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到新鮮的錐形瓶中，在25℃下培養(yǎng)16小時(shí)。離心除去細(xì)胞，通過(guò)添加6mL冰冷的20％PEG8000、2.5M NaCl而從20mL培養(yǎng)上清液中使噬菌體沉淀出來(lái)?；旌虾?，使溶液在冰上放置1小時(shí)，并在4℃下離心以分離沉淀的噬菌體。將噬菌體沉淀物重新懸浮在1mL 10mM tris-HCl pH8、1mMEDTA(TE)中，并在離心前孵育30min。將含有噬菌體的上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。在制備噬菌體樣品的同時(shí)，利用1∶2000稀釋的(70μL)兔抗人四柄蛋白(DAKO A/S提供的多克隆抗體，代碼A0371)或(70μL)BSA(10mg/mL)將Maxisorb平板各孔包被過(guò)夜。包被后利用PBS(2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，137mM NaCl，8.10mM Na2HPO4，pH7.4)沖洗孔三次，并在37℃下利用280μL添加3％脫脂乳的PBS或添加3％脫脂乳、5mM EDTA的PBS封閉1小時(shí)。隨后將抗四柄蛋白包被的和BSA包被的孔與人Phtlec-、PhTN3-或輔助噬菌體樣品共孵育1小時(shí)，并隨后利用添加有適當(dāng)封閉劑的PBS緩沖液沖洗3次。在與綴合HRP的抗噬菌體綴合物(Amersham Pharmacia，代碼27-9421-01)共孵育并隨后沖洗后，對(duì)孔中的噬菌體進(jìn)行檢測(cè)。隨后，利用標(biāo)準(zhǔn)的HRP產(chǎn)色底物測(cè)定法在96孔ELISA閱讀儀中測(cè)定HRP的活性。
不管封閉試劑中存在或不存在EDTA，Phtlec和PhTN3噬菌體在檢驗(yàn)中產(chǎn)生了強(qiáng)響應(yīng)(14倍于背景)，而輔助噬菌體在兩種封閉劑中沒(méi)有產(chǎn)生高于背景讀數(shù)的響應(yīng)。僅僅觀察到與BSA的低程度結(jié)合(圖26)。
因此，我們可得出結(jié)論，人Phtlec和PhTN3噬菌體都展示出可為抗人四柄蛋白抗體特異性識(shí)別的表位。
實(shí)施例3在噬菌體上展示的Phtlec和PhTN3的真實(shí)配基結(jié)合特性的證實(shí)人四柄蛋白的CTLD結(jié)構(gòu)域的脫輔基以對(duì)賴(lài)氨酸敏感的方式特異性結(jié)合到人纖溶酶原kringle 4結(jié)構(gòu)域上[Graversen et al.(1998)]。鈣或賴(lài)氨酸類(lèi)似物如AMCHA(6-氨基-環(huán)己酸)可抑制四柄蛋白對(duì)纖溶酶原的結(jié)合，其中鈣能夠結(jié)合到CTLD結(jié)構(gòu)域的配基結(jié)合位點(diǎn)中的兩個(gè)位點(diǎn)上(Kd約為0.2mM)，而賴(lài)氨酸類(lèi)似物能夠特異性結(jié)合到纖溶酶原中兩個(gè)更強(qiáng)的賴(lài)氨酸結(jié)合位點(diǎn)上(Kd約為15mM)，這兩個(gè)位點(diǎn)中一個(gè)定位在kringle 1中，另一個(gè)定位在kringle 4中。
為了證明人Phtlec和PhTN3噬菌體對(duì)人纖溶酶原的特異性AMCHA敏感性結(jié)合，設(shè)計(jì)了與應(yīng)用來(lái)證明在噬菌體顆粒上存在展示的Phlec和PhCTLD GIII融合蛋白的ELSISA檢驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例2)相似的檢驗(yàn)。
利用添加或未添加5mM AMCHA的人纖溶酶原溶液(10μg/mL)包被平板各孔。對(duì)照孔利用BSA進(jìn)行包被。設(shè)計(jì)了兩個(gè)完全相同的檢驗(yàn)，一個(gè)利用3％脫脂乳封閉過(guò)剩的結(jié)合活性，另一個(gè)利用添加5mMEDTA的3％脫脂乳封閉過(guò)剩的結(jié)合活性。適當(dāng)情況下，封閉溶液、洗滌溶液和噬菌體貯存液中添加5mM AMCHA。將兩組孔與Phtlec-、或PhTN3-、或輔助噬菌體樣品進(jìn)行共孵育，沖洗后，如上文所述利用綴合HRP的抗噬菌體抗體測(cè)定每個(gè)孔中結(jié)合的噬菌體量。結(jié)果如圖27中panel A和B所示，總結(jié)如下(a)在不存在AMCHA的情況下，利用任何封閉劑時(shí)，人Phtlec噬菌體與纖溶酶原包被的孔的結(jié)合產(chǎn)生了8-10倍于背景水平的響應(yīng)，而人PhTN3噬菌體產(chǎn)生了4倍(不存在EDTA)或7倍(存在EDTA的情況下)于背景響應(yīng)水平的響應(yīng)。
(b)在存在5mM AMCHA的情況下，發(fā)現(xiàn)人Phtlec-和PhTN3噬菌體與纖溶酶原的結(jié)合受到完全破壞。
(c)Phtlec和PhTN3噬菌體沒(méi)有展示對(duì)BSA的結(jié)合，并且對(duì)照輔助噬菌體沒(méi)有展示出對(duì)任何固定化物質(zhì)的結(jié)合。
(d)在利用組合噬菌體技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的、優(yōu)選用以減少非特異性結(jié)合的脫脂乳封閉試劑時(shí)，可非常高效地檢測(cè)到人Phtlec和PhTN3噬菌體對(duì)特異性配基的中等結(jié)合強(qiáng)度(約20mM的水平)的特異性結(jié)合，并且?guī)缀鯖](méi)有背景。
總之，結(jié)果表明，在噬菌體顆粒上展示的Phtlec和PhTN3 Gene III融合蛋白展示出與那些真實(shí)的四柄蛋白相對(duì)應(yīng)的纖溶酶原結(jié)合特性，并且Phtlec和PhTN3噬菌體的物理和生化特性與將它們用作載體以產(chǎn)生組合文庫(kù)的預(yù)期用途是很相容的，從這樣的文庫(kù)中可篩選具有新結(jié)合特性的CTLD衍生單位。
實(shí)施例4構(gòu)建噬菌體文庫(kù)Phtlec-lb001和Phtlec-lb002本實(shí)施例中應(yīng)用的所有寡核苷酸全部由DNA Technology(Aarhus，Denmark)提供。
通過(guò)將20μg經(jīng)KpnI和MunI限制性消化的pPhtlec噬菌粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例1)與利用標(biāo)準(zhǔn)條件從寡核苷酸htlec-lib1-tp(SEQ ID NO39)擴(kuò)增得到的10ug經(jīng)Kpn I和Mun I限制性消化的DNA區(qū)段連接，構(gòu)建了含有相應(yīng)于Phtlec(SEQ ID NO12)位點(diǎn)141-146(環(huán)3)、150-153(環(huán)4的一部分)及殘基168(β4中的Phe)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)Phtlec-lb001，其中N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各50％的混合物，其編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列的，并且寡核苷酸htlec-lib1-rev(SEQ ID NO40)和htlec-lib1/2-fo(SEQ ID NO41)用作引物。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
通過(guò)將20μg經(jīng)BglII和MunI限制性消化的pPhtlec噬菌粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例1)與利用標(biāo)準(zhǔn)條件從寡核苷酸對(duì)htlec-lib2-tprev(SEQ IDNO42)和htlec-lib2-tpfo(SEQ ID NO43)擴(kuò)增得到的15ug經(jīng)BglII和MunI限制性消化的DNA區(qū)段連接，構(gòu)建了含有相應(yīng)于Phtlec(SEQID NO12)位點(diǎn)121-123、125和126(環(huán)1的絕大部分)以及殘基150-153(環(huán)4的一部分)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)Phtlec-lb002，其中N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各為50％的混合物，其編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列，并且寡核苷酸htlec-lib2-rev(SEQ ID NO44)和htlec-lib1/2-fo(SEQ ID NO41)用作引物。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
確定了文庫(kù)Phtlec-lb00l和-1b002的滴度分別為1.4×109及3.2×109克隆。對(duì)每個(gè)文庫(kù)中的6個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并利用標(biāo)準(zhǔn)的小量制備方法分離噬菌粒DNA確定環(huán)區(qū)的核苷酸序列(DNA Technology，Aarhus，Denmark)。由于技術(shù)原因，每個(gè)文庫(kù)中的一個(gè)克隆沒(méi)有能夠提供可靠的核苷酸序列，而Phtlec-lib001中的一個(gè)克隆顯然含有一個(gè)主要缺失。表3展示了與Phtlec(SEQ ID NO12)相比，其它9個(gè)克隆(lb001-1，lb001-2，lb001-3，lb001-4，lb002-1，lb002-2，lb002-3，lb002-4和lb002-5)的環(huán)區(qū)核苷酸序列的變異。
表3從Phtlec-lb001和-lb002文庫(kù)中分離的Phtlec環(huán)衍生物的變異(標(biāo)出了β2和β3的共有元件)
實(shí)施例5構(gòu)建噬菌體文庫(kù)PhtCTLD-lb003本實(shí)施例中應(yīng)用的所有寡核苷酸全部由DNA Technology(Aarhus，Denmark)提供。
通過(guò)將20μg經(jīng)BglII和MunI限制性消化的pPhtCTLD噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例1)與編碼適當(dāng)隨機(jī)化的環(huán)1和環(huán)4區(qū)的10μg經(jīng)BglII和MunI限制性消化的DNA區(qū)段群相連接，構(gòu)建了含有相應(yīng)于PhtCTLD(SEQ ID NO15)位點(diǎn)77-79、81-82(環(huán)1)及108-109(環(huán)4)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)PhtCTLD-lb003，其中環(huán)1中具有或不具有兩和三個(gè)隨機(jī)殘基插入，而環(huán)4中具有三和四個(gè)隨機(jī)殘基插入。以三個(gè)環(huán)1 DNA區(qū)段之一與兩個(gè)環(huán)4 DNA區(qū)段之一的混合物為模板，以寡核苷酸TN-lib3-rev(SEQ ID NO45)and loop 3-4-5tagfo(SEQID NO46)為引物，利用標(biāo)準(zhǔn)的方法，從6個(gè)所謂的組裝反應(yīng)擴(kuò)增得到了DNA區(qū)段群。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，以寡核苷酸loop1b(SEQ ID NO47)、loop1c(SEQ ID NO48)或loopld(SEQ ID NO49)為模板，以寡核苷酸TN-lib3-rev(SEQ ID NO45)和TN-KpnI-fo(SEQ ID NO50)為引物，在反應(yīng)中擴(kuò)增三個(gè)環(huán)1區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段；以寡核苷酸loop4b(SEQ ID NO51)或loop4c(SEQ ID NO52)為模板，以寡核苷酸loop3-4rev(SEQ ID NO53)和loop3-4fo(SEQ ID NO54)為引物，在反應(yīng)中擴(kuò)增兩個(gè)DNA環(huán)4區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段。在寡核苷酸序列中，N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各為50％的混合物，編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上，并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
確定了得到的文庫(kù)PhtCTLD-lb003的大小為1.4×1010個(gè)克隆。對(duì)文庫(kù)中的24個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并分離噬菌體和噬菌粒DNA。確定環(huán)區(qū)的核苷酸序列(DNA Technology，Aarhus，Denmark)，并利用標(biāo)準(zhǔn)方法，以綴合HRP的抗gene VIII(Amersham Pharmacia Biotech)作為二抗，利用ELISA-type檢驗(yàn)分析其與抗四柄蛋白的多克隆抗體即抗TN(DAKO A/S，Denmark)的結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)，18個(gè)克隆含有正確的環(huán)插入?yún)^(qū)段，一個(gè)克隆含有野生型環(huán)區(qū)序列，一個(gè)克隆含有主要的缺失，兩個(gè)克隆含有兩或多個(gè)序列，兩個(gè)克隆含有存在于環(huán)區(qū)中的移框突變。具有正確環(huán)插入?yún)^(qū)段的18個(gè)克隆中的13個(gè)克隆、野生型克隆、以及混合分離物中的一個(gè)分離物與多克隆抗TN抗體反應(yīng)強(qiáng)烈。18個(gè)正確克隆中的3個(gè)克隆與抗體反應(yīng)很弱，然而，兩個(gè)正確克隆、缺失突變體、一個(gè)混合分離物以及兩個(gè)移框突變體沒(méi)有展示高于背景的信號(hào)。
實(shí)施例6利用對(duì)抗TN抗體的生物淘選進(jìn)行噬菌體篩選利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)在Maxisorb immunotube(NUNC，Denmark)中進(jìn)行淘選，在多克隆抗TN抗體上對(duì)取自PhtCTLD-lb003文庫(kù)中的約1011個(gè)噬菌體進(jìn)行兩輪篩選。在進(jìn)行了第二輪篩選后，對(duì)平皿接種的7×107個(gè)克隆中的15個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)，噬菌粒DNA進(jìn)行分離，對(duì)核酸序列進(jìn)行確定。發(fā)現(xiàn)所有的15個(gè)克隆都編碼正確的且不同的環(huán)序列。
實(shí)施例7CTLD-噬菌體在纖溶酶原上的模型篩選I淘選后利用胰蛋白酶消化進(jìn)行洗脫為了證明能夠從一群噬菌體中選擇出具有源自四柄蛋白的CTLD噬菌體，在96孔Maxisorb微滴定板(NUNC，Denmark)中、以人纖溶酶原為抗原通過(guò)淘選進(jìn)行的選擇試驗(yàn)中，選用了含有從M13K07輔助噬菌體感染后利用噬菌粒pPhtCTLD(參見(jiàn)實(shí)施例1)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TGl培養(yǎng)物中分離的PhtCTLD噬菌體與從M13K07輔助噬菌體感染后利用噬菌粒pPhtCPB轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中分離的噬菌體的混合物，其中這兩種噬菌體的比率分別為1∶10和1∶105。通過(guò)將具有適當(dāng)限制性酶突出末端序列的雙鏈寡核苷酸(SEQ ID NO55)連接到經(jīng)KpnI和MunI限制性消化的pPhtCTLD噬菌粒DNA中，構(gòu)建了pPhtCPB噬菌粒。由于翻譯終止密碼子被導(dǎo)入到生成的pPhtCPB噬菌粒(SEQ IDNO56)的CTLD編碼區(qū)，所以因利用輔助噬菌體進(jìn)行感染獲得的pPhtCBP噬菌體僅僅展示野生型M13 gene III蛋白。
利用標(biāo)準(zhǔn)的方法，在96孔微滴定板中進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)單來(lái)講，在每個(gè)孔中，利用溶于100μL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8gNaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，加水至1L，利用NaOH調(diào)節(jié)pH7.4)的3μg人纖溶酶原或100μL PBS(用于分析非特異性結(jié)合)，在4℃包被過(guò)夜，在37℃包被1小時(shí)。利用PBS沖洗一次后，在37℃下利用400μLPBS和3％脫脂乳封閉孔1小時(shí)。封閉完成后，利用PBS和0.1％Tween20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗三次，然后向其中添加懸浮在100μLPBS、3％脫脂乳中的噬菌體。使噬菌體在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的結(jié)合，然后利用PBS、Tween 20沖洗3次和利用PBS沖洗3次。室溫下，通過(guò)100ul(1mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液)進(jìn)行胰蛋白酶消化30min來(lái)從每個(gè)孔中洗脫結(jié)合的噬菌體，并利用洗脫的噬菌體感染指數(shù)增長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后在添加有2％葡萄糖和0.1mg/ml氨芐青霉素的2×TY瓊脂平板上進(jìn)行涂布和滴定。
最開(kāi)始(第一輪)，選用了1012個(gè)PhtCTLD噬菌體(A系列)、1010個(gè)PhtCTLD噬菌體和1011個(gè)PhtCPB噬菌體的混合物(B系列)或106個(gè)PhtCTLD和1011個(gè)PhtCPB噬菌體的混合物(C系列)。隨后(第二輪)，選用了每個(gè)系列中的1011個(gè)噬菌體。表4總結(jié)了這兩輪篩選的結(jié)果。
表4利用淘選和胰蛋白酶洗脫進(jìn)行PhtCTLD和PhtCPB混合物篩選
從第二輪涂布得到的12個(gè)克隆和起始噬菌體混合物涂布得到的5個(gè)克隆中分離了噬菌粒DNA，并確定了CTLD區(qū)的核苷酸序列。PhtCTLD/PhtCPB的起始1/10混合物(B系列)中，1/5鑒定為CTLD序列。起始1/105混合物(C系列)中，所有5個(gè)序列都源自pPhtCPB噬菌粒。第二輪篩選后，從B系列中分析的12個(gè)序列中有9個(gè)序列以及C系列中的所有12個(gè)序列都源自pPhtCTLD噬菌粒。
實(shí)施例8CTLD-噬菌體在纖溶酶原上的模型篩選II淘選后利用0.1M三乙按進(jìn)行洗脫為了證明能夠從一群噬菌體中選擇含源自四柄蛋白的CTLD的噬菌體，在96孔Maxisorb微滴定板(NUNC，Denmark)中、以人纖溶酶原為抗原通過(guò)淘選進(jìn)行的選擇試驗(yàn)中，選用了M13K07輔助噬菌體感染后從噬菌粒pPhtCTLD(參見(jiàn)實(shí)施例1)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TG1培養(yǎng)物中分離的PhtCTLD噬菌體與M13K07輔助噬菌體感染后從噬菌粒pPhtCPB(參見(jiàn)實(shí)施例6)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中分離的噬菌體組成的混合物，其中這兩種噬菌體的比率分別為1∶102和1∶106。
簡(jiǎn)單來(lái)講，在每個(gè)孔中，利用溶于100μL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2gKH2PO4，8g NaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，加水至1L，利用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4)的3μg人纖溶酶原或100μL PBS(用于非特異性結(jié)合分析)在4℃包被過(guò)夜，在37℃包被1小時(shí)。利用PBS沖洗一次后，在37℃下利用400μL PBS和3％脫脂乳封閉孔1小時(shí)。封閉完成后，利用PBS和0.1％Tween 20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗三次，然后向其中添加懸浮在100μL PBS、3％脫脂乳中的噬菌體。使噬菌體在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的結(jié)合，然后在利用PBS、Tween 20沖洗15次，利用PBS沖洗15次。室溫下，通過(guò)100ul 0.1M三乙胺從每個(gè)孔中洗脫結(jié)合的噬菌體，為時(shí)10分鐘，經(jīng)0.5vol.1M Tris-HCl pH7.4中和后，利用洗脫的噬菌體感染指數(shù)增長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后在添加有2％葡萄糖和0.1mg/ml氨芐青霉素的2×TY瓊脂平板上進(jìn)行涂布和滴定。
最開(kāi)始(第一輪)，選用了1012個(gè)PhtCTLD噬菌體(A系列)、109個(gè)PhtCTLD噬菌體和1011個(gè)PhtCPB噬菌體的混合物(B系列)或105個(gè)PhtCTLD和1011個(gè)PhtCPB噬菌體的混合物(C系列)。隨后(第二輪)，選用了每個(gè)系列中的1011個(gè)噬菌體。表5總結(jié)了這兩輪篩選的結(jié)果。
表5通過(guò)三乙胺淘選洗脫篩選PhtCTLD和PhtCPB混合物
n.d.＝未測(cè)利用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)從第二輪篩選得到的A和B系列的噬菌體混合物，并利用ELISA-type檢驗(yàn)分析其與纖溶酶原的結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)講，在每個(gè)孔中，利用溶于100μL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8gNaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，加水至1L，利用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4)的3μg纖溶酶原或100μL PBS(用于非特異性結(jié)合分析)在4℃下包被過(guò)夜，在37℃下包被1小時(shí)。利用PBS沖洗一次后，在37℃下利用400μL PBS和3％脫脂乳封閉孔1小時(shí)。封閉完成后，利用PBS和0.1％Tween 20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗一次，然后向其中添加懸浮在100μL PBS、3％脫脂乳中的噬菌體。使噬菌體混合物在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的結(jié)合，然后利用PBS、Tween 20沖洗3次，利用PBS沖洗3次。沖洗完成后，向每個(gè)孔中添加溶于PBS、3％脫脂乳的50μL 1∶5000稀釋的綴合HRP的抗-gene VIII抗體(Amersham Pharmacia Biotech)并在37℃下孵育1小時(shí)。在與“第二”抗體結(jié)合后，每孔利用PBS、Tween 20沖洗3次，利用PBS沖洗3次，隨后向其中添加50μL TMB底物(DAKO-TMB One-Step Substrate System，代碼S1600，DAKO，Denmark)。反應(yīng)進(jìn)行20min，隨后利用0.5vol.0.5M H2SO4使其終止，并進(jìn)行分析。ELISA分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了此兩個(gè)系列中噬菌體與纖溶酶原特異性結(jié)合(圖28)。
實(shí)施例9從Phtlec-lb002文庫(kù)中篩選與母雞卵白溶菌酶結(jié)合的噬菌體在利用標(biāo)準(zhǔn)方法、涉及系列淘選、用以篩選與母雞卵白溶菌酶結(jié)合的噬菌體的試驗(yàn)中，應(yīng)用了源自Phtlec-lb002文庫(kù)(參見(jiàn)實(shí)施例4)但大小約為原始文庫(kù)的250倍的1.2×1012個(gè)噬菌體。
簡(jiǎn)單來(lái)講，利用溶于1mL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8gNaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，添水至1L，利用NaOH調(diào)至pH7.4)的30μg母雞卵白溶菌酶或1mL PBS(用于非特異性結(jié)合分析)分別在4℃包被Maxisorb immunotubes(NUNC，Denmark)過(guò)夜和37℃下包被1小時(shí)。利用PBS沖洗一次后，在37℃下向試管中注入PBS和3％脫脂乳并封閉1小時(shí)。封閉完成后，利用PBS和0.1％Tween 20將管沖洗一次，利用PBS沖洗3次，然后向其中添加懸浮在1ml PBS、3％脫脂乳中的噬菌體。使噬菌體在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的結(jié)合，然后在利用PBS、Tween 20沖洗6次和利用PBS沖洗6次。室溫下，通過(guò)用1ml 0.1M三乙胺從每個(gè)孔中洗脫結(jié)合的噬菌體，為時(shí)10分鐘，經(jīng)1MTris-HCl pH7.4中和后，利用洗脫的噬菌體感染指數(shù)增長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后在添加有2％葡萄糖和0.1mg/ml氨芐青霉素的2×TY瓊脂平板上進(jìn)行涂布和滴定。在隨后的多輪篩選中，淘選步驟應(yīng)用了源自在經(jīng)從溶菌酶包被的試管洗脫下的噬菌體感染后涂布的克隆培養(yǎng)物中的約1012個(gè)噬菌體。然而，通過(guò)在噬菌體淘選后將沖洗次數(shù)由6次增至10次，提高了結(jié)合的嚴(yán)格性。
表7展示了篩選步驟的結(jié)果表7通過(guò)淘選從Phtlec-lb002文庫(kù)中選擇結(jié)合溶菌酶的噬菌體
n.a.＝不適用為了對(duì)結(jié)合特異性進(jìn)行分析，利用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)從第3輪篩選得到的12個(gè)克隆中的噬菌體，并利用ELISA-type檢驗(yàn)分析其與母雞卵白溶菌酶和人β2-微球蛋白的結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)講，在每個(gè)孔中，利用溶于100μL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8g NaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，加水至1L，利用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4)的3μg母雞卵白溶菌酶或3μg人β2-微球蛋白或100μL PBS(用于非特異性結(jié)合分析)在4℃下包被過(guò)夜和在37℃下包被1小時(shí)。利用PBS沖洗一次后，在37℃下利用400μL PBS和3％脫脂乳封閉孔1小時(shí)。封閉完成后，利用PBS和0.1％Tween 20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗3次，然后向其中添加懸浮在100μL PBS、3％脫脂乳中的噬菌體。使噬菌體在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的結(jié)合，然后利用PBS、Tween 20沖洗3次和利用PBS沖洗3次。沖洗完成后，向每個(gè)孔中添加溶于PBS、3％脫脂乳的50μL1∶5000稀釋的綴合HRP的抗-gene VIII抗體(Amersham PharmaciaBiotech)并在37℃下孵育1小時(shí)。在與“第二”抗體結(jié)合后，每孔利用PBS、Tween 20沖洗3次，利用PBS沖洗3次，隨后向其中添加50μL TMB底物(DAKO-TMB One-Step Substrate System，codeS1600，DAKO，Denmark)。反應(yīng)進(jìn)行20min，隨后利用0.5M H2SO4使其終止。
圖29中總結(jié)的結(jié)果顯示了對(duì)溶菌酶有相對(duì)弱但特異性的結(jié)合。
實(shí)施例10構(gòu)建源自大白鼠甘露糖結(jié)合蛋白CTLD(r-MBP)的噬菌粒(pPrMBP)和源自人肺表面活性劑蛋白D CTLD(h-SP-D)的噬菌粒(pPhSP-D)利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從大白鼠肝臟分離的cDNA擴(kuò)增得到的、并經(jīng)Sfi I和Not I限制性消化的DNA區(qū)段(Drickamer，K.，et al.，J.Biol.Chem.1987，262(6)2582-2589)(擴(kuò)增中利用寡核苷酸引物SfiMBP 5′-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCAAACAAGTTGCATGCCTTCTCC-3′[SEQ ID NO62]和NotMBP5′-GCACTCCTGCGGCCGCGGCTGGGAACTCGCAGAC-3′[SEQID NO63])連接到Amersham Pharmacia Biotech(代碼27-9401-01)提供的預(yù)先經(jīng)Sfi I和Not I切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pPrMBP。圖31展示了獲得的pPrMBP的略圖，并給出了PrMBP的核苷酸序列(SEQ ID NO58)。圖30展示了由PrMBP插入?yún)^(qū)段編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO59)。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將從人肺分離的cDNA擴(kuò)增得到的、并經(jīng)SfiI和Not I限制性消化的DNA區(qū)段(Lu，J.，et al.，Biochem J.1992jun15；284795-802)(擴(kuò)增中利用寡核苷酸引物SfiSP-D5′-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCAAAGAAAGTTGAGCTCTTCCC-3′[SEQ ID NO64]和NotSP-D5′-GCACTCCTGCGGCCGCGAACTCGCAGACCACAAGAC-3′[SEQ ID NO65])連接到Amersham Pharmacia Biotech(代碼27-9401-01)提供的預(yù)先經(jīng)Sfi I和Not I切割的載體pCANTAB 5E中，構(gòu)建了噬菌粒pPhSP-D。圖33展示了獲得的pPhSP-D的略圖，并給出了PhSP-D的核苷酸序列(SEQ ID NO60)。圖32展示了由PhSP-D插入?yún)^(qū)段編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO61)。
實(shí)施例11構(gòu)建噬菌體文庫(kù)PrMBP-lb001通過(guò)將20μg經(jīng)SfiI和NotI限制性消化的pPrMBP噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)與編碼適當(dāng)隨機(jī)化的環(huán)1和環(huán)4區(qū)的10ug經(jīng)SfiI和NotI限制性消化的DNA區(qū)段群連接，構(gòu)建了含有對(duì)應(yīng)于PrMBPCTLD(SEQ ID NO59)位點(diǎn)71-73或70-76(環(huán)1)及97-101或100-101(環(huán)4)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)PrMBP-lb001。將組合3個(gè)環(huán)1DNA區(qū)段之一與3個(gè)環(huán)4 DNA區(qū)段之一的9個(gè)組裝反應(yīng)為模板，以寡核苷酸Sfi-標(biāo)記5′-CGGCTGAGCGGCCCAGC-3′(SEQ ID NO74)和Not-標(biāo)記5′-GCACTCCTGCGGCCGCG-3′(SEQ ID NO75)為引物，利用標(biāo)準(zhǔn)方法，擴(kuò)增得到了DNA區(qū)段群。以pPrMBP噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)為模板，以寡核苷酸MBPloop1a fo(SEQ ID NO66)、MBPloop1b fo(SEQ ID NO67)或MBPloop1c fo(SEQ ID NO68)以及SfiMBP(SEQ ID NO62)為引物，在第一次PCR反應(yīng)中擴(kuò)增三個(gè)環(huán)1區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段，并利用Sfi-tag(SEQ ID NO74)和MBPloop1-tagfo(SEQ ID NO69)進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)以進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。以pPrMBP噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)為模板，以寡核苷酸MBPloop4arev(SEQ ID NO71)、MBPloop4b rev(SEQ ID NO72)或MBPloop4crev(SEQ ID NO73)以及NotMBP(SEQ ID NO63)為引物，利用標(biāo)準(zhǔn)方法，在第一次PCR反應(yīng)中擴(kuò)增3個(gè)DNA環(huán)4區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段，并利用MBPloop4-tag rev(SEQ ID NO70)和Not-tag(SEQ ID NO63)進(jìn)行第二次PCR，以進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。在寡核苷酸序列中，N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各為50％的混合物，編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1細(xì)胞涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
實(shí)施例12構(gòu)建噬菌體文庫(kù)PhSP-D-lb001通過(guò)將20μg經(jīng)SfiI和NotI限制性消化的pPhSP-D噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)與編碼適當(dāng)隨機(jī)化的環(huán)1和環(huán)4區(qū)的10ug經(jīng)SfiI和NotI限制性消化的DNA區(qū)段群連接，構(gòu)建了含有對(duì)應(yīng)于PhSP-DCTLD插入?yún)^(qū)段(SEQ ID NO61)位點(diǎn)74-76或73-79(環(huán)1)及100-104或103-104(環(huán)4)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)PhSP-D-lb001。將組合3個(gè)環(huán)1 DNA區(qū)段之一與3個(gè)環(huán)4 DNA區(qū)段之一的9個(gè)組裝反應(yīng)為模板，以寡核苷酸Sfi-標(biāo)記5′-CGGCTGAGCGGCCCAGC-3′(SEQID NO74)和Not-標(biāo)記5′-GCACTCCTGCGGCCGCG-3′(SEQ IDNO75)為引物，利用標(biāo)準(zhǔn)方法，擴(kuò)增DNA區(qū)段群。以pPhSP-D噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)為模板，以寡核苷酸Sp-dloop1a fo(SEQ IDNO76)、Sp-dloop1b fo(SEQ ID NO77)或Sp-dloop1c fo(SEQ IDNO78)以及SfiSP-D(SEQ ID NO64)為引物，在第一次PCR反應(yīng)中擴(kuò)增得到了三個(gè)環(huán)1區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段，并利用Sfi-tag(SEQ IDNO74)和Sp-dloop1-tag fo(SEQ ID NO79)為引物在PCR中進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。以pPhSP-D噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例10)為模板，以寡核苷酸Sp-dloop4a rev(SEQ ID NO81)、Sp-dloop4b rev(SEQ ID NO82)或Sp-dloop4c rev(SEQ ID NO83)以及NotSP-D(SEQ ID NO65)為引物，利用標(biāo)準(zhǔn)方法在第一次PCR反應(yīng)中擴(kuò)增3個(gè)DNA環(huán)4區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段，并以Sp-dloop4-tag rev(SEQ ID NO80)和Not-tag(SEQ IDNO75)為引物進(jìn)行PCR以進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。在寡核苷酸序列中，N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各為50％的混合物，編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1細(xì)胞涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
實(shí)施例13構(gòu)建噬菌體文庫(kù)PhtCTLD-lb004本實(shí)施例中應(yīng)用的所有寡核苷酸皆由DNA Technology(Aarhus，Denmark)提供。
通過(guò)將20μg經(jīng)KpnI和MunI限制性消化的pPhtCTLD噬菌粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例1)與編碼適當(dāng)隨機(jī)化的環(huán)3和環(huán)5區(qū)的10ug經(jīng)KpnI和MunI限制性消化的DNA區(qū)段群連接，構(gòu)建了含有相應(yīng)于PhtCTLD(SEQ ID NO15)位點(diǎn)97-102或98-101(環(huán)3)以及位點(diǎn)116-122或118-120(環(huán)5)的隨機(jī)氨基酸殘基的噬菌體文庫(kù)PhtCTLD-lb004。從組合3個(gè)環(huán)5 DNA區(qū)段中的每個(gè)區(qū)段與3個(gè)環(huán)3 DNA區(qū)段中的每個(gè)DNA區(qū)段的9個(gè)第一次PCR反應(yīng)物中擴(kuò)增得到了DNA區(qū)段群。這些區(qū)段是以寡核苷酸loop3a(SEQ ID NO84)、loop3b(SEQ ID NO85)或loop3c(SEQ ID NO86)為模板、以loop5a(SEQ ID NO87)、loop5b(SEQ ID NO88)或loop5c(SEQ ID NO89)及l(fā)oop3-4rev(SEQID NO91)為引物進(jìn)行擴(kuò)增得到的。以第一次PCT產(chǎn)物為模板、以寡核苷酸loop3-4rev(SEQ ID NO91)和loop3-4-5tag fo(SEQ ID NO90)為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)這些DNA區(qū)段進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。所有PCR反應(yīng)都是利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的。
在寡核苷酸序列中，N表示核苷酸T、C、G和A分別各占25％的混合物，S表示C和G各為50％的混合物，編碼適當(dāng)隨機(jī)化的核苷酸序列。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)電穿孔方式利用連接混合物轉(zhuǎn)化所謂的電感受態(tài)大腸桿菌TG-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，將大腸桿菌TG-1細(xì)胞涂布到含有0.2mg氨芐青霉素/mL和2％葡萄糖的2×TY-瓊脂平板上并在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
生成的文庫(kù)PhtCTLD-lb004的大小確定為7×109個(gè)克隆。從文庫(kù)中挑選16個(gè)克隆并分離噬菌粒DNA。確定出環(huán)區(qū)的核苷酸序列(DNATechnology，Aarhus，Denmark)。發(fā)現(xiàn)13個(gè)克隆含有正確的環(huán)插入?yún)^(qū)段，而3個(gè)克隆在該區(qū)域含有移框突變。
實(shí)施例14篩選與固定在人血清白蛋白上的A型血糖基部分結(jié)合的Phtlec-噬菌體和PhtCTLD-噬菌體在設(shè)計(jì)為利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)在96孔Maxisorb微滴定板(NUNC，Denmark)中淘選而篩選對(duì)固定在人血清白蛋白A-HA上的A型血糖基部分具有特定親和力的、源自Phtlec-和PhtCTLD的噬菌體的試驗(yàn)中，應(yīng)用了通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從Phtlec-lb001和Phtlec-lb002(參見(jiàn)實(shí)施例4)文庫(kù)的甘油原液培養(yǎng)的噬菌體從PhtCTLD-lb003(參見(jiàn)實(shí)施例5)文庫(kù)的甘油原液培養(yǎng)的噬菌體。
最初，利用0.3vol.20％聚乙二醇6000(PEG)溶液和2.5M NaCl溶液中對(duì)噬菌體上清液進(jìn)行沉淀，并將沉淀物重新懸浮在TE-緩沖液(10mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA)中。在大腸桿菌TG-1細(xì)胞上進(jìn)行滴定后，將源自Phtlec-lb001和-lb002的噬菌體以1∶1的比率混合，并在2×TY培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)至5×1012pfu/mL，并在2×TY培養(yǎng)基中將源自PhtCTLD-lb003文庫(kù)(#4)的噬菌體調(diào)節(jié)至2.5×1012pfu/mL。
進(jìn)行第一輪淘選前，在三個(gè)孔的每個(gè)孔中，用固定化在含于100ulPBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8g NaCl，1.44g Na2HPO4，2H20，添加水至1L，利用NaOH調(diào)節(jié)pH7.4)中的人血清白蛋白A-HA(Glycorex AB，Lund，Sweden)上的1ug人A型血三糖抗原分別在4℃下包被過(guò)夜和在室溫下包被1小時(shí)。利用PBS沖洗1次后，在室溫下利用300μL PBS和3％脫脂乳對(duì)所有的孔進(jìn)行為時(shí)1小時(shí)的封閉。封閉后，利用PBS和0.1％Tween 20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗三次，然后向其中添加50ul噬菌體懸浮液和50μL PBS、6％脫脂乳的混合物。使噬菌體在室溫下進(jìn)行2小時(shí)的結(jié)合，然后利用PBS、Tween 20沖洗8次和利用PBS沖洗8次。室溫下，通過(guò)100ul(1mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液)胰蛋白酶消化30min來(lái)從每個(gè)孔中洗脫結(jié)合的噬菌體，并利用洗脫的噬菌體感染指數(shù)增長(zhǎng)的大腸桿菌TG1細(xì)胞，然后在添加有2％葡萄糖和0.1mg/ml氨芐青霉素的2×TY瓊脂平板上進(jìn)行涂布和滴定。
在第二輪篩選中，將150μL第一輪篩選得到的集落的粗噬菌體上清液與150μL PBS、6％脫脂乳混合，并如前所述，利用在三個(gè)A-HA包被的孔的每個(gè)孔中淘選分配100ul混合物。通過(guò)將沖洗步驟從16次增至32次而提高結(jié)合的嚴(yán)格性。也利用300μL噬菌體混合物在沒(méi)有接受任何抗原作為對(duì)照的三個(gè)孔中進(jìn)行淘選。
在第三輪篩選中，將150μL第2輪篩選得到的集落的粗噬菌體上清液與150μLPBS、6％脫脂乳混合，并如前所述，利用其在三個(gè)A-HA包被的孔的每個(gè)孔中淘選分配100ul混合物。沖洗次數(shù)仍為32次。也利用300μL噬菌體混合物在沒(méi)有接受任何抗原作為對(duì)照的三個(gè)孔中進(jìn)行淘選。
表8對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)。
表8.通過(guò)淘選和胰蛋白酶消化洗脫，選擇與A-HA結(jié)合的Phtlec噬菌體(#1)和PhtCTLD噬菌體(#4)
n.a.＝不適用從#1和#4系列各挑取48個(gè)克隆，置于96孔微量滴定盤(pán)中生長(zhǎng)，并利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)M13K07輔助噬菌體感染制備噬菌體。利用ELISA-type檢驗(yàn)分析96個(gè)噬菌體上清液中的噬菌體對(duì)A-HA抗原的結(jié)合和對(duì)母雞卵白溶菌酶的非特異性結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)講，在每個(gè)孔中，利用溶于100μL PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8g NaCl，1.44gNa2HPO4，2H20，加水至1L，利用NaOH調(diào)至pH7.4)的1μgA-HA或溶于100μL PBS的1μg母雞卵白溶菌酶(用于非特異性結(jié)合分析)在4℃下包被過(guò)夜及在室溫下包被1小時(shí)。利用PBS沖洗1次后，在室溫下利用300μL PBS和3％脫脂乳對(duì)孔進(jìn)行為時(shí)1小時(shí)的封閉。封閉完成后，利用PBS和0.1％ Tween 20將孔沖洗一次，利用PBS沖洗三次，然后向其中添加處于50μL PBS、6％脫脂乳中的50ul噬菌體上清液。使噬菌體混合物在室溫下進(jìn)行2小時(shí)的結(jié)合，然后利用PBS、Tween 20沖洗3次和利用PBS沖洗3次。沖洗完成后，向每個(gè)孔中添加溶于PBS、3％脫脂乳的50μL 1∶5000稀釋的綴合HRP的抗-geneVIII抗體(Amersham Pharmacia Biotech)并在室溫下孵育1小時(shí)。在與“笫二”抗體結(jié)合后，每孔利用PBS、Tween 20沖洗3次，利用PBS沖洗3次，隨后向其中添加50μL TMB底物(DAKO-TMB One-StepSubstrate System，代碼S1600，DAKO，Denmark)。反應(yīng)進(jìn)行20min，隨后利用0.5M H2SO4使其終止，并進(jìn)行分析。ELISA分析結(jié)果展示了兩個(gè)系列中的噬菌體對(duì)A-HA特異性結(jié)合的″陽(yáng)性結(jié)果″(圖34和35)，這是通過(guò)在A-HA上產(chǎn)生的信號(hào)與在溶菌酶產(chǎn)生的信號(hào)之比等于或大于1.5并且具有高于背景的信號(hào)來(lái)判斷的。
從#l系列中檢驗(yàn)得到13個(gè)陽(yáng)性(hits)，而從#4系列中檢驗(yàn)得到28個(gè)陽(yáng)性。
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Etzerodt，M.(1997.).″四柄蛋白，一種三聚體纖溶酶原結(jié)合C型外源凝集″.Prot.Sci.61511-1515Honma，T.，Kuroki，Y.，Tzunezawa，W.，Ogasawara，Y.，Sohma，H.，Voelker，D.R.，and Akino，T.(1997).″谷氨酸185-丙氨酸221的甘露糖結(jié)合蛋白A區(qū)可在不損失任何與脂質(zhì)與多房型棘球囊II型細(xì)胞的相互作用的情況下替代谷氨酸195-苯丙氨酸228的表面活性蛋白A區(qū)″。Biochemistry 367176-7184Huang，W.，Zhang，Z.，and Palzkill，T.(2000).″利用β-內(nèi)酰胺酶抑制性蛋白的噬菌體展示設(shè)計(jì)有效的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑″.J.Biol.Chem.27514964-14968Hufton，S.E.，van Neer，N.，van den Beuken，T.，Desmet，J.，Sablon，E.，and Hoogenboom，H.R.(2000).″可用作產(chǎn)生新穎的結(jié)合配基的蛋白質(zhì)支架的、與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)的抗原4的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用″.FEBS Letters 475225-231H kansson，K.，Lim，N.K.，Hoppe，H-J.，and Reid，K.B.M.(1999).″三聚體alpha-螺旋卷曲螺旋和人肺表面活性蛋白D的三個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)″.Structure Folding and Design 7255-264Iobst，S.T.，Wormald，M.R.，Weis，W.I.，Dwek，R.A.，andDrickamer，K.(1994)?！逄桥浠cCa(2+)依賴(lài)型動(dòng)物凝集素的結(jié)合。I.利用定點(diǎn)誘變和NMR進(jìn)行甘露糖結(jié)合分析″.J.Biol.Chem.26915505-15511Iobst，S.T.and Drickamer，K.(1994).″糖配基與Ca(2+)依賴(lài)型動(dòng)物凝集素的結(jié)合。II.利用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生高親和性半乳糖結(jié)合″.J.Biol.Chem.26915512-15519Iobst，S.T.and Drickamer，K.(1996).″對(duì)大白鼠肝臟和巨噬細(xì)胞唾液酸糖蛋白受體的糖識(shí)別域的選擇性糖基結(jié)合″.J.Biol.Chem.2716686-6693Jaquinod，M.，Holtet，T.L.，Etzerodt，M.，Clemmensen，I.，Th gersen，H.C.，and Roepstorff，P.(1999).″人四柄蛋白中的翻譯后修飾和遺傳變異的質(zhì)譜定性″.Biol.Chem.3801307-1314Kastrup，J.S.，Nielsen，B.B.，Rasmussen，H.，Holtet，T.L.，Graversen，J.H.，Etzerodt，M.，Th gersen，H.C.，and Larsen，I.K.(1998).″人四柄蛋白的C型凝集素糖識(shí)別域的結(jié)構(gòu)″.Acta.Cryst.D 54757-766Kogan，T.P.，Revelle，B.M.，Tapp，S.，Scott，D.，and Beck，P.J.(1995).″單氨基酸殘基可確定內(nèi)皮細(xì)胞選擇素的配基特異性″.J.Biol.Chem.27014047-14055Kolatkar，A.R.，Leung，A.K.，Isecke，R.，Brossmer，R.，Drickamer，K.，and Weis，W.I.(1998).″N-乙酰半乳糖胺對(duì)C型動(dòng)物凝集素糖識(shí)別域的結(jié)合機(jī)理″.J.Biol.Chem.27319502-19508Lorentsen，R.H.，Graversen，J.H.，Caterer，N.R.，Th gersen，H.C.，and Etzerodt，M.(2000).″四柄蛋白中的肝素結(jié)合位點(diǎn)定位在N-末端區(qū)中并且其結(jié)合與糖識(shí)別域無(wú)關(guān)″.Biochem.J.34783-87Marks，J.D.，Hoogenboom，H.R.，Griffiths，A.D.，and Winter，G.(1992).″絲狀噬菌體上的蛋白的分子進(jìn)化。模擬免疫系統(tǒng)的策略″.J.Biol.Chem.26716007-16010Mann K，Weiss IM，Andre S，Gabius HJ，F(xiàn)ritz M.(2000).″abalone(Haliotis laevigata)nacre protein perlucin的氨基酸序列。具有半乳糖/甘露糖特異性的功能性C型凝集素結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)″.Eur.J.Biochem.2675257-5264McCafferty，J.，Jackson，R.H.，and Chiswell，D.J.(1991).″噬菌體酶細(xì)菌噬菌體表面上的功能性堿性磷酸酶的表達(dá)和親和層析″.Prot.Eng.4955-961McCormack，F(xiàn).X.，Kuroki，Y.，Stewart，J.J.，Mason，R.J.，andVoelker，D.R.(1994).″表面活性劑蛋白A氨基酸Glu195和Arg197對(duì)受體結(jié)合、磷脂聚集、分泌調(diào)節(jié)以及通過(guò)II型細(xì)胞進(jìn)行的促進(jìn)的磷脂吸收是必需的″.J.Biol.Chem.26929801-29807McCormack，F(xiàn).X.，F(xiàn)esta，A.L.，Andrews，R.P.，Linke，M.，andWalzer，P.D.(1997).″表面活性劑蛋白A的糖識(shí)別域介導(dǎo)了對(duì)卡氏肺囊蟲(chóng)的主要的表面糖蛋白的結(jié)合″.Biochemistry 368092-8099Meier，M.，Bider，M.D.，Malashkevich，V.N.，Spiess，M.，andBurkhard，P.(2000).″唾液酸糖蛋白受體H1亞單位的糖識(shí)別域的晶體結(jié)構(gòu)″.J.Mol.Biol.300857-865Mikawa，Y.G.，Maruyama，I.N.，and Brenner，S.(1996).″細(xì)菌噬菌體lambda頭上的蛋白的表面展示″.J.Mol.Biol.26221-30Mio H，Kagami N，Yokokawa S，Kawai H，Nakagawa S，TakeuchiK，Sekine S，Hiraoka A.(1998).″人、小鼠、大白鼠完全長(zhǎng)度干細(xì)胞生長(zhǎng)因子這一C型凝集素大家族中的新成員的cDNA的分離和定性″.Biochem.Biophys.Res.Commun.249124-130Mizuno，H.，F(xiàn)ujimoto，Z.，Koizumi，M.，Kano，H.，Atoda，H.，andMorita，T.(1997).″凝固輔助因子IX/X-結(jié)合蛋白這一C型凝集素結(jié)構(gòu)域異二聚體的結(jié)構(gòu)″.Nat.Struc.Biol.4438-441Ng，K.K.，Park-Snyder，S.，and Weis，W.I.(1998a).″C型甘露糖結(jié)合蛋白中的Ca2+-依賴(lài)型結(jié)構(gòu)變化″.Biochemistry 3717965-17976
Ng，K.K.and Weis，W.I.(1998b).″C型甘露糖結(jié)合蛋白中脯氨酰肽鍵異構(gòu)化作用與Ca2+結(jié)合的偶聯(lián)″.Biochemistry 3717977-17989Nielsen，B.B.，Kastrup，J.S.，Rasmussen，H.，Holtet，T.L.，Graversen，J.H.，Etzerodt，M.，Th gersen，H.C.，and Larsen，I.K.(1997).″具有α-螺旋卷曲螺旋的三聚體結(jié)合蛋白四柄蛋白的晶體結(jié)構(gòu)″.FEBS Letters 412388-396Nissim A.，Hoogenboom，H.R.，Tomlinson，I.M.，F(xiàn)lynn，G.，Midgley，C.，Lane，D.，and Winter，G.(1994).″′單pot′噬菌體展示文庫(kù)中的抗體區(qū)段作為免疫化學(xué)試劑″.EMBO J.13692-698Ogasawara，Y.and Voelker，D.R.(1995).″工程操作到表面活性劑蛋白D中的改變的糖識(shí)別域揭示了對(duì)磷脂酰肌醇和葡糖苷鞘氨醇的不同結(jié)合機(jī)理″.J.Biol.Chem.27014725-14732Ohtani，K.，Suzuki，Y.，Eda，S.，Takao，K.，Kase，T.，Yamazaki，H.，Shimada，T.，Keshi，H.，Sakai，Y.，F(xiàn)ukuoh，A.，Sakamoto，T.，andWakamiya，N.(1999).，″源自肝臟的新穎的人膠原凝集素(CL-L1)的分子克隆″.J.Biol.Chem.27413681-13689Pattanajitvilai，S.，Kuroki，Y.，Tsunezawa，W.，McCormack，F(xiàn).X.，and Voelker，D.R.(1998).″表面活性劑蛋白A的Argl97的突變分析。His197產(chǎn)生了特異性脂吸收缺陷″.J.Biol.Chem.2735702-5707Poget，S.F.，Legge，G.B.，Proctor，M.R.，Butler，P.J.，Bycroft，M.，and Williams，R.L.(1999).″源自與D-半乳糖復(fù)合的Polyandrocarpamisakiensis的有被膜的C-型凝集素的結(jié)構(gòu)″.J.Mol.Biol.290867-879Revelle，B.M.，Scott，D.，Kogan，T.P.，Zheng，J.，and Beck，P.J.(1996).，″P-選擇蛋白-sialyl LewisX結(jié)合相互作用的結(jié)構(gòu)功能分析。配基結(jié)合特異性的誘變變更″.J.Biol.Chem.2714289-4297Sano，H.，Kuroki，Y.，Honma，T.，Ogasawara，Y.，Sohma，H.，Voelker，D.R.，and Akino，T.(1998).″嵌合蛋白分析表明大白鼠肺膠原凝集素糖識(shí)別域中的區(qū)是與磷酸脂、糖脂和多房型棘球囊II細(xì)胞三相互作用所必需的″J.Biol.Chem.2734783-4789
Schaffitzel，C.，Hanes，J.，Jermutus，L.，and Plücktun，A.(1999).”核糖體展示文庫(kù)中的抗體的體外篩選與評(píng)估方法″.J.Immunol.Methods 231119-135Sheriff，S.，Chang，C.Y.，and Ezekowitz，R.A.(1994).″通過(guò)三α-螺旋卷曲螺旋進(jìn)行的人甘露糖結(jié)合蛋白糖識(shí)別域三聚化作用″.Nat.Struc.Biol.1789-794S rensen，C.B.，Berglund，L.，and Petersen，T.E.(1995).″編碼鼠四柄蛋白的cDNA的克隆″.Gene 152243-245Torgersen，D.，Mullin，N.P.，and Drickamer，K.(1998).″利用選擇蛋白/甘露糖結(jié)合蛋白嵌合體分析的對(duì)E-和P-選擇蛋白的配基結(jié)合機(jī)理″.J.Biol.Chem.2736254-6261Tormo，J.，Natarajan，K.，Margulies，D.H.，and Mariuzza，R.A.(1999).″結(jié)合到其MHC I配基上的類(lèi)凝集素天然殺傷細(xì)胞的晶體結(jié)構(gòu)”.Nature 402623-631Tsunezawa，W.，Sano，H.，Sohma，H.，McCormack，F(xiàn).X.，Voelker，D.R.，and Kuroki，Y.(1998).″表面活性劑蛋白A的定點(diǎn)誘變揭示了通過(guò)II型肺泡細(xì)胞進(jìn)行的脂聚集的解離和脂吸收″.Biochim.Biophys.Acta 1387433-446Weis，W.I.，Kahn，R.，F(xiàn)ourme，R.，Drickamer，K.，andHendrickson，W.A.(1991).″利用MAD phasing確定的大白鼠甘露糖結(jié)合蛋白的鈣依賴(lài)型凝集素結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)″.Science 2541608-1615Weis，W.I.，and Drickamer，K.(1996).″凝集素-糖識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)″.Annu.Rev.Biochem.65441-473Whitehorn，E.A.，Tate，E.，Yanofsky，S.D.，Kochersperger，L.，Davis A.，Mortensen，R.B.，Yonkovic，S.，Bell，K.，Dower，W.J.，andBarrett，R.W.(1995).″“標(biāo)記的”細(xì)胞表面受體的表達(dá)和應(yīng)用的一般方法″.Bio/Technology 131215-1219Wragg，S.and Drickamer，K.(1999).″氨基酸殘基鑒定確定了胞飲作用中配基對(duì)唾液酸糖蛋白受體結(jié)合的pH依賴(lài)性″.J.Biol.Chem.27435400-35406Zhang，H.，Robison，B.，Thorgaard，G.H.，and Ristow，S.S.(2000).″源自虹鱒魚(yú)(Oncorhynchos Mykiss)純合子克隆的魚(yú)C型凝集素基因的克隆、圖譜分析和基因組組織″.Biochim.et Biophys.Acta 149414-22
序列表<110>Borean Pharma A/S<120>具有C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域的支架結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)<130>P200001100 WO JNy<140><141><150>DK PA 2000 01872<151>2000-12-13<160>91<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>571<212>DNA<213>人類(lèi)<220><221>CDS<222>(1)..(564)<223>編碼FX-htlec的插入片段<400>1gga tcc atc gag ggt agg ggc gag cca cca acc cag aag ccc aag aag48Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys1 5 10 15att gta aat gcc aag aaa gat gtt gtg aac aca aag atg ttt gag gag96Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu20 25 30ctc aag agc cgt ctg gac acc ctg gcc cag gag gtg gcc ctg ctg aag144Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys35 40 45gag cag cag gcc ctg cag acg gtc gtc ctg aag ggg acc aag gtg cac192Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Val Leu Lys Gly Thr Lys Val His50 55 60atg aaa gtc ttt ctg gcc ttc acc cag acg aag acc ttc cac gag gcc240Met Lys Val Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala65 70 75 80agc gag gac tgc atc tcg cgc ggg ggc acc ctg agc acc cct cag act288Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr85 90 95ggc tcg gag aac gac gcc ctg tat gag tac ctg cgc cag agc gtg ggc336Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly100 105 110aac gag gcc gag atc tgg ctg ggc ctc aac gac atg gcg gcc gag ggc384Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Asp Met Ala Ala Glu Gly115 120 125acc tgg gtg gac atg acc ggt acc cgc atc gcc tac aag aac tgg gag432Thr Trp Val Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu130 135 140act gag atc acc gcg caa ccc gat ggc ggc aag acc gag aac tgc gcg480Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro Asp Gly Gly Lys Thr Glu Asn Cys Ala145 150 155 160gtc ctg tca ggc gcg gcc aac ggc aag tgg ttc gac aag cgc tgc cgc528Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg165 170 175gat caa ttg ccc tac atc tgc cag ttc ggg atc gtg taagctt571Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val180 185<210>2<211>188<212>PRT<213>人類(lèi)<400>2Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Glu Pro Pro Thr Gln 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49<210>63<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>63gcactcctgc ggccgcggct gggaactcgc agac 34<210>64<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>64cggctgagcg gcccagccgg ccatggccaa gaaagttgag ctcttccc48<210>65<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>65gcactcctgc ggccgcgaac tcgcagacca caagac36<210>66<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>66gccaccggtg acgtagatga attggccttc snnsnnsnns nnsnngtccg tgatgcctag 60gaagg 65<210>67<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>67gccaccggtg acgtagatga attggccttc snnsnnsnns nnsnnsnngt ccgtgatgcc 60taggaagg 68<210>68<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>68gccaccggtg acgtagatga asnnsnnsnn snnsnnsnns nncgtgatgc ctaggaaggc 60ag 62<210>69<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>69ccagttgctg tatttcaggc tgccaccggt gacgtagatg 40<210>70<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>70gcctgaaata cagcaactgg aagaaagacg aacc 34<210>71<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>71ctggaagaaa gacgaaccga 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39<210>80<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>80gggccccagg ggagcccaac gatgatggcn nsnnsnnsnn snnsgaggac tgtgtggaga 60tcttc 65<210>81<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>81gggccccagg ggagcccaac gatgatggcn nsnnsnnsnn snnsnnsgag gactgtgtgg 60agatcttc 68<210>82<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>82gggccccagg ggagcccaac gatgatggcn nsnnsnnsnn snnsnnsgag gactgtgtgg 60agatcttc 68<210>83<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>83gggccccagg ggagcccaac nnsnnsnnsn nsnnsgagga ctgtgtggag atcttc 56<210>84<211>77<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>84gcatcgccta caagaactgg nnsnnsnnsn nsnnsnnsca acccgatggc ggcaagaccg 60agaactgcgc ggtcctg77<210>85<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>85gcatcgccta caagaactgg gagnnsnnsn nsnnsnnsnn sgcgcaaccc gatggcggca 60agaccgagaa ctgcgcggtc ctg 83<210>86<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>86gcatcgccta caagaactgg gagnnsnnsn nsnnsnnsgc gcaacccgat ggcggcaaga 60ccgagaactg cgcggtcctg 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1.具有C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)支架結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含有模型CTLD的變體，其中α-螺旋和β-鏈以及連接區(qū)段保守到CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本維持不變而僅僅通過(guò)氨基酸替代、缺失、插入或它們的結(jié)合來(lái)進(jìn)行環(huán)區(qū)改變的程度，前提為該蛋白質(zhì)不是說(shuō)明書(shū)表2中所列的C型類(lèi)凝集素蛋白或C型凝集素的任何已知的CTLD環(huán)衍生物。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述模型CTLD限定為具有與圖1中例示的二級(jí)結(jié)構(gòu)排列相一致的3D結(jié)構(gòu)，其特征為下列主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的順序序列排列的5個(gè)β-鏈和2個(gè)α-螺旋，β-鏈排列在兩個(gè)反向平行β-折疊片中，一個(gè)包含β1和β5，另一個(gè)包含β2、β3和β4，至少兩個(gè)二硫橋，一個(gè)連接α1和β5，一個(gè)連接β3和連接β4與β5的多肽區(qū)段，以及由兩多肽區(qū)段組成的環(huán)區(qū)，環(huán)區(qū)段A(LSA)連接β2和β3，一般包括15-70個(gè)，或更為少見(jiàn)地包括5-14個(gè)氨基酸殘基，環(huán)區(qū)段B(LSB)連接β3和β4，一般包括5-12個(gè)，或更為少見(jiàn)地包括2-4個(gè)氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中模型CTLD限定為展示與以前認(rèn)定的CTLD族成員具有序列相似性，表現(xiàn)為有至少22％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少30％的氨基酸序列同一性，并且含有對(duì)確定保守的二硫橋拓?fù)鋵W(xué)所必需的半胱氨酸殘基(也即CysI，CysII，CysIII和CysIV)，其中通過(guò)與圖1中展示的CTLD匯總進(jìn)行序列比對(duì)檢驗(yàn)鑒定出由環(huán)區(qū)及其側(cè)翼β-鏈結(jié)構(gòu)元件，鑒定出β2-和β3-鏈的序列定位，并通過(guò)將這些序列與四殘基共有序列β2cseq和β3cseq及一般定位在相對(duì)于保守的CysIII殘基為-6--2位點(diǎn)、更為少見(jiàn)地定位于-5--2位點(diǎn)的β4鏈區(qū)段、以及與表1中闡明和說(shuō)明書(shū)部分?jǐn)⑹龅?5和-3位點(diǎn)處特征殘基進(jìn)行對(duì)比而提供進(jìn)一步的確證。
4.前述任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其中模型CTLD的α-螺旋和/或β-鏈和/或連接區(qū)段中多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，以及更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基被替代、缺失或插入。
5.前述任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其中在CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變的情況下，因在編碼CTLD的核苷酸序列中導(dǎo)入一或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以促進(jìn)對(duì)部分或所有環(huán)區(qū)的切除以及改變后的氨基酸序列的插入，從而在模型CTLD的β-鏈中進(jìn)行了多達(dá)4個(gè)殘基改變。
6.前述任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其中的模型CTLD為四柄蛋白的CTLD。
7.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中的模型CTLD為人四柄蛋白的CTLD，其包括其單體天然肽序列中的氨基酸殘基59-180。
8.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中的模型CTLD為鼠四柄蛋白CTLD，其包括其單體天然肽序列中的氨基酸殘基59-180。
9.前述任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包括CTLD變體的N-末端和/或C-末端延伸。
10.權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)，其中該N-末端和/或C-末端延伸效應(yīng)物、酶、以及進(jìn)一步的結(jié)合和/或多聚化功能。
11.權(quán)利要求9或10的蛋白質(zhì)，其中該N-末端和/或C-末端延伸為天然C型類(lèi)凝集素蛋白或C型凝集素或缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性變體的非CTLD部分。
12.前述任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其為包含CTLD變體的模塊的多聚體。
13.權(quán)利要求12的蛋白質(zhì)，其衍生自天然四柄蛋白三聚體。
14.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO13中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的多肽htlec。
15.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO15中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的多肽htCTLD。
16.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO09中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的多肽hTN。
17.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO11中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的多肽hTN3。
18.權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO36中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的多肽mtlec。
19.權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其衍生自通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列進(jìn)行改變而具有SEQ IN NO38中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的多肽mtCTLD。
20.具有C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的支架結(jié)構(gòu)的蛋白的組合文庫(kù)，該蛋白包含模型CTLD變體，其中的α-螺旋和β-鏈保守到CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變的程度，但CTLD的環(huán)區(qū)或部分環(huán)區(qū)進(jìn)行了針對(duì)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)的隨機(jī)化。
21.權(quán)利要求20中的組合文庫(kù)，其中所述模型CTLD限定為具有與圖1中例示的二級(jí)結(jié)構(gòu)排列相一致的3D結(jié)構(gòu)，其特征為有下列主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的順序依次排列的5個(gè)β-鏈和2個(gè)α-螺旋，β-鏈排列在兩個(gè)反向平行β-折疊片中，一個(gè)由β1和β5組成，另一個(gè)由β2、β3和β4組成，至少兩個(gè)二硫橋，一個(gè)連接α1和β5，一個(gè)連接β3和連接β4與β5的多肽區(qū)段，以及由兩多肽區(qū)段組成的環(huán)區(qū)，其中環(huán)區(qū)段A(LSA)連接β2和β3，一般包括15-70個(gè)，或更為少見(jiàn)地包括5-14個(gè)氨基酸殘基，環(huán)區(qū)段B(LSB)連接β3和β4，一般包括5-12個(gè)，或更為少見(jiàn)地包括2-4個(gè)氨基酸殘基。
22.權(quán)利要求20中的組合文庫(kù)，其中模型CTLD限定為展示與以前認(rèn)定的CTLD族成員具有序列相似性，表現(xiàn)為有至少22％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少30％的氨基酸序列同一性，并且含有對(duì)確定保守的二硫橋拓?fù)鋵W(xué)所必需的半胱氨酸殘基(也即CysI，CysII，CysIII和CysIV)，其中通過(guò)與圖1中展示的CTLD匯總進(jìn)行序列比對(duì)檢驗(yàn)鑒定出環(huán)區(qū)及其側(cè)翼β-鏈結(jié)構(gòu)元件，鑒定出β2-和β3-鏈的序列定位，并通過(guò)將這些序列與四殘基共有序列β2cseq和β3cseq及一般定位在相對(duì)于保守的CysIII殘基為-6--2位點(diǎn)、更為少見(jiàn)地定位于-5--2位點(diǎn)的β4鏈區(qū)段、以及表1中闡明和說(shuō)明書(shū)部分?jǐn)⑹龅?5和-3位點(diǎn)處特征殘基進(jìn)行對(duì)比而提供進(jìn)一步的確證。
23.前述權(quán)利要求20-22中任一權(quán)利要求中的包含CTLD變體的蛋白的組合文庫(kù)，其中對(duì)模型CTLD的α-螺旋和β-鏈和連接區(qū)段中多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行了替代、缺失或插入。
24.前述權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的包含CTLD變體的蛋白的組合文庫(kù)，其中在CTLD的支架結(jié)構(gòu)基本保持不變的情況下，因在編碼CTLD的核苷酸序列中導(dǎo)入一或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以促進(jìn)對(duì)部分或所有環(huán)區(qū)的切除以及改變后的氨基酸序列的插入，從而在模型CTLD的β-鏈中進(jìn)行了多達(dá)4個(gè)殘基改變。
25.前述權(quán)利要求20-24中任一權(quán)利要求中的包括CTLD變體的蛋白的組合文庫(kù)，其中的模型CTLD為四柄蛋白的CTLD。
26.權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中的模型CTLD為人四柄蛋白的CTLD，其包括其單體天然肽序列中的氨基酸殘基59-180。
27.權(quán)利要求25的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中的模型CTLD為鼠四柄蛋白的CTLD，其包括其單體天然肽序列中的氨基酸殘基59-180。
28.權(quán)利要求20-27的任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其進(jìn)一步包括CTLD變體的N-末端和/或C-末端延伸。
29.權(quán)利要求28的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中該N-末端和/或C-末端延伸包含效應(yīng)物、酶、以及進(jìn)一步的結(jié)合和/或多聚化功能。
30.權(quán)利要求28或29的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中該N-末端和/或C-末端延伸為天然C型類(lèi)凝集素蛋白或C型凝集素或其缺乏功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性變體的非CTLD部分。
31.權(quán)利要求20-30的任一權(quán)利要求的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)為包含CTLD變體的模塊的多聚體。
32.權(quán)利要求31的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)衍生自天然四柄蛋白三聚體。
33.權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO13中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的多肽htlec。
34.權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO15中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的多肽htCTLD。
35.權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO09中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的多肽hTN。
36.權(quán)利要求27的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO11中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的多肽hTN3。
37.權(quán)利要求28的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO36中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的肽mtlec。
38.權(quán)利要求28的蛋白質(zhì)組合文庫(kù)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)環(huán)區(qū)氨基酸序列和/或氨基酸殘基數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化而衍生自具有SEQ INNO38中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的肽mtCTLD。
39.天然四柄蛋白的衍生物，其中對(duì)CTLD的α-螺旋和/或β-鏈和/或連接區(qū)段中多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行了替代、缺失或插入，前提是所述衍生物不是說(shuō)明書(shū)表2中所列的(四柄蛋白chTN)的任何已知CTLD環(huán)衍生物。
40.具有SEQ IN NO13中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為htlec。
41.具有SEQ IN NO15中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為htCTLD。
42.具有SEQ IN NO09中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為PhTN。
43.具有SEQ IN NO11中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為PhTN3。
44.具有SEQ IN NO13中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為Phtlec。
45.具有SEQ IN NO15中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為PhtCTLD。
46.具有SEQ IN NO02中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為FX-htlec。
47.具有SEQ IN NO04中的氨基酸序列的人四柄蛋白衍生物，命名為FX-htCTLD。
48.具有SEQ IN NO36中位點(diǎn)5Glu-位點(diǎn)185Val的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為mtlec。
49.具有SEQ IN NO38中位點(diǎn)5Ala-位點(diǎn)141Val的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為mtCTLD。
50.具有SEQ IN NO36中的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為Pmtlec。
51.具有SEQ IN NO38中的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為PmtCTLD。
52.具有SEQ IN NO29中的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為FX-mtlec。
53.具有SEQ IN NO31中的氨基酸序列的鼠四柄蛋白衍生物，命名為FX-mtCTLD。
54.包含編碼htlec插入?yún)^(qū)段、如SEQ ID NO12中核苷酸20-562所展示的核苷酸序列的核酸。
55.包含編碼htCTLD插入?yún)^(qū)段、如SEQ ID NO14中核苷酸20-430所展示的核苷酸序列的核酸。
56.包含編碼mtlec插入?yún)^(qū)段、如SEQ ID NO35中核苷酸20-562所展示的核苷酸序列的核酸。
57.包含編碼mtCTLD插入?yún)^(qū)段、如SEQ ID NO37中核苷酸20-430所展示的核苷酸序列的核酸。
58.包含編碼權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的蛋白的核苷酸序列的核酸。
59.編碼權(quán)利要求20-38中任一項(xiàng)所述組合文庫(kù)的蛋白的核酸文庫(kù)，其中共同組成該核酸文庫(kù)的核酸組合中的成員能夠在展示體系中表達(dá)，而此展示體系能在可展示代表被展示表達(dá)產(chǎn)物特性的表型的實(shí)體和它們相應(yīng)的基因型間提供邏輯、物理或化學(xué)聯(lián)系。
60.權(quán)利要求49中的核酸文庫(kù)，其中所述展示體系可選自(I)噬菌體展示體系，如(1)絲狀噬菌體fd，其中的核酸文庫(kù)插入到(a)噬菌粒載體，(b)噬菌體的病毒基因組(c)以純化的單或雙鏈形式存在的純化的病毒核酸，或(2)噬菌體λ，其中文庫(kù)插入到(a)純化的噬菌體λDNA，或(b)λ噬菌體顆粒中的核酸；或(II)病毒展示體系，其中核酸文庫(kù)插入到真核病毒如桿狀病毒的病毒核酸中；或(III)基于細(xì)胞的展示體系，其中核酸文庫(kù)插入到或緊鄰能夠整合到宿主基因組中或整合到能夠在細(xì)胞中自身維持并表達(dá)且適于在下列細(xì)胞的細(xì)胞表面進(jìn)行細(xì)胞表面展示的染色體外元件的核酸載體中(a)細(xì)菌細(xì)胞，(b)酵母細(xì)胞，或(c)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；或(IV)適于與核糖體相關(guān)聯(lián)的展示的核酸實(shí)體，具有核酸文庫(kù)插入其中；或(V)適于與質(zhì)粒相關(guān)聯(lián)的展示的質(zhì)粒，具有核酸文庫(kù)插入其中。
61.權(quán)利要求60中的核酸文庫(kù)，其中噬菌粒載體為AmershamPharmacia Biotech提供的載體″pCANTAB 5E″(編號(hào)為no.27-9401-01)以與它們的“重組噬菌體抗體體系”結(jié)合應(yīng)用。
62.權(quán)利要求1-19中任一權(quán)利要求的蛋白的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)包含至少一或多個(gè)相同或不同的、已通過(guò)篩選或選擇而從一或多個(gè)CTLD文庫(kù)中分離出來(lái)的具有新穎的環(huán)區(qū)序列的CTLD結(jié)構(gòu)域。
63.權(quán)利要求62的蛋白質(zhì)制備方法，其中通過(guò)誘變對(duì)至少一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了進(jìn)一步修飾
64.權(quán)利要求62或63的蛋白質(zhì)的制備方法，其中含有至少一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域的蛋白通過(guò)化學(xué)或酶促偶聯(lián)或交聯(lián)而從兩或更多個(gè)組件組裝成的。
65.權(quán)利要求20-38中任一權(quán)利要求的組合文庫(kù)的制備方法，其包含下列步驟1)將編碼包含模型CTLD的蛋白的核酸插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，2)如果必要，通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，該識(shí)別位點(diǎn)適當(dāng)?shù)亩ㄎ辉谖挥诰幋aCTLD環(huán)區(qū)或其部分的序列末端或附近的序列中，3)利用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切出編碼環(huán)區(qū)或其部分的DNA區(qū)段，4)將DNA區(qū)段混合物連接到經(jīng)限制性消化的載體上，及5)誘導(dǎo)載體在適當(dāng)培養(yǎng)基中表達(dá)具有CTLD的支架結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化蛋白。
66.適于制備權(quán)利要求20-38中任一項(xiàng)的組合文庫(kù)的四柄蛋白衍生物的構(gòu)建方法，其中已經(jīng)對(duì)編碼四柄蛋白衍生物的核酸進(jìn)行了修飾，以在編碼β2、β3或β4的核酸區(qū)段中、或在序列上游或下游距離屬于編碼β2、β3或β4的核酸區(qū)段的任何核苷酸多達(dá)30個(gè)核苷酸中產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)。
67.編碼四柄蛋白或其CLTD的支架結(jié)構(gòu)基本保持的衍生物的核苷酸序列用于通過(guò)對(duì)編碼其CTLD環(huán)區(qū)的核酸序列的全部或部分進(jìn)行隨機(jī)化而制備編碼相關(guān)蛋白的核苷酸序列文庫(kù)的用途。
68.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列編碼哺乳動(dòng)物四柄蛋白。
69.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列編碼人或鼠四柄蛋白。
70.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列編碼天然四柄蛋白衍生物，所述衍生物的CTLD的α-螺旋和β-鏈和連接區(qū)段中多達(dá)10個(gè)，優(yōu)選多達(dá)4個(gè)，更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行了替代、缺失或插入。
7l.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列，如SEQ ID NO12中核苷酸20-562所展示的，編碼了命名為htlec的人四柄蛋白衍生物。
72.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列，如SEQ ID NO14中核苷酸20-430所展示的，編碼了命名為htCTLD的人四柄蛋白衍生物。
73.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列，如SEQ ID NO35中核苷酸20-562所展示的，編碼了命名為mtlec的鼠四柄蛋白衍生物。
74.權(quán)利要求67中的應(yīng)用，其中核苷酸序列，如SEQ ID NO37中核苷酸20-430所展示的，編碼了命名為mtCTLD的鼠四柄蛋白衍生物。
75.篩選權(quán)利要求20-38中任一權(quán)利要求的組合文庫(kù)以獲得與特定靶的結(jié)合的方法，其包括下列步驟1)表達(dá)按照權(quán)利要求59-61中的任一權(quán)利要求的核酸文庫(kù)以在展示體系中展示蛋白質(zhì)文庫(kù)；2)將展示的實(shí)體集合與適當(dāng)標(biāo)記的靶物質(zhì)進(jìn)行接觸，其中期望分離對(duì)該靶物質(zhì)有親和性的CTLD衍生物；3)利用其上綴合或物理性吸附或附著有所述靶物質(zhì)的標(biāo)記作為載體或其它親和純化形式，通過(guò)基于親和性的選擇性提取收獲對(duì)該靶物質(zhì)顯示親和性的展示實(shí)體亞群，此方法在本領(lǐng)域中通常稱(chēng)為“親和淘選”，隨后對(duì)該亞文庫(kù)進(jìn)行重?cái)U(kuò)增；4)通過(guò)重復(fù)多輪淘選和重?cái)U(kuò)增分離越來(lái)越好的結(jié)合物，直至獲得少量的良好的候選結(jié)合物，5)如果需要，以單克隆形式分離每個(gè)良好的候選結(jié)合物，并對(duì)其進(jìn)行普通的功能和結(jié)構(gòu)定性，從而為最終篩選一或多個(gè)優(yōu)選的產(chǎn)物克隆作準(zhǔn)備。
76.以想要的替代物種相容性框架方式使權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的蛋白或選擇自權(quán)利要求20-38任一項(xiàng)的組合文庫(kù)并含有展示所需結(jié)合性質(zhì)的CTLD變體的蛋白質(zhì)重定型的方法，包括利用PCR技術(shù)、定點(diǎn)誘變或限制性酶消化而從編碼該蛋白的核酸中切出編碼替代環(huán)區(qū)多肽及任何所需的單框架突變的核酸區(qū)段，以及將該核酸區(qū)段插入到含有編碼所要的替代CTLD框架之核酸序列的展示或蛋白表達(dá)載體中的適當(dāng)位點(diǎn)處。
全文摘要
本發(fā)明提供了一族含有CTLD(C型類(lèi)凝集素結(jié)構(gòu)域)的新穎的蛋白質(zhì)文庫(kù)，其中沿CTLD中的配基結(jié)合位點(diǎn)排列的內(nèi)部多肽環(huán)區(qū)為完全或部分隨機(jī)化的多肽區(qū)段所替代。選取四柄蛋白CTLD作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的框架，并且本發(fā)明公開(kāi)了在產(chǎn)生和操作人和鼠四柄蛋白CTLD文庫(kù)中有用的多種噬菌粒載體。利用重組fd噬菌體展示載體，單體及三聚體形式的四柄蛋白CTLD有效展示為完全功能形式的基因III融合體。通過(guò)在每輪富集中對(duì)富集的亞群進(jìn)行篩選或選擇并隨后進(jìn)行擴(kuò)增，這樣通過(guò)進(jìn)行一或多輪富集就可很容易的從展示已對(duì)環(huán)區(qū)進(jìn)行了隨機(jī)化的CTLD的載體文庫(kù)中分離對(duì)新配基具有親和性的CTLD衍生物。相對(duì)于重組抗體衍生物，有效生產(chǎn)含有具有新結(jié)合特性的CTLD的蛋白產(chǎn)物在簡(jiǎn)單性、生產(chǎn)成本和效率以及制備和診斷或治療應(yīng)用方面提供了重要的優(yōu)勢(shì)，所述蛋白產(chǎn)物可通過(guò)如細(xì)菌表達(dá)或以單體、三聚體或多聚體形式進(jìn)行的體外重折疊來(lái)制備。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1484698SQ01821632
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月13日
發(fā)明者M·伊澤羅德特, T·L·霍爾泰特, N·J·H·格拉沃森, H·C·瑟格森, H 格拉沃森, M 伊澤羅德特, 瑟格森, 霍爾泰特 申請(qǐng)人:伯瑞恩藥物公司