專利名稱：一種rna逆轉(zhuǎn)錄擴增標記探針的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因技術領域，涉及基因芯片技術，尤其涉及一種基因芯片RNA逆轉(zhuǎn)錄擴增標記探針的制備方法。
基因芯片是九十年代發(fā)展起來的一項前沿生物技術。隨著生物技術的迅猛發(fā)展，20世紀人類最宏偉的計劃之一—人類基因組計劃預計將提前至2003年完成，屆時人類將完成25種染色體(22種常染色體，2種性染色體和1種線粒體染色體)共計30億對堿基的序列測定，以及小鼠、果蠅、線蟲等模式生物的全基因組序列的測定。人類基因組計劃將由此進入后基因組時代，研究的重點將由發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)向發(fā)現(xiàn)基因的功能。人們將逐步闡明從基因到蛋白再到生命現(xiàn)象這一過程的奧秘。如何大規(guī)模研究人類約10萬條基因的功能，特別是基因相互作用和調(diào)控關系，迫切需要一種新的方法能以大規(guī)模、高通量的方式進行成千上萬個基因在各種生理狀態(tài)下表達狀況的研究。傳統(tǒng)的Northern blot雜交或點雜交方法，以及以電泳為基礎的基因表達、序列測定、突變和多態(tài)性分析等研究方法顯然不能適應上述的要求?；蛐酒夹g由此應運而生。
將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點與點之間的距離一般小于500μm)排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片，也叫基因微矩陣(Microarray)?；蛐酒梢杂脽晒鈾z測和計算機軟件進行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到southern blot雜交技術，即DNA-DNA之間通過堿基配對機制形成互補鏈。隨后又發(fā)展出northern blot雜交和點雜交技術。這三種技術都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴散，因此在單位面積上點樣的密度受到限制，無法進行大規(guī)模、高通量的DNA雜交。同時，由于濾膜面積較大而需較多探針量，檢測靈敏度較低。為了提高點樣密度和檢測靈敏度，降低探針用量，以玻璃、硅等材料為載體的基因芯片技術逐步得到了發(fā)展。
美國affymetrix公司于二十世紀八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，該公司運用半導體照相平板技術，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同時，探針的熒光標記，激光共聚焦掃描(U.S Patent5981965)和計算機分析(U.S Patent 5974164)等技術也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國Stanford大學誕生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，這標志著基因芯片技術步入了廣泛研究和應用的時期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優(yōu)點，適用于DNA序列測定、SNP分析等。但其缺點是合成寡聚核苷酸長度有限，因而基因特異性差，而且隨長度的增加合成錯誤率隨之增高，作為基因表達譜研究遠不如cDNA芯片。cDNA芯片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，也叫微矩陣(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)?；螯c樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點樣密度要高得多，可達到每張載玻片4萬個基因。而cDNA芯片最大的優(yōu)點是靶基因檢測特異性非常好，用作表達譜研究結(jié)果可靠。目前許多國家實驗室和大制藥公司都用此類芯片(Baldwin,D等(1999)Curr OpinPlant Biol 2(2):96-103.)。
有鑒于基因芯片具有高通量、高信息量、快速、樣品用量少、造價低、用途廣泛等優(yōu)點，目前世界上許多國家和地區(qū)都已著手進行基因芯片的研制和開發(fā)工作。美國政府于1998年正式啟動基因芯片計劃，NIH、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、中央情報局等均參與了此項目。同時斯坦福大學、麻省理工學院及部分國立實驗室如Argonne,Oakridge也參與了該項目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學、歐亞公司也正在從事該領域的研究。世界大型制藥公司尤其對基因芯片技術用于基因多態(tài)性、疾病相關性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設備和技術。
目前的基因微矩陣芯片技術包含以下幾個關鍵步驟PCR制備靶基因，點樣及固定，探針制備，雜交，檢測與分析。
在基因芯片技術中，探針標記是指通過PCR或逆轉(zhuǎn)錄的方法等，摻入經(jīng)過熒光基團修飾的堿基(如dCTP、dUTP)，形成帶有熒光標記的DNA探針。這是基因芯片檢測系統(tǒng)的重要步驟。雜交的結(jié)果通過熒光信號來表示，所以探針標記的好壞直接影響到雜交信號的強弱。
目前，一步逆轉(zhuǎn)錄法標記探針是表達譜芯片(cDNA芯片)制備中最常用的的標記方法(DR.Joseph,,et al；(1996).Nature genetics,14,457-460)，但這個方法有一個很大的缺陷，即樣本mRNA的需求量大，每次芯片雜交實驗需2-5μgmRNA，需要0.2g-1g的組織材料，對于來源困難的材料其應用受到限制。
國外Eberwine等人發(fā)明了一種RNA的逆轉(zhuǎn)錄擴增及標記方法(GelderRNV,PNAS.USA,87:1663-1667,1990)，這種方法的基本原理及思路是以mRNA為模板，以5’端含有T7啟動子的Oligo dT為引物，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，然后用RNase H降解mRNA，用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA片段(這時以還未降解的mRNA為引物)，再用大腸桿菌連接酶將第二鏈cDNA片段連接成完整的鏈，再以此cDNA為模板，用T7 RNA多聚酶擴增大量反義RNA，從而達到擴增效果。再利用反義RNA為模板，用6堿基隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄標記cDNA.
通過這種方法，可以使RNA擴增幾十到一百倍，減少對組織的需求。但此方法有以下的缺點1．操作步驟過于繁瑣，步驟太多；2．成功率不高；3．成本太高；4．由于步驟多，會導致不同的mRNA擴增效率不一樣，從而導致結(jié)果不夠準確。
由于以上的原因，限制了此方法的廣泛推廣，目前基因芯片的探針標記還是用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄方法進行。
本發(fā)明的目的在于公開一種在基因芯片的制備中能用少量的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄擴增出大量cDNA標記探針的方法。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的本發(fā)明是將RNA循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄技術應用于基因芯片擴增標記探針的制備。RNA循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄反應方法(中國專利，申請?zhí)?8121932.2)是指由一份RNA模板循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄得到多倍份的cDNA的技術。本發(fā)明將該技術應用于基因芯片領域，根據(jù)基因芯片探針標記的技術要求，提出一種在基因芯片技術中能用少量的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄擴增出大量cDNA標記探針的技術方案。本發(fā)明亦是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提出的CRT(循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄)反應體系(50μl)如下在反應體系中加入1x反應液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH4)2SO45.0-25mmol/l；MnCl21.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT180.5-2.0umol/l；耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng.上述反應體系利用高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如FD酶、Tth酶等，進行循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄(CRT)，即變性-復性-延伸的循環(huán)過程。上述反應混勻后，置于PCR儀中，按以下程序進行CRT1．變性溫度條件85-94℃，保溫時間5-120秒；2．復性溫度條件45-60℃，保溫時間5-100秒；3．延伸溫度條件55-70℃，保溫時間5-300秒。
循環(huán)次數(shù)10-40個然后進行純化去掉未摻入的單核苷酸。
以下將通過實施例對本發(fā)明的有關細節(jié)作進一步的闡述，但實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍，有關的技術人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開的技術方案，舉一反三地應用于基因芯片RNA逆轉(zhuǎn)錄擴增標記探針的制備，這也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例表達譜芯片探針制備(1)采用一步法制備組織mRNA(具體方法略)(2)在50μL反應體系中含有Tris-HCl pH8.0,25mmol/l；(NH4)2SO410mmol/l；MnCl22.0 mmol/l；DTT 2.0mmol/l；dA,G,C，各0.5-mmol/L；dTTP 150mmol/L；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 150mmol/L；polydT184umol/L；FD酶(或Tth酶)5U；mRNA模板80ng?；靹蚝螅赑CR儀上設置反應程序87℃,10秒；55℃,10秒；65℃,60秒；循環(huán)次數(shù)30個。然后乙醇沉淀進行純化去掉未摻入的單核苷酸。同時采用一步逆轉(zhuǎn)錄法和RNA擴增法作對照，一步法需用用3μg mRNA才能達到相同的效果，RNA的擴增法也只用了80ng mRNA，但成功率低，不到50％。
通過說明書所公開的技術方案和實施例表明，本發(fā)明可以利用少量的mRNA制備芯片雜交探針，只需常規(guī)方法的三十分之一左右的mRNA用量就能完成一次雜交，使基因芯片技術幾乎不受標本取材少的限制。其與目前常用的RNA擴增標記技術相比，具有以下優(yōu)點1．操作大大簡單，只需一種酶反應，而RNA擴增標記技術需要6種酶4步反應及至少3次純化過程，成功率低；2．成本大大降低，由于只使用一種酶，只需一次純化，因此成本只有RNA擴增標記方法的十分之一左右；3．節(jié)約時間，只需2-3小時就完成標記過程，而RNA擴增標記法至少需要兩個工作日；4．RNA擴增標記方法由于步驟多，會導致不同的mRNA擴增效率不一樣，另外，擴增的是反義RNA，再用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄標記，使不同的mRNA標記效率不一樣，而導致芯片雜交結(jié)果不夠準確。而本發(fā)明只用了一種酶反應，只用了一種引物(oligo dT),cDNA探針量基本上代表了其mRNA的量，使得芯片的結(jié)果更準確。
權(quán)利要求
1.一種RNA逆轉(zhuǎn)錄擴增標記探針的制備方法，其特征在于，應用循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄方法，(1)CRT(循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄)反應體系(50μl)為在反應體系中加入1x反應液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH4)2SO45.0-25mmol/l；MnCl21.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT180.5-2.0umol/l；耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng。(2)循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄(CRT)，即變性-復性-延伸的循環(huán)過程，其于PCR儀中的程序和條件為變性溫度條件85-94℃，保溫時間5-120秒；復性溫度條件45-60℃，保溫時間5-100秒；延伸溫度條件55-70℃，保溫時間5-300秒。循環(huán)次數(shù)10-40個然后進行純化去掉未摻入的單核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的RNA逆轉(zhuǎn)錄擴增標記探針的制備方法，其特征在于，最適條件為，在50μL反應體系中含有Tris-HCl pH8.0,25mmol/l；(NH4)2SO410mmol/l；MnCl22.0mmol/l；DTT 2.0mmol/l；dA,G,C，各0.5-mmol/L；dTTP150mmol/L；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 150mmol/L；polydT184umol/L；FD酶(或Tth酶)5U；mRNA模板80ng?；靹蚝?，在PCR儀上設置反應程序87℃,10秒；55℃,10秒；65℃,60秒；循環(huán)次數(shù)30個。然后乙醇沉淀進行純化去掉未摻入的單核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在基因芯片的制備中能用少量的mRNA為模板,擴增出大量cDNA探針的標記方法。采用一步逆轉(zhuǎn)錄法,只需用一種逆轉(zhuǎn)錄酶反應,只用了一種引物,使操作更簡單、成本大大降低、步驟少而節(jié)約時間。
文檔編號C12N15/10GK1314467SQ00114998
公開日2001年9月26日 申請日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 李瑤 申請人:上海博道基因開發(fā)有限公司