一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分：葡萄糖25?40份、檸檬酸2.5?3份、檸檬酸三鈉5?8份、碳酸氫鈉1.2?1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.2?1.3份、氯化鉀0.7?0.9份、三羥甲基氨基甲烷2.8?3份、半胱氨酸0.05?0.08份、聚維酮碘0.025?0.030份和抗菌肽0?0.002份。用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物精液的稀釋、保存和殺滅細(xì)菌病毒。
【專利說(shuō)明】
_種殺滅動(dòng)物精準(zhǔn)病毒細(xì)囷的稀釋保存準(zhǔn)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于畜牧業(yè)動(dòng)物人工授精領(lǐng)域，具體涉及一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀 釋保存液。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工授精技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是能夠通過(guò)人工采集動(dòng)物優(yōu)質(zhì)精液，通過(guò)一定的技術(shù)手段使 它能夠長(zhǎng)時(shí)間保存運(yùn)輸，為畜牧業(yè)品種改良和提高生產(chǎn)績(jī)效帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益。但是人工 授精技術(shù)也有它的天然缺陷，那就是將供體精液里面可能帶有的病原微生物都傳染給它的 受體。以豬為例，公豬精液中通常含有1〇 4~1〇5 CFU/ml細(xì)菌以及可能污染的未知病毒及其他 病原微生物。這些細(xì)菌和病毒會(huì)影響公豬精液的保存時(shí)間及精子的活率，并且能夠通過(guò)人 工授精技術(shù)將公豬所可能攜帶病原微生物傳染給母豬和小豬，導(dǎo)致母豬繁殖障礙、小豬疾 病的流行和生產(chǎn)績(jī)效的大幅度下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究表明公豬精液中能檢出的危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要病毒有：口蹄疫 病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜 合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)。其中已證實(shí)CSFV、PRRSV、 PPV、PRV能通過(guò)人工受精感染母豬引起死胎、流產(chǎn)等繁殖障礙。種公豬精液帶毒是豬群病毒 病垂直傳播的一個(gè)重要途徑，也是制約人工受精技術(shù)發(fā)展和推廣的一大難題。
[0004] 動(dòng)物精液稀釋保存液在人工授精行業(yè)應(yīng)用廣泛，技術(shù)難度不高，配方簡(jiǎn)單容易生 產(chǎn)，其主要功能是增加精液體積、防止冷應(yīng)激、提供精子營(yíng)養(yǎng)、作為高pH值的緩沖液，延長(zhǎng)精 子的存活時(shí)間。但針對(duì)公豬精液污染，現(xiàn)有的技術(shù)是通過(guò)在精液稀釋保存液中加入抗生素 (如青霉素、鏈霉素、慶大霉素、林可霉素等)來(lái)抑菌，但是抗生素僅能抑制精液中的部份細(xì) 菌繁殖，而對(duì)病毒完全無(wú)效，并且有濫用抗生素的風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物人工授精領(lǐng) 域還沒(méi)有更好的辦法來(lái)處理精液中的細(xì)菌和病毒污染問(wèn)題。
[0005] 如發(fā)明專利申請(qǐng)201510756292.6，公開(kāi)了一種豬鮮精保存長(zhǎng)效稀釋粉及制備方法 與應(yīng)用。它是由重量份數(shù)的葡糖糖35-40,乙二酸四乙酸鈉1.2-1.4,檸檬酸鈉4-8,碳酸氫鈉 1.2-1.4,氯化鉀0.7-0.8,聚乙烯醇0.4-0.6,半胱氨酸0.1-0.2,肌醇0.4-0.6,青霉素1.0-?. 5 ， 鏈霉素 1.0-1.5 等原料組成 ，存在濫用抗生素的 問(wèn)題。
[0006] 發(fā)明專利申請(qǐng)201410164618.1，公開(kāi)了一種豬抗病毒精液稀釋液的配方組成?；?于每1000毫升雙蒸餾水，豬抗病毒精液稀釋液含有：15.50份的葡萄糖；11.65份的檸檬酸三 鈉;2.35份的EDTA鈉鹽；1.75份的碳酸氫鈉；1.00份的聚乙烯醇；5.50份的三羧甲基氨基甲 烷;4.10份的檸檬酸;0.07份的半胱氨酸；1.00份的維生素 C; 0.10份的恩諾沙星；以及50ml 抗病毒劑。配方中含有利巴韋林等抗病毒成分，利巴韋林雖然有一定抑制病毒生長(zhǎng)的效果， 但卻是國(guó)家嚴(yán)禁畜牧獸醫(yī)行業(yè)使用的抗病毒藥物。
[0007] 殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的精液稀釋保存液的開(kāi)發(fā)難度體現(xiàn)在： a、安全性，首先要不損傷精子活率，不對(duì)受精卵、胚胎以及母豬的繁殖造成影響，對(duì)精 子的遺傳性能無(wú)影響。
[0008] b、有效性，對(duì)精子里面的有害病原，特別是病毒有效，是這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵。
[0009] C、能對(duì)精子提供有效保護(hù)，精子保存期可以達(dá)到7-10天。
[0010] d、安全性和有效性是一對(duì)矛盾，很難對(duì)立統(tǒng)一。
[0011] e、研究條件要求高，要求對(duì)藥劑學(xué)、獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、病毒細(xì)胞培養(yǎng)、以及畜牧 學(xué)等相關(guān)專業(yè)以及試驗(yàn)條件，單一企業(yè)或研究單位難以滿足。
[0012] 文獻(xiàn)"一種精液凈化保護(hù)劑對(duì)公豬精子活率的影響及對(duì)精液中5種病毒的殺滅作 用研究"（中國(guó)畜牧雜志，繁殖生理，2015年第51卷第7期），公開(kāi)了一種精液凈化保護(hù)劑對(duì)公 豬精子活率的影響，以及對(duì)存在于公豬精液中病毒的殺滅作用。該文獻(xiàn)的精液凈化保護(hù)劑 不適用于含碘的消毒劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存 液。在公豬精液稀釋保存液中加入低毒聚維酮碘和抗菌肽，用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物精液的稀釋、保存 和殺滅細(xì)菌病毒。
[0014] 本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案： 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖25-40份、 檸檬酸2.5-3份、檸檬酸三鈉5-8份、碳酸氫鈉1.2-1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.2-1.3份、氯 化鉀0.7-0.9份、三羥甲基氨基甲烷2.8-3份、半胱氨酸0.05-0.08份、聚維酮碘0.025-0.030 份和抗菌肽〇-〇. 002份。
[0015]優(yōu)選地，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖35-40份、檸檬酸2.8-3份、檸檬酸三鈉5-6份、碳酸氫鈉1.25-1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.25-1.3份、氯化鉀0.7-0.8份、三羥甲基氨 基甲烷2.8-2.9份、半胱氨酸0.05-0.07份、聚維酮碘0.025-0.030份和抗菌肽0.001-0.002 份。
[0016] 本稀釋保存液分為兩部分，第一部分為基礎(chǔ)稀釋營(yíng)養(yǎng)液部分:葡萄糖、朽1檬酸、朽1 檬酸三鈉、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鉀、三羥甲基氨基甲烷和半胱氨酸，其中的半 胱氨酸為精子保護(hù)劑;第二部分為殺滅病毒細(xì)菌有效成分:聚維酮碘。本發(fā)明配方通過(guò)對(duì)三 羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉與氯化鉀的加入比例的控制，使稀釋保存液的pH值為 6 · 20-6 · 30，滲透壓為 347m0sm。
[0017] 本發(fā)明所述稀釋保存液的pH為6.20-6.30，滲透壓為347m0sm。針對(duì)精子生存的嚴(yán) 格環(huán)境要求，在該環(huán)境中精子的保存穩(wěn)定性最好。
[0018] 本發(fā)明所述稀釋保存液采用的溶劑為雙蒸水。
[0019] 水質(zhì)對(duì)于精子活力和保存時(shí)間的影響很大，不同地區(qū)不同養(yǎng)殖企業(yè)水質(zhì)都不同， 其中的關(guān)鍵指標(biāo)如PH、礦物質(zhì)及微量元素含量、微生物含量、重金屬含量等對(duì)精子質(zhì)量影響 很大。本發(fā)明采用穩(wěn)定的雙蒸水水質(zhì)，克服了使用不便、效果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。
[0020]聚維酮碘是目前畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)常用的碘制劑之一，是將碘載于強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂上 形成的一種接觸型消毒劑，可殺死大部分細(xì)菌、真菌和病毒。但是，在對(duì)精子安全的濃度范 圍內(nèi)，聚維酮碘對(duì)部份細(xì)菌和病毒有很好的效果，但不能完全殺滅精液里面常見(jiàn)五種病毒， 特別是豬偽狂犬病毒和豬瘟病毒效果不佳。
[0021]抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000 ~7000左右，由20~60個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)細(xì)菌和病毒都有廣譜殺滅效果，且對(duì)精子安全 性非常好，特別是對(duì)精液常見(jiàn)病毒特別是豬痕病毒、偽狂犬病毒、藍(lán)耳病病毒有很好的殺滅 作用，和聚維酮碘配合使用有強(qiáng)烈互補(bǔ)性。
[0022]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的抗菌肽為幢螂內(nèi)源性抗菌肽。
[0023]本發(fā)明選用蟑螂內(nèi)源性抗菌肽，其氨基酸序列為SEQIDN0:1。這種抗菌肽具有良好 穩(wěn)定性以及廣譜高效抗菌、抗病毒等特點(diǎn)，且生產(chǎn)工藝成熟和完善，其生產(chǎn)工藝是以蟑螂內(nèi) 源性抗菌肽的氨基酸序列為模版，以固相多肽合成方法將氨基酸序列重組后用工程菌表達(dá) 發(fā)酵，得到重組廣譜抗菌肽純品。蟑螂內(nèi)源性抗菌肽在適當(dāng)?shù)臐舛认聦?duì)精子安全性非常好， 而且對(duì)精液常見(jiàn)病毒特別是豬瘟病毒、偽狂犬病毒、藍(lán)耳病病毒有很好的殺滅作用，和低毒 聚維酮碘配合使用有強(qiáng)烈互補(bǔ)性。
[0024]本發(fā)明的稀釋保存液已經(jīng)得到全國(guó)超過(guò)100家大中型養(yǎng)豬企業(yè)的生產(chǎn)驗(yàn)證，在使 用本發(fā)明產(chǎn)品后生產(chǎn)成績(jī)大幅改善的有超過(guò)80%，普遍反映母豬繁殖障礙疾病大幅降低， 疾病發(fā)生率顯著下降，妊娠率顯著提高，窩產(chǎn)仔豬頭數(shù)增加，生產(chǎn)績(jī)效普遍提高，具有顯著 經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0025] 本發(fā)明采用了優(yōu)選的稀釋保存液基礎(chǔ)配方和聚維酮碘消毒劑，使稀釋保存液配方 之間的穩(wěn)定性最好，再加上統(tǒng)一穩(wěn)定的雙蒸水水質(zhì)，克服了使用不便、效果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0027] 實(shí)施例1 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖25份、檸 檬酸2.5份、檸檬酸三鈉5份、碳酸氫鈉1.2份、乙二胺四乙酸二鈉1.2份、氯化鉀0.7份、三羥 甲基氨基甲烷2.8份、半胱氨酸0.05份和聚維酮碘0.025份。
[0028] 實(shí)施例2 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖40份、檸 檬酸3份、檸檬酸三鈉8份、碳酸氫鈉1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.3份、氯化鉀0.9份、三羥甲 基氨基甲烷3份、半胱氨酸0.08份、聚維酮碘0.030份和抗菌肽0.002份。
[0029] 該稀釋保存液的pH值為6.2，滲透壓為347m0sm。
[0030]所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0031] 實(shí)施例3 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖30份、檸 檬酸2.6份、梓檬酸三鈉6份、碳酸氫鈉1.22份、乙二胺四乙酸二鈉1.22份、氯化鉀0.8份、三 羥甲基氨基甲烷2.9份、半胱氨酸0.06份和聚維酮碘0.026份。
[0032] 該稀釋保存液的pH值為6.3，滲透壓為347m0sm。
[0033] 所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0034] 實(shí)施例4 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖35份、檸 檬酸2.8份、梓檬酸三鈉5份、碳酸氫鈉1.25份、乙二胺四乙酸二鈉1.25份、氯化鉀0.7份、三 羥甲基氨基甲烷2.8份、半胱氨酸0.05份、聚維酮碘0.025份和抗菌肽0.001份。
[0035] 該稀釋保存液的pH值為6.22，滲透壓為347m0sm。
[0036] 所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0037] 實(shí)施例5 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖40份、檸 檬酸3份、檸檬酸三鈉6份、碳酸氫鈉1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.3份、氯化鉀0.8份、三羥甲 基氨基甲烷2.9份、半胱氨酸0.07份、聚維酮碘0.030份和蟑螂內(nèi)源性抗菌肽0.002份。
[0038] 該稀釋保存液的pH值為6.25，滲透壓為347m0sm。
[0039] 所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0040] 實(shí)施例6 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖37份、檸 檬酸2.9份、檸檬酸三鈉6份、碳酸氫鈉1.25份、乙二胺四乙酸二鈉1.25份、氯化鉀0.75份、三 羥甲基氨基甲烷2.8份、半胱氨酸0.07份、聚維酮碘0.026份和蟑螂內(nèi)源性抗菌肽0.0015份。 [0041 ] 該稀釋保存液的pH值為6.26，滲透壓為347m0sm。
[0042]所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0043] 實(shí)施例7 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，按重量計(jì)，包括以下成分:葡萄糖37份、檸 檬酸2.9份、檸檬酸三鈉6份、碳酸氫鈉1.25份、乙二胺四乙酸二鈉1.25份、氯化鉀0.75份、三 羥甲基氨基甲烷2.8份、半胱氨酸0.08份、維生素 C 1份、聚維酮碘0.026份和蟑螂內(nèi)源性抗 菌肽0.0012份。
[0044] 該稀釋保存液的pH值為6.22，滲透壓為347m0sm。
[0045] 所述稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
[0046] 毒理學(xué)試驗(yàn) 毒理學(xué)試驗(yàn)采用動(dòng)物試驗(yàn)觀察其急性毒性、亞急性毒性及刺激性毒性結(jié)果。
[0047] 結(jié)果:本精液凈化消毒劑對(duì)大鼠和小鼠急性經(jīng)口 LD50均大于5000 m份/k份· BW， 其原液對(duì)兔眼、完整皮膚及破損皮膚無(wú)刺激性;給藥劑量在1000 m份/k份· BW以下，與陰性 對(duì)照組比較，對(duì)大鼠的體重、血常規(guī)及血液生物化學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著影響，試驗(yàn)動(dòng)物各臟器均未 見(jiàn)明顯病理改變。仔豬口服精液凈化保護(hù)劑原液，每天兩次，lml/每次，連續(xù)兩天給藥，用藥 前后試驗(yàn)仔豬可食用組織中碘濃度均低于最高殘留限量，聚維酮碘在豬使用時(shí)無(wú)休藥期。 精液凈化保護(hù)劑在使用濃度下毒理學(xué)是安全的。
[0048]本發(fā)明精液凈化消毒劑穩(wěn)定性好，37°C恒溫箱放置三個(gè)月后碘含量下降率低于 5%，六個(gè)月碘含量下降率低于10%。
[0049] 本發(fā)明用于豬精液常溫稀釋保存液穩(wěn)定性好，密閉常溫避光保存有效期可達(dá)1年。 pH為 6 · 20 ± 0 · 05、滲透壓為 347m0sm。
[0050] 制備方法：在無(wú)菌廠房?jī)?nèi)，37°C 995.00ml滅菌雙蒸水中依次加入配方量的葡萄 糖、EDTA-Na2、檸檬酸三鈉：、檸檬酸、碳酸氫鈉、Tris、氯化鉀和半胱氨酸，邊加邊低速攪拌， 保持溫度在37 °C不變，攪拌均勻后待溫度降至室溫，加入配方量的聚維酮碘，低速攪拌均 勾后無(wú)菌分裝。
[0051] 本發(fā)明的成品檢驗(yàn)項(xiàng)目與操作方法 1、有效碘含量檢測(cè) 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2005版)有效碘檢測(cè)方法，本品含聚維酮碘按有效碘（ I )計(jì)算，應(yīng)為標(biāo)示量的0.85%~1.20%。
[0052]【性狀】本品為無(wú)色液體。
[0053]【鑒別】 (1)取本品1~5滴，加水10ml與淀粉指示液1滴，即顯藍(lán)紫色。
[0054] (2)取本品10ml，置50ml錐形瓶中（瓶?jī)?nèi)頸切勿沾污），瓶口覆蓋一張用淀粉指示液 濕潤(rùn)的濾紙，放置80秒鐘，不顯藍(lán)色。
[0055] 【檢查】pH值應(yīng)為6.20 ±0.05。
[0056] 2、不同品牌精液稀釋保存液以及精液稀釋保存粉對(duì)精液常溫保存時(shí)間的影響 市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)四種不同品牌精液稀釋保存液或精液稀釋保存粉（1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào))稀釋 后待用。
[0057]表1不同稀釋液對(duì)豬精液常溫保存的影響
由表1可知，本發(fā)明稀釋保存液有效保存時(shí)間極顯著高于1、2、3、4號(hào)液（P <0.01)，生 存指數(shù)也顯著高于1、2、3、4號(hào)液（P<Q.05)。
[0058] 3、本發(fā)明稀釋保存液常溫保存精液配種成績(jī) 用本發(fā)明稀釋保存液稀釋豬精液，在17°C恒溫箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀釋 精液用于人工授精試驗(yàn)。共輸精母豬120頭，具體結(jié)果見(jiàn)表2:可見(jiàn)，本發(fā)明稀釋保存液常溫 保存5d的豬精液情期受胎率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)明顯高于1、2、3、4號(hào)液。
[0059]表2不同稀釋液常溫保存5d的豬精液情期受胎率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，其特征在于：按重量計(jì)，包括以下成分： 葡萄糖25-40份、檸檬酸2.5-3份、檸檬酸三鈉5-8份、碳酸氫鈉1.2-1.3份、乙二胺四乙酸二 鈉1.2-1.3份、氯化鉀0.7-0.9份、三羥甲基氨基甲烷2.8-3份、半胱氨酸0.05-0.08份、聚維 酮碘0.025-0.030份和抗菌肽0-0.002份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，其特征在于:按重 量計(jì)，包括以下成分：葡萄糖35-40份、檸檬酸2.8-3份、檸檬酸三鈉5-6份、碳酸氫鈉1.25-1.3份、乙二胺四乙酸二鈉1.25-1.3份、氯化鉀0.7-0.8份、三羥甲基氨基甲烷2.8-2.9份、半 胱氨酸〇. 05-0.07份、聚維酮碘0.025-0.030份和抗菌肽0.001-0.002份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，其特征在于:該稀 釋保存液的pH值為6.2-6.3，滲透壓為347mOsm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，其特征在于:所述 稀釋保存液的抗菌肽為蟑螂內(nèi)源性抗菌肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺滅動(dòng)物精液病毒細(xì)菌的稀釋保存液，其特征在于:所述 稀釋保存液的溶劑為雙蒸水。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK105994251SQ201610439771
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】況洪
【申請(qǐng)人】成都美強(qiáng)獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)有限公司