專利名稱：包囊與卵囊的凈化、回收及孢子形成的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明概括起來是關(guān)于對包囊原蟲進行凈化、回收和形成孢子，以用于疫苗生產(chǎn)的方法，原蟲是大家知道的襲擊宿主胃腸道的病原體。當宿主的免疫系統(tǒng)很弱或受抑制時，譬如作為很年輕、很老、以及免疫損害的宿主，傳染可以是致命的，這種損失也會轉(zhuǎn)成經(jīng)濟損失。原蟲在自然環(huán)境中以較穩(wěn)定的包囊形式存在，當原蟲是一種孢子蟲時也稱作卵囊。當攝入到宿主體內(nèi)時，包囊的原蟲對胃腸道的條件起反應(yīng)，并感染宿主。
為預防或減輕這類疾患，發(fā)展了非卵內(nèi)疫苗。這類疫苗一般使宿主接觸低水平的原蟲，以使宿主產(chǎn)生免疫而不引起疾病。這樣的疫苗包括一種能對抗多種球蟲中任一種所引起的禽類球蟲病的疫苗(U.S.專利號5,055,292)，一種用于貓抗弓形蟲的疫苗(U.S.專利號5,045,313)，以及用于豬和其它反芻動物的疫苗(U.S.專利號4,808,404)。這些疫苗只是部分地有效，因為它們必須填喂或加入到動物的水或食物中。填喂法的效率很低，因為它需要手工方法導入疫苗。而且，不少小雞因操作而死亡。將疫苗加在食物或水中也效率不高，因為剛孵化后的雞雛吃得很少，因此，疾病的控制被拖延了。其結(jié)果是獲益較慢，需較長時間才能取得市場效益。
為了生產(chǎn)疫苗，必須得到足夠的凈化的包囊原蟲的供應(yīng)。通用的分離回收技術(shù)使用腐蝕性的、有危險性的毒性材料。必須采取措施對付這些材料，如大量的洗滌操作以除去這些材料，這造成產(chǎn)率較低。獲得包囊原蟲的經(jīng)典方法包括取得包囊原蟲源，如受感染動物的腸或糞便。需要將腸或糞便成分與包囊原蟲分離開，因此采用浮選法。已采用重介質(zhì)浮選或沉降方法，這里的重介質(zhì)是氯化鈉(U.S.專利號4,863,731)或蔗糖(U.S.專利號5,068,104)。重介質(zhì)以水混合物形式應(yīng)用?？墒牵褂弥亟橘|(zhì)的水混合物會有不利的效應(yīng)。例如，氯化鈉的水混合物可引起設(shè)備的嚴重腐蝕。
在包囊原蟲能成為有傳染性之前，必須使分離得到的卵囊用溫和氧化的方法形成孢子?；?qū)⒙涯覒乙褐糜趽u床上，或向懸液內(nèi)通氣，以實現(xiàn)溫和氧化。為在孢子形成過程中抑制不需要的微生物生長，通常使用重鉻酸鉀。但是重鉻酸鉀是一種有害材料。它的使用引起操作和廢棄中的問題。為清除它，造成產(chǎn)率降低及費用增加。
用次氯酸鈉進行最后一步漂白，以消除任何殘留的有機物及非期望的微生物。經(jīng)漂白的包囊原蟲必須進行洗滌以使殘留的漂白劑濃度降到可接受的水平。洗滌采用一系列的稀釋和卵囊回收操作以降低漂白劑水平并產(chǎn)生卵囊濃集物。最終的包囊原蟲濃集物在無菌條件下制成疫苗。每一種疫苗可包括多種原蟲以提供最多種類的防護。
還需要一種更為有效的疫苗接種方法。這種方法可使用一種活的疫苗，其劑量水平足以產(chǎn)生免疫反應(yīng)建立起免疫力，同時又保持足夠低的水平不會引起急性癥狀。例如，一種抗禽類球蟲病的卵內(nèi)疫苗能縮短處理時間，并可得到更為均勻的劑量。此方法也可用于收集和生產(chǎn)對抗包括隱孢子蟲和蘭氏賈第蟲在內(nèi)的原蟲的人疫苗。此方法將使用一種非腐蝕性的密介質(zhì)浮選法，或氣體浮選法，而完全不需要鹽。這種改進的方法將不使用如重鉻酸鉀那樣的有害殺蟲劑。這種另外的殺蟲劑或氧化劑還可以起漂白劑的雙重作用，消除方法中的另一步驟和另一種有害化合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種凈化和回收包囊原蟲的方法，包括用鹽浮洗法或氣浮選法將包囊原蟲從含有包囊原蟲的懸液中分離出來，這里所指的鹽如硫酸鈉，硫酸鎂，氯化鎂，氯化鈣，或它們的混合物。
在一個實施方案中，分離包囊原蟲的方法是用鹽浮洗法，這里的鹽是硫酸鈉。在此方案中，本方法包括制備一種含有包囊原蟲及硫酸鈉的摻合物，將此漿液離心，從中回收上清，將上清稀釋并將該稀釋物離心，然后從離心后的稀釋物中回收濃集物。本方案也可包括將摻合物用高強度勻漿法制成勻漿。在摻合物中硫酸鈉約占3至30wt.％。此外，稀釋物的比重可低于包囊原蟲的比重。濃集物含有約1×104至約1.5×106的包囊原蟲/ml。
在另一實施方案中，包囊原蟲的分離采用氣浮選法。氣浮選法包括調(diào)節(jié)懸液pH達到足以影響懸液中氣泡與包囊原蟲間的粘著性，通過加入足量的表面活性劑化合物選擇性地涂裹懸液中的顆粒、以及加入足量的異極化合物生成穩(wěn)定的泡沫來調(diào)理已調(diào)好pH的懸液；將調(diào)理好的懸液通過至少一個氣浮選室，并從氣浮選室中回收包囊原蟲。適宜的氣體包括空氣。當氣體為空氣時，pH可調(diào)至約2.5至約3.5。表面活性劑化合物包括長鏈烷基硫酸氫鈉鹽，季胺化合物，脂肪醋酸銨和2-乙基己醇的摻合物，酯/酰胺化合物，烷氧聚乙烯氧基乙醇，及它們的混合物。異極化合物包括戊醇，丁醇，萜品油，甲酚，及其混合物。氣浮選室的適宜氣流速度為約0.25至約1.1體積的氣體/懸浮體積/分。在一個優(yōu)選的實施方案中，氣浮選室至少包含兩個連續(xù)的氣浮選單元，這些單元中可有不同的氣流速度。
本發(fā)明還涉及使卵囊形成孢子的方法，包括用水和過氧化氫制成卵囊的水懸液，其中過氧化氫的量足以消除非期望的微生物生長，還包括向水懸液充氣使卵囊形成孢子。水懸液充氣時間可大于約40小時，其條件為充氣過程中水懸液中溶解氧的水平高于80％左右的飽和水平，溫度為約22℃至約32℃，同時其攪拌水平足以使所有的固體充分懸浮。在本實施方案中，水懸液能包含的卵囊濃度為約104至約106卵囊/ml，過氧化氫的濃度為約1,000至約20,000mg/l。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明包括卵囊的凈化、回收和孢子形成，包括從含有卵囊的最初懸液中分離卵囊，并用本發(fā)明的方法使分離的卵囊形成孢子。適宜的卵囊為百型艾美球蟲，和緩艾美球蟲，禽艾美球蟲，堆型艾美球蟲，波氏艾美球蟲，萘氏艾美球蟲，塞前艾美球蟲，及其混合物。在一個實施方案中，用硫酸鈉浮選方法進行卵囊分離，包括制備含有卵囊和硫酸鈉的摻合物，將漿液離心，從中回收上清，制成上清的稀釋液并將其離心，從離心后的稀釋液中回收濃集物。
在另一個實施方案中，用氣浮選法進行卵囊分離，包括調(diào)節(jié)懸液pH達到足以影響懸液中氣泡與包囊原蟲間的粘著性，通過加入足量的表面活性劑化合物選擇性地涂裹懸液中的顆粒、以及加入足量的異極化合物生成穩(wěn)定的泡沫來調(diào)理已調(diào)好pH的懸液；將調(diào)理好的懸液通過至少一個氣浮選室，并從氣浮選室中回收包囊原蟲。此實施方案可進一步包括對形成孢子的卵囊加入漂白劑，其量足以使殘余的微生物滅活、消除殘余的有機物以及漂白形成孢子的卵囊。在另一實施方案中，漂白與孢子形成同時進行，漂白劑是過氧化氫。還有一個實施方案，漂白劑是次氯酸鈉，其含量為每百萬游離有效氯中約5000至約10000份，臭氧量為空氣中達3％左右，以及它們的聯(lián)合。
此方法還可進一步包括用錯流膜過濾洗滌漂白的卵囊以將殘存的漂白劑濃度減少到可接受的水平。還有另一實施方案，漂白劑是次氯酸鈉，洗滌后其濃度足以抑制殘余微生物生長，漂白并洗滌后的卵囊懸液的濃度為約1×106至2.5×106卵囊/ml，最大固體顆粒小于約200微米，而硫酸鈉的含量是充分地低，低到不會影響包囊或卵囊的活力和傳染力，優(yōu)選地低于約3％，更優(yōu)選地低于約0.9％。此方法可進一步包括將漂白洗凈的卵囊濃集為無菌的濃集物，將一種或更多種的卵囊無菌濃集物合并成聯(lián)合濃集物，并在無菌條件下將聯(lián)合濃集物進行包裝。
附圖簡述


圖1A是一流程圖，說明本發(fā)明第一部分方法的實施方案；
圖1B是一流程圖，說明本發(fā)明第二部分方法的實施方案；圖2是以卵囊濃度對硫酸鈉濃度所作之圖；圖3是以孢子形成百分比對包囊收獲后時間所作之圖。
發(fā)明詳述本方法涉及生產(chǎn)一種包囊或形成孢子的卵囊的濃集物在疫苗中使用。尤其，本方法涉及生產(chǎn)一種形成孢子的禽類球蟲卵囊的濃集物，用于生產(chǎn)抗球蟲的卵內(nèi)疫苗。生產(chǎn)一種適宜、合格的疫苗需要由多單元方法構(gòu)成的多步驟處理方法。如
圖1A及
圖1B所示，疫苗生產(chǎn)過程包括以下步驟收集包囊原蟲懸液，將懸液勻漿化，用鹽浮選或氣浮洗法從懸液中分離包囊原蟲，必要時使包囊原蟲形成孢子，將形成孢子的包囊原蟲漂白，洗滌漂白產(chǎn)物，濃縮包囊原蟲，合并多種包囊原蟲濃集物，以及無菌裝填產(chǎn)生疫苗。以下詳述這些步驟。
包括包囊和卵囊在內(nèi)的包囊原蟲可從各種來源取得，包括凈化的懸液，腸道內(nèi)層，以及糞便懸液。尤其當包囊原蟲取自糞便時，懸液或漿中可能包括相當量的不需要的懸浮固體。例如，懸液中可能包括約1％直至約20wt.％的固體或糞便。優(yōu)選在采用鹽浮選法時，懸液含有約5至20wt.％的固體，在氣浮選法時含有約1wt.％的固體。為了使包囊從懸液內(nèi)締合的有機物中游離出來，可將懸液進行勻漿處理。懸液可以勻漿化持續(xù)0分鐘以上至約5分鐘，優(yōu)選是1分鐘，視勻漿化的強度而定。勻漿化的條件應(yīng)當是其強度足以游離包囊和卵囊，但是也要足夠溫和以防止其破壞。
從此最初懸液中分離包囊原蟲優(yōu)選地達到至少回收約70％的包囊原蟲，并至少排除約80％的固體。典型情況下，這可使包囊原蟲的濃度達約1×104至約1.5×106包囊原蟲/ml。用鹽浮選法或氣浮選法可以實現(xiàn)分離。
采用鹽浮選法時，制備未凈化包囊原蟲與鹽的摻合物。適宜的鹽溶液包括水溶性鹽的濃溶液，包括氨、鈉、鉀、鈣、鎂和鋅的氯化物，硫酸鹽，磷酸鹽，硝酸鹽和醋酸鹽。適宜的高氫鍵有機化物包括尿素和胍鹽。優(yōu)選鹽類包括硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈣，及其混合物。更優(yōu)選的鹽是硫酸鈉。這些鹽的優(yōu)點是對操作設(shè)備極少腐蝕。加入鹽的量足以使包囊原蟲的比重和摻合物比重之間產(chǎn)生差別。優(yōu)選地，包囊原蟲的比重會低于摻合物的比重。鹽的含量約為3％(w)至約30wt.％，優(yōu)選為約14至約20wt.％，更優(yōu)選為20wt.％。
然后將摻合物進行離心，收集上清液及濃集物。依摻合物的條件不同，包囊原蟲可以收集在上清中或濃集物中。摻合物以約3000g至約15000g離心，最好是12,000g，持續(xù)時間要足以充分分離包囊原蟲，典型情況下可長達約10分鐘。在20％硫酸鈉溶液中，包囊原蟲會包含在上清中；因此，收集上清，而將濃集物或沉淀物作廢物處理。如圖2所示，20％濃度的硫酸鈉可提供含高濃度的包囊原蟲(此處為卵囊)的上清(產(chǎn)物)，只有少量包囊原蟲在沉淀中(廢物)。在回收上清中加水形成稀釋液。上清要充分稀釋，使包囊原蟲的比重高于稀釋液的比重。因此包囊原蟲會趨向于在稀釋液中沉下來。對于20％濃度的硫酸鈉，稀釋液質(zhì)量與上清液質(zhì)量之比約為4至8左右。
然后將稀釋液進行二次離心，離心條件與首次離心相仿，即使殘余鹽濃度低于約10wt.％，最好低于約1wt.％，所得包囊濃度約為104-106包囊/ml，表明回收率約為80％至95％左右。固體碎片的清除率優(yōu)選地為約90～99％左右。在此實施方案中，包囊原蟲從濃集物中得到回收，而上清作廢物處理。
在另一實施方案中，用氣浮選法分離包囊原蟲。優(yōu)選的氣體是空氣，盡管包括氧和氮在內(nèi)的任何氣體均可使用。當采用氣浮選法時，懸液的pH調(diào)整到一種pH，足以影響懸液中氣泡和包囊原蟲間的粘著性，這是通過改變包囊原蟲表面化學而實現(xiàn)的。一般情況下，pH調(diào)到約為2～9左右，優(yōu)選為約2.5～3.5，更為優(yōu)選是3左右。
經(jīng)pH調(diào)節(jié)的懸液又通過加入表面活性化合物進行調(diào)理，這類化合物有時叫做促集劑化合物和異極化合物，有時叫做起沫劑化合物。表面活性劑化合物，也叫做選擇性去垢劑、潤濕劑、或乳化劑，加入的量足以促進所選擇的固體與氣泡間的接觸，這借助于在要浮起的顆粒表面形成一薄涂層，使這些顆粒呈疏水性，而不涂布其它顆粒。因此，通過選擇表面活性劑化合物，可以決定浮起的顆粒。因此，包囊原蟲可在氣浮選過程中浮起而被收集，或在一逆浮選過程中將要除去的固體浮起而得到收集。適宜的表面活性劑包括長鏈烷基硫酸氫鈉鹽，季胺化物，脂肪醋酸銨和2-乙基己醇的摻合物，酯/酰胺化合物，烷氧聚乙烯氧基乙醇，及其混合物。優(yōu)選的表面活性劑化合物是月桂基硫酸鈉。表面活性劑的用量應(yīng)當足以涂布擬浮起的顆粒。表面活性劑在調(diào)理好的懸液中的量約為0.5-2lb/噸固體，優(yōu)選0.5lb/噸固體。或者，表面活性劑化合物可以是約0.5lb的十二烷基胺/噸固體，它已用鹽酸酸化達到pH中性，或是0.5lb的油酸鉀鹽/噸固體。
異極化合物的選擇根據(jù)其改變水表面張力和生成穩(wěn)定性泡沫的能力。典型地，這些異極化物含有一個或一個以上的烴基，與一個極性基相結(jié)合，烴基具有5或6個以上的碳原子。適宜的異極化合物包括戊醇和丁醇，萜品油，甲酚，及其混合物。優(yōu)選異極化合物為甲基異丁基甲醇(MIBC)，也叫做甲基戊醇，最精確地叫做4-甲基戊醇-2。異極化合物存在的量足以生成穩(wěn)定的泡沫，異極化合物的存在量優(yōu)選為達到約2.0lb/噸固體，更優(yōu)選的是約0.5～2.0lb/噸固體，最優(yōu)選的是約0.5lb/噸固體。
將經(jīng)調(diào)理的懸液通過一氣浮選室，包囊原蟲得到回收。因所選的pH、表面活性劑化合物和異極化合物的不同，包囊原蟲可以浮起，或留在懸液中。優(yōu)選將包囊原蟲浮起。氣浮選法持續(xù)一段時間，其空氣流速足以回收包囊原蟲約20～100％，典型的是85％，而同時排除固體碎片20～90％，典型的是70％。氣浮選法進行的時間約為3分鐘至10分鐘以上，優(yōu)選約10分鐘?？諝飧∵x室中的氣流速度為約0.25～約1.1體積的氣體/溶液體積/分(“vvm”)，優(yōu)選為約0.25～約0.83vvm，更優(yōu)選約0.25～約0.75vvm。氣浮洗室可包含多個連續(xù)的浮選單元。優(yōu)選的是，氣浮選室包含至少兩個連續(xù)的浮選單元。優(yōu)選地，浮洗單元是氣浮選柱。在連續(xù)浮選單元中的氣體流速可以相同，或不同。優(yōu)選不同的氣流，例如一個32英寸高、2英寸直徑柱的流速約為0.47vvm，而60英寸高、2英寸直徑柱內(nèi)約為0.27vvm。
當包囊原蟲是卵囊或包囊孢子蟲時，使卵囊形成孢子。如圖3所示，應(yīng)在收獲卵囊后盡快地形成孢子，優(yōu)選地，卵囊應(yīng)在收獲3天內(nèi)形成孢子。制備卵囊與氧化劑或殺蟲劑的水懸液，然后將水懸液充氣一段時間足以使卵囊形成孢子。如用鹽浮選法分離卵囊，那么在孢子形成過程中的鹽濃度應(yīng)當?shù)陀诩s10wt.％，優(yōu)選地低于約2wt.％，更優(yōu)選地低于約1wt.％。優(yōu)選地，孢子形成過程中包囊濃度為約104～約106卵囊/ml，更優(yōu)選地約105卵囊/ml。應(yīng)當在回收純凈包囊濃集物后約1～24小時內(nèi)使卵囊形成孢子。水懸液的pH值應(yīng)為約5.0～7.0，優(yōu)選地約5.2～6.8。水懸液溫度在一個實施方案中為約20～約33℃，優(yōu)選約22～約32℃，更優(yōu)選約25～約29℃，最優(yōu)選約25℃。在一個實施方案中充氣速度為約0.1～約10vvm，優(yōu)選地約0.1～約2.0vvm?？傊瑪噭铀綉?yīng)足以使孢子形成過程中所有固體充分懸浮但不至于損壞卵囊。這在充氣，振蕩，攪拌及其結(jié)合的過程中是可能發(fā)生的。當采用攪拌時，例如，攪拌應(yīng)足以使懸液中的固體保持懸浮但不至于損壞包囊或卵囊。在一個6英寸直徑的容器中以約121～204rpm可產(chǎn)生適宜的攪拌，優(yōu)選地約197～200rpm，更優(yōu)選約200rpm。溶解氧含量應(yīng)當保持在足以允許卵囊形成孢子的水平，優(yōu)選地約為該溫度下飽和濃度的80％。孢子形成的時間可以達到約72小時，優(yōu)選地約40小時～約72小時之間，更優(yōu)選地約48～約50小時。
氧化劑加入的量要足以使水懸液中的不良微生物滅活。適宜的氧化劑，或殺蟲劑，包括過氧化氫，臭氧，重鉻酸鉀，氯，及其聯(lián)合。在一個實施方案中，氧化劑是重鉻酸鉀，存在的量約為2.5％(v/w)。在一優(yōu)選實施方案中，氧化劑是過氧化氫，含量約1,000～約20,000mg/l，優(yōu)選地5,000mg/l。過氧化氫的優(yōu)點是操作方便、價廉，而且此方法生成的有害廢物副產(chǎn)物較低。
充氣的方法可藉在搖床上震搖，或在孢子形成罐(如發(fā)酵罐)中噴射空氣。優(yōu)選地，采用在空氣噴射罐中充氣，因為送入的空氣量較大，從而減少孢子形成所需的時間和設(shè)備所需的體積。
孢子形成后，必要時，可洗滌卵囊以降低殘存氧化劑濃度達到合格水平。過氧化氫的好處是不需要此步驟。洗滌可通過連續(xù)清洗，優(yōu)選地采用膜過濾清洗，更優(yōu)選地采用滲濾。在膜過濾時，對膜孔徑的選擇要能使溶質(zhì)通過膜，而限制卵囊從膜的一側(cè)進入另一側(cè)。在一個實施方案中，清洗中水的跨膜壓力為約達30psi，優(yōu)選地約20～約25psi，錯流速度達到約10m/s，優(yōu)選地約2m/s，通過膜的流量達到約101/min/m2，優(yōu)選地約31/min/m2。
對卵囊可進行漂白以滅活殘留的微生物并消除殘余的有機物。首先，加入足量的漂白劑，然后卵囊被漂白或與漂白劑保持接觸足夠長的時間。卵囊可被漂白長達1.5小時。適宜的漂白劑包括次氯酸鈉，過氧化氫，臭氧，及其混合物。漂白劑的起始含量可以是約2000～20,000mg/l，優(yōu)選地約8000～約10,000mg/l，更優(yōu)選地8000mg/l。漂白劑的量不應(yīng)引起設(shè)備腐蝕。當將過氧化氫用于孢子形成時，漂白和孢子形成可同時進行。必要時，在漂白后對漂白懸液進行洗滌，以使殘余氧化劑濃度降到合格水平。當用次氯酸鈉作漂白劑時，合格水平為約1mg/l以下。洗滌可采用連續(xù)清洗或滲濾。
漂白后的懸液可濃縮成無菌濃集物，其高濃度足以進行有效和高效的操作。例如，最后的濃縮包囊原蟲懸液可包含的最大固體的大小小于約200μ，優(yōu)選地小于約25μ，鹽濃度低于約0.9％，游離的殘余氯濃度低于約1mg/l，但仍足以抑制殘余微生物生長，包囊濃度為約1×106～2.5×106包囊/ml。
當許多的包囊原蟲或一類包囊原蟲的不同種屬用于單個疫苗時，不同種屬的無菌濃集物合并成為單一的無菌濃集物。例如，包囊原蟲可以是禽球蟲卵囊包括百型艾美球蟲，和緩艾美球蟲，禽艾美球蟲，堆型艾美球蟲，波氏艾美球蟲，萘氏艾美球蟲，塞前艾美球蟲，及其混合物，且包括每一種的多個品系在內(nèi)。最后將合并的濃集物填裝，并在無菌條件下包裝，一種疫苗就產(chǎn)生了。
雖然已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應(yīng)當理解，本方法可以生產(chǎn)用于多種類型動物以及用于人的其它疫苗。事實上，本方法可用于免疫人類抵抗典型的水傳播的原蟲如隱孢子蟲和蘭氏賈第蟲。而且，即使描述了整個的回收方法，但其中的各單元方法可以不離開本發(fā)明的范圍和精神獨立地使用或插進其它的回收、監(jiān)控、或處理系統(tǒng)中使用。
權(quán)利要求
1.一種凈化和回收包囊原蟲的方法，包括從含有包囊原蟲的懸液中分離包囊原蟲，采用的方法是鹽浮選法，其中的鹽包括氨、鈉、鉀、鈣、鎂或鋅的硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、氫鍵有機物，胍鹽，或其混合物，或采用氣浮選法。
2.權(quán)利要求1的方法，其中分離包囊原蟲通過硫酸鈉浮選法完成，包括制備一種含有包囊原蟲和硫酸鈉的摻合物；離心該漿液，從中回收上清；形成上清稀釋液，并將此稀釋液離心；及從經(jīng)離心的稀釋液中回收濃集物。
3.權(quán)利要求2的混合物，還包括用高強度勻漿法將摻合物勻漿化。
4.權(quán)利要求2的方法，其中硫酸鈉在摻合物中的量為約3～30wt.％。
5.權(quán)利要求2的方法，其中稀釋液的比重低于包囊原蟲的比重。
6.權(quán)利要求2的方法，其中濃集物含有約1×104～約1.5×106包囊原蟲/ml。
7.權(quán)利要求1的方法，其中分離包囊原蟲的方法采用氣浮選法，包括調(diào)節(jié)懸液的pH，使之足以影響懸液中氣泡和包囊原蟲間的粘著力，調(diào)理調(diào)好pH的懸液，其方法是加入足夠量的表面活性劑化合物以選擇性地涂裹懸液中的顆粒，并加入足夠量的異極化合物生成穩(wěn)定的泡沫；將調(diào)理好的懸液通過至少一個氣浮選室；以及從氣浮選室回收包囊原蟲。
8.權(quán)利要求7的方法，其中氣體是空氣。
9.權(quán)利要求8的方法，其中懸液pH為約2.5～約3.5。
10.權(quán)利要求7的方法，其中表面活性劑化合物包括長鏈烷基硫酸氫鈉鹽，季胺化物，脂肪醋酸銨和2-乙基己醇的摻合物，酯/酰胺化合物，烷氧聚乙烯氧基乙醇，或其混合物。
11.權(quán)利要求7的方法，其中異極化合物包括戊醇，丁醇，萜品油，甲酚，或其混合物。
12.權(quán)利要求7的方法，其中氣浮選室的氣體速度為約0.25～1.1容積的氣體/體積懸液/分。
13.權(quán)利要求7的方法，其中氣浮選室包括至少兩個連續(xù)的氣浮選單元。
14.權(quán)利要求13的方法，其中這至少兩個單元包含不同的氣流速度。
15.一種卵囊孢子形成的方法，包括卵囊與水及過氧化氫形成一種水性懸液，其中過氧化氫存在量足以消除不需要的微生物生長；以及對水性懸液充氣使卵囊孢子形成。
16.權(quán)利要求15的方法，其中水性懸液充氣時間大于約40小時，以使水性懸液在充氣過程中溶解氧的水平高于約80％的飽和度，其溫度為約22℃～約32℃，其攪拌水平足以充分懸起全部固體。
17.權(quán)利要求15的方法，其中水懸液含有卵囊濃度為約104～約106卵囊/ml，起始過氧化氫濃度為約1,000～約20,000mg/l。
18.一種使卵囊凈化，回收并形成孢子的方法，包括從含有卵囊的最初懸液分離卵囊；及使按權(quán)利要求14的方法分離的卵囊形成孢子。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的卵囊為百型艾美球蟲，和緩艾美球蟲，禽艾美球蟲，堆型艾美球蟲，波氏艾美球蟲，萘氏艾美球蟲，塞前艾美球蟲，或其組合。
20.權(quán)利要求18的方法，其中卵囊的分離采用硫酸鈉浮選方法，包括制備包含卵囊和硫酸鈉的摻合物；離心漿液并從中回收上清；形成上清稀釋液，并離心此稀釋液；及從經(jīng)離心的稀釋液中回收濃集物。
21.權(quán)利要求18的方法，其中卵囊的分離采用氣浮選法，包括調(diào)節(jié)最初懸液的pH達到足以影響懸液中氣泡與包囊原蟲間的粘著性；調(diào)理調(diào)好pH的懸液，其方法是加入足夠量的表面活性劑化合物以選擇性地涂裹懸液中的顆粒，并加入足夠量的異極化合物生成穩(wěn)定的泡沫；將調(diào)理好的懸液通過至少一個氣浮選室；以及從氣浮選室回收包囊原蟲。
22.權(quán)利要求21的方法，還包括向孢子形成的卵囊加入漂白劑，其量足以滅活殘余微生物并消除殘余有機物；及漂白孢子形成的卵囊。
23.權(quán)利要求22的方法，其中漂白與孢子形成同時進行，漂白劑是過氧化氫。
24.權(quán)利要求22的方法，其中漂白劑是次氯酸鈉，其存在量為約5,000～約10,000份/百萬游離有效氯，臭氧存在量高達空氣中約3％，或其聯(lián)合。
25.權(quán)利要求22的方法，還包括用錯流膜過濾法洗滌經(jīng)漂白的卵囊，以使殘余漂白劑濃度減少到可接受水平。
26.權(quán)利要求25的方法，其中漂白劑是次氯酸鈉，在洗滌后其存在的濃度足以抑制殘余微生物生長，經(jīng)漂白和洗滌的卵囊懸液的濃度為約1×106～約2.5×106卵囊/ml，最大固體的大小小于約200μ，硫酸銨的含量低于約0.9％。
27.權(quán)利要求26的方法，還包括將漂白和洗滌的卵囊濃縮為無菌濃集物；將一種或更多種的卵囊無菌濃集物聯(lián)合為聯(lián)合濃集物；以及在無菌條件下包裝聯(lián)合濃集物。
全文摘要
用于卵內(nèi)接種的抗禽球蟲病疫苗的生產(chǎn)方法,包括:從糞便懸液中獲得球蟲卵囊,將糞便懸液制成勻漿,用硫酸鈉的鹽浮選法或空氣的氣浮選法從糞碎片中分離卵囊,用過氧化氫和空氣噴射使卵囊孢子形成,漂白孢子形成的卵囊,洗滌經(jīng)漂白的卵囊,濃縮無菌的、經(jīng)洗滌的卵囊,及聯(lián)合多種球蟲卵囊的濃集物,從而生產(chǎn)疫苗。此方法的全部、或其部分,可應(yīng)用于其它種類的包囊原蟲以生產(chǎn)用于多種動物的疫苗。
文檔編號C12N3/00GK1348490SQ00806754
公開日2002年5月8日 申請日期2000年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月26日
發(fā)明者H·N·康克勒, S·J·布洛尼根, T·M·維爾納, J·E·舒爾茨, D·R·基拉諾夫斯基, T·L·圖克斯伯里, B·蒙茨克, C·M·庫克賽, F·H·韋伯, H·A·I·麥阿圖爾 申請人:美國輝瑞有限公司