專(zhuān)利名稱(chēng)：有效的多重檢測(cè)丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺損病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物樣本中的核酸序列、尤其是來(lái)源于感染性微生物的序列的改進(jìn)方法。
全世界數(shù)百萬(wàn)人感染有人免疫缺損病毒(HIV)，由此帶來(lái)嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題。通過(guò)污染的血制品可導(dǎo)致HIV感染蔓延，這就意味需要一種能檢測(cè)出患者樣本中少量HIV RNA的篩選方法。而且，對(duì)HIV感染的改進(jìn)治療的不斷增加，意味著對(duì)患者的感染進(jìn)行早期檢測(cè)是極其重要的，以便開(kāi)始實(shí)行適當(dāng)?shù)闹委煷胧?br> 丙型肝炎病毒(HCV)是一種非腸道傳播病毒，全世界大多數(shù)輸血后肝炎和大部分偶發(fā)性(或群體獲得的)肝炎病例都源于此。已證實(shí)全世界1％以上的人口感染有HCV。HCV感染與急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和隨后的肝細(xì)胞癌有關(guān)。
在Flaviviridae家族中，目前將HCV分類(lèi)成分離屬、Hepacivirus。其基因組由含單個(gè)、大的開(kāi)放讀框(ORF)、約9500核苷酸的正鏈RNA分子組成，這種開(kāi)放讀框編碼約3000氨基酸的聚蛋白前體。這種大的ORF以約340個(gè)核苷酸的5’非編碼(NC)區(qū)為開(kāi)端，它是基因組的極其保守區(qū)域。ORF的5’區(qū)編碼(在5’-3’方向)衣殼蛋白、兩個(gè)包膜蛋白(E1和E2)和少數(shù)未知功能的蛋白(P7)。ORF的3’部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括蛋白酶、蛋白酶/解旋酶雙功能蛋白、RNA聚合酶和常用肽。
全世界范圍對(duì)HCV編碼序列的分析發(fā)現(xiàn)個(gè)體病毒分離物之間存在相當(dāng)大的序列變化。而且，對(duì)單個(gè)病人的HCV序列的分析表明病毒循環(huán)成所謂的“準(zhǔn)種”，它包含相關(guān)但不相同的序列。一般認(rèn)為分離物間和單個(gè)病人中存在的變化是由于病毒編碼的RNA依賴(lài)性RNA聚合酶的低保真性所致。HCV的基因改變程度對(duì)感染的預(yù)防、診斷和控制具有重要意義。
HCV感染的血清學(xué)診斷，典型的是通過(guò)商業(yè)上可得到的酶免疫測(cè)定法(EIA)來(lái)檢測(cè)，該方法可檢測(cè)結(jié)合有重組HCV蛋白或肽的抗體。通過(guò)重組免疫印跡測(cè)定法(RIBA)可以證實(shí)陽(yáng)性EIA的結(jié)果，但是EIA或RIBA測(cè)定法都無(wú)法將現(xiàn)在的感染與過(guò)去區(qū)別開(kāi)。由于循環(huán)病毒的滴度特別低，還沒(méi)有成功地找到一種直接測(cè)定病毒蛋白的方法。而且，對(duì)于暴露感染后2-3個(gè)月，基于抗體的測(cè)定法通常無(wú)法檢測(cè)出HCV感染。
因此，本技術(shù)領(lǐng)域需要一種改進(jìn)的測(cè)定法，該方法能同時(shí)篩選患者樣本中的HIV和HCV。
本發(fā)明提供了用多重測(cè)定法同時(shí)檢測(cè)生物樣本中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法。
因此，一方面，本發(fā)明涉及共檢測(cè)生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法。該方法包括(A)用來(lái)源于上述樣本的RNA作為模板、至少一種能引發(fā)從HCV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；(B)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)具有特異性的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV具有特性異的寡核苷酸引物對(duì)上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV具有特異性的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1具有特異性的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(i)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(ii)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，
其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物；和(C)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對(duì)HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIVRNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCVRNA和HIVRNA。
第二方面，本發(fā)明涉及一種共擴(kuò)增丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者同時(shí)含HCV DNA與HIV DNA的DNA樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>；且其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
第三方面，本發(fā)明涉及一種共檢測(cè)生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來(lái)源于上述樣本的RNA和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)RNA作為模板、用至少一種引發(fā)從IPC RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物、至少一種引發(fā)從HCVRNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)IPC特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(c)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(d)任何上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的組合；(B)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物、一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(c)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(d)任何上述擴(kuò)增產(chǎn)物的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IP-CF1)<序列號(hào)8>，和(II)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物；和(C)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中對(duì)IPC-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC RNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCVRNA，對(duì)HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIV RNA。
第四方面，本發(fā)明涉及一種共擴(kuò)增內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)DNA、丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物、一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)可疑含有IPC DNA、HCV DNA、HIV DNA、或者任何前面所述組合的DNA樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)IPC擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(c)HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；其中上述每一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號(hào)8>，和(ii)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和
(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
其它方面，本發(fā)明使用隨機(jī)寡核苷酸引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；或者可以使用一種或多種HCV特異的和一種或多種HIV特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，如含與HCV或HIV RNA中的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸。
測(cè)定擴(kuò)增物的方法包括，但不限于(a)電泳和(b)在固體支持體上捕捉擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物上附有IPC-、HCV-或HIV-特異性探針，接著用比色測(cè)定法對(duì)結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定。有用的IPC-特異性捕捉探針包括但不限于5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號(hào)17>，有用的HCV特異性捕捉探針包括但不限于5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<序列號(hào)12>，有用的HIV-1特異性捕捉探針包括但不限于5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’<序列號(hào)13>，和有用的HIV-2特異性捕捉探針包括但不限于5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’<序列號(hào)14>。
另一方面，本發(fā)明涉及一種共檢測(cè)生物樣本中的HCV RNA和HIV RNA的試劑盒，該試劑盒包括(a)一對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；和(b)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的、對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTCC AGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，以及(c)一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
還有一方面，本發(fā)明涉及一種用于共擴(kuò)增DNA樣本中的HCV DNA和HIVDNA的試劑盒，它包括(a)一對(duì)對(duì)HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；和(b)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的、對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，以及(c)一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可以用下列多重測(cè)定法同時(shí)檢測(cè)含HCV和HIV RNA的生物樣本中的少量丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA，即(i)在來(lái)源于樣本的RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，和(ii)用含與存在于HCV和HIV RNA中的某些序列互補(bǔ)的序列的特殊寡核苷酸對(duì)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此本發(fā)明提供了改進(jìn)的單循環(huán)、多重逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增測(cè)定法，該方法可檢測(cè)同一樣本中低復(fù)制量的HCV和HIVRNA。
根據(jù)序列保守性、分子內(nèi)和分子間的相互作用以及預(yù)測(cè)的擴(kuò)增子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和環(huán)境序列來(lái)選擇寡核苷酸引物。而且，該引物和測(cè)定方法應(yīng)該允許HCV和HIV基因組的多區(qū)域、多病毒種類(lèi)和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)RNA(或DNA)的共同擴(kuò)增(和共同檢測(cè))。病毒基因組的多區(qū)域的共同擴(kuò)增/檢測(cè)增加了測(cè)定的敏感性，IPC的共同擴(kuò)增減少了因PCR抑制而致假陰性結(jié)果的可能性。
分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的許多技術(shù)可用于實(shí)施本發(fā)明，這些在下列文章中有解釋《當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)》I、II和III卷，1997(F.M..Ausubel ed.)；Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約；《DNA克隆實(shí)驗(yàn)入門(mén)》I和II卷，1985(DN.Glover ed.)；《寡核苷酸合成》1984，(M.L.Gait ed.)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》，1984(Hames和Higgins eds.)；《分子克隆的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》；叢書(shū)，《酶學(xué)方法》(Academic出版社)；和《蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)驗(yàn)》第二版(Springer-Verlag，N.Y.)。
本文所用的“核酸”或“聚核苷酸”是指任意長(zhǎng)度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸或混合多核糖-多脫氧核糖核苷酸。這包括單鏈和雙鏈分子，如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交體，以及由堿基與氨基酸主鏈共軛形成的“蛋白質(zhì)核酸(PNA)”。這些也包括含修飾堿基的核酸。
本文所用的核酸序列的“成分”是指與起始序列參加Watson-Crick堿基配對(duì)的反義序列。
本文所用的“引物”是指長(zhǎng)度約為5-50核苷酸的分離寡核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)約6-25核苷酸，最好的優(yōu)選是長(zhǎng)約6-18核苷酸，它與有意義的單鏈核酸序列形成雙鏈體，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶允許互補(bǔ)鏈聚合。
本文所用的“分離”的核酸是指從其初始環(huán)境去除的成分(例如，如果是天然產(chǎn)生的，則為天然環(huán)境；或者如果是合成的，則為反應(yīng)混合物)。分離的核酸含有約小于50％的其原始相關(guān)成分，優(yōu)選小于約75％，最好的優(yōu)選是約小于90％。
“來(lái)源于”指定的序列的核苷酸序列是指與指定序列的區(qū)域相對(duì)應(yīng)的序列。這包括與該序列同源或互補(bǔ)的序列。
內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)靶核苷酸是指克隆到成質(zhì)粒載體中的合成的核苷酸序列，該質(zhì)粒隨后被線性化，尤其是通過(guò)限制酶的作用。IPC尤其含有包圍基因探針結(jié)合區(qū)域的多引物結(jié)合序列，并作為一種對(duì)抗核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中的假陰性結(jié)果的基因控制。
優(yōu)選的內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照靶DNA的序列為5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<序列號(hào)15>
可以用常規(guī)方法制備含有任何本文所公開(kāi)的序列或其亞序列的核苷酸。例如，DNA可以用下列方法化學(xué)合成，如Matteucci等，1981，《美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志》(J.Am.Chem.Soc.)1033185中的亞磷酰胺固體支持體方法，Yoo等，《生物化學(xué)雜志》76417078中的方法，或者其它已知方法。也可用本技術(shù)領(lǐng)域已知的許多方法對(duì)核苷酸進(jìn)行修飾。這些修飾的非限定例子包括甲基化作用、“帽結(jié)構(gòu)”、用一種類(lèi)似物取代一種或多種天然產(chǎn)生的核苷酸、以及內(nèi)核苷酸修飾，如用未荷電的連鎖(如膦酸甲基酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的修飾或荷電連鎖(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾。核苷酸可以含有一個(gè)或多個(gè)額外的共價(jià)交聯(lián)部分，例如，蛋白質(zhì)(如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴(lài)氨酸等)、嵌入劑(如丫啶、補(bǔ)骨脂素等)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等)以及烷化劑?！昂怂帷币辉~也包括PNA。核酸可以通過(guò)甲基或乙基磷酸三酯的形成或者烷基氨基磷酸酯連鎖而衍生。而且，本發(fā)明的核酸序列也可以用一種能直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記進(jìn)行修飾。例如標(biāo)記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等等。
本文所用的擴(kuò)增是指一種復(fù)制核酸的重復(fù)方法。適合的擴(kuò)增方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸單堿基擴(kuò)增、以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增。
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)生物樣本中的HCV和HIV的方法。該方法是通過(guò)以下步驟完成的(i)用包含在樣本或來(lái)源于樣本的RNA作為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(ii)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物，該引物含與HCV基因組內(nèi)(優(yōu)選HCV的5’編碼區(qū))的序列相對(duì)應(yīng)的序列，和至少一對(duì)含與HIV基因組內(nèi)的序列相對(duì)應(yīng)的序列的擴(kuò)增引物，以產(chǎn)生HCV特異性和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；和(iii)檢測(cè)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明樣本中分別存在HCV和HIV RNA。
根據(jù)本發(fā)明，生物樣本是通過(guò)任意常用方法從病人身上獲得的。適合的生物樣本包括但不限于血液、血清、血漿、尿液、人乳和腦脊液。血漿優(yōu)選作為病毒RNA的來(lái)源。
以任意方法處理這種生物樣本，這些方法可使逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)入樣本內(nèi)含有的RNA特別是病毒RNA中?！皝?lái)源于”生物樣本的RNA是起初存在于樣本中的任何RNA，通過(guò)處理樣本可完成進(jìn)入。特別是，RNA可以用本領(lǐng)域已知的任何方法從樣本中提取，如使用異硫氰酸胍、或使用商業(yè)上可得到的試劑的方法，以及如來(lái)自Gentra系統(tǒng)公司(Minneapolis MN)的PureScriptθ方法?？梢允褂萌魏翁崛》椒?，這些方法可從RNA酶、其它蛋白質(zhì)和/或可能參與逆轉(zhuǎn)錄的任何其它成分分離出RNA。
然后使用(a)隨機(jī)引物，如從Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ得到的隨機(jī)六聚體引物，和/或(b)來(lái)源于HCV RNA基因組序列的5’或3’非編碼區(qū)的引物對(duì)樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用常規(guī)方法實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄，例如見(jiàn)于《當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)》I、II和III卷，1997(F.M..Ausubel ed.)；美國(guó)專(zhuān)利5,322,770；Young等，《臨床微生物雜志》31(4)882(1993)；Myers等，《生物化學(xué)》30(3)7661(1991)；或者如未決專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)＿＿，代理人案卷號(hào)為2094/0E287的案卷中所述。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，將產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增?？梢允褂萌魏螖U(kuò)增方法，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、或核酸單堿基擴(kuò)增。優(yōu)選使用PCR。特別是，含PCR的所有必需成分的反應(yīng)混合物是直接加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中的。然后采用對(duì)所用引物對(duì)有特異性的條件進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)某些HCV特異性和HIV特異性擴(kuò)增引物對(duì)可以同時(shí)用以檢測(cè)病人樣本中低水平的HCV和HIV RNA。可用于實(shí)施本發(fā)明的引物的非限定實(shí)例包括下表1所列出的。
(s)＝有義鏈；(as)＝反義鏈擴(kuò)增后，可以用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，這些方法包括但不限于瓊脂糖凝膠電泳或丙烯酰胺凝膠電泳；非同位素比色測(cè)定如SureCellθ系統(tǒng)，它可以從Ortho Clinical Diagnostic，Rochester，NY獲得(參見(jiàn)下面實(shí)施例1)；Eci測(cè)定；化學(xué)發(fā)光和熒光。
病毒特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明樣本中存在病毒RNA。當(dāng)使用凝膠電泳時(shí)，病毒特異性擴(kuò)增產(chǎn)物是根據(jù)其大小來(lái)確定的，正如通過(guò)在含與反應(yīng)中所用的擴(kuò)增引物相對(duì)應(yīng)的序列的各自病毒RNA中的定位所預(yù)測(cè)的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了其在診斷病人的HIV和HCV感染中的應(yīng)用；在檢測(cè)抗病毒治療方案的效能中的應(yīng)用；和在篩選用于HCV感染和HIV感染的樣本的供血中的應(yīng)用。
下面的實(shí)施例是舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是進(jìn)行限定。實(shí)施例1生物樣本中的HCV和HIV的多重檢測(cè)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)是為了根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)檢測(cè)HCV和HIV的多重測(cè)定的敏感性。A.方法1.患者樣本使用制造廠商的指導(dǎo)中的RocheAmplicor測(cè)定法對(duì)加樣在HIV陽(yáng)性患者血漿和HCV陽(yáng)性患者血漿中的病毒進(jìn)行定量測(cè)定。首先將含HIV和含HCV的血漿樣本分別稀釋至含1,000copies/ml和10,000copies/ml。然后按如下結(jié)合將50l HCV和500l HIV血漿加入450l陰性血漿中，以產(chǎn)生25個(gè)病毒基因組RNA/PCR反應(yīng)復(fù)制。將10l HCV和100l HIV血漿加入890l陰性血漿中，以產(chǎn)生5個(gè)拷貝/PCR反應(yīng)。
2.樣本制備用PureScriptθRNA分離試劑(Gentra Systems，Minneapolis MN)從血漿樣本中制備RNA。根據(jù)制造廠商的方案對(duì)體液的修飾包括使用40g、而不是20g糖元作為載體以有助于病毒RNA的沉淀。另外，在大多數(shù)情況下，RNA的異丙醇沉淀后，用乙醇洗滌RNA粒狀沉淀，將粒狀沉淀再懸浮在RT緩沖混合液中，而不是懸浮在廠商提供的RNA水合溶液中。
3.逆轉(zhuǎn)錄通過(guò)在含50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMDTT、0.4mM每個(gè)dNTP(Pharmacia Biotech)、4M隨機(jī)六聚體((PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)或特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、和焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中的20單位RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑(Promega，Madison，Wisconsin)的50l溶液中加入100U重組Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)，來(lái)催化從RNA到cDNA的合成。在42EC培養(yǎng)30分鐘后，在100EC進(jìn)行5分鐘RT反應(yīng)以去除RT活性。使每一反應(yīng)冷卻1分鐘后，以16000×g微量離心4秒。
4.PCR擴(kuò)增在含25mM Tris-HCl、3mM MgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40M DTT、108g/mL明膠(IV型)、9.5％甘油、0.02％吐溫20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM每個(gè)dNTP、0.4M每個(gè)引物、10個(gè)拷貝線性化內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)質(zhì)粒DNA、和16 U標(biāo)記(Tag)聚合酶的100l溶液中、在PE9600熱循環(huán)器(Perkin-Elmer)中進(jìn)行PCR。將Tag、TP1-12和TP4-9的單克隆抗體(其制備公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利5,338,671中)，分別以50∶1和5∶1摩爾比例加入反應(yīng)中，以提供Tag聚合酶的55∶1摩爾比例的抗體。在96EC進(jìn)行3分鐘初始變性作用后，在96EC和68EC分別進(jìn)行5秒和40秒的40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。循環(huán)結(jié)束時(shí)，在103EC進(jìn)行5分鐘后加熱步驟，以使Tag聚合酶失活。
5.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)通過(guò)4％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行溴化乙錠染色。或者，在擴(kuò)增期間用5’-生物素標(biāo)記的引物(有義鏈)使PCR產(chǎn)物生物素化。通過(guò)對(duì)與乳汁顆粒共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交以捕捉產(chǎn)物，它沉積在流通膜的表面(SureCellθ測(cè)定HCV-1探針是5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>和5’-GAACAGATAAACACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；HIV-2探針是5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>；和HCV探針是5’-CTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成)。探針/產(chǎn)物復(fù)合體與鏈霉親和素(SA)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物反應(yīng)，它催化染料前體向染料(藍(lán)色)的氧化轉(zhuǎn)化。通過(guò)將顏色強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)色比較，對(duì)藍(lán)色強(qiáng)度進(jìn)行目視計(jì)分(0-10)。所有目視顏色計(jì)分＞3則認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果。B.結(jié)果凝膠電泳出現(xiàn)下列擴(kuò)增產(chǎn)物188nt(HCV)、160nt(IPC)，和150nt(HIVLTR-長(zhǎng)產(chǎn)物)。在每個(gè)PCR檢測(cè)25拷貝的檢測(cè)(500病毒顆粒/ml血漿)時(shí)，HIV和HCV的結(jié)合測(cè)定可以檢測(cè)所有結(jié)合的HIV和HCV樣本。另外，在5拷貝/PCR檢測(cè)(100病毒顆粒/ml血漿)下，檢測(cè)了50-90％的結(jié)合陽(yáng)性樣本。結(jié)果如下表。
上述的所有專(zhuān)利、申請(qǐng)、論文、出版物和實(shí)驗(yàn)方法均在此引作參考。
根據(jù)詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多變通。這些顯而易見(jiàn)的變通應(yīng)在附加的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種共檢測(cè)生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來(lái)源于上述樣本的RNA作為模板、并用至少一種引發(fā)從HCV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(c)包括(a)和(b)的組合；(B)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(c)(a)和(b)的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物；和(C)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物；其中對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對(duì)HTV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIVRNA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用隨機(jī)寡核苷酸引物進(jìn)行的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用一種或多種具有與HCV RNA的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸引物和一種或多種具有與HIVRNA的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸引物進(jìn)行的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的擴(kuò)增是通過(guò)一種選自下列的方法進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸單堿基擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括用凝膠電泳使所述的擴(kuò)增產(chǎn)物顯色。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括在固體支持體上捕捉上述擴(kuò)增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(B)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(c)(a)和(b)的組合；并用比色測(cè)定法對(duì)上述捕捉產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的樣本是選自血液、血清、血漿、尿液、唾液和腦脊液。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的共檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的。
10.一種共擴(kuò)增丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者同時(shí)含HCV DNA與HIV DNA的DNA樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(c)(a)和(b)的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)1>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)2>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>；且其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，還進(jìn)一步包括(B)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA，對(duì)HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV DNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA和HIVDNA。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括用凝膠電泳使所述的擴(kuò)增產(chǎn)物顯色。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括在固體支持體上捕捉上述擴(kuò)增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(c)(a)和(b)的組合；并用比色測(cè)定法對(duì)上述捕捉產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的共擴(kuò)增是同時(shí)進(jìn)行的。
16.一種共檢測(cè)生物樣本中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA和人免疫缺損病毒(HIV)RNA的方法，該方法包括(A)用來(lái)源于上述樣本的RNA和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)RNA作為模板、用至少一種引發(fā)從IPC RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物、至少一種引發(fā)從HCVRNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物和至少一種引發(fā)從HIV RNA的DNA逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括(a)IPC特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(b)HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(c)HIV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或(d)任何上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的組合；(B)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物、一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(c)IPC特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(d)任何上述擴(kuò)增產(chǎn)物的組合；其中上述每一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物包括(1)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號(hào)8>，和(2)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物；和(C)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物；其中對(duì)IPC-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC RNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA，對(duì)HTV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV RNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HTV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV RNA和HIV RNA。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用隨機(jī)寡核苷酸引物進(jìn)行的。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用一種或多種具有與IPC RNA的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸引物、一種或多種具有與HCVRNA的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸引物和一種或多種具有與HIV RNA的序列相對(duì)應(yīng)的序列的寡核苷酸引物進(jìn)行的。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的擴(kuò)增是通過(guò)一種選自下列的方法進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括用凝膠電泳使所述的擴(kuò)增產(chǎn)物顯色。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括在固體支持體上捕捉上述擴(kuò)增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種IPC特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(c)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；并用比色測(cè)定法對(duì)上述捕捉產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號(hào)17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>，和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>。
23.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的樣本是選自血液、血清、血漿、尿液、唾液和腦脊液。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的共檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的。
25.一種共擴(kuò)增內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)DNA、丙型肝炎病毒(HCV)DNA和人免疫缺損病毒(HIV)DNA的方法，該方法包括(A)用一對(duì)或多對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物、一對(duì)或多對(duì)對(duì)HCV的5‘非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物和一對(duì)或多對(duì)對(duì)HIV特異的寡核苷酸引物對(duì)含IPC DNA的DNA樣本、可疑含有HCV DNA、HIV DNA、或者任何全面所述的組合的DNA樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括(a)IPC擴(kuò)增產(chǎn)物，(b)IPC擴(kuò)增產(chǎn)物和HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，(c)IPC擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或(d)包括(a)、(b)和(c)的任意組合；其中上述每一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號(hào)8>，和(ii)反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>；其中上述每一對(duì)對(duì)HCV特異的寡核苷酸引物包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；其中每一對(duì)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，其中每一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
26.如權(quán)利要求10所述的方法，還包括(B)檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物，其中對(duì)IPC-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在IPC DNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA，對(duì)HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HIV DNA，對(duì)HCV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和HIV-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明上述樣本中存在HCV DNA和HIV DNA。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括用凝膠電泳使所述的擴(kuò)增產(chǎn)物顯色。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的檢測(cè)包括在固體支持體上捕捉上述擴(kuò)增產(chǎn)物，該支持體含有(a)一種或多種IPC特異性寡核苷酸探針，(b)一種或多種HCV特異性寡核苷酸探針，(c)一種或多種HIV特異性寡核苷酸探針，或(d)全面所述的任意組合；并用比色測(cè)定法對(duì)上述捕捉產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號(hào)17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自(a)5’-CAACAGACGGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的共擴(kuò)增是同時(shí)進(jìn)行的。
31.一種共檢測(cè)生物樣本中的HCV RNA和HIV RNA的試劑盒，該試劑盒包括(a)一對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；和(b)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的、對(duì)HIV-1特異的反向引物(1)5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，以及一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，還包括一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物，其中所述的對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物對(duì)包括正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號(hào)8>，和反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>。
33.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
34.如權(quán)利要求32所述的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
35.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述的探針選自由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>、5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>、5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>和5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>組成的組。
36.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’<序列號(hào)17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自以下組成的組(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<14>。
37.一種用于共擴(kuò)增DNA樣本中的HCV DNA和HIV DNA的試劑盒，它包括(a)一對(duì)對(duì)HCV的5’非編碼區(qū)特異的寡核苷酸引物，包括(i)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<序列號(hào)10>，和(ii)反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<序列號(hào)11>；和(b)對(duì)HIV-1特異的寡核苷酸引物，它包括如下序列的正向引物5’-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’(JBLTR4)<序列號(hào)3>，和選自下列的、對(duì)HIV-1特異的反向引物(1) 5’-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT-3’(JBLTR6)<序列號(hào)4>，和(2)5’-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’(JBLTR8)<序列號(hào)5>，以及一對(duì)對(duì)HIV-2特異的寡核苷酸引物，它包括序列為5’-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3’(2LTRe)<序列號(hào)6>的正向引物，和對(duì)HIV-2特異、序列為5’-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3’(2LTR-R1)<序列號(hào)7>的反向引物。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，還包括一對(duì)對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物，其中所述的對(duì)IPC特異的寡核苷酸引物對(duì)包括正向引物5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’(IPCF1)<序列號(hào)8>，和反向引物5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’(IPCR1)<序列號(hào)9>。
39.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
40.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
41.如權(quán)利要求39所述的試劑盒，其中所述的探針選自由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>、5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>、5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>和5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>組成的組。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的IPC特異性探針是由5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’(IPCIP)<序列號(hào)17>組成，所述的HCV特異性探針是由5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<序列號(hào)12>組成，所述的HIV特異性探針是選自以下組成的組(a)5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr3)<序列號(hào)13>；(b)5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)16>；和(c)5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)14>。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于同時(shí)檢測(cè)人生物樣本中的丙型肝炎病毒和人免疫缺損病毒的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1268575SQ00104630
公開(kāi)日2000年10月4日 申請(qǐng)日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月3日
發(fā)明者K·M·戈曼, D·R·帕特森, J·M·林南, K·宋 申請(qǐng)人:奧索臨床診斷有限公司