專利名稱：殺蟲融合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有結(jié)合與毒性部分的新型殺蟲融合多肽。其還涉及產(chǎn)生和使用此類多肽的方法和材料，以及分析多肽毒性的分析方法和試劑盒。
現(xiàn)有技術(shù)本領(lǐng)域公知源自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的毒素具有殺蟲特性。自然狀態(tài)下，前毒素大分子(130-160kDa)溶于昆蟲中腸的堿性環(huán)境中。溶解的毒素然后發(fā)生蛋白水解，裂解為更小的片段(30-80kDa)。在δ內(nèi)毒素晶體溶解和活化后，該毒素與特定的中腸細(xì)胞表面受體相結(jié)互作用，在膜內(nèi)形成孔洞。細(xì)胞的離子平衡受到破壞，細(xì)胞裂解。
Bt毒素引起使用者特別注意的地方是其宿主范圍、低濃度毒性，以及使目的昆蟲產(chǎn)生耐藥性的能力。
已報(bào)道了許多研究該諸多問(wèn)題、意欲改善天然毒素的一或多方面的實(shí)驗(yàn)。
這樣一般認(rèn)為頂膜上特定受體的存在對(duì)于Bt毒素的特異性起重要作用(1)。在這種情況下，毒素潛力可依賴于受體豐度及其與該蛋白的親和力，以及該毒素形成孔洞的能力。殺蟲晶體蛋白CryIA(a)和CryIA(c)有82％同源性，但后者對(duì)煙芽夜蛾(heliothisvirescens)和粉紋夜蛾(trichoplusiani)的殺蟲活性比CryIA(a)高10倍(4)。這兩種基因之間的同源掃描和相互重組表明，CryIA(c)的335-450氨基酸與抗T.ni的活性有關(guān)，而同一毒素的335-615氨基酸是完全變成H.virescens特異性所必需的(4)。
總體而言，殺蟲蛋白的特異性是幾種功能的結(jié)果，包括昆蟲中腸蛋白酶的蛋白水解過(guò)程、受體結(jié)合和/或細(xì)胞裂解功能(4)。鱗翅類特異性的殺蟲晶體蛋白的末端缺失結(jié)果表明5’端至第10密碼子或3’端第645密碼子缺失不會(huì)使毒性消失(5)。
通過(guò)點(diǎn)定向突變，Cry毒素暫定為含三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域I與毒素插入到膜內(nèi)有關(guān)并影響離子通道的功能，結(jié)構(gòu)域II與受體結(jié)合和插入到膜內(nèi)有關(guān)，結(jié)構(gòu)域III與離子通道功能、受體結(jié)合以及插入到膜內(nèi)有關(guān)(6)。
在煙草天蛾幼蟲(manduca sexta)和甘藍(lán)蝴蝶(大菜粉蝶(Pierisbrassicae))的刷狀緣膜囊泡上進(jìn)行兩種Btδ內(nèi)毒素Bt2(源自蘇云金芽孢桿菌柏林那亞種(B.thuringiensis berliner)的130kDa重組晶體蛋白)和Bt4412(源自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種(B.thuringiensis thuringiensis)的136kDa晶體蛋白)的結(jié)合研究(12)。Bt2活性蛋白(60kDa)結(jié)合并殺傷兩種昆蟲而Bt4412活性蛋白僅對(duì)煙草天蛾幼蟲有強(qiáng)毒性(12)。該研究表明大菜粉蝶與Bt2和Bt4412毒素具有兩種不同的結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)閮煞N蛋白幾乎并不競(jìng)爭(zhēng)彼此的結(jié)合位點(diǎn)(12)。
自敏感煙草天蛾幼蟲的中腸上皮細(xì)胞克隆得到CryIA(b)毒素的受體(13)。據(jù)測(cè)定該210kDa的膜糖蛋白受體與鈣粘蛋白蛋白質(zhì)超家族具有30-60％相似性，和20-40％同一性。鈣粘蛋白是膜糖蛋白，據(jù)信介導(dǎo)鈣依賴的細(xì)胞積聚和分類(13)。該受體的確切功能尚未得知。但有可能參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)，一種與鈣粘蛋白樣人腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能相類似的功能，后者引導(dǎo)肽類抗生素透過(guò)沿小腸排列的上皮細(xì)胞(13)。認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌毒素主要作用于敏感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞(13)。
另一結(jié)合蛋白質(zhì)純化自煙草天蛾，大小為120kDa(14)。同一蛋白質(zhì)，氨肽酶N，純化自舞毒蛾(Lymantra dyspar(卷葉蛾)刷狀緣膜囊泡(14)。測(cè)試CryIA(a)、CryIA(b)、CryIIA、CryIC、CryIIIA、CryIIB、CryID、CryIF和CryIVD時(shí)，純化自舞毒蛾的氨肽酶N幾乎沒(méi)有結(jié)合活性(14)。相反，純化自煙草天蛾的氨肽酶N與CryIA(a)、CryIA(b)和CryIA(c)有很強(qiáng)的結(jié)合親和力(14)。尚不清楚為何氨肽酶N的結(jié)合活性有此差別。相反推測(cè)蛋白質(zhì)根據(jù)其得以純化的昆蟲來(lái)源不同而產(chǎn)生差別，或該差異反映了所用方法的敏感性的差別(14)。雖然實(shí)驗(yàn)室選擇實(shí)驗(yàn)表明許多昆蟲可產(chǎn)生Bt基因抗性，一農(nóng)作物害蟲，菱形斑紋蛾(plutella xylostella)的戶外群已產(chǎn)生Bt耐藥性(17)。已發(fā)現(xiàn)菱形斑紋蛾的一種常染色體隱性基因?qū)λ姆NBt毒素CryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)和CryIF具有極高抗性(16)。這表明抵抗四種Bt毒素的此類突變導(dǎo)致破壞(其)與作為所有四種Bt毒素之共同受體的單一昆蟲蛋白質(zhì)的結(jié)合(16，18)。這表明確實(shí)可能對(duì)甚至含有多種Bt毒素的植物產(chǎn)生抵抗力。
WO91/17254(加利福尼亞大學(xué)的董事)公開了改善宿主范圍或殺蟲毒素毒性的方法。主要是將殺蟲蛋白與源自苜蓿銀紋夜蛾(autographa californica)的多核多角病毒(MNPV)的特定的腸-上皮-結(jié)合糖蛋白gp64相連接。該糖蛋白據(jù)說(shuō)與上皮細(xì)胞表面受體相互作用，從而使積聚并進(jìn)入到中腸細(xì)胞內(nèi)。另一實(shí)施方案表明CytA蛋白質(zhì)可用來(lái)增強(qiáng)毒性。該蛋白據(jù)說(shuō)與細(xì)胞脂質(zhì)部分的脂肪酸結(jié)合，通過(guò)去污劑樣的作用方式使之得以破壞。未討論抗性(若有的話)。
天然Bt基因的結(jié)合結(jié)構(gòu)域也已由其他的Bt基因替代，從而改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的毒性(見如De Maagd等人(1996)Appl Env Microb 62No 51537-1543)。如上所述，如參見(16)，考慮到可能產(chǎn)生抗性，此策略不會(huì)使特性改善。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以看到新型毒素殺蟲物質(zhì)，尤其是提供另外的方法的或優(yōu)于上述殺蟲物質(zhì)的新型毒素殺蟲物質(zhì)，將對(duì)本領(lǐng)域有所貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)合成高表達(dá)毒性融合蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)基因。這些蛋白質(zhì)包括與提高毒素部分的效能的異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的毒素結(jié)構(gòu)域。該結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選能非特異性地與細(xì)胞膜結(jié)合而不破壞它們的結(jié)構(gòu)域，從而使該毒素結(jié)構(gòu)域在其作用位點(diǎn)濃縮和固定而不需要特殊受體的呈遞。已經(jīng)應(yīng)用Bt-來(lái)源的區(qū)域和碳水化合物結(jié)合部分，例如蓖麻毒蛋白B鏈基因的半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域舉例說(shuō)明。
應(yīng)用采用昆蟲細(xì)胞系和一對(duì)熒光染料的新型改良分析方法，已經(jīng)證實(shí)該表達(dá)產(chǎn)物的毒性優(yōu)于該融合蛋白質(zhì)任一組成部分的毒性。發(fā)展了評(píng)價(jià)融合基因產(chǎn)物毒性的體外生物分析方法，該方法建立在乙錠同源二聚體1和鈣黃綠素(Calcein)AM的基礎(chǔ)上。這兩種熒光團(tuán)早先主要用于活/死毒性分析中(39)。下面將描述本發(fā)明的這些和其它方面的內(nèi)容。
這樣在本發(fā)明第一方面的內(nèi)容中公開了編碼殺蟲融合多肽的核酸分子，包括(i)毒素結(jié)構(gòu)域(ii)能與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而不破壞該膜結(jié)構(gòu)的異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
‘殺蟲的’意思是指具有抗任何一種或多種類型害蟲，尤其是包括昆蟲和其它節(jié)肢動(dòng)物如蛛形綱的有經(jīng)濟(jì)學(xué)意義的非脊椎類害蟲的毒性。昆蟲包括任何發(fā)育時(shí)期的昆蟲。感興趣的昆蟲的具體類別包括鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、蚊科(Culicidae)、蚋科(Simuliidae)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)和雙翅目(Diptera)昆蟲。
‘融合多肽’意思是指含有兩個(gè)或多個(gè)成分的多肽，這些成分是互為異源性的，也就是不是天然存在的單一多肽鏈的一部分?；蛘呖砂ㄟB接區(qū)，該連接區(qū)通過(guò)減少結(jié)構(gòu)域之間的位阻效應(yīng)促使這些結(jié)構(gòu)域折疊成天然構(gòu)象。
‘毒素’是指優(yōu)選以害蟲所能攝入之?dāng)?shù)量對(duì)害蟲產(chǎn)生毒性的物質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的毒素部分可以是合成的或者源自天然來(lái)源，如原核生物、真核生物(包括真菌、植物和動(dòng)物)。尤其想到應(yīng)用已證實(shí)的蛋白質(zhì)毒素(比如，Bt毒素或者植物防御性的異化學(xué)物例如來(lái)自豇蟲或大豆的蛋白酶抑制劑)或其部分。優(yōu)選這些殺蟲劑可殺蟲但對(duì)人類和動(dòng)物無(wú)害。優(yōu)選在細(xì)胞膜具有其確切作用位點(diǎn)的毒素。
上面所提的Bt毒素是非常有效的毒素成分來(lái)源。在本發(fā)明第一方面的最優(yōu)選形式中，該毒素源自Bt cry多肽。這樣在該方面的一實(shí)施方案中該毒素為Bt cryIA(b)或(c)。
融合多肽的‘結(jié)合’結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而不破壞該膜，因此該結(jié)合域本身是無(wú)毒的。
本文中‘非特異性’是指無(wú)需特定的特異性受體。其優(yōu)越性在于減少害蟲通過(guò)在編碼毒素受體的核酸序列內(nèi)發(fā)生突變而產(chǎn)生對(duì)融合物抗性的可能性，因?yàn)榭紤]在Bt抗性中發(fā)生過(guò)這種情況(見參考文獻(xiàn)16、17、18)。其提供除物理方法以外的方法，可用來(lái)最大限度地減少抗性發(fā)生的可能性，也就是播種時(shí)將Bt轉(zhuǎn)化的植物與非-轉(zhuǎn)化植物混合以便最大限度地減少選擇性壓力。
‘結(jié)合’結(jié)構(gòu)域本身是無(wú)毒的，也就是盡管其可以增加毒素結(jié)構(gòu)域的毒性，但在融合蛋白質(zhì)中單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，其本身不引起明顯的或更優(yōu)選地任何的對(duì)細(xì)胞膜的破壞。這樣結(jié)合區(qū)域高效協(xié)助毒素發(fā)揮其作用，但是優(yōu)選不改變?cè)摱舅貦C(jī)理的作用方式，從而提供更高的可預(yù)測(cè)的特異性和反應(yīng)。這在其中該融合蛋白質(zhì)可進(jìn)入動(dòng)物食物鏈中，并且其中該毒素已經(jīng)嚴(yán)格篩選、對(duì)動(dòng)物無(wú)-毒的實(shí)施方案中是非常有用的。
優(yōu)選該結(jié)合結(jié)構(gòu)域與碳水化合物結(jié)合，后者以糖脂和糖蛋白的形式存在于所有的真核細(xì)胞膜的細(xì)胞外側(cè)。因此該結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒍舅劐^定在多種細(xì)胞的作用位點(diǎn)上。
優(yōu)選該細(xì)胞形成害蟲的腸上皮部分。
優(yōu)選將毒素實(shí)際上固定于作用位點(diǎn)，但是即使實(shí)際上(不可逆的)未發(fā)生固定，應(yīng)用異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域仍將作用以提高毒素在其細(xì)胞膜作用位點(diǎn)的有效濃度。
在此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有所有的或部分外源凝集素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知外源凝集素具有與碳水化合物緊密結(jié)合的能力，不同的外源凝集素一般對(duì)不同的糖殘基具有特定的親和力。尤其需要的是具有半乳糖和半乳糖基親和力的結(jié)構(gòu)域，其可以在靶害蟲類別中導(dǎo)致非常廣泛的結(jié)合。
優(yōu)選的外源凝集素是2型核糖體失活蛋白質(zhì)，并應(yīng)用(非-毒性)B鏈。該類型的例子包括(a)相思豆(Abrus precatorius)(相思豆毒素)(b)歐寄生(Viscum album)( 寄生毒素)(c)蒴蓮屬digitata(Adenia digitata)(modeccin)(d)蒴蓮屬volkensii(Adenia volkensii)(volkensin)給出列有上述4種范例的起源和特性的表格(Stirpe等人，1992.植物來(lái)源的核糖體失活蛋白質(zhì)現(xiàn)況與展望(Riobosome-inactivating proteins from plantspresent status and futureprospects)．生物/技術(shù)(Bio/Technology)，10卷，405-412；Barbieri，等人.，1993.植物來(lái)源的核糖體失活蛋白質(zhì)(Riobosome-inactivating proteins from plants).Biochemica etBiophysica Acta，1154卷，237-282)。
最優(yōu)選在核酸中應(yīng)用來(lái)源于蓖麻毒蛋白的蓖麻毒蛋白B鏈基因。蓖麻毒蛋白是毒性糖蛋白，包括兩個(gè)多肽鏈，A和B，它們通過(guò)二硫鍵相連(32)。
B-鏈與細(xì)胞表面的半乳糖苷末端殘基的結(jié)合是通過(guò)位于該肽任何一端的兩個(gè)半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)完成的(34)。在缺乏另一位點(diǎn)時(shí)，兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中的每一個(gè)位點(diǎn)都能與半乳糖和更復(fù)雜的糖結(jié)合，與配體的親和力無(wú)明顯降低(35)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的雙外源凝集素位點(diǎn)蓖麻毒蛋白B鏈突變體具有半乳糖殘基結(jié)合能力蓖麻毒蛋白B鏈上具有兩個(gè)以上的外源凝集素位點(diǎn)的證據(jù)。Bioconjugate，Chem.7卷，651-658；Ferrini，等人.，1995.應(yīng)用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)功能性蓖麻毒蛋白B鏈(Expression of functional ricin B chain using thebaculovirus system).歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.).233卷，772-777)。這表明可能存在其他的細(xì)胞-表面結(jié)合位點(diǎn)。一種可能是蓖麻毒蛋白B鏈本身的甘露糖側(cè)鏈與細(xì)胞表面的甘露糖受體相作用(見Newton等人(1992)生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)267(17)11917-11922；Frankel等人(1997)糖類研究(CarbohydrateResearch)300，3251-258)。
其B鏈與細(xì)胞表面的結(jié)合，例如與具有非還原末端半乳糖殘基的糖綴合物結(jié)合，使得或促進(jìn)蓖麻毒蛋白內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)吞可通過(guò)包殼和非包殼小窩內(nèi)的胞內(nèi)吸收來(lái)完成(見如Frankel等人(1996)蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)9，4371-379；Magnusson和Berg(1993)生物化學(xué)雜志291749-755)。運(yùn)送并釋放自由A鏈至胞漿后，通過(guò)自60s核糖體亞基內(nèi)的真核28sRNA斷裂一個(gè)腺嘌呤殘基來(lái)抑制真核細(xì)胞的細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(33)。幾種最新研究支持蓖麻毒蛋白B鏈的廣泛作用；該多肽據(jù)認(rèn)為不僅與細(xì)胞表面半乳糖殘基相作用，也可能與蓖麻毒蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(44)。經(jīng)內(nèi)涵體囊泡再循環(huán)至細(xì)胞表面的許多受體穿過(guò)跨-高爾基網(wǎng)狀體。細(xì)胞內(nèi)的高爾基體蓖麻毒蛋白結(jié)合位點(diǎn)最密集，也許說(shuō)明半乳糖轉(zhuǎn)移酶在此細(xì)胞器內(nèi)的濃度(45)。已觀察到通過(guò)與半乳糖-末端受體相互作用而進(jìn)入細(xì)胞的蓖麻毒蛋白積聚在高爾基體區(qū)域(45)。
盡管過(guò)去已制備了重組B鏈外源凝集素衍生物，但其一般用于治療應(yīng)用，以便增強(qiáng)A鏈的毒性。因此在許多實(shí)驗(yàn)中已觀察到，利用蓖麻毒蛋白B和A鏈一起構(gòu)建的免疫毒素比僅用例如蓖麻毒蛋白A鏈構(gòu)建的毒素有更強(qiáng)的毒性(見如Vitetta等人，1991 Sem.Cell Biol 2卷，47-58；Timar，等人1991英國(guó)癌癥雜志(Br.J.Cancer)，64卷，655-662；Embleton，等人，1991英國(guó)癌癥雜志，63卷，670-674)。
因此本發(fā)明的第二方面是包括以下部分的核酸分子(i)編碼全部或部分Bt cry多肽的序列和(ii)編碼全部或部分外源凝集素的序列。
可以分離和/或純化自其天然環(huán)境，基本上很純或均質(zhì)的形式，或沒(méi)有或基本沒(méi)有不同于編碼具有所需功能多肽之序列的感興趣種類或來(lái)源的核酸或基因來(lái)提供本發(fā)明的核酸分子和其編碼的多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明的核酸可包括cDNA、RNA、基因組DNA，可以是全部或部分合成的。
術(shù)語(yǔ)‘分離的’包含所有這些可能性。指定DNA序列時(shí)，例如參考圖3(a)-(k)的Seq ID Nos1-11，除非文章另外要求，否則由U替代T的RNA等價(jià)物和簡(jiǎn)并的等價(jià)物以及互補(bǔ)序列也包括在內(nèi)。
優(yōu)選核酸分子的Bt cry毒素-編碼部分包括Seq ID No 1(CryIA(b))或Seq ID No 2(CryIA(c))的全部或部分。
優(yōu)選核酸分子的外源凝集素-編碼部分包括全部或部分Seq ID No3(RTB1)、Seq ID No4(RTB2)或Seq ID No5(RTB3)；如下所述這些來(lái)源于蓖麻毒蛋白B鏈，但是包括導(dǎo)入限制性位點(diǎn)的突變體。
優(yōu)選該核酸分子含有任何一個(gè)Seq ID No 6(CryIA(b)-RTB1)；Seq ID No 7(CryIA(b)-RTB2)；Seq ID No 8(CryIA(b)-RTB3)；Seq ID No 9(CryIA(c)-RTB1)；Seq ID No 10(CryIA(c)-RTB2)或Seq ID No 11(CryIA(c)-RTB3)中所示的CryIA-RTB聯(lián)合體。
需著重指出的是本發(fā)明也涉及編碼天然毒素和結(jié)合分子的變異體的核酸，其可以例如為這些分子的突變體或其它衍生物。尤其包括具有依據(jù)Seq ID No 1到11所修飾的序列的核酸。
在每種情況下，該變異體編碼與天然序列(如Bt Cry或外源凝集素)同源的毒素或結(jié)合產(chǎn)物，并保留那些產(chǎn)物的恰當(dāng)?shù)墓δ芴攸c(diǎn)(例如，分別地，毒性或結(jié)合糖基化的能力)。
相似性或同源性可通過(guò)Attschul等人.(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215403-10的TBLASTN程序來(lái)定義或判定，該程序是在本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用的程序，或者可以優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)程序BestFit，其是Wisconsin軟件包版本8，1994年9月的一部分，(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group)575 Science Drive，Madison，威斯康辛州，美國(guó)，威斯康辛53711)。
同源性可以是核苷酸序列和/或氨基酸序列水平上的。優(yōu)選地，核酸和/或氨基酸序列與作為該變體基礎(chǔ)的序列(例如天然序列，或任一Seq ID Nos 1到11序列)共享大約50％，或60％，或70％，或80％的同源性，最優(yōu)選地至少大約90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。正如可能存在的情況所示，與相關(guān)氨基酸序列或核苷酸序列相比，同源性可以就相關(guān)序列全長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，或更優(yōu)選地可以就大約或多于約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200個(gè)或更多氨基酸(或密碼子)的連續(xù)序列來(lái)說(shuō)。
這樣本發(fā)明的變異序列可以編碼，例如(雜交序列Seq ID Nos 6到11)關(guān)于那些序列的單一氨基酸變化，或2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)變化，大約10、15、20、30、40或50個(gè)變化，或超過(guò)大約50、60、70、80、或90個(gè)變化。除了所述序列編碼的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)改變之外，編碼的變異氨基酸序列可包括C-端和/或N-端其它氨基酸。自然地，包括所編碼氨基酸序列無(wú)變化的核酸的改變(也就是‘簡(jiǎn)并等價(jià)物’)。
應(yīng)用雜交技術(shù)(52)例如應(yīng)用雜交液可以評(píng)價(jià)同源性，該雜交液包括5×SSC(其中‘SSC’＝0.15M氯化鈉；0.15M檸檬酸鈉；pH7)、5×Denhardt氏試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.05％焦磷酸鈉和最高50％的甲酰胺。
計(jì)算完成特定序列同源性的核酸分子之間的雜交所需嚴(yán)格條件的一般公式為(52)Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp(雙鏈)
就上述公式舉例說(shuō)明，采用[Na+]＝0.368和50％的甲酰胺，及GC含量42％和200個(gè)堿基的平均探針長(zhǎng)度，Tm為57℃。同源性每降低1％，DNA雙鏈的Tm降低1-1.5℃。因此，超過(guò)大約75％序列同一性的靶序列可以用42℃雜交溫度觀察。
對(duì)于某些應(yīng)用例如在植物內(nèi)表達(dá)尤其有用的是密碼子使用上的變化(即簡(jiǎn)并中性突變)，以便幫助表達(dá)。例如Cry基因的AU/GC比值明顯不同于植物編碼區(qū)和良好表達(dá)的報(bào)告基因如nptII、bar、gus和cat中的比值(24)。植物編碼區(qū)AU含量一般約為40-50％，而CryI編碼區(qū)AU含量為60-64％，一些區(qū)域超過(guò)70％(24)。同樣，Cry-編碼序列所用密碼子與優(yōu)選使用的植物密碼子明顯不同(25)。一些位點(diǎn)存在不利的密碼子群。改變所用的密碼子可提高翻譯和延伸效率以便使mRNA更穩(wěn)定地抵抗胞質(zhì)RNA酶的活性(23，26)。
此處所述的突變體具有上述增強(qiáng)的結(jié)合特性。
一種分析突變體或其他衍生物的可能方式是通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)評(píng)價(jià)導(dǎo)入到能表達(dá)本發(fā)明之核酸的宿主細(xì)胞內(nèi)的功能，隨后比較該細(xì)胞和轉(zhuǎn)化有其他核酸的細(xì)胞的存活率。利用SF21昆蟲細(xì)胞作為示例，下面詳述了此類轉(zhuǎn)化和分析的方法。另一方法包括應(yīng)用表達(dá)突變體或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物。
產(chǎn)生上述突變體或衍生物的方法包括對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言所熟悉的任何方法。
因此另一方面是產(chǎn)生編碼殺蟲融合多肽的核酸的方法，包括編碼毒素的核酸與編碼異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的連接步驟，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而不破壞之。
或者該方法可包括，或在這之前加上，改變毒素或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列以便產(chǎn)生突變體或衍生物這一步驟，其可通過(guò)在核酸內(nèi)添加、插入、缺失或替換一或多個(gè)核苷酸導(dǎo)致所編碼的多肽中添加、插入、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
可因多種原因需要改變，包括導(dǎo)入或去掉以下特征限制性內(nèi)切酶序列；翻譯后修飾所需的其他位點(diǎn)；所編碼多肽的斷裂位點(diǎn)；所編碼多肽發(fā)生糖基化或脂化等的基序等。可將先導(dǎo)或其他靶序列加到表達(dá)蛋白上以便確定其在表達(dá)后的位置。所有這些可有助于有效克隆和表達(dá)重組形式的活性多肽(如下所述)。
其他所需突變可以是隨機(jī)或點(diǎn)定向誘變，以改變所編碼多肽的活性(如特異性)或親和力或穩(wěn)定性。
容易理解，多肽同源性通過(guò)氨基酸相似性或同一性來(lái)判斷(這種情況下考慮毒素結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的變化)。
相似性可以是保守變化，即一種疏水性殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替換另一疏水性殘基，或一極性殘基替換另一極性殘基，如精氨酸替換賴氨酸、谷氨酸替換天冬氨酸、或谷氨酰胺替換天冬酰胺。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，通過(guò)保守性替換改變多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以不明顯改變此多肽的活性，因?yàn)椴迦朐撔蛄械陌被岬膫?cè)鏈可能能夠形成與替換出的氨基酸的側(cè)鏈相似的鍵和連接。甚至當(dāng)替換發(fā)生于決定該肽構(gòu)象的關(guān)鍵區(qū)域時(shí)也是如此。
具有非-保守性替換的同源體也包括在內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，對(duì)確定其構(gòu)象不是關(guān)鍵性的區(qū)域的替換對(duì)其活性可能無(wú)太大影響，因?yàn)樗鼈儾幻黠@改變?cè)撾牡娜S結(jié)構(gòu)。在確定肽構(gòu)象或活性中關(guān)鍵的區(qū)域，這樣的改變可以賦予該多肽有益特性。實(shí)際上，如上所述的改變可稍稍提高該肽的特性，例如毒性增加或宿主-范圍擴(kuò)廣。
在本發(fā)明一個(gè)方面中，上述的核酸的形式是重組體形式并且優(yōu)選為可復(fù)制載體。
“載體”定義包括，特別是任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或雙鏈或單鏈線性或環(huán)狀形式的Agrobacterium(土壤桿菌屬)binary載體，其可以或不可以自身傳遞和轉(zhuǎn)移，并能通過(guò)整合到細(xì)胞基因組內(nèi)或存在于染色體外(例如具有復(fù)制起始點(diǎn)的自我復(fù)制質(zhì)粒)來(lái)轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。對(duì)于一些應(yīng)用而言尤其適用的是BAC或BiBAC載體。特別包括穿梭載體，即自然地或通過(guò)設(shè)計(jì)能夠在兩個(gè)不同宿主生物體內(nèi)復(fù)制的DNA載體，宿主可選自放線菌或相關(guān)種類，細(xì)菌和真核生物(例如高等植物、哺乳動(dòng)物、酵母或真菌細(xì)胞)。
包含本發(fā)明之核酸的載體無(wú)需含有啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列，尤其是如果應(yīng)用該載體向細(xì)胞中導(dǎo)入核酸以進(jìn)行基因組重組時(shí)。
但是，優(yōu)選載體中的核酸在適宜的啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件的控制之下，并可操作性地與其相連，以便在宿主細(xì)胞例如微生物如細(xì)菌，或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。該載體可以是在多種宿主中發(fā)揮功能的雙-功能表達(dá)載體。就基因組DNA而言，其可含有其自身啟動(dòng)子或其他調(diào)控元件；就cDNA而言，其可以在適宜啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件的控制之下，以便在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
“啟動(dòng)子”意思是指可以啟動(dòng)可操作性地連接到其下游的DNA的(即以雙鏈DNA有義鏈的3’方向)的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
“可操作性連接”是指作為相同核酸分子的一部分連接，適宜定位和定向以便由啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄?？刹僮餍缘嘏c啟動(dòng)子連接的DNA在該啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控下”。
這樣本發(fā)明的此方面提供基因構(gòu)建體，優(yōu)選可復(fù)制載體，包括與如上所述本發(fā)明提供的核苷酸序列例如SEQ ID No 9、10或11操作性相連的啟動(dòng)子。
一般而言，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能夠很好地構(gòu)建載體和設(shè)計(jì)重組基因表達(dá)方案?？蛇x擇或構(gòu)建適宜的載體，其含有適宜的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列、終止片段、多聚腺苷酸序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其它的適當(dāng)序列。細(xì)節(jié)見，例如，分子克隆(MolecularCloning)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版，Sambrook等人，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社。
許多已知的核酸操作技術(shù)和方案，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變(見上)、測(cè)序、向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入DNA和基因表達(dá)，及蛋白質(zhì)分析在分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等人編輯.John Wiley和Sons，1992.中有詳細(xì)描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公開內(nèi)容在此引入作為參考。早先廣泛地成功應(yīng)用于植物的具體方法和載體見Bevan(核酸研究(Nucl.Acids Res.)12，8711-8721(1984))和Guerineau和Mullineaux(1993)(植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)載體(Plant transformationand expression vectors.).于植物分子生物學(xué)Labfax(Cory RRDed))牛津，Bios Scientific Publisher，PP121-148)所述。
本文中具體涉及昆蟲-細(xì)胞載體(例如以桿狀病毒為基礎(chǔ))和植物載體。
在植物中起作用的適宜啟動(dòng)子包括實(shí)際上在全部植物組織中高水平表達(dá)的菜花樣花葉病毒35S(CaMV35S)基因啟動(dòng)子(Benfey等人，1990a和1990b)；在植物頂端分生組織和植物體中幾個(gè)很好定位的部位例如，內(nèi)韌皮部、花原基、根和芽的分支點(diǎn)表達(dá)的菜花樣花葉病毒5啟動(dòng)子(Medford，1992；Medford等人，1991)，和在花極早發(fā)育時(shí)期表達(dá)的擬南芥(Arabidopsis thaliana)Leafy啟動(dòng)子(Weigel等人，1992)。其它的啟動(dòng)子包括水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
在本發(fā)明此方面的一個(gè)實(shí)施方案中提供基因構(gòu)建體，優(yōu)選可復(fù)制載體，包括與本發(fā)明提供的核苷酸序列操作性連接的可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員很好理解應(yīng)用于啟動(dòng)子的術(shù)語(yǔ)“可誘導(dǎo)”一詞。實(shí)際上，在可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子控制下的表達(dá)針對(duì)所施加的刺激“開啟”或增加。啟動(dòng)子之間的刺激特性是不同的。在沒(méi)有適宜刺激物存在的情況下，某些可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子不引起表達(dá)或表達(dá)水平無(wú)法檢測(cè)(或無(wú)表達(dá))。其它的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在無(wú)刺激物存在的情況下引起可檢測(cè)的組成型表達(dá)。在沒(méi)有刺激物的情況下無(wú)論表達(dá)水平如何，在正確刺激物存在的情況下任何可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子導(dǎo)致表達(dá)增加。優(yōu)選的情況是以有效改變表型特性的劑量應(yīng)用相關(guān)刺激物時(shí)，表達(dá)水平增加。因此在無(wú)刺激物存在的情況下(刺激物水平太低以至于不能產(chǎn)生所需表型(且可能實(shí)際為零))，可應(yīng)用導(dǎo)致基礎(chǔ)水平表達(dá)的可誘導(dǎo)性(或‘可開啟’)啟動(dòng)子。加入刺激物時(shí)，表達(dá)增加(或開啟)至產(chǎn)生所需表型的水平。
GST-II-27基因啟動(dòng)子可以是適宜的可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，已發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)能夠用于培育植物的某些化學(xué)化合物來(lái)誘導(dǎo)。在單子葉植物和雙子葉植物中該啟動(dòng)子均行使功能。因此在多種遺傳修飾植物中，包括大田農(nóng)作物例如蕓苔、向日葵、煙草、甜菜、棉花；谷類例如小麥、大麥、水稻、玉米、高粱；水果例如西紅柿、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉和甜瓜；及蔬菜例如胡蘿卜、萵苣和洋蔥，可應(yīng)用該啟動(dòng)子來(lái)控制基因表達(dá)。GST-II-27啟動(dòng)子也適宜用于多種組織中，包括根、葉、莖和生殖組織。其它的啟動(dòng)子包括potatin啟動(dòng)子(塊莖)和泛素啟動(dòng)子(小麥胚)。
該啟動(dòng)子可包括一個(gè)或多個(gè)序列基序或提供發(fā)育和/或組織-特異性表達(dá)調(diào)控的元件。
本文內(nèi)容中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其可以受誘發(fā)物或捕食過(guò)程中觸發(fā)的其它植物信號(hào)影響而反應(yīng)性地開啟。該系統(tǒng)可輔助降低長(zhǎng)期喂食-害蟲的過(guò)程中所產(chǎn)生耐藥性的可能性，其是因?yàn)榻M成性毒性植物所帶來(lái)的篩選壓力造成的。
本發(fā)明提供的方法還包括將這些構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞和/或通過(guò)應(yīng)用適宜刺激物、有效的外源誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)植物細(xì)胞中構(gòu)建體的表達(dá)。
通過(guò)任何適宜的方法例如結(jié)合、移動(dòng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或如下詳述的電穿孔方法可將上述的載體導(dǎo)入宿主中。在本發(fā)明的另一方面中，公開了含有根據(jù)本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞，尤其是植物、昆蟲或微生物細(xì)胞。
應(yīng)用那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可制備用含有該序列的DNA片段轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
因此可應(yīng)用任何的適宜技術(shù)將DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞，例如土壤桿菌屬利用其自然基因轉(zhuǎn)移能力攜帶的雙臂(disarmed)Ti-質(zhì)粒載體(EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR12(22)8711-87215，1984)、顆粒或微粒轟擊(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)微注射(WO 92/09696，WO 94/00583、EP 331083、EP 175966，Green等人.(1987)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)(Plant Tissue and CellCulture)，Academic Press)、電穿孔(EP290395、WO 8706614 GelvinDebeyser)其他形式的定向DNA攝取(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(例如，F(xiàn)reeman等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol).291353(1984))、或震蕩方法(例如Kindle，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，美國(guó).871228(1990d))。在Oard，1991，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotech.Adv.)91-11中綜述了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的物理方法。
那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員廣泛應(yīng)用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化雙子葉種類。近來(lái)，在幾乎所有的經(jīng)濟(jì)相關(guān)單子葉植物中常規(guī)制備穩(wěn)定能育轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)步(Toriyama，等人.(1988)生物/技術(shù)(Bio/Technology)6，1072-1074；Zhang，等人.(1988)PlantCell Rep.7，379-384；Zhang，等人.Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto，等人(1989)自然(Nature)338，274-276；Datta，等人.(1990)生物/技術(shù)8，736-740；Christou，等人.(1991)生物/技術(shù)9，957-962；Peng，等人.(1991)國(guó)際水稻研究所(International Rice Institute)，馬尼拉，菲律賓563-574；Cao，等人.(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li，等人.(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore，等人.(1993)植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biolgy)21，871-884；Fromm，等人.(1990)生物/技術(shù)8，833-839；Gordon-Kamm，等人.(1990)植物細(xì)胞(PlantCell)2，603-618；D’Halluin，等人.(1992)植物細(xì)胞4，1495-1505；Walters，等人.(1992)植物分子生物學(xué)18，189-200；Koziel，等人.(1993)生物技術(shù)(Biotechnology)11，194-200；Vasil，I.K.(1994)植物分子生物學(xué)25，925-937；Weeks，等人.(1993)植物生理學(xué)(Plant Physiology)102，1077-1084；Somers，等人.(1992)生物/技術(shù)10，1589-1594；WO92/14828)。特別地，現(xiàn)在土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也成為單子葉植物中的另一種高效轉(zhuǎn)化方法(Hiei等人.(1994)植物雜志(The Plant Journal)6，271-282)。
在土壤桿菌屬無(wú)效或無(wú)作用時(shí)優(yōu)選微粒轟擊、電穿孔和直接DNA攝取?；蛘呖梢越Y(jié)合應(yīng)用不同的技術(shù)來(lái)提高轉(zhuǎn)化過(guò)程的效率，例如用包被有土壤桿菌的微顆粒進(jìn)行轟擊(EP-A-486234)或微粒轟擊以便誘導(dǎo)損傷，然后用土壤桿菌屬共同培養(yǎng)(EP-A-486233)。
轉(zhuǎn)化技術(shù)的具體選擇將通過(guò)其轉(zhuǎn)化某些植物種類的效率和用特定選擇方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明的人的經(jīng)驗(yàn)和偏好來(lái)決定。很顯然，對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的具體選擇是非必須的或不限制本發(fā)明，植物再生技術(shù)的選擇同樣如此。如果需要的話，可應(yīng)用由嵌合基因組成的可選擇性遺傳標(biāo)志，其提供例如對(duì)抗生素如卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素(phosphinotricin)、氯磺隆、氨甲蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮和草甘膦耐藥的可選擇性表型。
本領(lǐng)域已經(jīng)報(bào)道許多轉(zhuǎn)化有Bt基因的植物。具體而言，應(yīng)用合成的CryIA(b)已經(jīng)獲得抵抗歐洲玉米蛀蟲極高度和反復(fù)感染的轉(zhuǎn)基因玉米(27)。用天然Bt基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化無(wú)法產(chǎn)生可檢測(cè)水平的蛋白質(zhì)，而將G-C含量由38％提高至65％產(chǎn)生了在玉米中高度表達(dá)的基因(27)。在核苷酸水平上此CryIA(b)基因與天然基因具有大約65％的同源性并且按照密碼子應(yīng)用狀況將其設(shè)計(jì)組裝到玉米基因中(27)。這樣在本發(fā)明之向植物導(dǎo)入殺蟲-融合基因以便表達(dá)的那些方面中，需要相應(yīng)地如(27)中所述改變密碼子應(yīng)用狀況以便提高多肽的產(chǎn)量。
這樣本發(fā)明的另一方面提供轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中并且致使或允許該載體和該植物細(xì)胞基因組之間重組以便將該核苷酸序列導(dǎo)入基因組中。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)化有本發(fā)明之核酸或載體的宿主細(xì)胞，尤其是植物或微生物細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(也就是對(duì)正討論的核酸的轉(zhuǎn)基因)中該轉(zhuǎn)基因可以在外-基因組載體上或優(yōu)選牢固地?fù)饺牖蚪M中。每個(gè)單倍體基因組可有一個(gè)以上的核苷酸序列。這樣在本發(fā)明此方面的一個(gè)實(shí)施方案中提供其基因組中已摻入本發(fā)明核酸的植物細(xì)胞，該核酸受控制表達(dá)的調(diào)控序列的操作性控制。編碼序列可以可操作性地與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列連接，該調(diào)控序列可以是與殺蟲融合多肽基因異源或外源的，即與該基因表達(dá)的任一部分無(wú)天然聯(lián)系。本發(fā)明的核酸可置于在外部可誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子的控制下，從而將表達(dá)置于使用者的控制之下。
一般說(shuō)來(lái)，在轉(zhuǎn)化之后，植物可以從例如，單細(xì)胞、愈傷組織或葉片再生，這是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。幾乎任何的植物能從該植物的細(xì)胞、組織和器官完全再生。在Vasil等人.，細(xì)胞培養(yǎng)和植物體細(xì)胞遺傳學(xué)(Cell Culture and Somatic Cell Genetics)，卷I、II、III，實(shí)驗(yàn)室方法及其應(yīng)用，Academic Press，1984和Weissbach和Weissbach，植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant MolecularBiology)，Academic Press，1989中綜述了可以使用的技術(shù)。
已經(jīng)能夠在谷類水稻、玉米、小麥、燕麥和大麥中實(shí)現(xiàn)能育轉(zhuǎn)基因植物的增升(見綜述Shimamoto，K.(1994)生物技術(shù)的當(dāng)前觀點(diǎn)(Current Opinion in Biotechnology)5，158-162；Vasil等人.(1992)生物/技術(shù)10，667-674；Vain等人.1995生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnology Advances)13(4)653-671；Vasil，1996，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)14 702頁(yè))。
除了再生的植物，本發(fā)明包括下面所有內(nèi)容這樣一種植物的克隆、種子、自交或雜交子代和后代(例如F1和F2后代)及任何這些東西的任何部分，例如插條、種子。
本發(fā)明還提供取自這樣一種植物的植物繁殖體，其為可用于再生或繁殖的任何有性或無(wú)性部分，包括插條、種子等等。
本發(fā)明的植物可以是一或多種特性根本無(wú)法培育的植物?？梢耘懦参锲贩N，特別是根據(jù)植物培育者權(quán)利可注冊(cè)的植物品種可除外。注意不必僅因?yàn)槠浠蚪M中穩(wěn)定含有導(dǎo)入該植物的細(xì)胞或其祖細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因就認(rèn)為該植物是‘植物品種’。
本發(fā)明還提供影響或改變植物對(duì)害蟲毒性的方法，包括造成或使得上述殺蟲融合多肽基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明還提供包括在早先將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞或其祖先的細(xì)胞中的步驟之后該本發(fā)明核酸(例如圖3所示，或該序列的突變體、等位基因或衍生物)在植物細(xì)胞中(從而產(chǎn)生該編碼多肽)表達(dá)的方法。這些方法將影響或改變植物對(duì)于特定害蟲的抵抗性。優(yōu)選植物將有對(duì)此害蟲的免疫力，即在任何已知的情況下此害蟲將不消耗或損傷該植物。或者與非轉(zhuǎn)化植物相比抵抗性可高或低(即損害低于平均水平)。
自然地本發(fā)明還包括任何所公開的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物及通過(guò)在適宜條件下，在適宜的宿主細(xì)胞中，編碼核酸的表達(dá)而產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物的方法。表達(dá)后，可從表達(dá)系統(tǒng)(如微生物)中分離該產(chǎn)物并可以根據(jù)需要用于例如包括至少一種附加成分(例如液體載體)的組合物的制備。這些殺蟲組合物可用作例如，噴霧劑，尤其在與已事先采用該融合蛋白質(zhì)的毒性成分的情形相似的情況下。
這樣，對(duì)經(jīng)這樣一種組合物處理的害蟲之攻擊敏感的植物或其它物品，也是本發(fā)明的一部分。
或者該多肽產(chǎn)物可如上所述在體內(nèi)或在原位行使其功能。
因此本發(fā)明還包括防制害蟲的方法，包括應(yīng)用本發(fā)明多肽(或組合物或含有其的宿主細(xì)胞)，尤其是殺死害蟲的方法，包括向害蟲給予或造成或使得其攝入該多肽(或組合物或含有其的宿主細(xì)胞)。
采用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可應(yīng)用本發(fā)明的純化多肽制備抗體。抗體和包括抗體的抗原-結(jié)合片段的多肽可以用于例如多肽的分析，或?qū)ζ溥M(jìn)行標(biāo)記。
制備抗體的方法包括用蛋白質(zhì)或及其片段免疫哺乳動(dòng)物(例如人、小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或猴)。應(yīng)用任何本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)可從免疫動(dòng)物中獲取抗體，并且優(yōu)選應(yīng)用抗體與目的抗原的結(jié)合進(jìn)行篩選。例如，可應(yīng)用Western印跡技術(shù)或免疫沉淀(Armitage等人，1992，自然(Nature)35780-82)。抗體可以是多克隆的或單克隆的?？贵w可通過(guò)多種方法修飾。實(shí)際上術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)理解為涵蓋任何具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合物。這樣，該術(shù)語(yǔ)涵蓋抗體片段、抗體衍生物、功能等價(jià)物和同系物，包括任何含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然或合成多肽。因此與其它多肽融合的含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等價(jià)體的嵌合分子包括在內(nèi)。嵌合抗體的克隆和表達(dá)見EP-A-0120694和EP-A-0125023中所述。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)整個(gè)抗體的片段能行使結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的示例為(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的V1和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward，E.S.等人.，自然341，544-546(1989))；(v)分離的CDR區(qū)域；(vi)F(ab’)2片段，含有兩個(gè)相連Fab片段的二價(jià)片段(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽連接物連接，該連接物使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接以產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等人，科學(xué)(Science)，242，423-426，1988；Huston等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，美國(guó)，85，5879-5883，1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)“diabodies”，通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)體或多特異性片段(WO94/13804；P Holliger等人.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，美國(guó)，90 6444-6448，1993)。
Diabodies是多肽的多聚體，每一個(gè)多肽具有含免疫球蛋白輕鏈結(jié)合區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域和含免疫球蛋白重鏈結(jié)合區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，將兩結(jié)構(gòu)域連接(例如通過(guò)肽連接物)但不能相互結(jié)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)多聚體中一多肽的第一結(jié)構(gòu)域與多聚體中另一多肽的第二結(jié)構(gòu)域的連接來(lái)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(WO94/13804)。
作為免疫哺乳動(dòng)物的替代物或補(bǔ)充物，例如應(yīng)用表面具有功能性免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的λ噬菌體或絲狀噬菌體；例如見WO92/01047，可從表達(dá)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的重組制備文庫(kù)中獲取具有適宜結(jié)合特異性的抗體。
在本發(fā)明的又一方面公開了評(píng)價(jià)多肽對(duì)具體物種之毒性的方法，包括(i)將編碼所述多肽的核酸導(dǎo)入該物種的宿主細(xì)胞，(ii)導(dǎo)致或使該核酸在該物種的宿主細(xì)胞中表達(dá)，
(iii)觀察該細(xì)胞的存活力并使觀察結(jié)果與該多肽的毒性相聯(lián)系。
如上所述可完成該毒素的導(dǎo)入和表達(dá)。為最大限度地減少轉(zhuǎn)錄中的任何變異優(yōu)選應(yīng)用已充分表征的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，可能僅通過(guò)視覺(jué)觀察，或應(yīng)用EM觀察，來(lái)評(píng)價(jià)存活力。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括應(yīng)用評(píng)價(jià)酯酶活性或膜完整性的測(cè)定法，例如以乙錠同源二聚體1、鈣黃綠素AM或臺(tái)盼藍(lán)(見分子探針(Molecular Probes)，產(chǎn)品說(shuō)明書，活/死/細(xì)胞毒性試劑盒，L-3224)為基礎(chǔ)的測(cè)定法。乙錠同源二聚體1和鈣黃綠素AM分別測(cè)定細(xì)胞存活力-質(zhì)膜完整性和細(xì)胞內(nèi)酯酶活性的不同方面(40，41)。
盡管以前在活/死分析(39)中應(yīng)用過(guò)這些發(fā)色團(tuán)，其應(yīng)用還未涉及過(guò)特異性導(dǎo)入的毒素-編碼核酸。
膜完整性分析對(duì)于測(cè)定考慮作用于膜的毒素(例如以Bt cry為基礎(chǔ)的毒素)是非常有用的。
本發(fā)明的測(cè)定格式具有許多有用特征-尤其是不用外加細(xì)胞毒性試劑。這便無(wú)需檢測(cè)該細(xì)胞毒性試劑及其純度。
因此在本文中該多肽可以是上述的殺蟲性多肽。該宿主細(xì)胞將來(lái)自適宜的害蟲，例如昆蟲細(xì)胞。
優(yōu)選將存活力評(píng)價(jià)結(jié)果與不表達(dá)該毒素、但其中已隨意導(dǎo)入了其它異源核酸的對(duì)照細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行比較。此比較將提高可獲得相關(guān)性的可信性。
桿狀病毒是本方法中應(yīng)用的非常有效的載體，因?yàn)閼?yīng)用這些載體的蛋白質(zhì)合成是瞬間的(Miller(1988)微生物年度綜述(Ann RevMicrobiol)42177-199)。在對(duì)照細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中與該蛋白質(zhì)濃度相同的其它東西將穩(wěn)定增加共存的毒性效應(yīng)，其嚴(yán)重程度將由該蛋白質(zhì)的LC50來(lái)測(cè)定。
參考下面的非-限制性圖表和實(shí)施例，本發(fā)明將進(jìn)一步得到說(shuō)明。根據(jù)這些說(shuō)明本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本發(fā)明范圍內(nèi)的其他實(shí)施方案。
附1-在Sf21細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因水稻植物中表達(dá)的構(gòu)建體。(A)蓖麻毒蛋白B-鏈(RTB)的點(diǎn)定向誘變以衍生跨越半乳糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(綠盒)的3’末端片段。將錯(cuò)配的寡核苷酸LF1、LB1、LB2和LB3用于導(dǎo)入新的EcoRI(LF1)和HindIII(LB1、LB2和LB3)位點(diǎn)。獲得三個(gè)RTB片段并命名為RTB1、RTB2和RTB3。(B)對(duì)照物和融合盒的示意圖。橙色盒表示Bt cry1Ab和cry1Ac序列，粗線為RTB片段。pB和pC構(gòu)建體是Bt對(duì)照物，pR1、pR2和pR3構(gòu)建體是RTB對(duì)照，pBR1、pBR2、pBR3、pCR1、pCR2和pCR3是融合構(gòu)建體。僅顯示pBR1限制性位點(diǎn)，但適用于所有的構(gòu)建體。將位點(diǎn)簡(jiǎn)寫如下B＝BamHI、Ec＝EcoRI、Eh＝EheI、H＝HindIII。(C)轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，在含有玉米泛素-1啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子及nos終止子的pAC76載體中克隆該11個(gè)構(gòu)建體。限制性位點(diǎn)簡(jiǎn)寫為Eh＝EheI、H＝HindIII、S＝SmaI。
圖2-以轉(zhuǎn)基因水稻莖和對(duì)照物為食的枝干蛀蟲幼蟲的生存、生長(zhǎng)和發(fā)育。圖示在4天后的昆蟲平均存活率±SE(6個(gè)新生幼蟲的初始接種物)。每一數(shù)值代表除對(duì)照外4個(gè)重復(fù)的生物分析的平均值，對(duì)照代表6次重復(fù)的生物分析。
圖3(a)到(k)-顯示CryIA(b&c)、蓖麻毒蛋白B鏈基因片段和在多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下將融合基因克隆到pFASTBAC1中的核苷酸序列。該序列為Seq ID Nos 1-11。所有序列按照5’-3’方向閱讀。自第97核苷酸開始的ATG密碼子是CryIA(b&c)基因和所有融合基因的翻譯起始位點(diǎn)。就蓖麻毒蛋白B鏈片段而言自第125位核苷酸開始的ATG密碼子為翻譯起始位點(diǎn)。所有基因終止于SV40多聚腺苷酸序列。采用的終止密碼子為TAG和TAA，其位置(按照5’-3’方向閱讀序列的話)因每一基因的長(zhǎng)度而變化。若以3’-5’方向閱讀序列的話，兩種密碼子TAG和TAA分別位于17和7位的核苷酸。
實(shí)施例材料.所有限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶和所有限制性酶購(gòu)自Boehringer Manheim(英國(guó))。QUIAGEN質(zhì)粒試劑盒和QUIAquick凝膠提取試劑盒購(gòu)自QUIAGEN。pGEM-T克隆載體購(gòu)自Promega(英國(guó))。乙錠同源二聚體1和鈣黃綠素AM購(gòu)自分子探針歐洲BV(荷蘭)。pFASTBAC1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體、TC-100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基、胎牛血清、cellfectin和DH10BAC全能細(xì)胞購(gòu)自GIBCO BRL(英國(guó))。本研究所使用的蓖麻毒蛋白B鏈基因(pWBT質(zhì)粒)和抗-蓖麻毒蛋白B鏈抗體由Warwick大學(xué)的L.Roberts博士惠贈(zèng)。含有CryIA(b)和CryIA(c)基因的pUBB和pUBC質(zhì)粒由加拿大渥太華大學(xué)I.Altosaar博士惠贈(zèng)，并如同所述(Sardana等人，1996)。所有使用的引物由Genosys生物技術(shù)(英國(guó))合成。
實(shí)施例1毒素基因的制備對(duì)蓖麻毒蛋白B鏈基因進(jìn)行點(diǎn)定向誘變。將4種誘變寡聚核苷酸用于PCR反應(yīng)，以便在pWT質(zhì)粒內(nèi)的蓖麻毒蛋白B鏈的所選擇位點(diǎn)產(chǎn)生EcoRI和HindIII限制性位點(diǎn)(Wales等人，1991)-見


圖1A。五種誘變寡聚核苷酸(有下劃線的為突變堿基)為L(zhǎng)F1＝5′CAACAACAAAGGAATTCATGCTGATG 3′LB1＝5′GGACACACACACTGCAAGCTTGTAATC 3′LB2＝5′CGGATCCGAAAGCTTCACATCTAACAC 3′LB3＝5′GCTTGCAAGCTTAGACCATATAGCCC 3′在含有1X PCR緩沖液(Boehringer Mannheim)、200mM每種dNTP、15mM MgCl2、300nM每種引物、2.6單位酶混合物(BoehringerMannheim)和70ng pBWT質(zhì)粒DNA的50ml總體積內(nèi)進(jìn)行PCR誘變。開始的變性步驟為94℃ 2分鐘，然后是10次固定的擴(kuò)增循環(huán)(94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分鐘)，然后是另一進(jìn)行性延長(zhǎng)的20個(gè)循環(huán)(94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分鐘；延伸步驟每循環(huán)增加5秒)。最后的延伸步驟是72℃進(jìn)行7分鐘。通過(guò)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物大小，純化之(QIA-quick凝膠提取試劑盒，Qiagen)并亞克隆到pGEM-T載體(Promega)內(nèi)。通過(guò)EcoRI和HindIII酶切來(lái)確定插入物的大小和方向。
應(yīng)用M13/pUC19引物(Gibco BRL)和BIG DYE測(cè)序試劑盒(Boehringer Mannheim)進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)原來(lái)的RTB序列。應(yīng)用PTC-200 Peltier熱循環(huán)儀(M.J.Research Inc.)進(jìn)行循環(huán)測(cè)序。
實(shí)施例2桿狀病毒載體內(nèi)融合物的制備桿狀病毒系統(tǒng)回顧先前已發(fā)現(xiàn)苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)(Ac)昆蟲桿狀病毒和家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒(MNPV)是異源蛋白的多能高水平表達(dá)載體(6，7，13，17)。這主要是由于桿狀病毒復(fù)制循環(huán)的獨(dú)特性質(zhì)所致，包括病毒編碼基因在四個(gè)短暫而不同的時(shí)相中的系列表達(dá)(2，7，10，18)。前三個(gè)階段產(chǎn)生侵犯其他細(xì)胞并因而播散感染的感染性病毒顆粒。最后，基因表達(dá)的極晚時(shí)期(開始于轉(zhuǎn)染后約18小時(shí))，病毒顆粒包納入稱為多角體蛋白的晶體蛋白結(jié)構(gòu)中(7)。多角體蛋白基因不是產(chǎn)生病毒顆粒所必需的，可由外源編碼序列取代(7，27)。由于多角體蛋白基因是在基因表達(dá)的晚期表達(dá)的，其可由編碼毒性蛋白的序列替代而不影響病毒的感染能力。
已發(fā)現(xiàn)幾種殺蟲晶體毒素可在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。將完整的殺蟲晶體蛋白基因cryIA(b)克隆到AcNPV中，替代多角體蛋白基因(8)。應(yīng)用桿狀病毒載體在鱗翅類昆蟲細(xì)胞中也成功表達(dá)了全長(zhǎng)和截短的細(xì)菌CryIVD滅蚊蛋白(11)。
克隆入pFASTBAC1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。
通過(guò)BamHI和EcoRI酶切自原質(zhì)粒(pUBB和pUBC(46))切除Cry1Ab和Cry1Ac基因，亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC Hb(Gibco)中。重組質(zhì)粒用EcoRI和HindIII酶切以便定向亞克隆蓖麻毒蛋白基因片段。產(chǎn)生六個(gè)中間pFASTBAC Hb融合構(gòu)建體，表示兩個(gè)Bt基因每個(gè)融合到三種RTB片段之一中。用Eco47III和EcoRI(CryIAb)或EcoRI和XhoI(CryIAc)酶切這些構(gòu)建體，用綠豆核酸酶將斷端切平以便在重新連接時(shí)使Bt和RTB編碼區(qū)域在讀框內(nèi)連接(
圖1)。然后用StuI和HindIII酶切重組質(zhì)粒，以便將融合構(gòu)建體定向亞克隆到同樣酶切的載體pFASTBAC1中，后者的多接頭側(cè)翼是Tn7連接位點(diǎn)。pFASTBAC1載體也分別用BamHI和EcoRI或EcoRI和HindIII酶切以便分別亞克隆兩種未修飾的Bt基因和RTB片段作為對(duì)照。
點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)位。
將重組pFASTBAC1轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希氏桿菌細(xì)胞DH10BAC株中(Gibco BRL)。這些細(xì)胞含有帶Tn7連接位點(diǎn)的修飾的桿狀病毒基因組，以及提供Tn7轉(zhuǎn)位酶的質(zhì)粒，以便使在pFASTBAC1中克隆的盒點(diǎn)-特異性地轉(zhuǎn)位到桿狀病毒基因組中。分離白色克隆，從中按文獻(xiàn)所述(37)純化高分子量DNA。
應(yīng)用PCR和M13/PUC19引物證實(shí)重組桿粒。50μl PCR反應(yīng)液中應(yīng)用5微升10 X PCR緩沖液、一微升10X dNTP混合物、1.25μl 10μM每種引物原液、1.5μl 50mM MgCl2、2.5μl 1％去污劑W-1溶液、一微升模板DNA和2.5單位Taq聚合酶。在93℃溫育3分鐘后，如下進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)94℃45秒、55℃45秒和72℃5分鐘(37)。取10微升PCR反應(yīng)液在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳觀察。
載體構(gòu)建結(jié)果。
獲得三個(gè)蓖麻毒蛋白B鏈基因的末端缺失片段。應(yīng)用限制性酶EcoRI和HindIII酶切所產(chǎn)生的pGEM-T重組載體，得到預(yù)期的三種蓖麻毒蛋白B鏈基因缺失片段RTB1、RTB2和RTB3。對(duì)于RTB3(480bp，AA1-AA139)使用引物L(fēng)F1xLB3；對(duì)于RTB2(739bp，AA1-AA236)使用引物L(fēng)F1xLB2；對(duì)于LB1(841bp，AA1-AA262)使用引物L(fēng)F1xLB1。
然后將三種蓖麻毒蛋白B鏈片段與兩種Bt基因融合(應(yīng)用每一基因的EcoRI位點(diǎn))以得到六種不同的翻譯融合蛋白。通過(guò)限制性酶切證實(shí)這六種翻譯融合蛋白基因(結(jié)果未列)。
然后在多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下將該融合基因轉(zhuǎn)位至桿狀病毒基因組中。應(yīng)用M13/PUC引物通過(guò)PCR證實(shí)點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)位是成功的。該引物指向桿狀病毒基因組的Tn7連接位點(diǎn)。僅此區(qū)(無(wú)任何構(gòu)建體)的PCR反應(yīng)產(chǎn)生300堿基對(duì)的片段。若該區(qū)與非重組pFASTBAC1DNA發(fā)生轉(zhuǎn)位，應(yīng)用M13/PUC19引物該區(qū)的PCR產(chǎn)生2300堿基對(duì)的DNA片段。PCR結(jié)果(未列)證實(shí)整個(gè)翻譯融合蛋白基因表達(dá)盒發(fā)生了成功轉(zhuǎn)位，這一點(diǎn)由超過(guò)2300堿基對(duì)大小的片段相應(yīng)增加來(lái)指明。然后將這些重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染到Sf21昆蟲細(xì)胞中。自感染的昆蟲細(xì)胞提取的高分子量DNA也證實(shí)(用M13/PUC引物通過(guò)PCR)昆蟲細(xì)胞發(fā)生了成功感染(結(jié)果未列)。
實(shí)施例3表達(dá)殺蟲融合多肽之宿主細(xì)胞的產(chǎn)生用重組桿粒(bacmid)DNA轉(zhuǎn)染Sf21昆蟲細(xì)胞。在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中將一百萬(wàn)Sf21昆蟲細(xì)胞接種到2ml含10％胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)血清和抗生素的培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，鋪上1ml轉(zhuǎn)染混合物(5微升重組桿粒DNA、800μl無(wú)血清和抗生素的TC-100培養(yǎng)基和6微升cellfectin)作用5小時(shí)(37)。去掉轉(zhuǎn)染混合物后細(xì)胞然后覆蓋有完全TC-100培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)中培養(yǎng)48小時(shí)。收集上清中的病毒(首次接種物)，細(xì)胞在2毫升完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48小時(shí)，收集病毒(二次接種物)。實(shí)驗(yàn)中采用第二次的上清作為接種物來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)的最佳時(shí)間。對(duì)所有的感染而言，吸出細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入250μl接種物將細(xì)胞1小時(shí)(m.o.＝5)。一小時(shí)后去掉接種物，加入兩毫升含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞。在60小時(shí)內(nèi)分析蛋白質(zhì)的表達(dá)。在每一分析階段末用蛋白裂解緩沖液(62.5mM Tris-HCl、2％SDS)裂解細(xì)胞。然后將15微升蛋白樣品上樣到12.5％聚丙烯酰胺凝膠上，用抗蓖麻毒蛋白B鏈抗體或抗-CryIA(c)抗血清進(jìn)行Western印跡分析。
蛋白質(zhì)表達(dá)的Western印跡分析結(jié)果。
60小時(shí)內(nèi)分析桿狀病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。在2、20、24、34、48和60小時(shí)后p.i.收集細(xì)胞樣品，用染料結(jié)合方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度(47)。蛋白質(zhì)樣品(20μg)在12.5％SDS-PAGE上分級(jí)分離并按照廠家說(shuō)明用半干式電轉(zhuǎn)移印跡槽(Bio-Rad)將之轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Hybond C；Amersham)。用抗Cry1Ab和Cry1Ac的抗血清(Ms.S.Bano-Maqbool，植物分子生物學(xué)中心(Centre forExcellence in Plant Molecular Biology)，巴基斯坦)或抗RTB的抗血清(L.Roberts博士，Warwick大學(xué)，英國(guó))對(duì)濾膜進(jìn)行檢測(cè)。我們使用堿性磷酸酶(AP)綴合的抗兔IgG(Fc)(Promega)作為二抗，按照提供者的建議進(jìn)行檢測(cè)。
對(duì)RTB1、RTB2和RTB3而言(對(duì)照構(gòu)建體僅含蓖麻毒蛋白片段)，蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染后約20小時(shí)開始表達(dá)，并不斷增加，直到60小時(shí)，在34小時(shí)左右最佳。在48小時(shí)(RTB1)、34小時(shí)(RTB2)和24小時(shí)(RTB3)檢測(cè)到意外的低分子量蛋白帶，可能是降解產(chǎn)物。這樣尤其第三個(gè)蓖麻毒蛋白B鏈基因缺失片段RTB3看起來(lái)并不穩(wěn)定，并在合成后降解。
就CryIA(a)和CryIA(c)基因及融合蛋白而言，早在20小時(shí)就檢測(cè)到了降解產(chǎn)物，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)在昆蟲細(xì)胞中對(duì)降解敏感。
實(shí)施例4體外毒性分析確定熒光團(tuán)最佳濃度。
染料的最佳濃度隨細(xì)胞類型而不同。以下實(shí)驗(yàn)是為了確定產(chǎn)生足夠(強(qiáng))信號(hào)的最低染料濃度。將健康生長(zhǎng)的細(xì)胞收集到微量離心管中，用1000μlDulbecco’S磷酸緩沖鹽水洗一次。半數(shù)細(xì)胞加入30％甲醇處理30分鐘，使細(xì)胞死亡。分別采用死細(xì)胞和活細(xì)胞樣品，每份細(xì)胞與0.1-12.8μM不同濃度的乙錠同源二聚體1溫育30分鐘。活細(xì)胞和死細(xì)胞的樣本也分別與不同水平的鈣黃綠素AM溫育(0.1-12.8μM)。在普通的熒光顯微鏡下觀察著色細(xì)胞。6.8μM乙錠同源二聚體1的濃度足以使死細(xì)胞的核標(biāo)記成亮紅色。0.4μM鈣黃綠素AM的濃度足以使活細(xì)胞標(biāo)記成綠色。然后將兩種熒光團(tuán)混合一起，得到含6.8μM乙錠同源二聚體1和0.4μM鈣黃綠素AM的D-PBS溶液，用來(lái)對(duì)死細(xì)胞和活細(xì)胞樣品進(jìn)行染色。從這些結(jié)果得出結(jié)論所選濃度的兩種熒光團(tuán)可以可靠地用來(lái)評(píng)價(jià)感染細(xì)胞的存活力。
96小時(shí)內(nèi)存活/死亡存活力/細(xì)胞毒性分析。
對(duì)每種感染而言將一百萬(wàn)細(xì)胞接種到35mm培養(yǎng)皿中過(guò)夜培養(yǎng)(每種重復(fù)7次)。從細(xì)胞吸出培養(yǎng)基，加入250μl接種物。進(jìn)行14種不同的感染，包括(a)用培養(yǎng)基感染的昆蟲細(xì)胞模擬物(b)用非-重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞(c)用含gus基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞(d)分別用含CryIA(b)、CryIA(c)、RTB1、RTB2和RTB3之編碼序列的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞。
(e)分別用六種不同的融合基因感染的昆蟲細(xì)胞。
感染后34小時(shí)裂解感染的細(xì)胞，提取DNA。裂解緩沖液組成和提取方法按照King和Possee所述(38)。在用M13/PUC引物的PCR反應(yīng)中該DNA用來(lái)核實(shí)Sf 21昆蟲細(xì)胞的感染成功與否。在感染后2、24、34、48、72和96小時(shí)分析每種感染的一個(gè)培養(yǎng)皿的感染細(xì)胞。以5000 x g離心細(xì)胞，用無(wú)菌的組織培養(yǎng)級(jí)Dulbecco’S磷酸緩沖鹽水(D-PBS)洗一次。將細(xì)胞小心重懸于50μl活/死(細(xì)胞)分析試劑(6.8μM乙錠同源二聚體1和0.4μM鈣黃綠素AM，溶解于D-PBS)，室溫溫育30分鐘。30分鐘后，自細(xì)胞取出40μl分析試劑，棄之。現(xiàn)在如果未受破壞，細(xì)胞應(yīng)沉積于微量離心管的底部。將剩余的10μl細(xì)胞濃縮液置于顯微鏡載玻片上，在熒光顯微鏡下以400x的放大倍數(shù)(485±11nm)拍照。
乙錠同源二聚體1與DNA緊密結(jié)合，發(fā)出深紅色熒光，但它是親水分子，無(wú)法穿過(guò)活細(xì)胞膜。鈣黃綠素AM是可自由擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的中性分子。其由細(xì)胞內(nèi)酯酶活性裂解而發(fā)出亮綠色熒光。因此乙錠同源二聚體1可標(biāo)記死細(xì)胞的核，而鈣黃綠素AM標(biāo)記活細(xì)胞的胞質(zhì)。
通過(guò)轉(zhuǎn)換兩套濾光片來(lái)拍攝兩套圖片，一種為乙錠同源二聚體1熒光，另一種為鈣黃綠素AM熒光，這樣每個(gè)細(xì)胞樣本既有顯示活細(xì)胞(綠熒光)比例的圖片，也有顯示死細(xì)胞(紅熒光)比例的圖片。
毒性分析結(jié)果在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察(X400)時(shí)，感染有融合蛋白的細(xì)胞早在感染后24小時(shí)便出現(xiàn)一些毒性癥狀。該癥狀包括，漂浮于培養(yǎng)基中、大的球形和裂解的細(xì)胞。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中一些癥狀，尤其是細(xì)胞裂解，在感染后超過(guò)60小時(shí)出現(xiàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括感染培養(yǎng)基的細(xì)胞模擬物、僅感染桿狀病毒的細(xì)胞和僅感染含gus基因和蓖麻毒蛋白B鏈基因的重組桿狀病毒的細(xì)胞。在對(duì)感染有表達(dá)不同蛋白質(zhì)之重組桿狀病毒的Sf21昆蟲細(xì)胞進(jìn)行活/死存活力分析的實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生綠色熒光的細(xì)胞具有酯酶活性，認(rèn)為是活細(xì)胞，而產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞的膜受到損害，認(rèn)為是死細(xì)胞。
分析結(jié)果總結(jié)如下(a)用健康Sf21昆蟲細(xì)胞進(jìn)行分析。未感染的細(xì)胞沒(méi)有干擾再培養(yǎng)72小時(shí)，不更換培養(yǎng)基。用上述方法評(píng)價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)極少有細(xì)胞死亡。用70％甲醇處理健康細(xì)胞30分鐘時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部死亡。
(b)僅用桿狀病毒感染的Sf21昆蟲細(xì)胞在感染后2小時(shí)、24小時(shí)、34小時(shí)和72小時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。許多細(xì)胞在72小時(shí)后仍存活。
(c)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)GUS活性的Sf21昆蟲細(xì)胞。同樣許多細(xì)胞在72小時(shí)后仍存活。
(d)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(b)的Sf21昆蟲細(xì)胞。在34-72小時(shí)之間許多細(xì)胞受到該蛋白的嚴(yán)重影響。
(e)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(c)的Sf21昆蟲細(xì)胞。同樣在23-72小時(shí)之間細(xì)胞也受到該蛋白的嚴(yán)重影響。
(f)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)RTB1蛋白質(zhì)的Sf21昆蟲細(xì)胞。許多細(xì)胞在72小時(shí)后仍存活。
(g)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(b)-RTB1融合蛋白的Sf21細(xì)胞。在感染后24-34小時(shí)之間細(xì)胞受到嚴(yán)重影響。
(h)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(c)-RTB1融合蛋白的Sf21細(xì)胞。在24-34小時(shí)之間細(xì)胞受到嚴(yán)重影響。
(i)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)RTB2蛋白質(zhì)的Sf21細(xì)胞。許多細(xì)胞在72小時(shí)后仍存活。
(j)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(b)-RTB2蛋白質(zhì)的Sf21細(xì)胞。24小時(shí)以內(nèi)許多細(xì)胞死亡，即明顯早于上述分析。
(k)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(c)-RTB2蛋白質(zhì)的Sf21細(xì)胞。大量細(xì)胞在24小時(shí)以內(nèi)死亡；同樣早于毒素本身。
(l)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)RTB3蛋白質(zhì)的Sf21細(xì)胞。許多細(xì)胞在72小時(shí)后仍存活。
(m)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(b)-RTB3融合蛋白的Sf21細(xì)胞。許多細(xì)胞在24小時(shí)以內(nèi)死亡，但有些細(xì)胞活過(guò)了72小時(shí)。
(n)在感染后2、24、34、72小時(shí)評(píng)價(jià)表達(dá)CryIA(c)-RTB3融合蛋白的Sf21細(xì)胞。許多細(xì)胞活過(guò)了72小時(shí)。
昆蟲上皮細(xì)胞培養(yǎng)物不是Bt d-內(nèi)毒素的天然靶點(diǎn)，與在其來(lái)源的昆蟲中所觀察到相比，其毒素敏感性低幾個(gè)數(shù)量級(jí)23。然而，常規(guī)使用細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)估計(jì)Bt毒素抗多種昆蟲物種的活性24。
盡管在感染有含RTB1和RTB2之融合蛋白的昆蟲細(xì)胞中觀察到最嚴(yán)重癥狀，用乙錠同源二聚體1和鈣黃綠素AM分析存活力時(shí)，三種不同的RTB片段的任片段與Cry1Ab或Cry1Ac融合會(huì)大大提高Sf21細(xì)胞的毒素敏感性。在感染后約34小時(shí)觀察到毒性癥狀。很明顯融合蛋白對(duì)產(chǎn)生之的昆蟲細(xì)胞有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性效應(yīng)，也很明顯將糖基化-結(jié)合(蓖麻毒蛋白B鏈)基因加給該毒素提高其毒性，正如通過(guò)成熟前細(xì)胞死亡和廣泛的細(xì)胞裂解所測(cè)量到的一樣。
之所以選擇Cry1Ab和Cry1Ac毒素及使用Sf21細(xì)胞是基于早先的觀察，即Cry1Ab對(duì)Sf9和IPLB-Sf21昆蟲細(xì)胞有中度毒性而Cry1Ac對(duì)這些細(xì)胞沒(méi)有作用(42，43)。很明顯，與蓖麻毒蛋白B鏈結(jié)合使Cry1Ac獲得毒性說(shuō)明半乳糖-結(jié)合起介導(dǎo)毒性的作用。
實(shí)施例5在植物中應(yīng)用殺蟲融合物可如下將融合蛋白轉(zhuǎn)化到植物例如玉米或水稻中。將編碼融合多肽的序列插入到泛素啟動(dòng)子控制下的表達(dá)盒中。應(yīng)用顆粒轟擊的方法轉(zhuǎn)化植物(見如Christenson等人(1992)植物分子生物學(xué)(PlantMol Biol)18675-689；Christou等人(1991)生物/技術(shù)(Bio/Technol)16957-962)。該植物然后可用于昆蟲飼養(yǎng)生物分析以便評(píng)價(jià)融合物在整個(gè)有機(jī)體水平的毒性以及衡量在不同選擇壓力條件下的抗性。也可評(píng)價(jià)植物的轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)模式，并用傳統(tǒng)方法純化表達(dá)產(chǎn)物。用水稻示例如下。
Bt-轉(zhuǎn)基因水稻植株的產(chǎn)生(方法)回顧將11個(gè)構(gòu)建體(六個(gè)融合物，5個(gè)對(duì)照物)轉(zhuǎn)化到成熟的種子來(lái)源的胚胎水稻愈傷組織(callus)中，見
圖1B。通過(guò)顆粒轟擊方法將每一構(gòu)建體導(dǎo)入水稻組織，同時(shí)導(dǎo)入的還有共-轉(zhuǎn)化載體以便篩選潮霉素抗性。在表達(dá)相同數(shù)量的11種重組蛋白質(zhì)的植物上進(jìn)行進(jìn)一步分析。與未修飾的Bt蛋白一樣，融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達(dá)效率高于在桿狀病毒-感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體應(yīng)用EheI和HindIII自pFASTBAC Hb中間載體分離上述對(duì)照物和融合蛋白盒，并定向亞克隆到經(jīng)SamI和HindIII酶切的pAL76(內(nèi)部以泛素啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)化載體)中(
圖1C)。
顆粒轟擊和轉(zhuǎn)基因植物的回收脫去成熟水稻種子(ORYZA STAIVA L CV EYIL105)的殼，在70％的乙醇中洗2分鐘。用蒸餾水沖洗兩次后，將種子置于1.6％次氯酸鈉中輕輕搖動(dòng)30分鐘進(jìn)行消毒，然后用無(wú)菌的蒸餾水沖洗3次。在避光條件下種子在水稻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RCIM；加入2.5mg l-12，4-D并用2.5g l-1phytagel固化的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基)上發(fā)芽。7天后，從發(fā)芽的種子上剖離源自角質(zhì)鱗部的愈傷組織，在滲透劑培養(yǎng)基(加有36g l-1山梨醇和36g l-1甘露醇的RCIM(48))上避光培養(yǎng)4小時(shí)。然后用包被有DNA的0.95mm直徑的金粒轟擊愈傷組織。轟擊兩次，間隔4小時(shí)，用含有融合或?qū)φ諛?gòu)建體的11種質(zhì)粒的一種和含帶來(lái)潮霉素抗性的標(biāo)記的共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(49)以1∶3的摩爾比共-轟擊愈傷組織。顆粒包被以及轟擊方法以前有述(50，51)。在第二次轟擊后，在滲透劑培養(yǎng)基上再避光培養(yǎng)愈傷組織16小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到RCIM上培養(yǎng)三天。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(含30mg l-1潮霉素B的RCIM)培養(yǎng)4周。間隔2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在日光下將潮霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到HRSM1培養(yǎng)基中(添加有30g l-1麥芽糖、2mg l-1BAP、0.5mg l-1NAA、30mg l-1潮霉素B和5g l-1脫乙酰吉蘭糖膠吉蘭糖膠的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基)以促使其發(fā)芽再生。一周后將再生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到HRSM2培養(yǎng)基中(與HRSM1培養(yǎng)基相同，只是僅含有2.5g l-1脫乙酰吉蘭糖膠吉蘭糖膠樹膠)，在同樣的條件下培養(yǎng)。完全再生的發(fā)芽系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基HRRM(添加有10g l-1蔗糖的1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基)上。將成熟植株轉(zhuǎn)移到溫室中。
RT-PCR分析應(yīng)用Rneasy Plant Mini試劑盒(Qiagen)按照廠家說(shuō)明自100mg轉(zhuǎn)化和野生型水稻的葉組織提取總RNA。按照廠家說(shuō)明應(yīng)用Access-PCR試劑盒(Promega)進(jìn)行RT-PCRs。我們使用100ng總RNA和50pmol每一引物。CRF1和CRR1引物擴(kuò)增cry1Ab和cry1Ac，而RTF1和RTR1引物擴(kuò)增RTB基因片段。引物序列如下CRF1(5’CGCATTGAAAC CGGTTACACTC CCA-3’)、CRR1(5’CTTGGGCAGAACCACGGAAGCTACC-3’)、RTF1(5’GATGTTTGTATGGATCCTCAGCCCA-3’)和RTR1(5’GCCGAACAATGGTTGTAACAAAAGG-3’)。
Northern印跡如上所述提取總RNA，在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上電泳分級(jí)分離15mg樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(52)。標(biāo)記相對(duì)應(yīng)于cyr1Ab和cry1Ac編碼區(qū)域的1.8kbp BamHI/EcoRI片段，用作探針。
Western印跡分析對(duì)在液氮下研磨成細(xì)粉的小葉切片進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的Western印跡分析。將樣品分散于蛋白質(zhì)提取緩沖液中(100mM Tris.Cl pH8.1，100mM 2-巰基乙醇)，在4℃以12000 xg離心10分鐘。用30mg樣品進(jìn)行SDS-PAGE，如上所述進(jìn)行印跡和檢測(cè)程序。
對(duì)Western印跡上的泳帶圖案進(jìn)行分析表明含最長(zhǎng)的RTB片段(RTB1)的融合蛋白最穩(wěn)定。對(duì)照RTB片段在轉(zhuǎn)基因水稻植物中也得以高效表達(dá)。通過(guò)Northern印跡和RT-PCR證實(shí)植物中存在轉(zhuǎn)基因mRNAs(數(shù)據(jù)未列)。這樣很明顯，融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻植物中得以高效表達(dá)。
實(shí)施例6昆蟲生物學(xué)分析昆蟲生物學(xué)分析回顧應(yīng)用野生型對(duì)照植物和各轉(zhuǎn)化有11種構(gòu)建體(六種融合物和五種對(duì)照物)之9種的轉(zhuǎn)基因系的莖切片進(jìn)行昆蟲生物學(xué)分析，見
圖1B。未測(cè)試轉(zhuǎn)化有pR2或pR3(含較短RTB片段的對(duì)照構(gòu)建體)的植物。檢測(cè)了這些對(duì)照物和融合蛋白對(duì)有重要經(jīng)濟(jì)學(xué)意義的水稻害蟲，斑紋枝干蛀蟲的影響。
昆蟲生物學(xué)分析自菲律賓國(guó)際水稻研究所M.Cohen博士獲得斑紋鉆心蛀蟲的卵培養(yǎng)物(二化螟(chilo suppressalis))。在27/25℃白天/夜晚溫度設(shè)置下維持卵，光周期為16小時(shí)。昆蟲置于MAFF許可號(hào)EPHL51/2595(3/1998)下。水稻植株在相同條件下生長(zhǎng)和維持。
在原代轉(zhuǎn)化物和野生型對(duì)照物的莖切片上進(jìn)行生物學(xué)分析。每一植株取出一段至少含一個(gè)結(jié)節(jié)的7厘米長(zhǎng)的單一莖切片。將切片置于潮濕的濾紙上，放到平皿內(nèi)，用莖蛀蟲幼蟲(＜2小時(shí)齡)進(jìn)行感染，切開的切片每端放3個(gè)幼蟲以便進(jìn)入到莖內(nèi)。每一品系設(shè)4個(gè)重復(fù)，野生型對(duì)照物設(shè)8個(gè)重復(fù)。然后用封口膜密封平皿，在上述具體條件下置于條件生長(zhǎng)箱內(nèi)4天。試驗(yàn)期最后，在雙目微鏡下仔細(xì)研究莖切片，記錄昆蟲的存活、發(fā)育和體重狀況。用Statview軟件V.5.0(Abacus Concepts，CA)對(duì)昆蟲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用方差分析(ANOVA)來(lái)衡量處理組之間的顯著性差異。應(yīng)用P＞0.05的棄除限。
結(jié)果結(jié)果見圖2。野生對(duì)照莖切片的昆蟲存活率超過(guò)95％。
在表達(dá)未修飾的Cry1Ab和Cry1Ac毒素的植物上的昆蟲存活率降至55到80％之間(均值為79％(Cry1Ab)和71％(Cry1Ac))。該數(shù)據(jù)表明Cry1Ac對(duì)莖蛀蟲的毒性略大于Cry1Ab對(duì)莖蛀蟲的毒性，但這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。表達(dá)RTB1對(duì)照片段的pR1系對(duì)昆蟲的存活率沒(méi)有顯著影響，但存活的幼蟲表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度降低(見下文)。
除轉(zhuǎn)化pBR3構(gòu)建體的植物外，表達(dá)融合蛋白的所有植物上的昆蟲的平均存活率，比野生型對(duì)照植物和表達(dá)對(duì)照蛋白的植物上(的昆蟲存活率)低得多。
轉(zhuǎn)化pCR1、pCR2和pCR3構(gòu)建體的植物對(duì)莖蛀蟲有很大的抵抗力，昆蟲死亡率分別為87％、74％和61％。
轉(zhuǎn)化pBR1、pBR2和pBR3構(gòu)建體的植物結(jié)果變化更大，存活率在30-50％范圍內(nèi)，pBR2最有效。
所有轉(zhuǎn)基因品系的存活幼蟲表現(xiàn)出生長(zhǎng)減緩和發(fā)育停止現(xiàn)象。在表達(dá)對(duì)照Bt蛋白和對(duì)照RTB片段的植物中平均幼蟲體重下降了30％。表達(dá)Cry1Ac的植物比表達(dá)Cry1Ab的植物幼蟲發(fā)育停止現(xiàn)象更嚴(yán)重。
在Cry1Ab融合蛋白中，僅pBR1比對(duì)照Bt蛋白質(zhì)Cry1Ab效果顯著增強(qiáng)，使幼蟲的平均體重下降60％。在表達(dá)pCR1、pCR2和pCR3的植物中也觀察到幼蟲生長(zhǎng)和發(fā)育狀況嚴(yán)重下降。pCR2和pCR3結(jié)果與pBR1類似，而pCR1同樣是最有效的構(gòu)建體，使幼蟲的平均體重下降超過(guò)80％并使其發(fā)育期阻滯在第一齡期。
這樣表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植物完全受到保護(hù)抵抗斑紋莖蛀蟲的吞噬，導(dǎo)致昆蟲55-80％死亡，存活幼蟲生長(zhǎng)減緩，發(fā)育停滯。毒性最大的融合蛋白是pCR1。四天后87％昆蟲死亡，存活幼蟲在第一齡期階段發(fā)育阻滯。四天后，攝食野生型水稻植物的幼蟲達(dá)到第三齡期，并對(duì)莖造成嚴(yán)重?fù)p害。相反，攝食表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的幼蟲未造成明顯損害。這樣Bt毒素加上半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域顯著提高其抗斑紋鉆心蟲的活性。
結(jié)論這些實(shí)施例清楚表明，本身無(wú)毒但與毒素(如d-內(nèi)毒素Cry1Ab和Cry1Ac)連接時(shí)能夠非-特異性結(jié)合細(xì)胞膜而不破壞該膜(如蓖麻毒蛋白B鏈)的一類異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可提高毒素分子相互作用范圍，進(jìn)而有效擴(kuò)大其活性譜。尤其是這些實(shí)施例表明，與未修飾的毒素相比，(修飾的)毒素體外(針對(duì)Sf21細(xì)胞)和體內(nèi)(針對(duì)斑紋鉆心蟲)毒性升高。另外，加入新型結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能會(huì)延緩或防止昆蟲群體發(fā)展耐藥性，因?yàn)槔ハx不太可能發(fā)生消除兩種或多種不同的細(xì)胞吸收活性的突變。
實(shí)施例7外源凝集素、Bt毒素和Bt-外源凝集素融合物與昆蟲腸多肽的結(jié)合方法學(xué)簡(jiǎn)而言之，從兩種水稻昆蟲害蟲，用于上文所述昆蟲生物學(xué)測(cè)定的斑紋鉆心蟲和同翅類，稻褐飛虱(褐稻虱(Nilaparvata lugens))中分離腸道。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所提取出的腸多肽，進(jìn)行印跡并用外源凝集素、Bt毒素或Bt-外源凝集素融合蛋白探測(cè)；然后用適宜的特異性抗體檢測(cè)結(jié)合的探針。
更具體而言，編碼His-標(biāo)記的Bt毒素Cry1Ac結(jié)構(gòu)域1和雪花蓮?fù)庠茨?GNA)(稱為JD1)之融合物的構(gòu)建體在大腸桿菌中首先表達(dá)。在溶解、透析以去除變性物以及通過(guò)超濾濃縮后，該融合蛋白通過(guò)在Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)上層析的方法得以純化，得到可溶的功能蛋白質(zhì)制品。通過(guò)SDS-PAGE估計(jì)最后的濃度和純度。從新收集自水稻植株的昆蟲分離水稻褐色植物跳蟲(褐稻虱(Nilaparvata lugens))中腸，在SDS樣品緩沖液中通過(guò)超聲使之勻漿化。斑紋莖蛀蟲中腸(由Mike Cohen博士提供，IRRI)收集自晚齡期幼蟲，同樣進(jìn)行處理。然后通過(guò)SDS-PAGE(12.5％丙烯酰胺)分離溶解的腸蛋白，將之轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。就稻褐飛虱而言，每道上樣蛋白量相當(dāng)于1.5腸；就斑紋鉆心蟲而言，每道上樣蛋白約5μg。在封閉液(Sigma)中溫育60分鐘后，通過(guò)分別與JD1、Cry1Ac(David Ellar博士惠贈(zèng)；前毒素如(53)所述通過(guò)胰酶處理而激活)、GNA(W.Peumans和E.Van Damme博士，Leuven天主教大學(xué)，比利時(shí))或蓖麻(Ricinus Communis)外源凝集素(Sigma)溫育檢測(cè)含腸蛋白的膜。溫育條件為25℃60分鐘，濃度為1μg ml-1。用Tris-緩沖的Triton-鹽水(TBS-T；50mM Tris-Hcl緩沖液，pH7.2，含0.15MNaCl和0.1％ Triton X-100)洗膜3次，每次5分鐘。然后與恰當(dāng)?shù)囊豢?抗Cry1Ac，David Ellar博士惠贈(zèng)；抗-GNA，作者制備；抗蓖麻外源凝集素，載體實(shí)驗(yàn)室)在10,000稀釋的TBS-1中在25℃溫育60分鐘來(lái)檢測(cè)配體結(jié)合。同上再次洗膜，與二抗溫育(HRP-綴合；Bio-Rad)(稀釋度1∶5000)。同上再次洗膜，另外用蒸餾水沖洗2次，然后按照廠家說(shuō)明加入ECL試劑(Amersham PharmaciaBiotech，UK)，將膜在X-射線膠片上曝光。
結(jié)果用蓖麻(Ricinus communis)外源凝集素作為探針、抗蓖麻外源凝集素抗體作為檢測(cè)劑的組合發(fā)現(xiàn)其與兩種昆蟲腸組織提取物內(nèi)的許多多肽與有很強(qiáng)的結(jié)合力。相反，Cry1Ac蛋白質(zhì)探針僅與同樣提取物中的一種多肽(斑紋鉆心蟲中約45kDa，稻褐飛虱中約90kDa)強(qiáng)烈結(jié)合。為進(jìn)一步表征Bt毒素和Bt-外源凝集素融合物之間結(jié)合的差別，通過(guò)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)合適的基因構(gòu)建體產(chǎn)生源自雪蓮的特異性甘露糖-結(jié)合外源凝集素 雪花蓮(Galanthus nivalis)外源凝集素，GNA)和Cry1Ac的融合蛋白。然后將融合蛋白與昆蟲腸多肽的結(jié)合力與GNA和Cry1Ac蛋白質(zhì)分別與腸多肽的結(jié)合力進(jìn)行比較。與以前的結(jié)果一致，GNA與自水稻稻褐飛虱腸提取的約75kDa(2條帶)和50kDa的多肽強(qiáng)烈結(jié)合，與取自斑紋鉆心蟲腸的約80kDa的多肽強(qiáng)烈結(jié)合。GNA還與鉆心蟲腸提取物的45kDa多肽結(jié)合，該多肽的分子量與Cry1Ac檢測(cè)到的主要蛋白帶類似。GNA-Cry1Ac融合物與GNA在斑紋鉆心蟲腸中所識(shí)別的85kDa的多肽結(jié)合力非常弱，但可與GNA和Cry1Ac毒素都識(shí)別的45kDa的多肽結(jié)合。另一方面，該融合物表現(xiàn)出與GNA和Cry1Ac毒素在稻褐飛虱腸提取物中所識(shí)別的所有主要多肽(約90Da、75kDa和45kDa)結(jié)合。這些結(jié)果表明，與其來(lái)源的Bt毒素相比較，外源凝集素-Bt融合物與昆蟲腸組織提取的多肽具有不同的結(jié)合特異性。
討論在上述實(shí)驗(yàn)中，使純化的外源凝集素、Bt毒素和Bt-外源凝集素融合蛋白與自昆蟲腸道提取的多肽反應(yīng)。結(jié)果表明蓖麻毒蛋白的半乳糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Cry1Ac毒素相比，強(qiáng)烈結(jié)合昆蟲腸提取物中更多的多肽。通過(guò)純化的GNA-Cry1Ac融合蛋白在昆蟲腸多肽上的結(jié)合分析，直接說(shuō)明了外源凝集素-Bt融合蛋白的結(jié)合雙功能特性(即具有源自兩種有貢獻(xiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性)。
參考文獻(xiàn)1.Monette等(1997).應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)63(2)，440-447。2.Luckow，(1991).用桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)克隆和表達(dá)異源基因，p.97-151.Prokop等，(Ed)，重組DNA技術(shù)與應(yīng)用。McGraw-Hill，New York，NY。3.Ferrini等，(1995)歐洲生化雜志233，772-777。4.Ge等，(1991).生物化學(xué)雜志266(27)，17954-17958。5.Schnepf和Whitley，(1985)。生物化學(xué)雜志266，(10)，6273-6280。6.Dean等，(1996)基因179，111-117。7.Weyer等，(1990).普通病毒學(xué)雜志71，1525-1534。8.Martens等，(1990).應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)56(9)，2764-2770。9.Merryweather等，(1990).普通病毒學(xué)雜志71，1535-1544。10.Miller，(1988).微生物學(xué)年度綜述42，177-199。11.Pang等，(1992).一般病毒學(xué)雜志73，89-101。12.Hofmann等，(1988).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85，7844-7844。13.Vadlamudi等，(1995).生物化學(xué)雜志270(10)5490-5494。14.Lee等，(1996).應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)62(8)2845-2849。15.Masson等，(1995).生物化學(xué)雜志270(35)，20309-20315.16.Tabashnik等，(1997).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)94，1640-1644.17.Tabashnik，(1994).昆蟲學(xué)年度綜述39，47-79.18.Tabashnik等。應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)62(8)2839-2844.19.Perlak等，(1990).生物/技術(shù)8，939-943.20.Vaek等，(1989).Cell Cult.Somatic Genet.Plants6，425-439.21.Vaek等，(1987).自然327，33-37.22.Cornelissen，(1989).核酸研究17，7203-7209.23.perlak等，(1991).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，3324-3328.24.Arsine等，(1995).植物分子生物學(xué)28，513-524.25.Murray等，(1989).核酸研究17，477-498.26.Wolin和Walter，(1988).Embo Journal 7，3559-3569.27.Koziel等，(1993).生物/技術(shù)11，194-199.28.Dellaporta和Calderon-Urrea，(1994).科學(xué)266，1501-1505.29.Irish，(1996).生物分析18(5)，363-369.30.Heslop-Harrison，(1961).Proc.Linn.Soc.，London.172，108-123.31.Hansen等，(1976).農(nóng)作物科學(xué)16，371-374.32.Morino等，(1995).生物藥學(xué)簡(jiǎn)報(bào)18(12)1770-1772.33.Endo和Tsurugi，(1987).生物化學(xué)雜志262，8128.34.Wales等，(1992).生物化學(xué)和生物物理檔案294(1)，291-296.35.Wales等，(1991).生物化學(xué)雜志266(29)，19172-19179.36.Sardana等，(1996).植物細(xì)胞報(bào)告15，677-681.37.GIBCO(1996).BAC-To-BACTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)指導(dǎo)手冊(cè)1-33.38.King和Possee，(1990).桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)Chapman和Hall，143-144。39. 分子探針產(chǎn)物信息表，活/死存活力/細(xì)胞毒性試劑盒kit(L-3224)，ppl._40.Glaze和Rye(1992)自然 359859-861.41.Bell等(1988)J.Orthopaedic Res.6467-474.42.Johnson(1994)J.Invertebr.Pathol.63123-129.43.[see 1]44.Newton等(1992)生物化學(xué)雜志26711917-11922.45.Gonatas等(1975)表達(dá)細(xì)胞研究94426-431.46.[see 36]47.Bradford(1976)分析生物化學(xué)72248-254.48.Vain等(1993)Plant Cell Rep.1284-88.49.Cooley等(1995)Theoret.Appl.Genet.90，97-104.50.Klein等(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)854305-430951.Sudhakar等(1998)轉(zhuǎn)基因研究7289-29452.Sambrook等(1989).分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。第二版，冷泉巷實(shí)驗(yàn)出版社。53.Knight等(1994)分子微生物學(xué)11429-436.
權(quán)利要求
1.編碼殺蟲融合多肽的核酸分子，包括(i)毒素結(jié)構(gòu)域；和(ii)能與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而不破壞該膜的異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1中的核酸，其中該毒素結(jié)構(gòu)域源自蘇云金芽孢桿菌cry毒素。
3.權(quán)利要求2中的核酸，其中該蘇云金芽孢桿菌cry毒素是CryIA(b)或(c)。
4.任一上述權(quán)利要求中的核酸，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域與糖類結(jié)合。
5.權(quán)利要求4中的核酸，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有半乳糖或半乳糖基親和力。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5中的核酸，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自外源凝集素。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中該外源凝集素是2型核糖體失活蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的核酸，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自蓖麻毒蛋白B鏈。
9.權(quán)利要求2-8之任一的核酸，包括Seq ID No 1(CryIA(b))或Seq ID No 2(CryIA(c))的全部或部分或其簡(jiǎn)并的等同序列。
10.權(quán)利要求2-9之任一的核酸，包括Seq ID No 3(RTB1)、Seq ID No 4(RTB2)或Seq ID No 5(RTB3)的全部或部分或其簡(jiǎn)并的等同序列。
11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10中的核酸，包括Seq ID No 6(CryIA(b)-RTB1)；Seq ID No 7(CryIA(b)-RTB2)；Seq ID No 8(CryIA(b)-RTB3)；Seq ID No 9(CryIA(c)-RTB1)；Seq IDNo 10(CryIA(c)-RTB2)或Seq ID No 11(CryIA(c)-RTB3)中任一序列所示的CryIA-RTB組合體(combination)，或其簡(jiǎn)并的等同序列。
12.權(quán)利要求2-8之任一的核酸，包括Seq ID Nos 1到11的任一序列的同源變體核苷酸序列。
13.權(quán)利要求1-12之任一的核酸的制備方法，該方法包括將編碼毒素的核酸與編碼異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸連接起來(lái)的步驟，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而不破壞之。
14.權(quán)利要求13的方法，其中該方法還包括通過(guò)在核酸中添加、插入、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)改變毒素或結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中序列的改變使該序列的密碼子使用發(fā)生變化。
16.包括權(quán)利要求1-12之任一的核酸的重組載體。
17.權(quán)利要求16的載體，其中任一權(quán)利要求1-12的核酸操作性地連接一種啟動(dòng)子。
18.權(quán)利要求17的載體，其是一種可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，其響應(yīng)一種誘導(dǎo)物或響應(yīng)捕食作用而激發(fā)的其它植物信號(hào)而開啟。
19.權(quán)利要求16-18之任一的載體，其為桿狀病毒載體或適用于植物的載體。
20.轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，包括將任一權(quán)利要求16-19的載體導(dǎo)入細(xì)胞，并致使或允許該載體和細(xì)胞基因組之間發(fā)生重組以便將該核酸導(dǎo)入到基因組內(nèi)這一步驟。
21.含有權(quán)利要求1-12之任一的核酸或權(quán)利要求16-19之任一的載體的宿主細(xì)胞。
22.用權(quán)利要求1-12之任一的核酸或任一權(quán)利要求16-19的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中該植物為單子葉植物。
25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中該單子葉植物為玉米或水稻。
26.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括步驟(a)實(shí)施權(quán)利要求20的方法，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；(b)從該轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞再生植物。
27.通過(guò)權(quán)利要求26的方法獲得的植物，其包括權(quán)利要求23-25之任一的宿主細(xì)胞。
28.一種植物，其是權(quán)利要求27之植物的克隆、自交或雜交子代、或其他后代，其包括權(quán)利要求23-25之任一的宿主細(xì)胞。
29.權(quán)利要求27或權(quán)利要求28的植物，其為單子葉植物。
30.權(quán)利要求29的植物，其中單子葉植物為玉米或水稻。
31.包括權(quán)利要求23-25之任一的宿主細(xì)胞的權(quán)利要求27-30之任一的植物的部分或繁殖體。
32.影響或改變植物對(duì)害蟲毒性的方法，該方法包括使或允許權(quán)利要求1-12之任一的核酸在植物中表達(dá)的步驟。
33.權(quán)利要求1-12之任一的核酸編碼的殺蟲融合多肽。
34.制備權(quán)利要求33的多肽的方法，該方法包括使權(quán)利要求1-12之任一的核酸在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的步驟。
35.包括要求33的多肽以及至少一種附加成分的組合物。
36.已用權(quán)利要求35的組合物處理使其對(duì)害蟲侵襲的敏感性降低的商品。
37.控制害蟲的方法，包括應(yīng)用權(quán)利要求33的多肽。
38.評(píng)價(jià)多肽對(duì)害蟲物種的毒性的方法，包括(i)將編碼該多肽的核酸導(dǎo)入源自那些害蟲物種的宿主細(xì)胞中，(ii)致使或允許該核酸在源自那些害蟲物種的宿主細(xì)胞中表達(dá)，(iii)觀察該細(xì)胞的存活力，并分析觀察結(jié)果與該多肽的毒性之間的相關(guān)性，其中該存活力通過(guò)評(píng)價(jià)酯酶活性或膜完整性來(lái)檢測(cè)。
39.權(quán)利要求37或權(quán)利要求38的方法，其中該害蟲是一種昆蟲物種。
40.權(quán)利要求39的方法，其中該物種選自鱗翅目、鞘翅目、蚊科、蚋科、膜翅目、同翅目、直翅目和雙翅目。
41.選自下面的寡核苷酸LF1＝5′CAACAACAAAGGAATTCATGCTGATG 3′，LB1＝5′GGACACACACACTGCAAGCTTGTAATC 3′，LB2＝5′CGGATCCGAAAGCTTCACATCTAACAC 3′，或LB3＝5′GCTTGCAAGCTTAGACCATATAGCCC 3′.
全文摘要
本發(fā)明公開的是編碼殺蟲融合多肽的核酸分子,該多肽包括(i)毒素結(jié)構(gòu)域;和(ii)能夠與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合而又不破壞該膜的異源結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選該毒素結(jié)構(gòu)域來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)cry毒素(如CryIA(b)或(c)),結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)自外源凝集素(例如蓖麻毒蛋白B鏈)。應(yīng)用此融合物有助于防止用該多肽處理的害蟲群產(chǎn)生耐藥性。還公開了產(chǎn)生和應(yīng)用該核酸及其編碼多肽的方法和材料。以及載體(如桿狀病毒載體或?qū)ξ覀兌赃m用于植物的載體)、宿主細(xì)胞和植物等。本發(fā)明的另一方面是評(píng)價(jià)多肽對(duì)某類害蟲之毒性的方法,包括(i)將編碼該多肽的核酸導(dǎo)入到來(lái)自該害蟲的宿主細(xì)胞內(nèi);(ii)使或允許該核酸在來(lái)自該害蟲的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),(iii)觀察該細(xì)胞的存活率并將觀察結(jié)果與該多肽的毒性相聯(lián)系,其中存活率通過(guò)衡量酯酶活性或膜完整性來(lái)測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1359424SQ0080969
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月28日
發(fā)明者P·克里斯托, L·梅洛 申請(qǐng)人:植物生物科學(xué)有限公司