專利名稱：結(jié)核菌雙相快速培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核菌雙相快速培養(yǎng)基，還涉及一種培養(yǎng)基的制備方法。
目前我國(guó)普遍使用一種被稱之為“改良羅氏培養(yǎng)基”的固體結(jié)核菌培養(yǎng)基來(lái)對(duì)結(jié)核菌進(jìn)行體外人工分離培養(yǎng)，其成分為“天門冬酰胺0.72克、磷酸二氫鉀0.96克、枸椽酸鎂0.12克、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.048克、中性甘油2.4毫升、水120毫升、馬鈴薯粉6克、新鮮雞蛋6-8只、1％孔雀綠水溶液8毫升”；其制法為“將天門冬酰胺、磷酸二氫鉀、枸櫞酸鎂及甘油加水后，置于沸水浴中加熱溶解。再加入馬鈴薯粉，繼續(xù)在沸水浴中加熱30分鐘，時(shí)加攪拌，使成均勻糊狀。待冷至65℃時(shí)，加入新鮮雞蛋液200毫升及1％孔雀綠8毫升，充分?jǐn)噭蚝笥秒p層紗布過(guò)濾，然后分裝于大試管中，每管10毫升，用橡皮塞緊，置成長(zhǎng)斜面。用85℃、150分鐘流動(dòng)蒸氣菌即成”。這些記載在福州部隊(duì)總醫(yī)院編、朱忠勇、陳之航主編、上海科學(xué)技術(shù)出版社1978年4月出版的《臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)》第454頁(yè)上。由于現(xiàn)有的固體結(jié)核菌培養(yǎng)基均是靠各醫(yī)院去配制而無(wú)現(xiàn)成產(chǎn)品可購(gòu)，這就需要院方單獨(dú)為此添置一套相應(yīng)的生產(chǎn)設(shè)備，既加大了醫(yī)院的設(shè)備開(kāi)支，又相應(yīng)增加了配制工作量。經(jīng)檢索中國(guó)專利，專利申請(qǐng)?zhí)?8110068其技術(shù)方案是由基礎(chǔ)物質(zhì)、能量物質(zhì)、植物生長(zhǎng)刺激物質(zhì)混合配制而成，基礎(chǔ)物質(zhì)中有磷酸二氫鉀、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、枸櫞酸鎂、檸檬酸鐵銨、天門冬酰胺、中性甘油、馬鈴薯粉、新鮮雞蛋液、2％孔雀綠水溶液、水、動(dòng)物血清，能量物質(zhì)中有輔酶A、三磷酸腺苷、細(xì)胞色素丙，植物生長(zhǎng)刺激物質(zhì)中有α-萘乙酸，每1000克結(jié)核菌快速培養(yǎng)基中各組分的含量為磷酸二氫鉀 1.36-1.4克 新鮮雞蛋液 560-600克硫酸鎂 0.136-0.14克2％孔雀綠水溶液 11-13克枸櫞酸鎂 0.3-0.4克 水 300-340克檸檬酸鐵銨 0.028-0.03克動(dòng)物血清 56-60克天門冬酰胺 2.06-2.1克 輔酶A0.4-0.8克中性甘油 6-8克 三磷酸腺苷 0.04-0.08克馬鈴薯粉 17-17.5克 細(xì)胞色素丙0.045-0.075克α-萘乙酸 0.05-0.1毫克。
其步驟是A、制糊將17-17.5克的馬鈴薯粉加150-170克水后，置于沸水浴中加熱，時(shí)加攪拌，使成均勻糊狀，自然降至室溫后備用；B、混合調(diào)配將1.36-1.4克的磷酸二氫鉀、0.136-0.14克的硫酸鎂、0.3-0.4克的枸櫞酸鎂、0.028-0.03克的檸檬酸鐵銨、2.06-2.1克的天門冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克水后，置于沸水浴中加熱溶解，待冷至50℃以下時(shí)，加入560-600克的新鮮雞蛋液、56-60克的動(dòng)物血清、0.4-0.8克的輔酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克細(xì)胞色素丙、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，再加?67-187.5克的馬鈴薯粉及11-13克的2％孔雀綠水溶液，并經(jīng)充分?jǐn)噭蚝蟮?000克混合物；C、分裝及密封；將混合物分裝于大試管中，每管分裝5克，置成長(zhǎng)斜面后，熔封；D、滅菌；采用血清凝固器對(duì)大試管進(jìn)行滅菌，滅菌條件為頭日，85℃，30分鐘；次日，80℃，30分鐘；第三是，80℃，30分鐘。由以上所述可知，固體結(jié)核菌培養(yǎng)基的現(xiàn)有配制過(guò)程較為復(fù)雜和麻煩，故醫(yī)院只能根據(jù)近期內(nèi)固體結(jié)核菌培養(yǎng)基的大致用量予先配制一些備用，但是，全國(guó)幾千家醫(yī)院各自分散配制的固體結(jié)核菌培養(yǎng)基，均存在著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一致、成品率不高、不易長(zhǎng)期貯存及貯存期稍長(zhǎng)因水份散失、藥物分解而使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)的缺陷。臨床檢測(cè)是發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的結(jié)核菌培養(yǎng)基存在以下缺陷1、由于現(xiàn)有的固體結(jié)核培養(yǎng)基保藏在大試管中，管口用橡皮塞塞緊，故該培養(yǎng)基被密封的程度較差，其內(nèi)的水份易散失，以至該培養(yǎng)基的貯藏期很短(僅3個(gè)月)，這樣便不能通過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)手段進(jìn)行大批量生產(chǎn)，而只能由醫(yī)院自行配制，因此，目前在我國(guó)固體結(jié)核菌培養(yǎng)基僅有醫(yī)院配制品而并無(wú)工業(yè)化產(chǎn)品。2、眾所周知，結(jié)核菌的生產(chǎn)繁殖所需條件較高，其培養(yǎng)基中需有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而如上所述可知，現(xiàn)有的固體結(jié)核菌培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類少，另外其內(nèi)也沒(méi)有能加快結(jié)核菌新陳代謝活動(dòng)以提高結(jié)核菌生長(zhǎng)繁殖速度的能量物質(zhì)和植物生長(zhǎng)刺激物質(zhì)，這樣使得結(jié)核菌在現(xiàn)有的固體結(jié)核菌培養(yǎng)基中不能進(jìn)行很好地生長(zhǎng)繁殖，分裂周期長(zhǎng)達(dá)12-16小時(shí)，要4-6周方能看到菌落。3、有些液體培養(yǎng)基配方復(fù)雜，方法繁瑣，羅氏培養(yǎng)基需35天。因此，使用現(xiàn)有的結(jié)核菌培養(yǎng)基來(lái)對(duì)結(jié)核菌進(jìn)行體外人工分離培養(yǎng)時(shí)，，其檢測(cè)速度相當(dāng)慢，陽(yáng)性檢出率低，不利于結(jié)核病的早期診斷和治療。
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)快速培養(yǎng)結(jié)核桿菌的雙相培養(yǎng)基，解決了臨床早期診斷及有效地治療的問(wèn)題。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種方法易行，操作方便配制結(jié)核菌雙相培養(yǎng)基的制備方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施A、平菇液相培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)磷酸二氫鉀 0.2-1硫酸鎂 0.2-1枸櫞酸鐵銨 0.02-0.1天門冬素1-5丙酮酸鈉0.2-1甘油5-20蒸餾水 150-350平菇浸出液 150-350用磷酸鹽調(diào)整PH6.1-7.0，再加入瓊脂粉0.05-0.5份，高壓滅菌，冷卻，濕度控制在50-70℃，然后加入羥芐青霉素(50μg/ml)和二性霉素B(50μg/ml)，滅活小牛血清15-30搖勻，置4℃冰箱備用。
平菇固相培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)取上述平菇液相培養(yǎng)基200-700，加瓊脂粉2-8，高壓滅菌，冷卻，濕度控制在50-70℃，加入滅活小牛血清15-30，攪拌均勻，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶平放，待凝固后加入平菇液相培養(yǎng)基5-15，裝好后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)置4℃冰箱保存。
酸羅氏培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)磷酸二氫鉀2-2.8硫酸鎂0.2-0.3，枸櫞酸鎂0.5-0.7，天門冬素3-4，甘油10-14，蒸餾水550-650，馬鈴薯淀粉25-35，雞蛋液550-650，2％孔雀綠水溶液15-25。首先將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素、甘油加蒸餾水后置于沸水溶液中加熱使之溶解；其次加入馬鈴薯淀粉，繼續(xù)在沸水中加熱28-34分鐘，不斷攪拌，使成均勻糊狀；第三是冷卻，濕度控制在58-62℃；第四是加入雞蛋液及2％孔雀綠水溶液，攪拌均勻；第五是用雙層紗布進(jìn)行過(guò)濾，分裝試管，80-90℃流動(dòng)蒸汽滅菌140-160分鐘，貯存在于4℃冰箱備用。
檢測(cè)結(jié)果情況是結(jié)核菌在平菇以相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況H37RV10-1mg/ml在接種后第三天液相培養(yǎng)基中層略變混濁，有5-8個(gè)白色顆粒狀菌落出現(xiàn)。第5天即有15-20個(gè)菌落，8天時(shí)中層乳白狀混濁，轉(zhuǎn)動(dòng)試管可見(jiàn)無(wú)數(shù)菌落。固相在第6天出現(xiàn)明顯細(xì)小灰白色菌落，第9天布滿平板。菌落略粗糙，菌落較疏松，易于挑起。將液相和固相菌落挑出分別涂片抗酸染色，均呈典型抗酸桿菌，但前者有索狀形成，后者菌體稍短。
基礎(chǔ)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表H37RV菌在兩種培養(yǎng)基上初生時(shí)間比較液相(+)固相培養(yǎng)基(天) 酸性羅氏培養(yǎng)基(天)3 4 5 6 8 10 12 14 17 19 255 8 11 14 17 20 23 3510-1++10-2+ +10-3+ +10-4+  +10-5+  +10-6+  +10-7+  +10-8+  僅二個(gè)菌落從上表明顯看到，大菌量(10-1-10-3)平菇液相培養(yǎng)基3-5天即生長(zhǎng)豐滿，而酸性羅氏基需5-11天。小接種量(10-8mg/ml)雙相為14天，酸性羅氏培養(yǎng)基35天才有2個(gè)菌落生長(zhǎng)，平菇固相培養(yǎng)基稍晚于液相培養(yǎng)基，但優(yōu)于酸性羅氏培養(yǎng)基。
臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)結(jié)果387份臨床標(biāo)本接種平菇培養(yǎng)基污染21份，酸性羅氏培養(yǎng)基污染15份各占0.05％和0.04％，在統(tǒng)計(jì)中去掉所污染份數(shù)，即按366份進(jìn)行分析。366份標(biāo)本在兩種培養(yǎng)基中總陽(yáng)性數(shù)為172份(46.99％)，其中平菇雙相培養(yǎng)基166份，陽(yáng)性檢出率為45.36％。酸性羅氏培養(yǎng)基礎(chǔ)144份，陽(yáng)性檢出率為39.34％。分別占總陽(yáng)性96.51％和83.72％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理X2＝1.354，P＞0.05，無(wú)顯著差異。
平菇雙相培養(yǎng)基和酸性羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度的比較，結(jié)果見(jiàn)下表雙相培養(yǎng)基與酸性羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度比較生長(zhǎng)速度(周) 合計(jì)1 2 3 4 5678雙相培基 12567622 166酸羅氏培基 4 624818 642 144上表說(shuō)明，平菇雙相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的166份標(biāo)本中，1周陽(yáng)性者12份(7.23％)，2至3周陽(yáng)性數(shù)分別為56份(33.73％)和76份(45.78％)，4周陽(yáng)性數(shù)為22份(13.25％)；而在酸性羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的144份標(biāo)本中，1周無(wú)生長(zhǎng)，2周陽(yáng)性者4份(2.77％)，3周陽(yáng)性62份(43.06％)，4周48份(33.33％)，4周以后至8周仍有30份(20.83％)。結(jié)果說(shuō)明平菇雙相培養(yǎng)平均生長(zhǎng)時(shí)間12.3天，酸性羅氏培養(yǎng)20.5天，前者平均生長(zhǎng)快8.2天，二者差異非常顯著(P＜0.01)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果，配方合理，方法易行，操作方便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確可靠，價(jià)格低廉，通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)證明，陽(yáng)性標(biāo)本接種雙相培養(yǎng)基14天生長(zhǎng)，尤其適用于基層醫(yī)院，具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
實(shí)施例平菇液相培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.5，枸櫞酸鐵銨0.05，天門冬素2，丙酮酸鈉0.5，甘油10，蒸餾水250，平菇浸出液250，瓊脂粉0.1，滅活小牛血清25。首先將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鐵銨、天門冬素、丙酮酸鈉，甘油用蒸餾水溶解；其次是加入平菇浸出液；第三是用磷酸鹽溶解，調(diào)至PH為6.5-6.7；第四是加入瓊脂粉；第五是高壓滅菌，冷卻，溫度控制在60-65℃；第六是加入羥芐青霉素(50μg/ml)和二性霉素B(50μg/ml)，滅活小牛血清搖勻，置4℃冰箱備用。
平菇固相培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)平菇液相培養(yǎng)基500，瓊脂粉6，滅活小牛血清25。首先在平菇液相培養(yǎng)基加入瓊脂粉；其次是高壓滅菌，冷卻，濕度控制在60℃；第三是加入滅活小牛血清，混勻，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；第四將培養(yǎng)瓶平放，凝固后加入平菇液相培養(yǎng)基，裝好后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)置4℃冰箱保存。
酸羅氏培養(yǎng)基由下列組分制成(用量為重量份)磷酸二氫鉀2.4，硫酸鎂0.24，枸櫞酸鎂0.6，天門冬素3，甘油12，蒸餾水600，馬鈴薯淀粉30，雞蛋液600，2％孔雀綠水溶液20。首先將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素、甘油加入蒸餾水，置于沸水溶液中加熱使之溶解；其次加入馬鈴薯淀粉，繼續(xù)在沸水中加熱30分鐘，不斷攪拌，成為均勻糊狀；第三是冷卻，濕度控制在60℃；第四是加入雞蛋液和2％孔雀綠水溶液，攪拌均勻；第五是用雙層紗布進(jìn)行過(guò)濾，分裝試管；第六是滅菌，85℃流動(dòng)蒸汽滅菌150分鐘，貯存在于4℃冰箱備用。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核菌雙相培養(yǎng)基，它由下述重量配比的原料制成的培養(yǎng)基A、磷酸二氫鉀0.2-1，硫酸鎂0.2-1，枸櫞酸鐵銨0.02-0.1，天門冬素1-5，丙酮酸鈉0.2-1，甘油5-20，蒸餾水150-350，平菇浸出液150-350，瓊脂粉0.05-0.5，滅活小牛血清15-30；B、平菇固相培養(yǎng)基平菇液相培養(yǎng)基200-700，瓊脂粉2-8，滅活小牛血清15-30；
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核菌雙相培養(yǎng)基的制備方法，該方法包括下列步驟A、平菇液相培養(yǎng)基，首先將磷酸二氫鉀、硫酸鎂、枸櫞酸鐵銨、天門冬素、丙酮酸鈉，甘油用蒸餾水溶解；其次是加入平菇浸出液；第三是用磷酸鹽調(diào)整PH6.5-6.7；第四是加入瓊脂粉；第五是高壓滅菌，冷卻，溫度為60-65℃；第六是加入羥芐青霉素和二性霉素B，滅活小牛血清搖勻；B、平菇固相培養(yǎng)基，首先在平菇液相培養(yǎng)基加入瓊脂粉；其次是高壓滅菌，冷卻，溫度為60℃；第三是加入滅活小牛血清，混勻，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；第四將培養(yǎng)瓶平放，凝固后加入平菇液相培養(yǎng)基；
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核菌雙相培養(yǎng)基及其制備方法，它由平菇液相培養(yǎng)基、平菇固相培養(yǎng)基構(gòu)成。在平菇固相培養(yǎng)基中加入平菇液相培養(yǎng)基和瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻，加入滅活小牛血清，混勻裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶平放，凝固后加入平菇液相培養(yǎng)基，裝好后經(jīng)滅菌試管置冰箱保存。本發(fā)明方法易行，操作方便，檢測(cè)快速，準(zhǔn)確可靠，尤其適用于基層醫(yī)院。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1398982SQ0111437
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2001年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者申建維, 袁瑋, 李增煌, 余新華, 李娉 申請(qǐng)人:武漢鋼鐵(集團(tuán))公司