專(zhuān)利名稱(chēng)：中國(guó)石斛屬植物及其藥材的dna分子鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)石斛藥材的DNA分子鑒別方法，屬生藥學(xué)領(lǐng)域。石斛為珍貴中藥材，應(yīng)用歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，具有滋陰清熱、生津養(yǎng)胃、潤(rùn)肺止咳等功效。現(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力及擴(kuò)張血管的作用，因此石斛在臨床上及中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用?！吨袊?guó)藥典》收載石斛為鐵皮石斛(Dendrobium candidum)、金釵石斛(Dendrobium nobile.)、束花石斛(Dendrobium chrysanthum)、粉花石斛(Dendrobium loddigesii)、流蘇石斛(Dendrobium fimbriatum)等蘭科石斛屬植物的新鮮或干燥莖。另有一些種被有關(guān)省、自治區(qū)的地方標(biāo)準(zhǔn)所收載。然而，商品市場(chǎng)上石斛規(guī)格繁多，基源十分復(fù)雜，幾乎中國(guó)石斛屬所有植物均當(dāng)作石斛藥用。
由于大多數(shù)石斛屬植物在未開(kāi)花時(shí)或在加工成藥材(干燥莖)時(shí)，依據(jù)其外部形態(tài)特征較難鑒別其種類(lèi)，因而《神農(nóng)本草經(jīng)》將其稱(chēng)之為“醫(yī)工難辨”的種類(lèi)。有的種利用顯微結(jié)構(gòu)或理化方法亦難以鑒定其基源。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)、AP-PCR、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等分子標(biāo)記方法不斷被用于中藥材的鑒別。其中RAPD、AP-PCR、RFLP等方法對(duì)模板DNA的要求較高，往往導(dǎo)致不穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而影響了鑒定的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明的目的是提供一種鑒別中國(guó)石斛屬植物及其藥材的DNA分子鑒別方法，用特定的DNA序列對(duì)中國(guó)石斛屬植物及藥材進(jìn)行種間鑒別，使中國(guó)石斛屬植物及其藥材的鑒別更可靠、正確。
本發(fā)明首先對(duì)中國(guó)石斛屬植物的rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，建立了中國(guó)石斛屬植物rDNA ITS區(qū)(包括ITS1，5.8S，ITS2)的全序列數(shù)據(jù)庫(kù)(見(jiàn)附表)，再在此基礎(chǔ)上對(duì)石斛類(lèi)藥材作高特異性PCR鑒定以及基因芯片鑒定。
本發(fā)明中利用rDNA ITS區(qū)DNA序列鑒別中國(guó)石斛屬植物所采用的步驟如下(1)總DNA提取取待檢植物新鮮的莖、葉片或藥材，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN試劑盒、CTAB等方法提取總DNA。(2)PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)一對(duì)石斛屬rDNA ITS區(qū)的擴(kuò)增引物P1、P2，序列如下P1為5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2為5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上，在30μL的體系中完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。(3)PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用Wizard或Watson劑盒純化，按試劑盒操作指南進(jìn)行。(4)DNA序列測(cè)定用BigDyeTM測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)的參數(shù)為Mix 1μl，純化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O適量，用ABI 310全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析所得rDNA ITS區(qū)序列輸入計(jì)算機(jī)后，用對(duì)位排列軟件(如Clustal)進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)。用MEGA或PAUP等遺傳分析軟件分析待檢樣品的DNA序列，并判斷所屬中國(guó)石斛屬的種。
本發(fā)明還利用高特異性PCR鑒別引物鑒定鐵皮石斛原植物及其藥材的基源，首先參照所測(cè)中國(guó)石斛屬植物的rDNA ITS序列數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)一對(duì)鐵皮石斛的高特異性鑒別引物，上游鑒別引物TP-JB01S5’-GTGCTGCTGAGATAAAATCCACTG-3’的設(shè)計(jì)參考了鐵皮石斛rDNA ITS區(qū)的ITS1部分，鐵皮石斛在該位點(diǎn)的堿基為G，均不同于石斛屬其它植物的堿基。下游鑒別引物TP-JB01X5’-CCACCATGCACATCCGAG CCTTAGT-3’的設(shè)計(jì)參照了鐵皮石斛rDNA ITS區(qū)的ITS2序列，鐵皮石斛的ITS2區(qū)域與引物TP-JB01X在3’端結(jié)合位點(diǎn)的第一個(gè)堿基為A，均不同于中國(guó)石斛屬其它植物的堿基。上、下游引物完全與鐵皮石斛的rDNA ITS區(qū)的堿基序列互補(bǔ)。
在進(jìn)行高特異性PCR鑒別之前，首先運(yùn)用引物P1、P2(序列同上文)對(duì)鐵皮石斛及其相似種進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)是否所有樣品都能擴(kuò)增出約430bp左右的片段以及擴(kuò)增片段的亮度，以驗(yàn)證模板DNA的質(zhì)量、調(diào)整模板DNA的濃度。然后，運(yùn)用鑒別引物TP-JB01S，TP-JB01X對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度控制在66℃時(shí)，只有鐵皮石斛能被擴(kuò)增出來(lái)，而其它的石斛均為陰性，用瓊脂糖電泳可以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
根據(jù)類(lèi)似方法可以設(shè)計(jì)出其它中國(guó)石斛屬植物及藥材的鑒別引物。
中國(guó)石斛屬植物的rDNA ITS區(qū)序列為中國(guó)藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室首次完成測(cè)序工作，本發(fā)明對(duì)中國(guó)石斛屬36種植物rDNA ITS區(qū)的序列進(jìn)行分析后表明，石斛屬植物的rDNA ITS區(qū)的居群差異一般在2-6個(gè)堿基之間(數(shù)據(jù)庫(kù)中僅列出各種石斛的一個(gè)居群樣本的rDNA ITS區(qū)序列)。本發(fā)明利用特定的重復(fù)多拷貝rDNA ITS區(qū)序列，通過(guò)CLUSTAL、MEGA等系列分析軟件就可以對(duì)待檢石斛屬植物進(jìn)行分析比較，最終鑒別出石斛的具體種。由于rDNA ITS序列能較好地反映植物的種間差別，因此，利用本方法鑒別中國(guó)石斛屬植物及藥材且具有高度的準(zhǔn)確性。隨著DNA測(cè)序成本的降低，此方法將會(huì)更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
由于絕大多數(shù)藥檢部門(mén)尚不具備DNA測(cè)序條件，依靠DNA序列分析鑒別石斛種類(lèi)的實(shí)用性因此受到很大限制。本發(fā)明還根據(jù)中國(guó)石斛屬植物的rDNA ITS序列，設(shè)計(jì)出鑒別石斛屬植物的引物，從而進(jìn)行高特異性PCR鑒別，以適應(yīng)各藥檢部門(mén)的檢測(cè)需要。
近年來(lái)，基因芯片技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，基因芯片鑒定的關(guān)鍵是選擇合適的DNA目的片段以及由此設(shè)計(jì)而成的高特異性鑒別引物。在本發(fā)明中，中國(guó)石斛屬rDNA ITS序列以及根據(jù)它們所設(shè)計(jì)的高特異性引物均可應(yīng)用于基因芯片鑒別。
下面提供本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例一 利用中國(guó)石斛屬植物rDNA ITS區(qū)的堿基序列鑒定石斛植物及藥材的基源本實(shí)施例取外形似石斛的3種待檢原植物葉或莖0.1g，分別編號(hào)為待檢種1、待檢種2，待檢種3，均通過(guò)以下步驟進(jìn)行鑒別(1)總DNA提取用無(wú)菌水沖洗干凈，在液氮中研成粉末。根據(jù)QIAGEN試劑盒的使用指南進(jìn)行總DNA提取或采用CTAB法以及其它方法提取總DNA。(2)PCR擴(kuò)增石斛屬I(mǎi)TS區(qū)的擴(kuò)增引物為P1、P2，序列如下P1為5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2為5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在30μL的體系中完成，反應(yīng)液含10mmol.L-1Tris-HCl，PH8.3，50mmol.L-1KCl，1.5mmol.L-1MgCl2，0.1％Triton X-100，Taq酶1U，4種dNTP各150mmol.L-1，兩個(gè)引物各10mmol.L-1，DNA模板約100ng。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性4min，95℃ 1min，52℃ 45s，72℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min補(bǔ)齊。以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。(3)PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用Wizard或Watson試劑盒純化，按試劑盒操作指南進(jìn)行。(4)DNA序列測(cè)定用BigDyeTM測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)的參數(shù)為Mix 1μl，純化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O適量。測(cè)序反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃30s，50℃20s，60℃4min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用10μlTSR溶解，熱循環(huán)儀上變性2分鐘，移入全自動(dòng)測(cè)序?qū)Ｓ霉?，用ABI 310全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析ITS1和ITS2的起止范圍參照Genbank中蘭科ITS范圍，所得DNA序列輸入計(jì)算機(jī)后，用Clustal軟件對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)。用MEGA軟件分析各樣品DNA序列間的差異。
經(jīng)上述步驟(4)對(duì)三個(gè)待檢種的rDNA ITS區(qū)序列測(cè)定結(jié)果如下；待檢種1〔來(lái)自云南〕TCGAGACCGAATTATATCGAGTGATTTATATAACCTGTAAAAATTTGCGTTGGCTATTGCTGCCGAAATAAAATCTATCCCAATCATCATCTGAACCCCCCTCCTTGGGGCGGAGATGCGATGAAGGATGGATGAACCCCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGTGAATAACGAAACAATATCCCTAAAATGGGTTTTGTAGCATGGCAATGCTATTGCATGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTAGATGCTCCGTGCCTTGTCATCAATTTATGGAAGTGTTGGTGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCTCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGGCATCATCTCGTTGGCTGCGTACAATAAGTGGTGGATAAAGGATAAGGCCTATTGTATTGTGCGTGCTAGCCCGAGAGATGATCATATTATTTTGGTGATCCCAAATCATGCGTCCATCCTTAGATGACGTTTTGAAT待檢種2〔來(lái)自云南〕TCGAGACTGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTGCCGAGATAATATTCATTTGAATCATCGTCTCATCCCCTCATTGGGGTTGGGACGTGATGAAGGATGGATAGAACCCCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGAAACATTGAAACATGAGCCCTAAAATGGGTTTAGTAGAATGGGGTGTTGTTACATGCCATAAGAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCATACATTTTATCGCTCCATGCCTAGCCACACATCGATGGATGTATTGGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATACGTGGTGGATTAAAGCAAGGCCGATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATACCTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCATGGATGGCGCTTTGAAT待檢種3〔來(lái)自廣西環(huán)江〕TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAAACTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGCCTATGCTATTGTGATAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATCATGCGCTAATCCATGGATGGCGTATCGAAT經(jīng)上述步驟(5)的DNA數(shù)據(jù)分析，三樣品的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下待檢種11.與數(shù)據(jù)庫(kù)中齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)的堿基差異為02.與數(shù)據(jù)庫(kù)中齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)的轉(zhuǎn)換及顛換總數(shù)為03.與數(shù)據(jù)庫(kù)中齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)的相對(duì)遺傳距離為0％4.在NJ樹(shù)上，待檢種1與數(shù)據(jù)庫(kù)中的齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)聚類(lèi)在一起，置信度為100％。
鑒別結(jié)論為待檢種1為齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)。待鑒種21.與數(shù)據(jù)庫(kù)中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的堿基差異為02.與數(shù)據(jù)庫(kù)中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的轉(zhuǎn)換及顛換總數(shù)為03.與數(shù)據(jù)庫(kù)中兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)的相對(duì)遺傳距離為0％4.在NJ樹(shù)上，待檢種2與數(shù)據(jù)庫(kù)中的兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)聚類(lèi)在一起，置信度為100％。
鑒別結(jié)論為待檢種2為兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)。待檢種31.與數(shù)據(jù)庫(kù)中鐵皮石斛(Dendrobium officinale)的堿基差異為22.與數(shù)據(jù)庫(kù)中鐵皮石斛(Dendrobium officinale)的轉(zhuǎn)換及顛換總數(shù)為23.與數(shù)據(jù)庫(kù)中鐵皮石斛(Dendrobium officinale)的相對(duì)遺傳距離為0.3％4.在NJ樹(shù)上，待檢種3與數(shù)據(jù)庫(kù)中的鐵皮石斛(Dendrobium officinale)聚類(lèi)在一起，置信度為100％。
鑒別結(jié)論為待檢種3為鐵皮石斛(Dendrobium officinale)。
當(dāng)然，步驟(5)除了用軟件進(jìn)行比較外，通過(guò)煩瑣的人工也可比較，并得出同樣的結(jié)綸。
實(shí)施例二 利用高特異性PCR鑒別引物鑒定鐵皮石斛原植物及藥材的基源(1)待檢植物總DNA提取將待檢品用無(wú)菌水沖洗干凈，在液氮中研成粉末。根據(jù)QIAGEN試劑盒的使用指南進(jìn)行總DNA提取或采用CTAB法以及其它方法提取總DNA。(2)模板DNA的質(zhì)量檢測(cè)運(yùn)用引物P1、P2(P1、P2序列同實(shí)施例一)對(duì)待檢品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)是否所有樣品都能擴(kuò)增出約430bp左右的片段以及擴(kuò)增片段的亮度，以驗(yàn)證模板DNA的質(zhì)量、調(diào)整模板DNA的濃度。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)在30μL的體系中完成，反應(yīng)液含10mmol.L-1Tris-HCl，PH8.3，50mmol.L-1KCl，1.5mmol.L-1MgCl2，0.1％Triton X-100，Taq酶1U，4種dNTP各150mmol.L-1，兩個(gè)引物各10mmol.L-1，DNA模板約100ng。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性4min，95℃ 1min，66℃ 45s，72℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min補(bǔ)齊。以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。(3)運(yùn)用鑒別引物TP-JB01S，TP-JB01X對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
當(dāng)退火溫度調(diào)整到66℃時(shí)，只有鐵皮石斛能被擴(kuò)增出來(lái)，而其它石斛均為陰性。在高特異性PCR鑒別反應(yīng)中，若待檢品為陽(yáng)性擴(kuò)增，則該種石斛即為鐵皮石斛，用瓊脂糖電泳可以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
運(yùn)用鐵皮石斛的高特異性鑒別引物可用于鐵皮石斛的基因芯片的檢測(cè)過(guò)程。
序列附表(中國(guó)石斛屬常見(jiàn)36種植物rDNA ITS區(qū)(包括ITS1，5.8S，ITS2)的全序列數(shù)據(jù)庫(kù))1.鐵皮石斛(Dendrobium officinale)[(Dendrobium candidum)《中國(guó)藥典》]—廣西西林居群、浙江天臺(tái)山居群TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGCCTATGCTATTGTGATAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATCATGCGCTAATCCATGGATGGCGTATCGAAT2.大苞鞘石斛(Dendrobium wardiaum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAAACAAAATCCAGCCCGGTCATCGCCTCTTCCCCTTTTCGGGGTGGGGACATGATCAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCCTCGCGCCAAGGCAATATCAAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTACGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGCAGGGCGGGTCGTCTTCTCGTTGGCTGCGGGCAATAGAGGGTGGATTAAAGAGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGATGATCAAACATTTTTAGGTGATCCCAATTCTTGCGTCGATCCACGGATGGCGTTGTAAT3.細(xì)莖石斛(Dendrobium moniliforme)—云南、廣西居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGGAATCTTGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCACTCCGTGCCTACTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCTAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT4.粉花石斛(Dendrobium loddigesii)—廣西居群TCGAGACTGAAATATATTGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGCGATGGCTATAGTTGTCGAGATAAAATTCATCCCAGTCGTCATGTCATCCTCTTTTGCGGGGTTGGGGACATGATGAAGGATGGATGAACCCACAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGAAATAATGAAATACGAGCCCTAAAATGGGTTTTATGAAATGGGGTGTTGTTGCATTCCTTATGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAGTCATTTTATCGCTCTGTGCCAAGCTACCCATCGATTGATGTGTTGGCGAAGGCTTGGATGTGCATTATGGCTCATCGTGCCCCCTGGCGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGACTGAAGGGAGACCTATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGTTGATCATACCTTTGAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCTATGGACGGCGCTTTGAAT5.串珠石斛(Dendrobium falconeri)—云南居群TCGAGACCGAAACACATTGAGCGATTTTGACAACCCGTAAAATTAAGCGGCGGCACTTGCTGCTGAGATAAAATCCACCCAAATCATTAGCCTTATCCCTCTTAGGGGCTGGGGACGTGATGAAGGTTGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAATATCGAAACACAAGCCTTTGAATGGGTTTTGTGGGATTGGGTGCTATCGCACACCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAGCCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCGATCGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGATGGGTTATCTTTTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAGAGAAGGCTATGCTATTGTGTCAAGCGTGCCTGAGTGATGATCATACTTTTACGGAGATCCATTCATGCGTCGATCCCAGGATGGCGTGGAAT6.腫節(jié)石斛(Dendrobium pendulum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACTCGTAATAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCAGCCCAGTCATCGCCTCTTCCCTTTTTGGGGTGGGGACGTGATCAAGGATGGATGAACCATCAAATCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGCAATATAAAAACACAAGCCTTAAATTGGGTTTCGTGAGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGTCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTTTGTCGCTTCGTGCCTAGCCACCCATCGATGGATGTGTTGGCCAGGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGTGTGGGTCGTCTTCTCACTGGCTGCGAACAATAGGGGGTGGATAAAAGAGAAGGCTCTACTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGGTGGTTATATAATTTTTCGTGATCCCAATTCAAGCGTCGATCCACGGATGGCGTTTGCAAT7.報(bào)春石斛(Dendrobium primulinum)—云南居群TCGAGACTGAAATATATTGAGCGATCTTGAGAACCTGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTACCGAGATAAAATTCATCCCAATCGTTGCCTAATCCCCTCTTCGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCCAAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATATCGAAACACAAGCCCTAAAATGGGATTTGTGGAATGGGGTGCTGTAGCATCTATAATATGGTTTGAAATACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAGACATTTTGTCGCTTCGTGCCTAGCCACCCATCGATGGATGTGTTGGCCAGGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCGTCTTGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAGCGATGCCTATGATATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATAACTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCACGGATGGTGCTTGAAT8.兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)—云南居群TCGAGACTGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGTGGTGGCTATAGCTGCCGAGATAATATTCATTTGAATCATCGTCTCATCCCCTCATTGGGGTTGGGACGTGATGAAGGATGGATAGAACCCCAAATCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGAAACATTGAAACATGAGCCCTAAAATGGGTTTAGTAGAATGGGGTGTTGTTACATGCCATAAGAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCATACATTTTATCGCTCCATGCCTAGCCACACATCGATGGATGTATTGGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATACGTGGTGGATTAAAGCAAGGCCGATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATCATACCTTTGAGGTGATCCCAAATCATGCGTTGATCCATGGATGGCGCTTTGAAT9.杯鞘石斛(Dendrobium gratiosissimum)—云南居群TCGAGACTGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTTAAAATAAGCGGCAGCTCTTGCTGCTGAGACAAAATCCAGCCCGGTCATCGCCTCTTCCCCTTTTGGGGTGGGGGCGTGATCAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCCTCGCGCCAAGGCAATATCAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTGGTGCCCCACGGTGCGGCGGGTTGAAGGGCGGGTCCTCTTCTCGTTGGCTGCGGACAATAGAGGGTGGATTAAAAGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCGTGCCGGAGAGATGATCATTCTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCACGGATGGCGTTGTAAT10.霍山石斛(Dendrobium huoshanense)—安徽霍山居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGTATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCGATCGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCCGAGAGATGGTCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCATGGATGGCGTATGAAT11.晶帽石斛(Dendrobium crystallinum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGAGAACCCGTTAAAATAATTTGGTGGCTCTTGCTGCCTGATAAAATCCACCCCAGTCATCGCCGCATGCCCTCTTTGGGGCGGGGACGTGATGAAGGATGGATGTACCCTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCAAAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTGTTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCCGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATAAAAGAGAAGGCCTGTGATATTGTGTCGGCGTGCCTGAGAGATGATCGTACCTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCTCGGATGGCGTTTGAAT12.羅河石斛(Dendrobium lohohense)—云南居群TCGAGACCGAAACACATCGAGCAATTTTGAGAACCTGTCAAAATAAGCGGTGGATATTGCTGCTGCGACATAATCCATCCAAGTCGTCGCCTCATCCCATCTCGGGGCGGGGACGCGACGAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTTGCGCCAAGGGAATCATCAAACATGAGCCCTAGAATGGGTTTTGTGGCATTGGGTGTTATTCACGCCATATGGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTACATCTCTCCACGTCAAGTCACCCTTCGATGGATGGGCTGGCGAAGGCTTGGATGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCACTTGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCGTCATCCTCTTGGCCGCGAACAATAATGGGTGGATTAAAGCGATGCCTAAGTTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTAAGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCAGGATGACGTTTTGAAT13.齒瓣石斛(Dendrobium devonianum)—云南居群TCGAGACCGAATTATATCGAGTGATTTATATAACCTGTAAAAATTTGCGTTGGCTATTGCTGCCGAAATAAAATCTATCCCAATCATCATCTGAACCCCCCTCCTTGGGGCGGAGATGCGATGAAGGATGGATGAACCCCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGTGAATAACGAAACAATATCCCTAAAATGGGTTTTGTAGCATGGCAATGCTATTGCATGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTAGATGCTCCGTGCCTTGTCATCAATTTATGGAAGTGTTGGTGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCTCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGGCATCATCTCGTTGGCTGCGTACAATAAGTGGTGGATAAAGGATAAGGCCTATTGTATTGTGCGTGCTAGCCCGAGAGATGATCATATTATTTTGGTGATCCCAAATCATGCGTCCATCCTTAGATGACGTTTTGAAT14.玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum)—云南居群TCGAGCCGAAATACATCGAGCAATTGTAGACCCTGTCAACATAAGTGGTGGCTACTGCTAAATCCATTCCAATCATTGCCTTGTCCCCTCTTTGCGGTTGGGATGTGATGAAGAGATGGGTGAACCCTCAAACCGGCGCAGCATCGCGTCAATGGAAAAATCAAAACACAAGTCCAAAAATGGGTTTTGTGGCATGGGGTGCTTTTGCTGGCCCCTTATGGATTGACACGACTTTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTTGCTCCGTGTCCACCTCACGATGGATGTGCTGGTGTAGGCTCGGATGTGCATGCTGGCTCGTCGTATCACCCCAGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCTATCTCGTTTGCGGGCCAACTAATAAGGGGTGGATTGAAGAGAGGTCTATGCTATTTTGTCGTGCATGCGCTGAGAGATGATTAACTTTTTTGTGATCCCAAATC TGCATCGATC？TGGATGATGCTTTGAAT15.束花石斛(Dendrobium chrysanthum)—云南居群TCGAGACCGAAATACCTCGAGCGATCTTGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTACTGCTGCCGAGATAAAATCCATCCAAGACATCGCCCCATACCCTCTTTGCGGTGAGGACGTGATGAAGGATGGATGAAACCTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATTAGAAACACGAGCCCTAAAATGGGTTTTGTGGCATGGGGTGCTGTTGCTCGCTCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTATTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCTGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTTGCTCCGTGTCTCGTCACCCATCAATGGATGTGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCCCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTTAAGAGCGGGTCGCCATCTCGTTGGTTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATGGAGGCCTATGCTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGAGATTAAATTTTTTAGGTGATCCCAAATCACGCGTCGATCCACGGATGAGCTTGAAT16.喇叭唇石斛(Dendrobium lituiflorum)—云南居群TCGAGACTGAAACACGAGCGATTTTGAGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGACAAAATCCAGCCCGATCATCGCCTCTTCCCCTTTTTGGGGTGGGGACGCGATCAAGGATGGATGGACCCTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGCAATATCAAAACACAAGCCTTAAAATGGGTTTCGTGGGATGGGGTGCTGTGCACGCCATATCGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCAAGCATTTTGTCGCTCCGTGTCTAGTCTCCCATCGTTGGATGTGCTGGTGAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCCCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGTCGATTGTCTTCTCGTTGGCTGCGGACAATAGAGGGTGGATTAAAATGAAGGCCTATGCTATTGTGTCGAGCATGCTGGAGAGATGATCGTACATATTTAGGCGATCCCAATTCATGCGTCAATCCATGGATGGCGTTTGGAAT17.重唇石斛(Dendrobium hercoglossum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAATGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGCCTGTAGTGCTGCGATAAAATCCCACTCGAGTCATCGC？TCATCCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGC？CGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTATTAGGTGACCCAATTCATGCGTCGATCCAGGAGGCGTATCGAAT18.曲莖石斛(Dendrobium flexicaule)—河南居群TCGAGACCGAACACCAACGAGCAATTTTGTGAACCCGTTAAAAAAAGCGGCGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTGGAGTCATCGCCTCATCCCCTTTATGGGGTGTGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTAAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCTCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGGATGTGTTACTAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAAAAAGGTCTATGCGATTGTGATAAGCGCGCCCGTGAGATGATCATACTTTTTAGGTGAGCCCAATTCATGCGCTAATCCAGGAGGCGTATCGAAT19.鉤狀石斛(Dendrobium aduncum)—廣西居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCAATTTCGTGAACCCGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGAGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGATGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATCAATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAATCTCCCATCCATGTATGTGTTGCAAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCCTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGCCGGGTCATCTTCTCGTTGGTTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAACAAGGCCATAGCTGTTGTGATATGCGCGCCCGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGCTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT20.伏牛石斛(Dendrobium funiushanense)—河南居群TCGAGACCGAAACACAACGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGGCTCTTGCTGCTGCGATAAAATCCACCCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCTATAAATGGGTTTTGTGGTATGGGGTGTTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACTGGCTGAGGGAACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCACTCTGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCTGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTTTCTATGTGATCCCAATTCATGCGTTGATCCAGGAGGCGTATCGAAT21.竹枝石斛(Dendrobium salaccense)—云南居群TCGAGACCGAAATATATCGAGCAATTTTGAGAACCTGTCAAAATAAGCGGTGGATATTGCTGCTGCGACATAATCCATCCAAGTCGTCGCCTCATCCCATCTTCGGGGCGGGGACGCGACGAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTTGTGCCAAGGGAATATCAAAACATGAGCCCTAGAATGGGTTTTTGTGGCATTGGGTGTTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTACATCGCTCCATGTCAAGTCACCCTTCGATGGATGGGCTGGCGAAGGCTTGGATGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCACTTGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCGTCATCCTCTTGGCCGCGAACAATAATGGGTGGATTAAAGCGATGCCTAAGTTATTGTGTGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTTAAGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCATGGATGACGTTTTTGAAT22.鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)—云南居群TCGAGACCGAAATACACCGAGCGATCTTGAGAACCCATCAAAACAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGCAGAAAAAATTCATCCCAGTCGGTGCCTCATCCCAACCTTGGGGTGGGGACGTGACAAAGGATGGACGAACCCACAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGATTATCGAAACATGAGACCTAAAATAGGTTTTGTGGCTTGGGGTGCTGCTGCACGCCATATGGATTGGCACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCGCTCCGTGTCCAGCCACCCGTCGATGGATGGGCTGGCGATGGCTCGGATGTGCACAGTGGCTCCTCGTGCCCCTCGGCACGGCGGGCTTAAGAGCGGGTAATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATATGGGGTGGATAAATGCGATGCTTATGATATTGTGCCGTGCATGCCCGAGAGATGATCATACTTATTCAGGTGATCCCAAACCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTTGAAT23.密花石斛(Dendrobium densiflorum)—云南居群TCGAGACCAAAATAAATCGAGCGATTTGGAGAACCGGTCAAAATAAGCGGTGATTATTATTTCCGTGATGAACGCCATCCCAGTCGTTACCTCATCCCCTTAGGGTCGAGGATGCGAGTAAGGATGGATGAACACTCAAGCCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATATCGAAACATGAGCCCTTAAATGGGTTTGGTGGAATGGGGTGCTGTTGCACGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACTGGCCAAGGGCACGTTTGCCTGGGCGTCAAGCGTTATGTCGCTTCGTGTCAACTCCATCCCGTCGATGTATGGGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCATCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACGATAAGGGGTGGATTAAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCTCGAGAGAAGATTATACATACTCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCAAAGGATGGCGCTTGGAAT24.球花石斛(Dendrobium thyrsiflorum)—云南居群TCGAGACCAAAATAAATCGAGCGATTTGGAGAACCGGTCAAAATAAGCGGTGATTATTATTTCCGTGATGAACGCCATCCCAGTCGTTACCTCATCCCCTTAGGGTCGAGGATGCGAGTAAGGATGGATGAACACTCAAGCCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGAAATATCGAAACATGAGCCCTTAAATGGGTTTGGTGGAATGGGGTGCTGTTGCACGCCATATGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACTGGCCAAGGGCACGTTTGCCTGGGCGTCAAGCGTTATGTCGCTTCGTGTCAACTCCATCCCGTCGATGTATGGGCTGGCGAAGGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCATCGTGCCCCTCGGTGCGGCGAGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACGATAAGGGGTGGATTAAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCTCGAGAGAAGATTATACATACTCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCAAAGGATGGCGCTTGGAAT25.細(xì)葉石斛(Dendrobium hancockii)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTTGAGAACTCGTCAAAATAAGAGGTGGCTGTTGCTGCTTCGATAAAATCCGTCTCAGTCGTCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGGCGCGATGAAGGATGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGCAATATCGAAACACGAGCCCTAAAATGGGTTTTATGGCTTGGTGTGCTTTTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCGATCGTTACGTCGCTCCGTGTCAAAGTCCCCCATCGTCGGATGGGTTGGCGAAGGCTCGGACGTGCACAGTGGCTCGTCGTGCCCCCCGGCGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATCATCTCGTTGGATGCGGACAATAAGGGGTGGATTAAAGTGAGGCCTATGTTATTGTGCCGTGCATGCCTAAGAGATGATAGTGCTTTTTTGGTGATCCCAAATCATGCGCCGATCCACAGATGGCGTTTTGAAT26.線葉石斛(Dendrobium aurantiacum)—廣西居群TCGAGACCGAAATGCATCGAGTGATCTTGAGAACCCATCAAAATAAGCGGTGGCCGCTGCTGCTGCGAAAAAGATCCAGCCCAGTCGTCGCCTCGCCCCAGCCTTGGGGCGGGGACCCGACGAAGGACGGATGAACTCTCAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGAAAAATTGAAACACGAGACCTAAAAAGGGCTCTGTGGCTTGGGGTGCTGTTGCATGCCATATGGATTCACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGTGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACAGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCGCTCCATGCCAAGTCACCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGCATAGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGAGCGGGTCATTATCTTGTTGGCTGCGGCAATAATGGGTGGATAAACGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGCATGCCTAAGATATGATTAAACTTTTTAGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCACGGATGGCGTTTTGAAT27.長(zhǎng)蘇石斛(Dendrobium brymerianum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATCTTGAGAACCCATCAAAATAAGCGGTGGCTATTGCTGCTGCGAATAAAATCCATCCCAATTATCGCCTCATCCCATCCTAGGGGCGGGGACGTGATAAAGGATGGATGAACCCTCAAACCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGCAATATTGAAACACGAGCCCTAAATCGGGTTTTGTGGCTTGGGGTGCTGTTGCACGTCATCTGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCAAGCGTTGCGTCGCTCCGTGTCAAGTCACCCATTGATGGATGGGTTGGCGAAGGCTTGGATGTGCATAGTGGCTCGTCGTGCCCCTCAGCGCGGCGGGCTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAATAATAAGGGGTGGATAAAAGCGAGGCAGATGTTATTGTGTTGTGCATGCCTAAGAGATGATTATACTTTTAAGATGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTTGAAT28.流蘇石斛(Dendrobium fimbriatum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACTTGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGCTGTCGTGATAAAATCCATCCCAGTCATTGCTTCATCCCCTTCTGGGCGGGGATGCGATGAAGGATGGATGAACAATCAAACCGGCGCAGCATTGCGCCAAGGGAATATCGAAACACGAGCCCCAAAATGGGTTTGGTGGCATGGGGTGCTGCTGCATACCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTTGCCTCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTATTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGTCAAGTCATCCCATCGATGGATGGGCTGGCGAGTGCTCGGATGTGCAGAGTGGCTCCTCGTGCCCCTCGGCGCGGTGTGCTGAAGAGCAGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCAAGGCCTATGTTATTGTGTCGTATGCCTTAGAGAAGATCATACTTTTTGGGAGATCCAAAATCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTTTGAAT29.短棒石斛(Dendrobium capillipes)—云南居群TCGAGACCGAAATGTATCGAGCGATTTGGAGAACCTGTCAAAAGATGCGGCAGCTATTGTTGCTGCATTAAAACTGTCCCAGTCGTCATCTCATCCCCTTTGGGGCGGGAGCGCGATGAAGGATGGAAGAACACTCAAACCGGTGCAATATCGCGCCAAGGAAATATCAAAATATGAGCCCCTAAATGGGTTTGTTGGCATTGGGTGATATTGCACTCATGTGGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGTGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGTGTCAAGCATTATGTTGCTCCATGCCAACTCTATCCCATCGAAGGATGGGATGGCGAAGGCTTGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGTCCAACGGTGCGGCGGGCTCAAAAGCGGTTCTTCATCTCACTGGCTGAGAACAATAACGGGTGGATTTAAGCGAGGCCTATGTTATTGTGTCGTGCATGCCACCGAGAAGATTATACTTATTCAGGTCATCCCAAGCCAAGCACTGATCCAAGGATGGCGTTTGGAAT30.棒節(jié)石斛(Dendrobium findlayanum)—云南居群TCGAGACCGAAACACAGTGAGCGATTTTGTGAACCCGTAAAAATAAGCGGCGGCTTTTGCTGCTGAGATAAAATCCACTCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGCGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGAAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGCCGCACGCCATATCGATTGACATGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAATCGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCAAGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGATCATACTTTTTAGGTGATCCCAATTCATGCGCCGATCCATGGATGGCGTATCTGAAT31金釵石斛(Dendrobium nobile)—云南麗江居群TCGAGACCGAAACACAATGAGCGATTTTGTGAACCTGTAAAAATAAGCGGTGCCTGTAGTGCTGCGATAAAATCCACTCGAGTCATCGCCTCATCCCCTCTTTGGGGTGGGGACGTGATGAAGGATGGATGAACCCTCAAATCGGCGCAGCGTAGCGCCAAGGGAATCTTGAAACACAAGCCCATAAATGGGTTTTGTGGGATGGGGTGCTGTCGCACGCCATATTGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATATGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCTGAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTTTATCGCTCCGTGCCTAGTCTCCCATCCATGGATGTGTTGCCAAGGCTCGGATGTGCACGGTGGCTCGTCGTGCCCCTTGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCATCTTCTCGTTGGCTGCCAACAATAAGGGGTGGATTAAATAAGGCCTATGCTATTGTGTCAAGCGCGCCTGAGAGATGGTCATACTTATTAGGTGATCCCAATTCATGCGTCGATCCATGGATGGCGTATCGAAT32.反瓣石斛(Dendrobium ellipsophyllum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAGTAAGCGGTGGCTATCGTTGCCATGATGAAAGCCATCCCAGATGCTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGAGCGTGATGAAGGATGGATGAACACTCAAATCGGCGCAGCGTCGCGCCAAGGGAATGTCGAAACACGAGATCACCAATGGGTTCTGGTGGCATGGGGTGCTGTTGCACGCCATACGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTTCGTGTCAGCTCCATCCCATCGAAGGATGGGCTGGTGAAGGCTCGGATGTGGAGGGTGGCTCGTCGTGCCCCTCGGTGCGGCGGGCTGAAGGGCGGGTCTTCATCTCGTCGGCCGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCGAGGCCTGTGCTATTGTGTCGTGTGCGCCCGAGAGGAGATCATATGTTATCGGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCACGGATGGCGCTCGGAAT33.翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGTTGCCGCGATAAAATCCATCCCAATCGTTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGATGCGATGAGGGTTGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAGTAACGAAACTTGAGCCCTTAAATGGGTCTTGTGGCATGGGGTGCTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGCCAACTCCATTCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGCCCGTCGGTGCGGCGGGTTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGAATAAAGTGAGACCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCCTGAGAGAAGACCATTATCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGAATGGCGTTTGGAAT34.黑毛石斛(Dendrobium williamsonii)—云南居群TCGAGACCGAAATACATCGAGCGATTTGGAGAACCCGTCAAAATAAGCGGTGGCTATTGTTGCCGCGATAAAATCCATCCCAATCGTTGCCTCATCCCCTTGGGGGCGGGGATGCGATGAGGGTTGGATGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGTAGTAACGAAACTTGAGCCCTTAAATGGGTCTTGTGGCATGGGGTGCTATTGCACGCCATATGGATTGACACGACTCTCGGCAATGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCGTTACGTCACTCCGTGCCAACTCCATTCCATCGATGGATGGGCCGGTGAAGGCTCGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTGCCCGTCGGTGCGGCGGGTTGAAGAGTGGGTCATCATCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGAATAAAGTGAGACCTATGTTATTGTGTCGTGTATGCCTGAGAGAAGACCATTATCAGGAGATCCCAAATCATGCGTCGATCCATGAATGGCGTTTGGAAT35.景洪石斛(Dendrobium exile)—云南居群TCGAGACGAAAATATATCGAACGATTTGGAGAACTAGTAAATATAAGCCGTGGTTATTACATCTGCGAAAGAAGCCATCCCATTTGTAATCTCACATCCCATCGAGGGAGAGATCATGAATAAGGATGGTTGAACACATAAACCGGCGCAGCATAGCGCCAAGGGATAAATAGAAGCACAAGCCCTTAAATGGGTTTGAAGGCATGGTGTGCTGTTGCGCCCAATAAGGATTGACATGACTCTCGACAATGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCAAGCATTTTGTCACTCCGAGTCTATTCCATCCCTTGGATGGTGTGCTGGCAGAGGCTTGGATGTGTAGAGTGGCTCGTCGTACCCCTCGGTACGGCGGGTTGAAGAGTGGATAATCAGCTTGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAATCGAGGCCTGTGTTATTGTCTTGCGTATGCCTGAGAGAAGATTATGCATTGTTAGGTGATCCAAAATCATGCGTACATCCTCGGATGGCGTTTGGAAT36.劍葉石斛(Dendrobium acinaciforme)—云南居群TCGAGACTAGAATACATCGAATGATTTGGATAACAAGTCAACATAAGCAGTGGATATTATATCTGCAAAAGAAGCCATCCTCCTCATAACCTCACATCCCCTCGATGGCGAGGTCATGAATAATGATGGAAGAACACTCAAACCGGCGCAGCATCGCGCCAAGGGATATATCGAAGCACAAGCCCATAAATGGGTTTGGTGGCATGGTGTGCCGTTGCGCCCCATAAGGATCGACATGACTCTCGACAATGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACGTGGTGCGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCAACCGGCCAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTACGTCACTCCGAGTTAATTTCATCCCTACAATGGTTGGGCTGGCAGAGGCTTGGATGTGCAGAGTGGCTCATCGTGCCGCTCGGTGCGGTGGGCTGAAGAACGGATCATCAGCTCGTTGGCTGCGAACAATAAGGGGTGGATTAAAGCGAGGCCTGTGTTATTGTGTCGAGTATGCCCGAGAGAATATCATGGTCAGGTGATCCCAAATCATGCGTCGATCCCTGGATGGCGTATTGGAAT
權(quán)利要求
1.一種中國(guó)石斛屬植物及其藥材的DNA分子鑒別方法，建立中國(guó)石斛屬常見(jiàn)植物rDNA ITS區(qū)，包括ITS1、5.8S、ITS2區(qū)的全序列數(shù)據(jù)庫(kù)(見(jiàn)序列附表)，其特征是然后按如下步驟(1)總DNA提取取待檢植物新鮮的莖、葉片或藥材，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN試劑盒、CTAB法以及其它方法提取總DNA。(2)PCR擴(kuò)增石斛屬rDNA ITS區(qū)擴(kuò)增引物P1、P2的序列如下P1為5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2為5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上。利用該引物對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。(3)PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用Wizard或Watson等試劑盒純化，按試劑盒操作指南進(jìn)行。(4)DNA序列測(cè)定用BigDyeTM測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)的參數(shù)為Mix 1μl，純化后的DNA片段15-45ng，Primer 1.6pmol，buffer 1.2μl，ddH2O適量，用ABI 310全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析及種類(lèi)的鑒別待檢種的rDNA ITS區(qū)的序列一經(jīng)測(cè)定，用對(duì)位排列軟件進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，用遺傳分析軟件分析各待檢種樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各序列間的差異。通過(guò)分析比較，最終判斷出待檢種所屬的物種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的中國(guó)石斛屬植物及其藥材的DNA分子鑒別方法，其特征是所說(shuō)的對(duì)位排列軟件是Clustal軟件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的中國(guó)石斛屬植物及其藥材的DNA分子鑒別方法，其特征是所說(shuō)的DNA遺傳分析軟件是MEGA軟件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的中國(guó)石斛屬植物及其藥材的DNA分子鑒別方法，其特征是所說(shuō)的DNA遺傳分析軟件是PAUP軟件。
5.鐵皮石斛原植物及藥材的高特異性PCR鑒別方法，其特征是對(duì)照所測(cè)中國(guó)石斛屬植物的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)出鑒別鐵皮石斛的高特異性鑒別引物，鐵皮石斛鑒別引物為上游鑒別引物TP-JB01S5’-GTGCTGCTGAGATAAAATCCACTG-3’下游鑒別引物TP-JB01X5’-CCACCATGCACATCCGAGCCTTAGT-3’；具體步驟為(1)總DNA提取取待檢植物新鮮的莖、葉片或藥材，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN試劑盒、CTAB法以及其它方法提取總DNA。(2)模板DNA的質(zhì)量檢測(cè)運(yùn)用引物P1、P2，序列如下P1為5’-CGTAACAAGGTTT CCGTAGGTGAAC-3’，位于18S上；P2為5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’，位于26S上，利用該引物對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)待檢品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證模板DNA的質(zhì)量、調(diào)整模板DNA的濃度。(3)運(yùn)用鑒別引物TP-JB01S，TP-JB01X對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將退火溫度升至66℃，能被擴(kuò)增出來(lái)的即是鐵皮石斛，而其它石斛均為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國(guó)石斛屬植物及其藥材DNA分子鑒別的方法。在建立了中國(guó)石斛屬植物rDNA ITS區(qū)全序列數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上,對(duì)待檢植物或藥材樣品進(jìn)行了總DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、DNA序列測(cè)定、分析等過(guò)程。當(dāng)待檢植物或藥材與數(shù)據(jù)庫(kù)中某石斛屬植物的DNA序列相符時(shí)為該種石斛。根據(jù)中國(guó)石斛屬植物rDNA ITS區(qū)的數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)計(jì)出鑒別鐵皮石斛的高特異性鑒別引物,能成功進(jìn)行鐵皮石斛原植物及藥材的高特異性PCR鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1372005SQ0112706
公開(kāi)日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者王崢濤, 徐珞珊, 丁小余, 徐紅 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)