專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼pfk基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼pfk基因的核苷酸序列，和通過(guò)具有增強(qiáng)的pfk基因的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的方法。
氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。
已知氨基酸可通過(guò)棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過(guò)離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物如賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)代謝物營(yíng)養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如L-賴(lài)氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒桿菌生產(chǎn)氨基酸的菌株的改良，其是通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)生物合成基因并研究對(duì)氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行。這一主題的綜述文章可在Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，BenjaminCummings，英國(guó)倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術(shù)學(xué)關(guān)鍵綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)學(xué)會(huì)年報(bào)782，25-39(1996))。
本發(fā)明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-賴(lài)氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)而提供新措施。
氨基酸、尤其是L-賴(lài)氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，因此提供生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。
當(dāng)下文提到L-賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸時(shí)，不僅是指堿，也指鹽，如賴(lài)氨酸單鹽酸鹽或賴(lài)氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了一種來(lái)自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選包括能復(fù)制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了權(quán)利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，權(quán)利要求6的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，包括權(quán)利要求1的多核苷酸序列的載體，特別是穿梭載體或質(zhì)粒載體，
以及作為宿主細(xì)胞的含有載體的棒狀細(xì)菌。
本發(fā)明還提供了基本上包括多核苷酸序列的多核苷酸，其可通過(guò)用包括相應(yīng)于SEQ ID NO1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫(kù)，并分離所述的DNA序列來(lái)篩選獲得，所述的文庫(kù)包括具有相應(yīng)于SEQ ID NO1的所述多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼果糖磷酸激酶的全長(zhǎng)cDNA，以及分離與果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少30個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。具有至少40或50個(gè)核苷酸的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來(lái)。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有果糖磷酸激酶生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO2的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的方法，在該棒狀細(xì)菌中編碼pfk基因的核苷酸序列是增強(qiáng)的，尤其是過(guò)表達(dá)的。
文中術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的增加，例如通過(guò)增加一或多個(gè)基因的拷貝數(shù)，通過(guò)用強(qiáng)啟動(dòng)子或編碼具有升高的活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸。此微生物可以是棒狀細(xì)菌尤其是棒桿菌屬的代表菌。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC17965黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的突變體或菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715。
本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼果糖磷酸激酶的新pfk基因。
為了分離谷氨酸棒桿菌的pfk基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫(kù)。可根據(jù)通常已知的教材和手冊(cè)建立基因文庫(kù)。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(mén)(Verlag Chamie,Weinheim,德國(guó),1990)，或由Sambrook等所著手冊(cè)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文庫(kù)是已由Kohara等(細(xì)胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫(kù)。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫(kù)。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫(kù)。為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫(kù)，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)7(1990)4645-4649)所述。借助于粘?？寺〉拈L(zhǎng)DNA片段隨后可亞克隆并用適于測(cè)序的通用載體測(cè)序，如Sanger等(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)745463-5467，1977)所述。
以此方式可獲得編碼pfk基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，是本發(fā)明的一部分，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得pfk基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ ID NO2表示。
通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性從SEQ ID NO1產(chǎn)生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，蛋白質(zhì)中的保守氨基酸置換，如用丙氨酸置換蛋白質(zhì)中甘氨酸，或用谷氨酸置換蛋白質(zhì)中天冬氨酸，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)任何功能的改變，即是中性的。另外已知蛋白質(zhì)N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)此的論述，參見(jiàn)Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技術(shù)61321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
通過(guò)雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見(jiàn)寶靈格曼海姆有限公司的手冊(cè)“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶(hù)指南”(曼海姆，德國(guó)，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國(guó)際雜志(1991)41255-260)。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)參見(jiàn)Gait的手冊(cè)寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國(guó)牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國(guó)，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在pfk過(guò)表達(dá)后，棒狀細(xì)菌以改良方式生產(chǎn)氨基酸尤其是L-賴(lài)氨酸。
為獲得過(guò)表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式工作。通過(guò)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在L-賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。通過(guò)目的在于延長(zhǎng)mRNA壽命的措施，也可改良表達(dá)。通過(guò)防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增?；蛘撸ㄟ^(guò)改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對(duì)此的詳述，參見(jiàn)Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)EPS0472869，美國(guó)專(zhuān)利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開(kāi)JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)綜述60512-538(1996))及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，本發(fā)明的pfk基因可借助于質(zhì)粒過(guò)表達(dá)。
合適的質(zhì)粒是在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。各種已知的質(zhì)粒載體，如pZl(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))是基于隱蔽質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它質(zhì)粒載體如基于pCG4(US-A4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)可以同樣方式使用。
其他合適的質(zhì)粒載體是那些可通過(guò)整合進(jìn)染色體而進(jìn)行基因擴(kuò)增的質(zhì)粒載體，例如，由Reinscheid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60126-132(1994))所述的用于復(fù)制或擴(kuò)增hom-thrB操縱子的質(zhì)粒載體。在這一方法中，將完整基因克隆進(jìn)能在宿主(典型地是大腸桿菌)中復(fù)制而在谷氨酸棒桿菌中不能復(fù)制的質(zhì)粒載體中。可考慮的載體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學(xué)雜志26932678-84；US-A5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷蘭；Bernard等，分子生物學(xué)雜志，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志1734510-4516)。含有待擴(kuò)增基因的質(zhì)粒載體然后可經(jīng)接合或轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移進(jìn)希望的谷氨酸棒桿菌菌株。接合方法例如如Schafer等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，756-759(1994))所述。轉(zhuǎn)化方法例如如Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)及細(xì)菌學(xué)29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學(xué)通信123，343-347(1994))所述。經(jīng)“交換”而同源重組后，得到的菌株含有至少兩個(gè)拷貝的所需基因。
另外，不僅是pfk基因，而且特定生物合成途徑、糖酵解、回補(bǔ)代謝、檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，對(duì)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，為生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸，例如可同時(shí)過(guò)表達(dá)一或多種選自如下一組的基因·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，或·編碼三糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，或
·編碼3-磷酸甘油激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)，或·編碼賴(lài)氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。
對(duì)于氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)，除了擴(kuò)增pfk基因外，還有利的是同時(shí)弱化·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 19950409.1，DSM13047)和/或·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)。
除pfk基因的過(guò)表達(dá)之外，抑制非所需的二級(jí)反應(yīng)對(duì)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過(guò)量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國(guó)，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或用分批方法，補(bǔ)料分批方法或重復(fù)補(bǔ)料分批法分批培養(yǎng)以生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechnik l.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器和外圍設(shè)備(Vieweg Verlag,Braunswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求，關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見(jiàn)于，美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)”(華盛頓D.C.,USA,1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至賴(lài)氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍達(dá)到。
L-賴(lài)氨酸的分析可通過(guò)陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等(分析化學(xué)，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用進(jìn)行。
本發(fā)明方法用于發(fā)酵制備氨基酸尤其是L-賴(lài)氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳述闡述。
實(shí)施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸?kù)如Tauch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA并用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國(guó)曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等(1987)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)842160-2164)的DNA用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述XbaI，編碼27-0948-02)酶切并類(lèi)似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA連接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack Ⅱ XL包裝提取物(Stratagene,La Jolla,USA，產(chǎn)品描述Gigapack Ⅱ XL包裝提取物，編碼200217)包裝進(jìn)噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細(xì)胞置于10mM MgSO4并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫(kù)的感染和滴定，細(xì)胞在含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過(guò)夜后，選擇重組克隆。
實(shí)施例2 pfk基因的分離和測(cè)序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號(hào)27106，Qiagen,Hilden，德國(guó))根據(jù)廠商指導(dǎo)分離各個(gè)菌落的粘粒DNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國(guó)曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號(hào)20021，Qiagen,Hilden，德國(guó))分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號(hào)K2500-01)的測(cè)序載體pZero-1的DNA用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號(hào)27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測(cè)序載體pZero-1中的連接，DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德國(guó))保溫過(guò)夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)874645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號(hào)900200，Qiagen，Hilden，德國(guó))進(jìn)行。測(cè)序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號(hào)403044，Weiterstadt，德國(guó))的“RR羅丹明終止循環(huán)測(cè)序試劑盒”。在帶有購(gòu)自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國(guó))的“ABI Prism 377”測(cè)序儀的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(29∶1)(產(chǎn)品號(hào)A124.1，Roth,Karlsruhe，德國(guó))中進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
原始數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對(duì)“國(guó)家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。對(duì)該核苷酸序列的分析顯示一990堿基對(duì)的開(kāi)放讀框，其被稱(chēng)為pfk基因。pfk基因編碼330個(gè)氨基酸的多肽。
實(shí)施例3用于在谷氨酸棒桿菌中增強(qiáng)pfk基因的表達(dá)載體pZ-pfkex的制備3.1pfk基因的克隆如Eikmanns等(微生物學(xué)1401817-1828(1994))所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA?；趯?shí)施例2已知的谷氨酸棒桿菌pfk基因的序列，選擇下述寡核苷酸用于聚合酶鏈反應(yīng)pfk-ex5′-GAT CTA GAA TTC AAC TTT CAG GTG GTA ACC CA-3′pfk-glp25′-GAT CTA GTC GAC CGG ACA AGC GAG GAA TTA T-3′經(jīng)過(guò)ARK生物系統(tǒng)科學(xué)有限公司(Darmstadt,德國(guó))合成所述的引物。引物pfk-ex含限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI裂解位點(diǎn)的序列，引物pfk-glp2含限制性?xún)?nèi)切酶SalI的裂解位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在上面所示的核苷酸序列中下面劃線(xiàn)。經(jīng)Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方法，方法和應(yīng)用指南，1990，學(xué)術(shù)出版社)用Roche診斷學(xué)有限公司(Mannheim，德國(guó))Pwo-聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，該引物允許擴(kuò)增大約1.05kb大小的DNA片段，它攜帶谷氨酸棒狀桿菌的pfk基因。以0.8％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定以這種方式擴(kuò)增的產(chǎn)物。
用限制性酶EcoRI和SalI完全裂解以這種方式獲得的PCR片段。用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號(hào)200021，Qiagen，Hilden，德國(guó))從瓊脂糖凝膠分離大約1.05kb大小的pfk片段。
3.2 在載體pZ8-1中克隆pfk大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭表達(dá)載體pZ8-1(EP0375889)用作基礎(chǔ)載體用于在谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌中表達(dá)。用限制性酶EcoRI和SalI完全裂解該質(zhì)粒的DNA，然后用蝦堿性磷酸酶(RocheDiagnostics GmbH,Manmheim，德國(guó)，產(chǎn)品描述SAP，產(chǎn)品號(hào)，1758250)去磷酸化。將在實(shí)施例3.1中從瓊脂糖凝膠分離的pfk片段與以這種方式制備的載體pZ8-1混合并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國(guó)，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編號(hào)27-0870-04)處理該混合物。
連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αmcr(Hanahan，見(jiàn)DNA克隆實(shí)踐方法，Vol.I,IRL-Press,Oxford,Washington DC,USA)。經(jīng)過(guò)在含50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1190)上涂布轉(zhuǎn)化混合物選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，選擇重組的單個(gè)克隆。用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(產(chǎn)品號(hào)27106，Qiagen,Hiden，德國(guó))按廠家說(shuō)明從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制性裂解分析。所得的質(zhì)粒稱(chēng)為pZ-pfkex。它在


圖1中顯示。
實(shí)施例4 用質(zhì)粒pZ-pfkex轉(zhuǎn)化菌株DSM5715通過(guò)Liebl等所述的電穿孔法(FEMS微生物學(xué)通信，53299-303(1989))用質(zhì)粒pZ-pfkex轉(zhuǎn)化菌株DSM5715。在補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂(18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，18g/l Bacto-瓊脂))上篩選轉(zhuǎn)化子。在33℃保溫2天。
用常規(guī)方法(Peters-Wendich等，1998，微生物學(xué)，144，915-927)從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和SalI切割并經(jīng)隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢查質(zhì)粒。獲得的菌株稱(chēng)為DSM5715/pZ-pfkex。
實(shí)施例5 生產(chǎn)賴(lài)氨酸實(shí)施例4中制備的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pZ-pfkex在適于生產(chǎn)賴(lài)氨酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中的賴(lài)氨酸含量。
為此，首先在33℃在具有合適抗生素的瓊脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。從這些瓊脂板培養(yǎng)物開(kāi)始，接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgⅢ。
培養(yǎng)基CgⅢNaCl 2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)至7.4。
加入卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。從此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(測(cè)量波長(zhǎng)660nm)是0.05。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 50g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過(guò)濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過(guò)濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過(guò)濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至pH7并高壓滅菌。然后加入無(wú)菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckman儀器有限公司，慕尼黑)確定在660nm測(cè)量波長(zhǎng)的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定形成的賴(lài)氨酸量。
所得結(jié)果示于表1。
表1
本發(fā)明包括如下附圖
圖1質(zhì)粒pZ-pfkex圖。
圖中所采用的縮寫(xiě)和符號(hào)有如下含義Kan卡那霉素抗性基因Ptactac啟動(dòng)子pfk谷氨酸棒桿菌ATCC13032的pfk基因rrnB-T1T2大腸桿菌rrnB基因的終止子T1T2rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒編碼的復(fù)制起點(diǎn)(pHM1519的復(fù)制起點(diǎn))perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點(diǎn)SalI限制酶SalI的酶切位點(diǎn)序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司<120>編碼pfk基因的新核苷酸序列<130>990179 BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1120<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(68)..(1057)<400>1ttgttaccga tgaccacacg ctagattttc cagttttgcc cgaccacaac tttcaggtgg 60taacccc atg arc arc aca ttc acc cca aac ccg agt att gat tcc acg 109Met Ile Ile Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser Ile Asp Ser Thr1 5 10ctg tcg ctc ggc gaa gag ctc tCc cgt gga tcc gtc caa cga ctt gat 157Leu Ser Leu Gly Glu Glu Leu Ser Arg Gly Ser Val Gln Arg Leu Asp15 20 25 30tcc gtc acc gct gtc gca ggt ggt aaa ggc atc aat gtc gcc cac gct 205Ser Val Thr Ala Val Ala Gly Gly Lys Gly Ile Asn Val Ala His Ala35 40 45gtc ttg ctt gcg ggc ttt gaa acc ttg gct gtg ttc cca gcc ggc aag 253Val Leu Leu Ala Gly Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys50 55 60ctc gac ccc ttc gtc cca ctg gtc cgc gac atc ggc ttg ccc gtg gaa 301Leu Asp Pro Phe Val Pro Leu Val Arg Asp Ile Gly Leu Pro Val Glu65 70 75act gtt gtg atc aac aag aac gtc cgc acc aac acc aca gtc acc gaa 349Thr Val Val Ile Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Glu80 85 90ccg gac ggc acc acc acc aag ctc aac ggc ccc ggc gcg ccg ctc agc 397Pro Asp Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Gly Pro Gly Ala Pro Leu Ser95 100 105 110gag cag aag ctc cgt agc ttg gaa aag gtg ctt atc gac gcg ctc cgc 445Glu Gln Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu Ile Asp Ala Leu Arg115 120 125ccc gaa gtc acc tgg gtt gtc ctg gcg ggc tcg ctg cca cca ggg gca 493Pro Glu Val Thr Trp Val Val Leu Ala Gly Ser Leu Pro Pro Gly Ala130 135 140cca gtt gac tgg tac gcg cgt ctc acc gcg ttg atc cat tca gca cgc 541Pro Val Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu Ile His Ser Ala Arg145 150 155cct gac gtt cgc gtg gct gtc gat acc tca gac aag cca ctg atg gcg 589Pro Asp Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala160 165 170ttg ggc gag agc ttg gat aca cct ggc gct gct ccg aac ctg att aag 637Leu Gly Glu Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu Ile Lys175 180 185 190cca aat ggt ctg gaa ctg ggc cag ctg gct aac act gat ggt gaa gag 685Pro Asn Gly Leu Glu Leu Gly Gln Leu Ala Asn Thr Asp Gly Glu Glu195 200 205ctg gag gcg cgt gct gcg caa ggc gat tac gac gcc atc atc gca gct 733Leu Glu Ala Arg Ala Ala Gln Gly Asp Tyr Asp Ala Ile Ile Ala Ala210 215 220gcg gac gta ctg gtt aac cgt ggc atc gaa cag gtg ctt gtc acc ttg 781Ala Asp Val Leu Val Asn Arg Gly Ile Glu Gln Val Leu Val Thr Leu225 230 235ggt gcc gca gga gcg gtg ttg gtc aac gca gaa ggt gcg tgg act gct 829Gly Ala Ala Gly Ala Val Leu Val ASn Ala Glu Gly Ala Trp Thr Ala240 245 250act tct cca aag att gat gtt gta tcc acc gtt gga gct gga gac tgt 877Thr Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys255 260 265 270gct ctt gca ggt ttt gtt atg gca cgt tcc cag aag aaa aca ctg gag 925Ala Leu Ala Gly Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu275 280 285gaa tct ctg ctg aat gcc gtg tct tac ggc tcg act gcg gcg tct ctt 973Glu Ser Leu Leu Asn Ala Val Ser Tyr Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu290 295 300cct ggc act acc att cct cgt cct gac caa ctc gcc aca gct ggt gca 1021Pro Gly Thr Thr Ile Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Gly Ala305 310 315acg gtc acc caa gtc aaa gga ttg aaa gaa tca gca tgaatagcgt1067Thr Val Thr Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala320 325 330aaataattcc tcgcttgtcc ggctggatgt cgatttcggc gactccacca cgg1120<210>2<211>330<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Met Ile Ile Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser Ile Asp Ser Thr Leu Ser1 5 10 15Leu Gly Glu Glu Leu Ser Arg Gly Ser Val Gln Arg Leu Asp Ser Val20 25 30Thr Ala Val Ala Gly Gly Lys Gly Ile Asn Val Ala His Ala Val Leu35 40 45Leu Ala Gly Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys Leu Asp50 55 60Pro PTe Val Pro Leu Val Arg Asp Ile Gly Leu Pro Val Glu Thr Val65 70 75 80Val Ile Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Glu Pro Asp85 90 95Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Gly Pro Gly Ala Pro Leu Ser Glu Gln100 105 110Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu Ile Asp Ala Leu Arg Pro Glu115 120 125Val Thr Trp Val Val Leu Ala Gly Ser Leu Pro Pro Gly Ala Pro Val130 135 140Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu Ile His Ser Ala Arg Pro Asp145 150 155 160Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala Leu Gly165 170 175Glu Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu Ile Lys Pro Asn180 185 190Gly Leu Glu Leu Gly Gln Leu Ala Asn Thr Asp Gly Glu Glu Leu Glu195 200 205Ala Arg Ala Ala Gln Gly Asp Tyr Asp Ala Ile Ile Ala Ala Ala Asp210 215 220Val Leu Val Asn Arg Gly Ile Glu Gln Val Leu Val Thr Leu Gly Ala225 230 235 240Ala Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Glu Gly Ala Trp Thr Ala Thr Ser245 250 255Pro Lys Ile Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys Ala Leu260 265 270Ala Gly Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu Glu Ser275 280 285Leu Leu Asn Ala Val Ser Tyr Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu Pro Gly290 295 300Thr Thr Ile Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Gly Ala Thr Val305 310 315 320Thr Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala325 330
權(quán)利要求
1.來(lái)自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選地是重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.權(quán)利要求2的可復(fù)制的DNA，包括(ⅰ)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于的(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸序列，其編碼包括示于SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴(lài)氨酸的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌，該細(xì)菌中至少pfk基因或其編碼核苷酸序列是增強(qiáng)的，特別是過(guò)表達(dá)的，(b)在培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中積累L-氨基酸，及(c)分離L-氨基酸。
8.權(quán)利要求7的方法，特征在于所用細(xì)菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因是額外增強(qiáng)的。
9.權(quán)利要求7的方法，其特征在于所用細(xì)菌中降低L-賴(lài)氨酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。
10.權(quán)利要求7的方法，其特征在于使用經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼pfk基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌。
12.權(quán)利要求6的方法，其特征在于發(fā)酵這樣的細(xì)菌生產(chǎn)賴(lài)氨酸，所述細(xì)菌中選自如下一組的一或多個(gè)基因同時(shí)增強(qiáng)，特別是過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增12.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.3編碼三糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因，12.4編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，12.5編碼3-磷酸甘油激酶的pgk基因，12.6編碼賴(lài)氨酸輸出蛋白的lysE基因。
13.權(quán)利要求9的方法，其特征在于發(fā)酵這樣的細(xì)菌生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸，所述細(xì)菌中選自如下一組的一或多個(gè)基因同時(shí)弱化13.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，13.2編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因。
14.前述一或多條權(quán)利要求的方法，其特征在于使用谷氨酸棒桿菌的微生物。
15.權(quán)利要求1的多核苷酸序列作為經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生編碼果糖磷酸激酶的基因的DNA的引物的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求1的多核苷酸序列作為雜交探針的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其包括選自如下一組的多核苷酸序列:a)與編碼包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼包括與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明還提供了經(jīng)增強(qiáng)pfk基因發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法,以及本發(fā)明多核苷酸作為引物或雜交探針的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1297055SQ0013250
公開(kāi)日2001年5月30日 申請(qǐng)日期2000年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月23日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司