專利名稱：編碼基因sdhA,sdhB和sdhC的新核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了來自棒狀細菌的編碼基因sdhC,sdhA和sdhB的核苷酸序列，和通過弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法。
L-氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。
已知L-氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物有抗性或重要的調(diào)節(jié)代謝物營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于棒桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良。
本發(fā)明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)而提供新措施。
L-氨基酸、尤其是賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)，因此提供生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。
本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)與編碼含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，c)與編碼含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，d)編碼含有與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)編碼含有與SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，f)編碼含有與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，g)與a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及h)含有a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其優(yōu)選是能在棒狀細菌中復制的DNA，并且特別是編碼含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還提供了是RNA的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了上述多核苷酸，其中其優(yōu)選包括一能復制的DNA，含有(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了含有一個所述的多核苷酸的載體，以及作為宿主細胞的含有該載體的棒狀細菌。
本發(fā)明還提供了基本上由一種多核苷酸序列組成的多核苷酸，其可通過用含有相應于SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫包括具有相應于SEQ ID NO:1的所述多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼琥珀酸脫氫酶或其亞基A、B或C的全長cDNA，以及分離與琥珀酸脫氫酶或其亞基A、B或C的基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(PCR)制備編碼琥珀酸脫氫酶的基因的DNA的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個、優(yōu)選至少20個、特別優(yōu)選至少15個連續(xù)核苷酸。具有至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應理解為包括經(jīng)肽鍵結合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7的多肽，特別是具有琥珀酸脫氫酶生物學活性的多肽，以及與SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO::3、SEQ ID NO::5和SEQID NO:7的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，在該棒狀細菌中編碼sdhC基因和/或sdhA和/或sdhB基因的核苷酸序列是弱化的，尤其是低水平表達的。
文中術語“弱化”是指微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶(蛋白質)的胞內(nèi)活性的降低或抑制，例如通過用弱啟動子或編碼具有低活性的相應酶的基因或等位基因或失活相應基因或酶(蛋白)，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸。此微生物可以是棒狀細菌尤其是棒桿菌屬的代表菌。在棒桿菌屬中尤其應提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌 ATCC13032醋谷棒桿菌 ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌 ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌株如谷氨酸棒桿菌 FERM-P1709黃色短桿菌 FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌 FERM-P1712谷氨酸棒桿菌 FERM-P6463
谷氨酸棒桿菌 FERM-P6464谷氨酸棒桿菌 DSM5714。
本發(fā)明人成功地從谷氨酸棒桿菌分離了編碼琥珀酸脫氫酶(EC1.3.99.1)的新基因sdhC,sdhA和sdhB。
為從谷氨酸棒桿菌中分離sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因，首先在大腸桿菌中構建這一微生物的基因文庫。構建基因文庫的方法在已知的教科書和手冊中有描述。可提及的例子為Winnacker的教科書，基因和克隆，遺傳工程方法入門(Verlag Chemie,Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實驗手冊(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細胞50,495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學，252:255-265,1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987,Proceedingof the National Academy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。O′Donohue(谷氨酸棒桿菌中四種常見芳香氨基酸生物合成基因的克隆和分子學分析，博士論文，國立愛爾蘭大學，Galway,1997)描述了用Short等(核酸研究，16:7583)描述的λZap表達系統(tǒng)克隆谷氨酸棒桿菌基因。
為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質粒如pBR322(Bolivar，生命科學25,807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19:259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller細菌遺傳學簡明教程，大腸桿菌和相關細菌的實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，1992)借助于粘?；蚱渌溯d體克隆的長DNA片段隨后可亞克隆并用適于DNA測序的通用載體中。
DNA測序方法如Sanger等(美國科學院院報74:5463-5467,1977)所述。
然后得到的DNA序列可用已知的算法或序列分析程序分析，例如Staden程序(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG程序(生化分析方法39,74-97(1998)),Pearson&Lipman的FASTA算法(美國科學院院報85,2444-2448(1988))或Altschul等的BLAST算法(自然遺傳學6,119-129(1994))，并與公眾可及數(shù)據(jù)庫中提供的序列比較。公眾可及核苷酸數(shù)據(jù)庫例如為歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(EMBL，德國海德堡)或國家生物技術信息數(shù)據(jù)庫(NCBI,Bethesda,MD,USA)。
本發(fā)明提供了以此方式獲得的編碼sdhC,sdhA和sdhB基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1。用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應蛋白質的氨基酸序列。所得sdhC,sdhA和sdhB基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7表示。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，蛋白質中的保守氨基酸置換，如用丙氨酸置換蛋白質中甘氨酸，或用谷氨酸置換蛋白質中天冬氨酸，本領域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質任何功能的改變，即是中性的。另外已知蛋白質N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領域技術人員可在以下文獻中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細菌學雜志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989)),Sahin-Toth等(蛋白質科學3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技術6:1321-1325(1988))，及已知關于遺傳和分子生物學的教材。以相應方式產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列以及編碼這些氨基酸序列的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。
通過雜交鑒別DNA序列的指導可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細菌學國際雜志(1991)41:255-260)。用聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA序列的指導參見Gait的手冊寡核苷酸合成實用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因弱化后，棒狀細菌以改良方式生產(chǎn)L-氨基酸尤其是L-賴氨酸。
弱化可通過降低或抑制sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因的表達或酶蛋白的催化性質而實現(xiàn)。兩種措施可任選地組合。
降低基因表達可通過合適控制培養(yǎng)或遺傳修飾(突變)基因表達的信號結構而實現(xiàn)。基因表達的信號結構是例如，阻遏基因、活化基因、操縱基因、啟動子、弱化子、核糖體結合位點、起始密碼和終止子。本領域熟練技術人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，例如專利申請WO96/15246,Boyd&Murphy(細菌學雜志170:5949(1988)),Voskuil&Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技術及生物工程58,191-195(1998)),Patek等(微生物學142:1297(1996))，及已知關于遺傳及分子生物學的教材，如Knippers的教科書(分子遺傳學，第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德國，1995)或Winnacker(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德國，1990)。
導致酶蛋白的催化特性的變化或降低的突變是現(xiàn)有技術已知的；可提及的例子為Qiu and Goodman的論文(生物化學雜志272:8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科學生物技術和生物化學61:1760-1762(1997))和Mockel(谷氨酸棒桿菌的蘇氨酸脫水酶酶的別構調(diào)節(jié)方法及結構，于利希研究中心報告，Jul-2906,ISSN09442952,于利希，德國，1994)。綜述可在遺傳學和分子生物學已知教科書中找到，例如，Hagemann的教科書(“Allgemeine Genetik”,Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1986)。
可以考慮的突變是轉換、顛換、插入和缺失。根據(jù)氨基酸交換對酶活性的影響，突變已知為錯義突變或無義突變?；蛑胁迦牖蛉笔е辽僖粋€堿基對導致移碼突變，結果是插入不正確的氨基酸或翻譯過早終止。缺失兩或多個密碼子典型地導致酶活性的完全喪失。產(chǎn)生這種突變的指導屬于現(xiàn)有技術并可在已知的遺傳學和分子生物學教科書中找到，例如Knippers的教科書(分子遺傳學，第6版，Georg ThiemeVerlag,Stuttgart，德國，1995),Winnacker的教科書(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德國，1990)或Hagemann的教科書(Allgemeine Genetik,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)。
突變谷氨酸棒桿菌的基因的一個常用方法是Schwarzer&Puhler所述的基因破壞和基因置換方法(生物/技術9,84-87(1991))。
在基因破壞方法中，將感興趣基因的編碼區(qū)的中心部分克隆進可在宿主(典型地是大腸桿菌)中復制而在谷氨酸棒桿菌中不能復制的質粒載體中。可考慮的載體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994)),pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，細菌學雜志174:5462-65(1992)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學雜志269:32678-84；US-A5,487,993),pCR(Blunt(Invitrogen,Groningen，荷蘭；Bernard等，分子生物學雜志，234:534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細菌學雜志173:4510-4516)。含有基因的編碼區(qū)的中心部分的質粒載體然后可經(jīng)接合或轉化轉移進希望的谷氨酸棒桿菌菌株。接合方法例如如Schafer等(應用及環(huán)境微生物學60,756-759(1994))所述。轉化方法例如如Thierbach等(應用微生物學及細菌學29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技術7,1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學通信123,343-347(1994))所述。經(jīng)“交換”而同源重組后，該基因編碼區(qū)被載體序列打斷，獲得兩個不完整的等位基因，每個缺失3′或5′末端。這一方法例如在由Fitzpatrick等所述的抑制谷氨酸棒桿菌的recA基因中所述(應用微生物學和生物工程42,575-580(1994))。sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因可以此方式抑制。
在基因置換方法中，在感興趣的基因中體外產(chǎn)生一突變，如缺失、插入或堿基置換。得到的等位基因隨后克隆進在谷氨酸棒桿菌中不能復制的載體中，該載體然后經(jīng)轉化或接合轉移進谷氨酸棒桿菌所需宿主中。經(jīng)第一次“交換”而同源重組實現(xiàn)整合后，及實現(xiàn)切割的合適的第二次“交換”后，在靶基因或靶序列中摻入突變或等位基因。這一方法例如已由Peters-Wendisch用于經(jīng)缺失抑制谷氨酸棒桿菌的pyc基因中(微生物學144,915-927(1998))。以此方式可在sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因中摻入缺失、插入或堿基置換。
本發(fā)明因此提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的方法，其中使用用一質粒載體轉化的菌株，該質粒載體攜帶編碼琥珀酸脫氫酶的基因的核苷酸序列，或者使用攜帶一sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因的缺失、插入或堿基置換的菌株。
發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的方法包括下述步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀細菌，該細菌中選自編碼琥珀酸脫氫酶及其亞基A、B和C的基因的至少一個基因是弱化的，
b)在培養(yǎng)基或細菌細胞中積累L-氨基酸，和c)分離L-氨基酸。
另外，除了弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因外，特定生物合成途徑、糖酵解、回補代謝、檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的擴增、特別是過表達，對L-氨基酸特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，為生產(chǎn)L-賴氨酸，例如可同時過表達選自如下一組的基因·編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174,6076-6086)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174,6076-6086)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生化雜志254,395-403(1998))，或·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)。
對于氨基酸特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)，還有利的是同時弱化·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)和/或·編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)。
除了弱化sdhC和/或sdhA和/或sdhB基因外，抑制非所需的二級反應對L-氨基酸特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama:“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(編輯)，學術出版社，倫敦，英國，1982)。
本發(fā)明還提供了含有權利要求1的多核苷酸的微生物，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或用分批方法，補料分批方法或重復補料分批法分批培養(yǎng)以生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸。已知的培養(yǎng)法由Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)，或由Storhas所著教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需求，關于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D.C.,USA,1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸，這些物質可單獨或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用生長必需物質如氨基酸和維生素，此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中上述物質可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至賴氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍達到。
L-氨基酸的測定方法是現(xiàn)有技術已知的，分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等(分析化學，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用進行，或通過反相HPLC，如Lindroth等(分析化學(1979)51:1167-1174)進行。
本發(fā)明借助于以下提供的實施例得以更詳述闡述。
實施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒基因文庫。
如Tauch等(1995，質粒33:168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AⅠ，編碼號27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla,USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等(1987)美國科學院院報84:2160-2164)的DNA用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaⅠ，編碼27-0948-02)酶切并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032DNA片段混合并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg,德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用GigapackⅡ XL包裝提取物(Stratagene,La Jolla,USA,產(chǎn)品描述GigapackⅡ XL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，將細胞置于10mM MgSO4并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學，1:190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實施例2 sdhC,sdhA和sdhB基因的分離和測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106,Qiagen,Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離單個菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AⅠ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021,Qiagen,Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989,分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物學通信，123:343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美國科學院院報87:4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學，1:190)上鋪板。重組克隆的質粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200,Qiagen,Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977,美國科學院院報74:5463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號403044,Weiterstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”。在帶有購自PE應用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(29:1)(產(chǎn)品號A124.1,Roth,Karlsruhe,德國)中進行凝膠電泳分離和序列分析。
得到的原始數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。進一步分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)對“國家生物技術信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。對該核苷酸序列的分析顯示-879堿基對的開放讀框，其被稱為sdhC基因，和-1875堿基對的開放讀框，其被稱為sdhA基因，和-852堿基對的開放讀框，其被稱為sdhB基因。sdhC基因編碼293個氨基酸的多肽，其在SEQID NO:3中示出。sdhA基因編碼625個氨基酸的多肽，其在SEQ IDNO:5中示出。sdhB基因編碼284個氨基酸的多肽，其在SEQ ID NO:7中示出。
實施例3用于sdhA基因的整合誘變的整合載體的制備用Eikmanns等(微生物學140:1817-1828(1994))的方法分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA。基于實施例2已知的谷氨酸棒桿菌sdhA基因的序列，選擇下述寡核苷酸用于聚合酶鏈反應sdhA-in15′-CGT CAT TGT CAC CGA ACG TA-3′sdhA-in25′-TCG TTG AAG TCA GTC CAG AG-3′所述引物由MWG生物技術公司(Ebersberg，德國)合成，并根據(jù)Innis等(PCR方案，方法和應用指南，1990，學術出版社)的標準PCR方法用來自寶靈格曼海姆公司的Pwo聚合酶(德國，產(chǎn)品描述Pwo DNA聚合酶，產(chǎn)品編號1 644 947)進行PCR反應。經(jīng)聚合酶鏈反應，該引物擴增一約0.67kb的sdhA基因的內(nèi)部片段。以此方式擴增的產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳證實。
用Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA；目錄號K2700-20)的Zero BluntTM試劑盒將擴增的DNA片段連接進載體pCRBluntⅡ載體(Bemard等，(1983)，分子生物學雜志234:534-541)中。
用連接混合物電穿孔大腸桿菌菌株TOP10(Hanahan等，DNA克隆實用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，華盛頓特區(qū)，美國)。通過將轉化混合物在補加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)上鋪板而選擇攜帶質粒的細胞。用來自Qiagen的QIAprep SpinMiniprep試劑盒從轉化子分離質粒DNA，并用限制酶EcoRⅠ限制隨后瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)證實。質粒命名為pCRBluntsdhAint，并示于


圖1。
實施例4 sdhA基因整合誘變?nèi)刖闐SM5715中用Tauch等的電穿孔法(FEMS微生物學通信，123:343-347(1994))，將實施例3中被稱為pCRBluntsdhAint的載體電穿孔進谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715的描述見EP-B-0435132。載體pCRBluntsdhAint在DSM5715中不能自行復制，且僅當其已整合入DSM5715的染色體中時存留在細胞中。將電穿孔物鋪板于已補加15mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，2ndEd，冷泉港實驗室出版，冷泉港，N.Y.1989)上，選擇具有整合進染色體中的pCRBluntsdhAint的克隆。
為檢測整合，用寶靈格曼海姆有限公司的“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)中的方法，用來自寶靈格的Dig雜交試劑盒標記sdhAint片段。用Eikmanns等(微生物學140:1817-1828(1994))的方法分離潛在的整合子的染色體DNA，并分別用SphⅠ和HindⅢ限制酶酶切。得到的片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，并用來自寶靈格的Dig雜交試劑盒在68℃雜交。實施例3的質粒pCRBluntsdhAint已插入DSM5715的染色體的染色體sdhA基因中。該菌株命名為DSM5715∷pCRBluntsdhAint。
實施例5用菌株DSM5715∷pCRBluntsdhAint生產(chǎn)L-谷氨酸實施例4中制備的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCRBluntsdhAint在適于生產(chǎn)谷氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中的谷氨酸含量。
為此，首先在33℃在具有合適抗生素的瓊脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。從這些瓊脂板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgⅢ。
培養(yǎng)基CgⅢNaCl 2.5g/lBacto-肽胨10g/l
Bacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)2％(w/v)pH值調(diào)節(jié)為pH7.4。
向此培養(yǎng)基中加入卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物16小時。從此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(測量波長660nm)是0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MM:
CSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l乙酸鈉(過濾滅菌) 20g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素HCl(過濾滅菌) 0.2mg/l亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水將CSL,MOPS和鹽溶液調(diào)至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
24小時后，用Biomek(Beckman儀器有限公司，慕尼黑)確定在660nm測量波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的谷氨酸量。
所得結果示于表1。
表1
本發(fā)明包括如下附圖
圖1質粒pCRBluntsdhAint圖。
圖中所采用的縮寫和符號有如下含義，所述堿基對數(shù)字是大約值。
Km卡那霉素抗性基因Zeocin:Zeocin抗性基因HindⅢ限制酶HindⅢ的酶切位點SphⅠ限制酶SphⅠ的酶切位點EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的酶切位點sdhAint:sdhA基因的內(nèi)部片段ColEl ori大腸桿菌的質粒編碼的復制起點序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司<120>編碼基因sdhA,sdhB和sdhC的新核苷酸序列<130>990170 BT<140><141><160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4080<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>基因<222>(288)..(1169)<223>sdhC<220><221>基因<222>(1330)..(3207)<223>sdhA<220><221>基因<222>(3102)..(3956)<223>sdhB<400>1gtgcccggcg tggtcgggcc acatccgccc cgggaacttt ttaggcacct acggtgcaac 60tgttgggata attgtgtcac ctgcgcaaag ttgctccctg gatcggaagg ttgggctgtc 120taaacttttt ggttgatacc aaacggggtt agaaactgtt cggatcggta tcctgtgagg 180aagctcacct tggttttaga atgttgaaaa ggcctcacgt ttccgcaggt agagcacact 240caattaaatg agcgtcaaac gacaataaag taaggctatc ctaataagtg gggttttatg 300tctctaaaca gccagttggg ggtcatgggg gagcgccccg tgactggtta atgccccgat 360ctgggacgta cagtaacaac gacactggag gtgccatgac tgttagaaat cccgaccgtg 420aggcaatccg tcacggaaaa attacgacgg aggcgctgcg tgagcgtccc gcatacccga 480cctgggcaat gaagctgacc atggccatca ctggcctaat gtttggtggc 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tgtccggtgg tgctgcagca gcagccctcg gcgaactcgg atacgacgtc 1440aaggcgttca cctaccacga cgcacctcgc cgtgcgcact ccattgctgc acagggtggc 1500gttaactccg cccgcggcaa gaaggtagac aacgacggcg cataccgcca cgtcaaggac 1560accgtcaagg gcggcgacta ccgtggtcgc gagtccgact gctggcgtct cgccgtcgag 1620tccgtccgcg tcatcgacca catgaacgcc atcggtgcac cattcgcccg cgaatacggt 1680ggcgccttgg caacccgttc cttcggtggt gtgcaggtct cccgtaccta ctacacccgt 1740ggacaaaccg gacagcagct gcagctctcc accgcatccg cactacagcg ccagatccac 1800ctcggctccg tagaaatctt cacccataac gaaatggttg acgtcattgt caccgaacgt 1860aacggtgaaa agcgctgcga aggcctgatc atgcgcaacc tgatcaccgg cgagctcacc 1920gcacacaccg gccatgccgt tatcctggca accggtggct acggcaacgt gtaccacatg 1980tccaccctgg ccaagaactc caacgcctcg gccatcatgc gtgcatacga agccggcgca 2040tacttcgcgt ccccatcgtt catccagttc cacccaaccg gcctgcctgt gaactccacc 2100tggcagtcca agaccattct gatgtccgag tcgctgcgta acgacggccg catctggtcc 2160cctaaggaac cgaacgataa ccgcgatcca aacaccatcc ctgaggatga gcgcgactac 2220ttcctggagc gccgctaccc 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aggcaaagac gactagtctt 3960taatccaagt aagtaccggt tcagacagtt aaaccagaaa gacgagtgaa caccatgtcc 4020tccgcgaaaa agaaacccgc accggagcgt atgcactaca tcaagggcta tgtacctgtg 4080<210>2<211>882<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(879)<223>sdhC<400>2gtg ggg ttt tat gtc tct aaa cag cca gtt ggg ggt cat ggg gga gcg 48Val Gly Phe Tyr Val Ser Lys Gln Pro Val Gly Gly His Gly Gly Ala1 5 10 15ccc cgt gac tgg tta atg ccc cga tct ggg acg tac agt aac aac gac 96Pro Arg Asp Trp Leu Met Pro Arg Ser Gly Thr Tyr Ser Asn Asn Asp20 25 30act gga ggt gcc atg act gtt aga aat ccc gac cgt gag gca atc cgt 144Thr Gly Gly Ala Met Thr Val Arg Asn Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg35 40 45cac gga aaa att acg acg gag gcg ctg cgt gag cgt ccc gca tac ccg 192His Gly Lys Ile Thr Thr Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Tyr Pro50 55 60acc tgg gca atg aag ctg acc atg gcc atc act ggc cta atg ttt ggt 240Thr Trp Ala Met Lys Leu Thr Met Ala Ile Thr Gly Leu Met Phe Gly65 70 75 80ggc ttc gtt ctt gtt cac atg atc gga aac ctg aaa atc ttc atg ccg 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權利要求
1.來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)與編碼含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，c)與編碼含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，d)編碼含有與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)編碼含有與SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，f)編碼含有與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，g)與a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及h)含有a),b),c),d),e)或f)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
2.權利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒狀細菌中復制的優(yōu)選地是重組的DNA。
3.權利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權利要求2的多核苷酸，含有(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
5.權利要求2的多核苷酸序列，其編碼含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
6.含義權利要求1的特別是1h)的多核苷酸序列的載體。
7.含義權利要求6的載體的棒狀細菌。
8.發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于進行下述步驟(a)發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀細菌，該細菌中選自編碼琥珀酸脫氫酶及其亞基A、B和C的基因的至少一個基因是弱化的，(b)在培養(yǎng)基或細菌細胞中積累L-氨基酸，及(c)分離L-氨基酸。
9.權利要求8的方法，特征在于所用細菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因是額外擴增的。
10.權利要求8的方法，其特征在于所用細菌中降低L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。
11.權利要求8的方法，其特征在于使用經(jīng)質粒載體轉化的菌株，且此質粒載體攜帶編碼琥珀酸脫氫酶的基因的核苷酸序列。
12.權利要求8-11任一項的方法，其特征在于使用產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀細菌。
13.權利要求9的方法，其特征在于編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同時過表達。
14.權利要求9的方法，其特征在于編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因同時過表達。
15.權利要求9的方法，其特征在于編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因同時過表達。
16.權利要求9的方法，其特征在于編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因同時過表達。
17.權利要求9的方法，其特征在于編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因同時過表達。
18.權利要求10的方法，其特征在于編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因同時弱化。
19.權利要求10的方法，其特征在于編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因同時弱化。
全文摘要
分離的多核苷酸,含有選自如下的多核苷酸序列:a)與編碼含SEQID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸,和d)含a)或b)序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。還提供了經(jīng)弱化編碼琥珀酸脫氫酶亞基A、B或C的sdhA,sdhB和sdhC基因發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法。
文檔編號C12N9/02GK1312374SQ0013608
公開日2001年9月12日 申請日期2000年12月8日 優(yōu)先權日1999年12月10日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費弗勒, 阿希姆·馬克思 申請人:德古薩－于爾斯股份公司