專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑、免疫調(diào)節(jié)劑食品和免疫調(diào)節(jié)劑飼料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及外用的含有得自原核生物細胞的DNA的免疫調(diào)節(jié)劑、免疫調(diào)節(jié)劑食品、免疫調(diào)節(jié)劑飼料、錠劑和藥物。
人們認為適度激活人和動物的免疫活性對抗傳染病(包括普通感冒)是重要的，對癌癥的初級預防和控制變應性及特應性疾病等也是重要的。已知得自原核生物細胞的DNA具有免疫強化活性，而得自真核細胞的DNA無免疫強化活性。然而，體外脫氧核糖核酸酶處理使DNA的免疫調(diào)節(jié)活性喪失(S.Yamamoto等，Microbiol.Immunol.，第36卷(9)，983-997，1992)。迄今為止人們認為，因為人類和動物消化液酶含有脫氧核糖核酸酶，所以只有通過其注射給予才能發(fā)揮DNA的免疫調(diào)節(jié)活性。
然而，因為注射給藥對所述機體是個損傷，所以不適合反復給藥。為了改善免疫強化所必需的物理條件，實踐中相當重要的是通過每日像攝食食物一樣服食DNA或者與皮膚粘膜接觸達到上述目的。
因此本發(fā)明的目的是提供免疫調(diào)節(jié)劑，在該免疫調(diào)節(jié)劑中DNA不是通過注射給予，而是例如經(jīng)口或皮膚給予；或者象食物或飼料一樣每日攝食。
為了解決上述問題進行廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口或皮膚給予得自例如枯草芽胞桿菌和乳酸菌的原核生物細胞的DNA意外地顯現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)活性。該發(fā)現(xiàn)導致完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明將提供含有作為活性成份的原核生物細胞源DNA的免疫調(diào)節(jié)劑、免疫調(diào)節(jié)劑食品或免疫調(diào)節(jié)劑飼料。
本發(fā)明為人類或動物提供調(diào)節(jié)所述免疫功能的方法，所述方法通過經(jīng)口、皮膚或粘膜給予藥用有效量的DNA，所述DNA從原核生物細胞提取獲得。
最好是所述DNA是通過以下步驟生產(chǎn)的產(chǎn)品培養(yǎng)原核生物細胞，收獲所述細胞，用細菌細胞壁消化酶將所述細胞溶于水中，并向該裂解液加入乙醇以分離DNA產(chǎn)品。所述DNA可以是細菌細胞的DNA提取制品或乙醇或含水乙醇中的細菌細胞的乙醇不溶性組分。以約40％(體積/體積)含水乙醇可以很好獲得所述產(chǎn)品。
最好是所述DNA含有至少8個堿基并包含至少一個CpG序列。所述DNA可以是其鈉鹽。
在本發(fā)明中，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被激活。因此，可治療傳染病。
在本發(fā)明中，腫瘤生長被抑制。
在本發(fā)明中，自身免疫性皮膚病得到治療。
在本發(fā)明中，所述原核生物不必是特殊的細菌。然而，考慮到安全性問題，可提及枯草芽胞桿菌(桿菌屬)、乳酸菌(乳桿菌)、氨基酸生產(chǎn)菌、大腸桿菌等。其中特別優(yōu)選納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)、乳酸桿菌和氨基酸生產(chǎn)菌用于生產(chǎn)食品。作為乳酸菌，可優(yōu)選干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus del-brueckii)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、長雙歧桿菌(Biphidobacterium longum)等。作為氨基酸生產(chǎn)菌，可優(yōu)選例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)、 黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammomaphilum)和大腸桿菌。
可以用已知方法從原核生物細胞生產(chǎn)DNA。例如可以在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌。然后離心收獲所述細胞，用0.85％生理鹽水洗滌，之后將其懸浮于生理鹽水或純水。加入諸如溶菌酶的細菌細胞壁消化酶溶解細胞。向所述溶液逐漸加入已冷的無水乙醇。將不溶于40％(體積/體積)乙醇濃度的DNA纏繞在玻棒上。用60％v/v乙醇、70％v/v乙醇和80％(重量)乙醇依次洗滌所獲得的DNA，真空干燥以獲得高純度DNA制品。
所獲得的DNA制品本身可以加入到食品、飼料或飲料。也可能的是將所獲得的DNA制品與常規(guī)用于藥物生產(chǎn)的填料、賦形劑等混合，然后將所述混合物根據(jù)需要模制成合適形狀以提供藥物制劑或食品。所述DNA也可以配制成溶液。
所述原核生物DNA的免疫調(diào)節(jié)活性在化學上是穩(wěn)定的。如實施例4和實施例5中所述，即使加入到普通飼料，它既不與飼料成份發(fā)生反應也不會因加熱而失活。這表明，在生產(chǎn)含有該DNA的免疫調(diào)節(jié)劑食品和免疫調(diào)節(jié)劑的步驟中，可以隨意地進行烹調(diào)或加熱滅菌處理。如上所述，得自原核生物的DNA的免疫調(diào)節(jié)活性是穩(wěn)定的，未觀察到隨時間而發(fā)生退變。因此，其活性在本品貯藏和流通中不會喪失。
在以免疫調(diào)節(jié)劑的水溶液形式給予DNA的情況下，特別通過超聲處理或限制性內(nèi)切核酸酶處理使其變?yōu)榈头肿?，由此使其粘度降低而方便飲用。在超聲處理中，例如，將純水加入所述DNA制品使其濃度為1％，并對其進行超聲處理5-10分鐘，同時用冰水冷卻。已知得自原核生物細胞的DNA分子顯示免疫調(diào)節(jié)活性，因為其堿基序列是特征性的，而且原核生物細胞與真核細胞不同，它含有大量CpG序列(A.M.Krieg等，Nature，第374卷；第546-549頁，1995)。因此，在限制性內(nèi)切核酸酶處理中，并不特別選擇限制性內(nèi)切核酸酶，只要它能切斷CpG鍵?？梢杂贸Ｒ?guī)內(nèi)切核酸酶處理方法進行所述限制性內(nèi)切核酸酶處理。
當將DNA加到食品時，所用食品是不特別受限制的。DNA可以加入到例如主食，諸如面包、面條和大米；配菜，諸如清煮魚膏(蒲鉾)、火腿、香腸、熟沙拉和醋漬疏菜；調(diào)味料，諸如豆瓣醬(日本豆醬)、醬油、湯、沙司和佐料汁；乳制品，諸如奶、可可飲料、奶油、人造奶油、奶酪和冰激淋；糖食，諸如曲奇餅、餅干、薄酥餅、糖果和口香糖；加工果品，諸如果汁飲料和果醬；和寵物飼料、漁業(yè)及畜牧業(yè)飼料等。
當本發(fā)明的DNA作為主要藥物應用時，它可以以粉劑、顆粒劑、分散劑、膠囊劑、糖果、飲料或諸如此類口服應用。除此之外，它還可以以軟膏劑、敷劑、溶液劑或沐浴制品經(jīng)皮膚應用以及以錠劑、栓劑或含漱劑經(jīng)粘膜應用。在經(jīng)皮膚應用時，優(yōu)選上述低分子制品。當本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑通過口服應用時，標準攝入是0.001-100g/天相當量的DNA，而且沒有具體的上限。經(jīng)皮膚使用的DNA濃度范圍為0.001-100％，但是它并不特別受限制。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供免疫調(diào)節(jié)劑，其中的DNA可以經(jīng)口或皮膚給予，而不是注射給予，或者其中的DNA可以像食物或飼料一樣每日攝食；本發(fā)明還提供免疫調(diào)節(jié)劑食品或飼料。
實施例通過給出以下實施例更具體地說明本發(fā)明。另外，在實施例中％和份數(shù)均是以重量計的。實施例1(細胞DNA的提取)將谷氨酸棒桿菌IAM 12435接種到含有10ml營養(yǎng)肉湯的L型試管，于30℃振搖培養(yǎng)7小時。分別在10個容量為500ml并含有100mlMimura等的培養(yǎng)基(Hakko Kogaku Zasshi，第41卷，第5期，第275-281頁，1963)的錐形瓶中接種1ml所述培養(yǎng)液，于37℃振搖培養(yǎng)21小時。將該培養(yǎng)物再加到20升Mimura等的培養(yǎng)基中，在小型發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。然后在對數(shù)生長期以0.2單位/ml的濃度加入青霉素G。離心收獲所述細胞以獲得約1,000g濕細胞。用生理鹽水離心洗滌所述濕細胞一次。然后，加入5升生理鹽水懸浮所述細胞。一邊攪拌一邊加入1g卵清溶菌酶。于37℃攪拌2小時后，使溫度升至65℃以破壞所述細胞。逐漸加入已經(jīng)冷卻至-20℃的無水乙醇。用玻棒纏繞不溶于40％乙醇濃度的DNA。用60％乙醇、70％乙醇和80％乙醇依次漂洗所獲得的DNA，然后真空干燥，獲得DNA制品5g。實施例2(DNA的超聲處理)將實施例1中獲得的DNA制品以10mg/ml濃度溶解于純水中。將70ml所述DNA溶液裝入超聲波儀(Kubota Seisakusho K.K.制造，201M型超聲波儀)容器中，并于90kHz超聲處理5分鐘，同時于-20℃冷卻。向該溶液中加入2倍體積-20℃的無水冷乙醇。將所述混合物于-20℃靜置24小時。然后將該沉淀離心，真空干燥，獲得700mg超聲處理的DNA制品。實施例3(DNA的限制性內(nèi)切核酸酶分解)將純水加入到實施例1中制得的DNA制品，使其以10mg/ml濃度溶解。于1ml該混合物中加入100mM tris鹽酸緩沖液(pH 7.5)1ml，該緩沖液含有10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇和100mM NaCl。此外，加入10,000單位限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，并于37℃進行該反應2小時。加入3M醋酸鈉溶液0.2ml，再加入-20℃冷無水乙醇2.5倍體積。該混合物于-20℃靜置24小時，然后離心所述沉淀。依次用60％、70％和80％乙醇漂洗所述沉淀，真空干燥，獲得限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA制品8mg。實施例4(用含細菌DNA的飼料或飲用水激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng))作為一個免疫調(diào)節(jié)活性指標，檢測細菌DNA對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)激活的影響。因為以飲用水給予需要降低溶液粘度，所以使用超聲處理制品。對一組(5只)6周齡ICR-株雌性小鼠給予含0.1％或1％DNA制品的含DNA飼料或含DNA飲用水。在持續(xù)所述給予7天后，以8mg/100g體重靜脈給予膠態(tài)炭(Pelican Ink)。在注射后0、3、6、9、12和15分鐘后，眶后穿刺取血20μl，加到4ml 0.1％碳酸鈉中。于675nm波長檢測吸光度。用Kato等的方法(I.Kato等，Microbiol.Immunol.，第27卷(7)，611-618，1983)計算碳從血液中清除的半衰期(清除率t1/2)。其結(jié)果示于表1。
表1<
>從表1中的結(jié)果可清楚看出的是，在得自所述細菌的DNA中觀察到所述網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的激活，而在得自真核細胞(酵母)的DNA中未觀察到所述網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的激活。
按實施例1產(chǎn)生納豆芽孢桿菌DNA。關(guān)于酵母DNA，在YPD培養(yǎng)基(2.0％葡萄糖，1％酵母提取物，2.0％細菌用蛋白胨，pH5.0)中接種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FT-1，并于30℃培養(yǎng)。通過用10單位/ml酵解酶Zymolase(Seikagaku Kogyo K.K.生產(chǎn))的含0.1mM EDTA的Tris鹽酸緩沖液pH7.0處理，使所述細胞經(jīng)受溶菌作用。然后，以2％的速率加入SDS以破壞所述酵母細胞核。此外，按實施例1用冷無水乙醇處理所述產(chǎn)物，以形成酵母DNA制品。
此外，按實施例2生產(chǎn)納豆芽孢桿菌DNA和酵母DNA的超聲處理制品。實施例5(用含細菌DNA的飼料或飲用水抑制腫瘤生長)得自谷氨酸棒桿菌IAM 12435的DNA(實施例1)用作細菌DNA樣品，而實施例4中所述的得自酵母的DNA用作比較和對照。任意給予雌性BALB/c小鼠飼料和水。含每種所述DNA制品(以90℃的產(chǎn)物溫度熱處理20分鐘)的飼料的DNA含量為1％，含每種所述DNA制品(于90℃熱處理20分鐘)的飲用水的DNA含量為1％。兩周后，以1×106細胞在所述小鼠背部皮下植入所述Meth-A腫瘤。此外，持續(xù)給予含有所述DNA的飼料。在腫瘤植入后的第十五天，取除所述腫瘤，稱其重量。所述結(jié)果示于表2。
表2
如下進行所述飼料的生產(chǎn)。即，按照以下配方用常規(guī)方法生產(chǎn)混合飼料20份酪蛋白、10份玉米油、30份礦物質(zhì)混合物(OrientalYeast Co.，Ltd.生產(chǎn))、2.0份維生素混合物(Oriental Yeast Co.，Ltd.生產(chǎn))、49份玉米淀粉、10份糖、5份纖維素和1.0份實施例1中制備的DNA。
從表2可清楚看出的是，給予得自所述原核生物細胞的DNA使所述腫瘤的生長被抑制。實施例6(外用藥物的制備)按照以下配方生產(chǎn)皮膚用制劑。
超聲處理的谷氨酸棒桿菌IAM 12435 DNA 1.0％甘油 5.0％丙二醇 4.0％油醇 0.1％乙醇 5.0％苯甲酸 0.05％純水 84.9％將超聲處理的DNA(實施例2)、甘油和丙二醇加入純水并溶解。同時，將油醇和苯甲酸溶在室溫下溶解于乙醇。將該溶液加到所述純水部分并溶解。該混合物于90℃加熱20分鐘，過濾，然后灌裝。實施例7(外用藥物的制備)按照以下配方生產(chǎn)皮膚用制劑。
限制性內(nèi)切核酸酶處理的谷氨酸棒桿菌IAM 12435 DNA1.0％甘油 5.0％丙二醇 4.0％油醇 0.1％乙醇 5.0％
苯甲酸 0.05％純水 84.9％將限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA(實施例3)、甘油和丙二醇加入純水并溶解。同時，將油醇和苯甲酸溶在室溫下溶解于乙醇。該溶液加到所述純水部分并溶解。該混合物過濾，然后灌裝。實施例8(錠劑的制備)按照以下配方生產(chǎn)100片錠劑。
白糖(精制粉)100g阿拉伯膠(精制粉)8g超聲處理的DNA 5g薄荷醇 0.6mg百里酚 0.6mg桉葉油 0.002ml檸檬油 0.002ml水 適量用濕法生產(chǎn)顆粒，并制成錠劑使得一片約1.2g。實施例9混合實施例1中制得的谷氨酸棒桿菌IAM 12435 DNA粉90mg、淀粉30mg和Avicell(纖維素，Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn))180mg，以常規(guī)方法生產(chǎn)片型食品，使得每片為300mg。實施例10把純水加入到實施例1中制得的谷氨酸棒桿菌IAM 12435 DNA粉0.05份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化劑0.05份，以將總量調(diào)節(jié)為100份，用常規(guī)方法生產(chǎn)可可飲料。實施例11把純水加入到實施例2中制得的谷氨酸棒桿菌IAM 12435 0.2份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化劑0.05份，以將總量調(diào)節(jié)為100份，用常規(guī)方法生產(chǎn)可可飲料。實施例12用滾筒型制面機生產(chǎn)含DNA的粗制糊劑。該配方為低強度面粉650g、硬質(zhì)面粉(精制粗粉)350g、蛋白粉10g、蛋黃粉8g、麥醇溶蛋白15g、乙醇30g、DNA(實施例1)100mg和水280g。實施例13加入水500g和DNA(實施例1)300mg，蒸煮生大米500g，所述大米已經(jīng)用水清洗并且已經(jīng)瀝干。
在一組12人中，每人每天食兩餐所述配方米飯，持續(xù)一個冬季(3個月)，其中僅2人患流感。同時，在未添加DNA的一組(12人)中，8人患者流感。由此，鑒定了DNA的免疫調(diào)節(jié)活性。實施例14通過均勻地混合以下組分生產(chǎn)粉狀配合飼料65％白魚粉39份、大豆餅5份、維生素B1和其它維生素的混合物2份、鈣、磷和其它礦物質(zhì)2份、羧甲基纖維素2份和實施例1中制得的DNA 0.1份。實施例15已知全身性硬皮病為自身免疫性皮膚病，并認為干擾素對其治療是有用的。采用用博萊霉素處理的硬皮病小鼠模型，檢測實施例6中制得的外用DNA制劑的治療效應。
每個實驗組為6周齡的雌性BALB/c小鼠6只。給兩組小鼠的背外側(cè)皮下每天以10μg/0.1ml劑量給予博萊霉素4周。在皮下注射博萊霉素的一組小鼠中局部涂抹所述外用DNA制劑，而皮下注射博萊霉素的另一組局部涂抹作為對照的實施例6中的不含DNA的制劑。從博萊霉素處理開始的5周內(nèi)每天進行所述涂抹步驟一次。在結(jié)束所述涂抹后的當天，測量所述皮膚的厚度。對照組測定值(2倍皮膚厚度±SE(mm))為5.27±0.66，而所述DNA處理組測定值為4.13±0.39。即，在用含DNA制劑處理的組中觀察到顯著抑制所述硬皮病。
權(quán)利要求
1.含有從原核生物細胞提取的DNA的免疫調(diào)節(jié)劑，所述DNA作為一種活性組分。
2.按照權(quán)利要求1要求的免疫調(diào)節(jié)劑，其中所述原核生物是納豆芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、乳酸菌、氨基酸生產(chǎn)菌或大腸桿菌。
3.按照權(quán)利要求1要求的免疫調(diào)節(jié)劑，其中通過超聲處理或限制性內(nèi)切核酸酶處理使DNA變成低分子。
4.按照權(quán)利要求1要求的免疫調(diào)節(jié)劑，它是一種錠劑。
5.按照權(quán)利要求1要求的免疫調(diào)節(jié)劑，它是一種外用藥物。
6.含有從原核生物細胞提取的DNA的免疫調(diào)節(jié)劑食品。
7.含有從原核生物細胞提取的DNA的免疫調(diào)節(jié)劑飼料。
8.調(diào)節(jié)所述免疫功能的一種方法，該方法通過給人或動物經(jīng)口、皮膚或粘膜給予藥用有效量的、從原核生物細胞提取的DNA。
9.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述DNA是通過以下方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，所述方法是培養(yǎng)原核生物細胞，收獲所述細胞，用細菌細胞壁消化酶使所述細胞溶于水中，將乙醇或含水乙醇加到所述裂解液中，以分離DNA產(chǎn)物。
10.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述原核生物選自納豆芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、乳酸菌、氨基酸生產(chǎn)菌或大腸桿菌。
11.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述原核生物選自干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、糞鏈球菌、長雙歧桿菌、谷氨酸棒桿菌、力士棒桿菌、黃色短桿菌、嗜氨微桿菌和大腸桿菌。
12.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中通過超聲處理或限制性內(nèi)切核酸酶處理使DNA變成低分子。
13.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被激活。
14.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中腫瘤的生長被抑制。
15.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中自身免疫性皮膚病得到治療。
16.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中傳染病得到治療。
17.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述DNA具有至少8個堿基并含有至少一個CpG序列。
18.按照權(quán)利要求8要求的方法，其中所述DNA是其鈉鹽。
全文摘要
提供免疫調(diào)節(jié)劑,在所述免疫調(diào)節(jié)劑中DNA可經(jīng)口或皮膚給予,而不是注射給予,或者可以象食品一樣每日攝食;或者提供免疫調(diào)節(jié)劑食品或免疫調(diào)節(jié)劑飼料。將得自諸如枯草芽胞桿菌、乳酸菌、氨基酸生產(chǎn)菌和大腸桿菌的原核生物細胞的DNA加入到食品或者模制成能夠經(jīng)口、皮膚或粘膜給予的DNA免疫調(diào)節(jié)劑,或者制成食品、飼料或者諸如此類。
文檔編號A23L1/10GK1267519SQ0010432
公開日2000年9月27日 申請日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月19日
發(fā)明者村田幸作, 福田泰樹, 矢嶋瑞夫, 勝山浩一 申請人:淺間化成株式會社