專利名稱：保存病毒和支原體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及病毒和支原體的保存。具體地，本發(fā)明涉及一種采用二糖，即海藻糖，保存這些材料的超快方法。通過該方法，可以實現(xiàn)對病毒和/或支原體的長期保存，尤其是可以制備減毒活疫苗。
通過脫水和滲透濃縮保存生物可降解材料是一項普通的古老技術。當必需保存敏感生物分子時，通過脫水進行的簡單干燥將無法勝任此任務，因為結構水的除去會引起隨后的變性和生命活性的喪失。在液氮中低溫貯藏和凍干已被接受為長期保存敏感生物分子的方法，后一種方法被廣泛用于保存減毒活疫苗。
通過延長第二個凍干周期以便使殘余水分(RM)減少至大約1％-2％，已經(jīng)實現(xiàn)了對凍干牛瘟疫苗耐熱性的提高。按Mariner，J.C.等，Vet.Microbiol.，1990，21，195-209所描述的，這需要長達72小時的長時間和高能量消耗操作周期。由此方法制備的疫苗稱作“THERMOVAX”，而與標準疫苗區(qū)分開。
正如以上提及的，目前使用的這些方法均耗時，并涉及高能量的投入。而且，凍干僅賦予終產(chǎn)品中等水平的耐熱性，而且仍需要冷藏降低貯存過程中的變質。對于在熱帶氣候下使用的活疫苗而言，這尤其是一個問題，因為這些疫苗會喪失效力而導致失敗的結果，即在難于監(jiān)測“冷鏈(cold chain)”的熱帶國家中野外實施的接種計劃將最終導致給患者接種低標準或，在某些情況下，無效的疫苗。
在進化的自然選擇過程中，某些植物和動物物種獲得了出色而精巧的耐受極度脫水的能力，以致可以在有害環(huán)境中極長時間地保持休眠，并能在重新水化后仍具有完全的生命活性。實例包括更蘇植物鱗葉卷柏(Selaginella lepidophyla)、海蝦Artemia salina(Clegg，J.，J.Comp.Biochem.Physiol.，1967，20，801-809)、酵母類釀酒酵母(Sachharomyces cerevisiae)(Coutinho，E.，生物技術雜志(Journal ofBiotechnology)，1988，7，23-32)、和緩步動物Macrobiotus hufelandi(Kinchin，I.M.，生物學家(Biologist)，1995，42，4)。這些生物被稱為隱生的，而它們存活的方法被稱作低濕生活。所有表現(xiàn)出此能力的動物和植物物種都含有二糖海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)。海藻糖在大多數(shù)隱生生物中一般以約0.2g/g細胞干重的量存在，這使得這些生物可以抵抗極度脫水、高溫、X-射線，以及在一些緩步動物物種中還可以抵抗高達600Mpa的壓力。
Colaco等，生物技術(Biotechnology)1992，10，1007-1011，描述了采用海藻糖快速干燥生物材料的益處。該方法主要涉及在預先形成的基質例如纖維素纖維上，或在用于診斷目的例如ELISA或實驗室中類似診斷應用的塑料板表面上，干燥限制性酶和免疫球蛋白。然而，當上升至工業(yè)應用時，例如大規(guī)模的商業(yè)疫苗生產(chǎn)，由于必需在部分密封的小瓶中采用必需的無菌技術操作大得多的單位數(shù)量和體積，這些技術產(chǎn)生多個問題。為了滿足大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的操作要求，即典型的1.0ml以上的單位體積和20升的生產(chǎn)批量，需要一個不同的策略以在經(jīng)濟上可接受的時間內(nèi)除去這種體積的水。在大氣壓力下，即使在最高的生理耐受溫度下進行干燥也將需要一段無法接受的長時間以足夠快地從部分塞住的疫苗小瓶中除去水分，而且將不可避免地導致變性和效力的喪失。
本發(fā)明涉及在可除去水分同時允許保持病毒或支原體材料的生物學完整性的條件下，采用海藻糖保存這些材料的方法。
因此，本發(fā)明提供含有活病毒或支原體的生物活性材料的保存方法，該方法包括步驟(i)將該生物活性材料的水懸液與海藻糖的無菌水溶液混合，以使該混合物中的海藻糖濃度在0.2-10％w/v范圍內(nèi)；(ii)在低于大氣的壓力下，在溫度最初不超過37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最終不超過40℃的條件下，對該混合物進行第一次干燥，時間為30-60分鐘，以形成含有玻璃樣海藻糖、殘留水分含量不超過10％的玻璃樣多孔基質，在該基質中含有干燥的生物活性材料；和
(iii)在不超過0.1mbar的壓力下，在溫度最終處于40-45℃范圍內(nèi)的條件下，對步驟(ii)的玻璃樣多孔基質進行第二次干燥，其10-30個小時，以形成含有干燥生物活性材料的、殘留水分含量不超過2％的海藻糖基質。
通過采用本發(fā)明的方法，可以制備與現(xiàn)有方法相比具有增強的生物學特性和突出的商業(yè)優(yōu)點的活疫苗。采用本發(fā)明方法制備的疫苗比采用常規(guī)凍干方法制備的疫苗其干燥速度要快得多。例如，可以采用本發(fā)明方法在不到1小時內(nèi)干燥海藻糖/生物活性材料混合物，使其含水量達到約10％。并可以在不足30個小時，例如約20小時的時間內(nèi)，實現(xiàn)進一步脫水，使殘留水分含量為約1-2％，而常規(guī)凍干方法需要50個小時。而且，根據(jù)本發(fā)明可使由于溶質濃縮造成的損傷最小化，尤其是避免了損傷性冰晶形成。保存在該海藻糖玻璃樣基質中的生物活性材料的熱穩(wěn)定性比按現(xiàn)有方法保存的材料的熱穩(wěn)定性高，由此，對常規(guī)凍干疫苗是一個嚴重限制的“冷鏈”，其必要性被最小化。本發(fā)明的產(chǎn)品可以更長時期地暴露于高環(huán)境溫度例如高達約45℃下，而生物學活性基本上沒有損失。除了本發(fā)明的這些和其它優(yōu)點外，本發(fā)明方法制備的產(chǎn)品當重新水化時還表現(xiàn)出即刻“速溶性”。
本發(fā)明的方法適于長期保存病毒和支原體。尤其是，可以采用本發(fā)明方法保存可以重新水化形成疫苗的高不穩(wěn)定性減毒活病毒成分和支原體成分?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明方法保存的這些生物活性材料的實例包括科副粘病毒科(Paramyxoviridiae)亞科Paramyxovirinae屬副流感病毒組麻疹(Measles)、牛瘟(Rinderpest)、犬瘟熱(caninedistemper)、小反芻動物瘟疫(Peste des Petits Ruminants)(PPR)副粘病毒屬(Paramyxovirus)腮腺炎病毒(流行性腮腺炎)屬風疹病毒(Rubivirus)，病毒性風疹(Rubella)(德國麻疹(GermanMeasles))屬黃病毒(Flavivirus)，黃熱病毒(Yellow fever virus)(黃熱病)
屬彈狀病毒(Rhabdoviruses)，Lyssaviridiae(狂犬病病毒(Rabiesvirus))細小核糖核酸病毒(Picorna viruses)(脊髓灰質炎病毒(Poliovirus))新城疫病毒(Newcastle Disease virus)支原體Mycoplasma mycoides(牛接觸感染性胸膜肺炎)流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)第19株疫苗衣原體Chlamydia psittaci(地方性動物病流產(chǎn)(Enzooticabortion))CorridiaToxoplasma gondii(弓形體病)根據(jù)本發(fā)明的方法，將待保存的生物活性材料在適當?shù)乃越橘|中配制成懸液。對于病毒，可能需要例如在非洲綠猴腎細胞系上于適當?shù)呐囵B(yǎng)基中對其進行培養(yǎng)，然后在懸浮前收獲以便提供有用濃度的材料。典型地，例如通過加入堿，調節(jié)生物活性材料水懸液的pH至7.0-7.8范圍內(nèi)，尤其是約7.4。
海藻糖是最穩(wěn)定的化學上不反應的二糖之一。其具有小于1Kcal/Mol的極低鍵能，使得該二聚物結構非常穩(wěn)定。除非劇烈加熱否則海藻糖不會發(fā)生焦糖化，而且它也不會與蛋白質或肽發(fā)生美拉反應。該天然二水化物結構含有兩個水分子，使得可以在該二糖鍵周圍造成不尋常的柔性，這樣就可以允許與三級結構的生物分子產(chǎn)生更為緊密的聯(lián)系。海藻糖并非是吸濕性的，但在水化時表現(xiàn)出“速溶性”，此性質對于干燥的疫苗是尤其有用的。
將生物活性材料的水懸液與海藻糖的無菌水溶液混合，配制該混合物以便其將含有0.20％-10％w/v、優(yōu)選2-10％、更優(yōu)選2.5-8％w/v濃度的海藻糖。在該海藻糖濃度范圍內(nèi)，所用的實際濃度一般將取決于該生物活性材料的單位大小。小病毒顆粒比大細胞需要較少的海藻糖。
將該無菌水性海藻糖/生物活性材料混合物進行真空干燥操作，該操作包括第一個干燥步驟及之后的第二個干燥步驟。優(yōu)選地，將常規(guī)凍干裝置(例如EDWARDS、CHRIST、USIFROID或SAVANT制造的凍干裝置)用于該干燥操作，以便為該方法中的關鍵階段提供可控環(huán)境。然而，要強調的是，盡管采用這樣的裝置，但并不采用凍干條件而且也不對材料進行凍干。該干燥操作包括兩個干燥階段，在第一個干燥階段材料的殘留水分含量降低至不超過10％，而在第二個干燥階段該材料的殘留水分含量進一步降低至不超過2％。
在第一個干燥階段，干燥裝置的初始溫度將保證該海藻糖混合物的溫度不超過37℃并優(yōu)選為37℃，以防止在該方法的此階段出現(xiàn)任何的生物活性喪失。當該混合物中的水被蒸發(fā)掉時，該混合物的溫度將下降。然而，實施該干燥，以保證不會發(fā)生在常規(guī)凍干操作中通常經(jīng)歷到的冰凍或冰的升華，即在該干燥操作的此階段產(chǎn)品的溫度被控制不降至0℃或更低，而且典型地被控制不降低至4℃以下。將所用壓力減少至大氣壓力以下，優(yōu)選800-300mbar。
該第一個干燥階段的持續(xù)時間在30-60分鐘之間，在此時間段內(nèi)海藻糖混合物的溫度最初隨水的蒸發(fā)而降低，然后回升。在該操作過程中當溫度達到約25℃(在所用的減壓下)時，該海藻糖形成包含玻璃樣海藻糖并含有處于干燥或部分干燥狀態(tài)的生物活性材料的玻璃樣基質。當該玻璃樣基質的含水量達到10％或更低時，第一個干燥階段完成，在該操作的此關鍵階段中最根本的是使溫度不超過40℃。如果在第一個干燥階段結束時溫度超過40℃，則生物活性材料將遭受損害。
然后將從第一個干燥階段獲得的產(chǎn)品用于第二個干燥階段，優(yōu)選產(chǎn)品不從用于該第一個干燥階段的干燥裝置中取出。在第二個干燥階段，在不超過0.1mbar的減壓下，對從第一個干燥階段獲得的玻璃樣基質進行進一步脫水。目前可利用的專門裝置具有在極低壓力，例如低于0.001mbar的壓力下操作的能力。然而，根據(jù)本發(fā)明在此第二個干燥步驟中采用0.001-0.1mbar，典型地0.01-0.1mbar范圍內(nèi)的減壓，已獲得了極為良好的結果。第二個干燥階段持續(xù)的總時間在10-30個小時，優(yōu)選20-30個小時范圍內(nèi)。
正如以上提及的，在第一個干燥階段結束時該玻璃樣基質的溫度不超過40℃。在第二個干燥階段中，該基質的溫度可以稍稍上升，當該干燥操作結束時，達到40-45℃的最終溫度。在第二個干燥階段結束時，該海藻糖基質將具有2％或更少，優(yōu)選1％或更少的殘留水分含量，以便在該產(chǎn)品中保證極高程度的熱穩(wěn)定性。在這樣的殘留水分含量時，該干燥操作的最終溫度應不高于45℃，因為高于45℃時該基質中的干燥生物活性材料可能遭到種程度的破壞。優(yōu)選地，在第二個干燥階段結束時，產(chǎn)品的溫度將不超過44℃。
通過實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有利的是在第二個干燥階段中控制基質溫度，以使基質在約37℃維持15-17個小時，然后在第二次干燥剩余的時間內(nèi)逐漸升高溫度(例如每小時0.5-1℃)，至40℃-45℃的最終溫度。
根據(jù)該方法制備的玻璃樣海藻糖基質可以在適合的水性介質中，典型的是無菌蒸餾水中，非?？焖俚刂匦滤?，在極短期內(nèi)產(chǎn)生使用的疫苗。
不經(jīng)過涉及冰升華的凍干步驟，將凍干儀用于病毒(例如牛瘟病毒和小反芻動物瘟疫病毒)及支原體干燥的該疫苗制備和操作程序，利用了二糖海藻糖在干燥過程中保護三級結構大分子這一獨特性質。
與常規(guī)凍干方法相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點本發(fā)明方法采用相對短的簡單程序，例如25個小時的制備周期，提供了高水平的病毒保護，由此降低了制備周期和能量消耗。
僅要求有基本干燥設備即可，盡管也可以采用精細復雜的微處理器控制的凍干儀，但這并不是嚴格必需的。
該方法耐受電力中斷，而凍干則不同，甚至短暫的停電也會引起產(chǎn)品的融化，導致不可接受的病毒損失。
在過去由于上皮向性(epitheliotropism)的喪失，口服接種某些減毒病毒株是難于實現(xiàn)的?？诜捅莾?nèi)接種對于許多應用而言將是有用和適合的，因為它們可以模擬飛沫傳染的天然途徑，產(chǎn)生級聯(lián)保護性粘膜免疫，包括IgA和體液IgG2a T輔助細胞1型應答。實施這些接種途徑是容易的，而且一旦制備了適合的疫苗，這些途徑將是適用的。模擬感染的天然途徑接種減毒活病毒株的方法誘導更為廣泛的漿液粘液性和細胞介導的免疫。根據(jù)再一方面，本發(fā)明提供制備用于口服或鼻內(nèi)給藥的疫苗的方法，其包括根據(jù)上述方法制備含有干燥病毒和適合的帶正電荷生物適合性水溶性佐劑的玻璃樣海藻糖基質，然后用適合的水性組合物重新水化該玻璃樣基質。根據(jù)本發(fā)明此方面的優(yōu)選實施方案，口服或鼻內(nèi)接種的疫苗是MMR疫苗。由于目前兒科MMR疫苗是通過常規(guī)凍干技術制備的，并皮下注射給患者，所以口服或鼻內(nèi)疫苗將有極大的好處。
以和該澄清病毒液1∶1的比例，在4℃加入含有10％w/v海藻糖和5％乳白蛋白水解物的無菌賦形劑。
將1.0ml的該賦形劑/病毒混合物分裝入無菌10ml中性玻璃小瓶中，然后用無菌干燥的丁基橡膠塞將該小瓶部分塞住。
將小瓶置于凍干室的架子上，并將該產(chǎn)品的溫度升高至37℃。
開啟冷凝器并使該冷凝器的溫度穩(wěn)定在-60℃。
開啟真空泵，并排出含有該產(chǎn)品的室的氣體，使壓力達到800mbar，然后輕柔地給產(chǎn)品脫氣30分鐘以避免飛濺，同時仔細檢查該產(chǎn)品的溫度以避免蒸發(fā)冷凍。通過在該干燥室和該冷凍冷凝器之間維持一個壓力梯度，在頭30分鐘內(nèi)將75％的水蒸汽抽入該冷凝器中。
然后將壓力降低至500mbar，形成結構亞穩(wěn)定玻璃樣基質。然后進一步降低壓力至0.1mbar并維持30分鐘。
在最終0.01mbar的真空下將小瓶塞住并密封，然后用鋁蓋蓋住。
干燥前病毒滴度104TCID/50/ml干燥后病毒滴度104TCID/50/ml該產(chǎn)品基質可在蒸餾水中快速溶解。該實施例表明，在本發(fā)明方法的第一個干燥階段中所用的處理基本上不影響該病毒的效力。該實施例還舉例說明了可以以工業(yè)規(guī)模對病毒脫水制備病毒疫苗。實施例2材料知方法RP知PPR疫苗培養(yǎng)物的制備首先采用非洲綠猴腎細胞系細胞，在補加了10％胰蛋白 磷酸鹽培養(yǎng)液(TPB，Difco)和10％胎牛血清(FCB)的Glasgow修飾Eagles培養(yǎng)基(GMEM)中，按如下所述培養(yǎng)小反芻動物瘟疫(PPRV 75/1)和牛瘟病毒(RBOK)株將非洲綠猴腎細胞系細胞接種在5個150cm2的塑料瓶中，細胞濃度為287,000個細胞/ml，每個瓶60ml。兩個瓶接種0.5ml PPR病毒懸液，感染復數(shù)為0.03個病毒顆粒/細胞。類似地，用RP病毒接種兩個瓶。一個瓶未接種作為對照。
這些瓶在5％CO2中37℃進行孵育，每天檢查細胞的致細胞病變效應(cpe)的出現(xiàn)。在第4天將GMEM培養(yǎng)基替換為含有2％FCS和0.1％海藻糖二水化物的Hanks乳白蛋白酵母提取物(Hanks LYE)。在第6天，該cpe為大約80％，將病毒收獲物匯合在一起，-20℃凍存。對照瓶在培養(yǎng)箱中保留10天，并證明其無污染或細胞降解，而且沒有明顯的外來物質的跡象。脫水方法所用脫水方法可以被認為由兩個類似于凍干的主要部分組成第一次干燥和第二次干燥。與凍干的根本不同在于產(chǎn)品不經(jīng)冰凍，而且干燥是通過簡單的脫水，而不是冰的升華來實現(xiàn)的。
化凍該匯集的病毒懸液，并用海藻糖二水化物的無菌5％w/v水溶液按1∶1進行稀釋，由此在該混合物中含有2.5％w/v終濃度的海藻糖。將1ml體積各分裝在5ml疫苗小瓶中，用干燥的開孔丁基橡膠塞部分密封。該操作在室溫于層流防生物危害室中進行，并注意嚴格的無菌預防措施。第一次干燥該脫水過程采用Edwards Supermodulyo凍干儀進行，該裝置對室內(nèi)壓力、冷凝器壓力、架子和產(chǎn)品的溫度具有精確的控制。在室內(nèi)架子上放置含有產(chǎn)品的小瓶之前，提前準備該凍干儀。將該架子的溫度升高至40℃并使冷凝器的溫度達到-40℃的操作極限。然后將小瓶放置在架子上，并使內(nèi)容物達到35℃。關閉室門，完全打開大和小進氣閥并打開真空泵，使氣鎮(zhèn)完全開放。小心關上大進氣閥，將室內(nèi)壓力調節(jié)至800mbar。使冷凝器中的壓力維持在500mbar，以便在該室和冷凝器之間產(chǎn)生壓力梯度，這提供驅動力量以促使水蒸氣從產(chǎn)品的表面流向冷凝器。用塞子部分封上這些小瓶也有減小孔隙由此更進一步增加產(chǎn)品表面壓力的有益作用。我們注意到，部分封閉的小瓶比含有溫度記錄熱電偶的完全敞開的小瓶干燥快。
在第一個干燥階段中產(chǎn)品溫度隨時間的改變以及室內(nèi)壓力隨時間的改變顯示在附圖
中。從圖中可以看出，正如由產(chǎn)品溫度下降所指示的，蒸發(fā)立即開始。產(chǎn)品的溫度在頭15分鐘內(nèi)主要通過仔細關閉大進氣閥來控制，之后通過操作小進氣閥來控制，以確保產(chǎn)品不會發(fā)生冷凍。通過蒸發(fā)冷卻使溫度維持在約1-2℃，這增加了蒸發(fā)速率，以致90％的水在1小時內(nèi)蒸發(fā)，然后使產(chǎn)品溫度開始上升以達到與架子溫度相似的溫度。隨著脫水繼續(xù)進行，40分鐘后達到一個關鍵點，在此時產(chǎn)品溫度突然快速上升至25℃，數(shù)秒之后產(chǎn)品溫度突然降低，至15℃。這時伴隨出現(xiàn)顯著的產(chǎn)品起泡。第二次干燥再制備一批減毒活牛瘟病毒株(RP)(第2批)，按以上所述對其進行1小時的第一次干燥。然后將之進行第二次干燥，其間在接著的17個小時內(nèi)溫度上升至42.4℃的終產(chǎn)品溫度，壓力為0.06mbar，氣鎮(zhèn)完全關閉。這具有將材料中殘留水分含量減少至約0.72％的作用。
再制備一批(第2批)減毒活小反芻動物瘟疫病毒株(PPR)，并按以上所述將其進行1小時的第一次干燥。然后將其進行第二次干燥。2小時后在產(chǎn)品溫度達到42.8℃和室內(nèi)壓力達到0.06mbar時終止第二次于燥。在此短期第二次干燥過程后，產(chǎn)品的殘留水分含量為5.36％。熱穩(wěn)定性測試將按上述方法制備的PPR和RP的第2批樣品保存在4℃、25℃、37℃和45℃。在第0、3、7、10和14天孵育后，從各保存溫度取3個小瓶，測量病毒滴度。這三個小瓶的幾何平均數(shù)被作為每批類型在各溫度孵育特定時間的殘余病毒滴度(表3和4)。病毒滴定進行這些試驗，通過評價該海藻糖玻璃樣狀態(tài)所誘導的保護程度，以確定該超快1小時脫水的效力。按Mark，M.Rweyemamu等在FAO動物產(chǎn)品和健康報(FAO Animal Production and Health Paper)1994年第118期(NB FAO是聯(lián)合國食品和農(nóng)業(yè)組織)中所述的用于牛瘟疫苗的標準操作方法，進行病毒滴定。注進行動物疫苗質量調節(jié)和協(xié)調的主體是動物流行病國際部(OIE)。RP效力的OIE標準是102.5TCID50s/劑量，對于PPR是103TCID50s/劑量(此處TCID是組織培養(yǎng)物的感染劑量)。在下表1、2、3和4中病毒滴度表示為X log10TCID50/ml，其中“X”是各表中試驗1、2和3下的所示數(shù)字。結果和討論采用以上方法干燥1小時的成對RP和PPR疫苗樣品，與凍干疫苗對照樣品以及與含有2.5％海藻糖的親本未處理病毒庫進行比較，所獲結果列在表1和2中。在800mbar的減壓條件下37℃快速脫水后，含有2.5％海藻糖的賦形劑給予RP病毒良好的保護，干燥后損失為0.45log10TCID50/ml。表1-第一次干燥后牛瘟疫苗的滴定結果
在相同的賦形劑中對PPR的保護是出色的，干燥后僅損失0.15log10TCID50/ml。表2-小反芻動物瘟疫病毒滴定
在該脫水方法中加入第二階段明顯地對產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了顯著影響。這通過如下事實獲得證明，即接受17個小時第二次干燥的第2批RP在45℃儲存2周后僅損失log 1.9TCID/50/ml。表3-第2批牛瘟疫苗的熱穩(wěn)定性測試
另一方面，僅進行了2個小時第二干燥的第2批PPR在45℃孵育14天后沒有檢測到病毒。
表4-第2批PPR的熱穩(wěn)定性測試
采用所述低濕休眠法進行的牛瘟和PPR病毒脫水，在1小時內(nèi)產(chǎn)生含有約10％殘留水分含量的玻璃樣蜂巢結構。推測，40分鐘干燥后觀察到的放熱可能指示了在減壓下該海藻糖賦形劑的玻璃過度溫度，此時該海藻糖由液體轉變形成亞穩(wěn)定玻璃(見Robert，J.Williams和A.CarlLeopold，玉米胚中的玻璃樣狀態(tài)(The glassy state in corn embryos)，Plant Physiol.1989，89，977-981)。在此狀態(tài)的產(chǎn)品殘留水分含量約10％，具有微晶結構，并且當用稀釋劑重新水化時表現(xiàn)出驚人的快速溶解性。在含有5.36％殘留水分含量的產(chǎn)品上進行的增高熱穩(wěn)定性測試導致不可接受的損壞，表現(xiàn)出巨大的病毒滴度喪失(表4)。
含有半強度Hanks LYE、1％FCS和2.5％w/v海藻糖的賦形劑足以在此1小時超快速脫水期間，殘留水分含量快速降低至10％時保護RP和PPR病毒(表1和2)。
對于5.36％的含水量，45℃暴露14天破壞該病毒(表4)。然而，將第二次脫水延長至17個小時具有進一步降低殘留水分含量(至不足1％)的預期效果，籍此賦予增強的熱穩(wěn)定性(表3)。
45℃暴露14天，滴度降低log 1.9TCID/50/ml，同時維持log103.03TCID50/ml的最小滴度，這與目前的凍干“熱穩(wěn)定性”(Thermovax)疫苗中發(fā)現(xiàn)的預期滴度降低相比更為有利。在僅進行了2個小時第二次干燥、然后同樣暴露于45℃的第2批PPR中，病毒的完全喪失突出了高殘留水分含量的破壞性作用，并強調了延長第二次干燥以確保低殘留水分含量的必要性。實施例3在含有10％胎牛血清和10％胰蛋白 磷酸鹽培養(yǎng)液(Difco)的GMEM培養(yǎng)基(sigma No.G6148)中于非洲綠猴腎細胞系細胞上增殖小反芻動物瘟疫(PPR)病毒。在150cm2瓶中以每毫升26×104-28×104個細胞的濃度，每個瓶加入60ml細胞懸液，增殖這些細胞。
每個150cm2瓶接種足量的PPR種病毒，感染復數(shù)(MOI)為10-3個病毒顆粒/細胞。
接種后第4天，當注意到早期致細胞病變效應(CPE)時，將該培養(yǎng)基替換成含有2％胎牛血清和0.1％海藻糖二水化物(代替葡萄糖)的Hanks乳白蛋白酵母提取物。這將在隨后的脫水過程中降低溶質濃縮并使?jié)B透應力最小化，以及除去可以參與美拉反應的還原性糖，例如葡萄糖，在脫水期間該反應會使核蛋白變性。
接種后第6天，cpe為80-90％，收獲該病毒液體并冷凍過夜。融化該冰凍液體以釋放內(nèi)源性病毒并保存在-20℃。
將該融化的病毒液體與16％w/v無菌海藻糖二水化物水溶液(DFS Ltd)按1∶1比例混合，在該病毒賦形劑混合物中產(chǎn)生8％終濃度的海藻糖。
將1ml體積的該病毒賦形劑混合物分裝在無菌5ml疫苗小瓶(每個小瓶中1ml液體)，并用開孔的干燥丁基橡膠塞(130℃3個小時新鮮干燥的)將這些小瓶部分塞上。采用Edwards Super Modulyo凍干儀進行脫水。
在將小瓶置于架子上之前，提前準備該凍干儀。打開冷凝器并使冷凝器溫度到達-40℃的操作極限。打開架子的加熱系統(tǒng)并將架子的溫度設置在40℃。關閉冷凝器門和排氣閥，打開真空泵，使氣鎮(zhèn)完全開放。當架子的溫度達到40℃時，將小瓶放置在架子上，并在每個架子的一個小瓶中插入溫度熱電偶，關閉室門并將大和小進氣閥完全打開。
當小瓶中內(nèi)容物的溫度達到35℃時，部分關閉大進氣閥以實現(xiàn)800-900mbar的壓力。在頭15分鐘內(nèi)，對小瓶中含有來自介質中碳酸氫鈉的溶解CO2的賦形劑輕柔地進行脫氣。在此階段中海藻糖可以接近病毒脂膜。
進一步關閉大進氣閥，以使壓力降低至500mbar。這使得小瓶中的賦形劑溫度可以降低至約4.0℃，這說明蒸發(fā)冷卻正在發(fā)生。仔細關閉小進氣閥，同時監(jiān)測賦形劑的溫度，以使該溫度穩(wěn)定在約4.0℃。由于在該操作中這是最關鍵的階段，所以注意避免飛濺和/或導致產(chǎn)品冷凍的過快蒸發(fā)。向室內(nèi)計量通入無菌空氣，以提供壓力梯度促進水蒸汽流向冷凝器。通過仔細控制小進氣閥，使整個過程中產(chǎn)品的溫度維持在4℃。產(chǎn)品溫度在4℃左右維持20-30分鐘后，將小進氣閥緩慢關閉，同時注意將產(chǎn)品溫度維持在約4℃，室內(nèi)壓力維持在300mbar。在該階段，產(chǎn)品體積極大地降低，到達糖漿稠度。到此時，將小氣閥完全關閉。
從第一個干燥步驟開始起40分鐘后，觀察到產(chǎn)品溫度的上升。45分鐘后，賦形劑中大多數(shù)水分已蒸發(fā)掉，并且伴隨大約15℃的突然散熱，產(chǎn)品擴大成微晶蜂巢結構，同時海藻糖玻璃化為亞穩(wěn)定起泡玻璃基質。這之后，產(chǎn)品中進一步的水汽蒸發(fā)成為具有10％最終含水量的產(chǎn)品，產(chǎn)品的溫度也隨之降低。
在關閉大和小進氣閥并關閉真空泵的氣鎮(zhèn)閥的情況下，于0.1mbar的室內(nèi)壓力下持續(xù)干燥過夜，在此期間產(chǎn)品的溫度達到40℃，即室內(nèi)架子的溫度。繼續(xù)干燥以完成總共24小時的干燥時間，其間室內(nèi)架子的溫度在最后4小時的干燥時間內(nèi)每小時上升1.0℃，達到44℃的最終溫度頂點(架子和產(chǎn)品)。在維持0.06mbar室內(nèi)壓力的同時，將這些小瓶密封并蓋上鋁封蓋。
將根據(jù)本實施例制備的脫水產(chǎn)品樣品儲存在45℃14天，然后按實施例2中所述方法測定病毒滴度。根據(jù)以上方法脫水的產(chǎn)品的殘留水分含量經(jīng)測定為約1.0％。45℃儲存14天后，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品的樣品僅有輕微程度的病毒效力損失，適用于制備有用的疫苗材料。實施例4按照以上實施例3的操作程序，采用RP病毒培養(yǎng)物代替實施例3中所述的PPR培養(yǎng)物，制備穩(wěn)定化RP。此干燥過程同樣制備了在45℃保存14天后滴度損失相對較低的穩(wěn)定RP。
權利要求
1.含有活病毒或支原體的生物活性材料的保存方法，該方法包括步驟(i)將該生物活性材料的水性懸液與海藻糖的無菌水溶液混合，以使該混合物中的海藻糖濃度在0.2-10％w/v范圍內(nèi)；(ii)在低于大氣的壓力下，在溫度最初不超過37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最終不超過40℃的條件下，對該混合物進行第一次干燥，時間為30-60分鐘，以形成含有玻璃樣海藻糖、殘留水分含量不超過10％的玻璃樣多孔基質，在該基質中含有干燥的生物活性材料；和(iii)在不超過0.1mbar的壓力下，在溫度最終處于40-45℃范圍內(nèi)的條件下，對步驟(ii)的玻璃樣多孔基質進行第二次干燥，時間為10-30個小時，以形成含有干燥的生物活性材料的、殘留水分含量不超過2％的海藻糖基質。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(iii)中的第二次干燥進行20-30個小時。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中第二次干燥在約37℃的溫度下進行15-17個小時，之后在第二次干燥剩余的時間內(nèi)溫度逐漸上升到40-45℃的最終溫度。
4.根據(jù)權利要求1-3之任一項的方法，其中，在步驟(i)中該混合物內(nèi)海藻糖的濃度在2-10％w/v的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中該混合物中海藻糖的濃度在2.5-8％w/v的范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權利要求1-5之任一項的方法，其中步驟(ii)中的第一次干燥在不超過800mbar的壓力下進行。
7.根據(jù)權利要求1-6之任一項的方法，其中在步驟(ii)的第一次干燥結束時該玻璃樣海藻糖基質的殘留水分含量為約10％。
8.根據(jù)權利要求1-7之任一項的方法，其中在步驟(iii)的第二次干燥結束時所述殘留水分含量為1.0％或更低。
9.根據(jù)權利要求1-8之任一項的方法，其中該活病毒選自牛瘟病毒、小反芻動物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、黃熱病毒、脊髓灰質炎病毒和新城疫病毒。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中該活病毒是牛瘟病毒或小反芻動物瘟疫病毒。
11.根據(jù)權利要求1-8之任一項的方法，其中該支原體是牛接觸感染性胸膜肺炎支原體。
12.用于制備疫苗的可重新水化的組合物，其含有殘留水分含量不超過2％的亞穩(wěn)定玻璃基質形式的海藻糖，在該基質中含有選自干燥活病毒和干燥支原體的干燥生物活性材料。
13.根據(jù)權利要求9的組合物，其具有不超過1％的殘留水分含量。
14.根據(jù)權利要求12或權利要求13的組合物，其中該生物活性材料是選自牛瘟病毒、小反芻動物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、黃熱病毒、脊髓灰質炎病毒和新城疫病毒的活病毒。
15.根據(jù)權利要求14的組合物，其中該生物活性材料是選自牛瘟病毒和小反芻動物瘟疫病毒的活病毒。
16.根據(jù)權利要求12或權利要求13的組合物，其中該生物活性材料是牛接觸感染性胸膜肺炎支原體。
17.制備疫苗的方法，其包括將權利要求12-17之任一項的組合物在適當?shù)乃越橘|中重新水化。
全文摘要
不經(jīng)凍干在殘留水分含量不超過2％的玻璃樣海藻糖基質中，通過干燥保存含有活病毒或支原體的生物活性材料。該方法包括兩個真空干燥階段。在比經(jīng)典凍干法短得多的一個周期時間內(nèi)，可以保存病毒或支原體以提供能夠通過重新水化產(chǎn)生有效疫苗的材料。
文檔編號C12R1/93GK1433465SQ00807149
公開日2003年7月30日 申請日期2000年5月3日 優(yōu)先權日1999年5月4日
發(fā)明者埃里克·愛德華·沃勒爾 申請人:埃里克·愛德華·沃勒爾