矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)方法，所述原生質(zhì)體分離方法包括以下步驟：稱(chēng)量矮牽牛幼嫩葉片進(jìn)行處理后用酶解液酶解；向酶解后的溶液中加入CPW洗液，經(jīng)過(guò)濾、離心，吸去上清液；再次加入CPW洗液洗滌，離心，收集沉淀，即得純化后的原生質(zhì)體。所述原生質(zhì)體培養(yǎng)方法包括：將制備的原生質(zhì)體加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液中，24℃黑暗環(huán)境固液培養(yǎng)法培養(yǎng)30d后，將培養(yǎng)形成的微型愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基；培養(yǎng)21d后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基；培養(yǎng)即可。用本發(fā)明的分離及培養(yǎng)方法可獲得高活性、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體，對(duì)其培養(yǎng)可誘導(dǎo)出愈傷組織，最終分化出芽，為矮牽牛進(jìn)一步體細(xì)胞融合等研究提供實(shí)驗(yàn)材料，可為矮牽牛種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]矮牽牛(Petunia hybrida)為前科矮牽牛屬草本花丼，因其具有花色豐富、花期長(zhǎng) 等優(yōu)點(diǎn)，在世界各國(guó)廣泛應(yīng)用，素有"花壇植物之王"的美譽(yù)。但黃色花及橙色花品種極為少 見(jiàn)，尤其缺乏顏色鮮亮、穩(wěn)定的黃色花品種。目前矮牽牛育種技術(shù)多采用雜交育種，由于基 因資源限制和有性雜交親和性差等原因，通過(guò)傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)培育黃色花品種存在一定 難度。植物體細(xì)胞融合技術(shù)可克服遠(yuǎn)緣雜交親和性差的困難，可為矮牽牛新品種的培育開(kāi) 辟新途徑。
[0003] 原生質(zhì)體的成功分離及培養(yǎng)是體細(xì)胞融合的前提，在矮牽牛原生質(zhì)體分離研究 中，迄今沒(méi)有查閱到關(guān)于酶種類(lèi)及濃度、酶解時(shí)間、滲透壓等因素影響矮牽牛原生質(zhì)體分離 的報(bào)道;在原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中，尚缺乏培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)密度、培養(yǎng)方法等因素影響原生 質(zhì)體培養(yǎng)的報(bào)道。
[0004] 專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201510363007.4,專(zhuān)利名稱(chēng)為"小花矮牽牛原生質(zhì)體的制備方法"中， 公開(kāi)了一種小花矮牽牛原生質(zhì)體的制備方法，發(fā)明人曾嘗試采用該方法制備本發(fā)明矮牽牛 的原生質(zhì)體，未能獲得較好的結(jié)果。原因是由于所用材料是同科不同屬植物，品種有區(qū)別， 基因型不同，導(dǎo)致矮牽牛原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)結(jié)果存在差異。本發(fā)明以矮牽牛錦浪系列白 色花品種的葉片為材料，通過(guò)對(duì)影響矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的諸多因素探討分 析，建立了一套完整的分離及培養(yǎng)體系，原生質(zhì)體產(chǎn)量提高，原生質(zhì)體純化方式簡(jiǎn)化，可重 復(fù)性好，成功培養(yǎng)原生質(zhì)體并誘導(dǎo)出芽，為矮牽牛通過(guò)體細(xì)胞融合培育新品種奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)方法;該方法可高效 分離原生質(zhì)體，且可重復(fù)性好，成功培養(yǎng)原生質(zhì)體并誘導(dǎo)出芽。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，所述方法包括以下步驟：
[0008] A、稱(chēng)量矮牽牛幼嫩葉片，依次經(jīng)肥皂水浸泡、流水沖洗、75wt %酒精浸泡、Iwt %雙 氧水消毒、無(wú)菌水沖洗后，吸干水分，切成細(xì)絲；
[0009] B、用酶解液酶解步驟A處理后的葉片;所述酶解液的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為如下終 濃度的物質(zhì)：2wt %纖維素酶、0.4wt %離析酶、0.2wt %果膠酶、0.5M甘露醇、0.1 Iwt % CaCl2、〇. IOwt %牛血清白蛋白、20mM MES;所述酶解液的PH為5.6~5.7;
[0010] C、向步驟B酶解后的溶液中加入CPW洗液，經(jīng)300目細(xì)胞篩過(guò)濾后I lOOr/min離心 2min，吸去上清液;所述CPW洗液的溶劑為CPW鹽溶液，溶質(zhì)為終濃度0.5M的甘露醇；
[0011] D、再次加入CPW洗液洗滌，1100r/min離心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得純化 后的原生質(zhì)體。
[0012]優(yōu)選地，步驟A中，所述幼嫩葉片為頂芽下端第3~5片幼嫩葉片。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟C和D中，所述離心采用的離心機(jī)型號(hào)為Centrifuge 5810R離心 機(jī)(Eppendorf)〇
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟C和D中離心的試管均為50ml的大試管;所述步驟C和D中離心機(jī) 的加速度為〇(離心機(jī)加速度一般是指從〇轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)能力，共分〇~9個(gè)等級(jí)。如加速度為0 時(shí)表示從0轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)所用時(shí)間較長(zhǎng)，加速度為9表示從0轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)所用時(shí)間較短）。
[0015] 優(yōu)選地，步驟B中，所述纖維素酶為纖維素酶R-10(5-10U/mg，Yakult)，離心酶為離 析酶 1?-10(5-101]/11^，￥&1〇11〇，果膠酶為果膠酶￥-23(11]/11^，￥&1〇11七）。
[0016] 優(yōu)選地，步驟B中，所述酶解溫度為25~27°C，酶解時(shí)間為5h。
[0017] 優(yōu)選地，步驟C中，所述CPW鹽溶液是由每升水中加入27.2mg KH2⑶3、101.0mg KN03、1480mg CaCO3 · 2Η20、246·Omg MgS〇4 · 7H20、0.16mg KI、0.025mg CuS〇4 · 5H20制備而 得;所述CPW鹽溶液的pH為5.6~5.7。在調(diào)配CPW洗液時(shí)，需要用微量氫氧化鈉調(diào)到5.6~ 5.7;從而不僅保證最初CPW鹽溶液是5.6~5.7，還保證最后含有甘露醇和其它物質(zhì)最終的 CPW洗液的PH值為5.6~5.7。
[0018] 優(yōu)選地，所述矮牽牛為矮牽牛錦浪系列Petunia hybrida'Shock Wave'白色花品 種，種子來(lái)源于泛美種子公司。
[0019] 更優(yōu)選地，所述矮牽牛的培養(yǎng)方法為:植株置于HP1500GS-B型全智能人工培養(yǎng)箱， 生長(zhǎng)條件為:溫度26°C，光照時(shí)間14h · cf1，光照強(qiáng)度為30001UX。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：
[0021] 步驟一、將前述方法制備的原生質(zhì)體加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液中，24°C黑暗環(huán)境中固 液培養(yǎng)法培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)15d、22d、29d時(shí)添加一次新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基;所述原生質(zhì)體在 原生質(zhì)體培養(yǎng)液中的密度為0.5~1.0 X IO5個(gè)/ml;所述原生質(zhì)體培養(yǎng)液的溶劑為水溶液， 溶質(zhì)為終濃度的〇·375wt%KMsP、20mM MES、0· 15wt%KCl、2wt%鹿糖、9wt%葡萄糖、0·5mg/ I 6-BA、2.0mg/l NAA;原生質(zhì)體培養(yǎng)液的pH為5.6~5.7;
[0022]步驟二、培養(yǎng)30d后，將經(jīng)步驟一中培養(yǎng)形成的微型愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基； 培養(yǎng)21d后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基;培養(yǎng)即可;所述增殖培養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度 的0 · 44wt%MS培養(yǎng)基、2wt%蔗糖、0 · 7wt%瓊脂、0 · 5mg/l 6-BA、0 · 5mg/l NAA;所述分化培 養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的〇 . 44wt %MS培養(yǎng)基、2wt %蔗糖、0.7wt %瓊脂、 1·Omg/I ZT、0.lmg/I NAA0
[0023]優(yōu)選地，步驟一中，所述固液培養(yǎng)法為先將含0.8%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基平鋪在培 養(yǎng)皿底部，待其凝固后，再加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液和原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。
[0024]優(yōu)選地，步驟一中，所述分別在培養(yǎng)15d、22d、29d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的 滲透壓依次遞減，即培養(yǎng)15d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為9wt%，培養(yǎng)22d 時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為6wt%，培養(yǎng)22d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng) 基的葡萄糖濃度為3wt %。
[0025]優(yōu)選地，步驟一中，所述原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中，待形成肉眼可見(jiàn)的乳黃色微型愈傷 組織后，置于散射光下培養(yǎng)。
[0026]優(yōu)選地，步驟二中，將微型愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基后，培養(yǎng)條件為:溫度(24 土 1)°C，光照 14h · d-S光照強(qiáng)度3 OOOlux。
[0027]本發(fā)明以甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，酶解液中不同甘露醇濃度對(duì)分離原生質(zhì)體產(chǎn)量 和活性的影響較大。當(dāng)濃度為0.2M時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性分別為1.05 X IO6個(gè)· 和 41.6 %，原生質(zhì)體破裂情況嚴(yán)重，細(xì)胞碎片較多；甘露醇濃度0.3M時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最 高值，而后隨滲透壓升高而小幅度下降;原生質(zhì)體活性先升高后降低，在0.5M時(shí)活性達(dá)到最 高值82.4%，且獲得的原生質(zhì)體形狀、大小基本相同，邊緣清晰，內(nèi)含物較多，碎片和雜質(zhì) 少。綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離較適宜的甘露醇濃度為0.5M。 [0028]本發(fā)明所用的纖維素酶R-IO與離析酶R-IO和果膠酶Y-23的配合使用效果顯著。果 膠酶對(duì)原生質(zhì)體游離效果有較大影響，在同一纖維素酶和離析酶濃度下，隨果膠酶濃度提 高，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低，而活性逐漸降低；離析酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量有較大影響，對(duì) 活性沒(méi)有顯著影響;纖維素酶顯著影響原生質(zhì)體的游離效果。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著纖維 素濃度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性均同步增加，在所有的酶液組合中，以2.Owt%纖維素 酶+0.2wt %果膠酶+0.4wt %離析酶的組合，原生質(zhì)體分離效果最好，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性 分別達(dá)到2 · 90 X IO6個(gè)· g-1和88 · 1 %。
[0029] 本發(fā)明在純化原生質(zhì)體過(guò)程中，離心時(shí)將升降加速度均設(shè)為0。當(dāng)升降加速度處于 0時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速自O(shè)rpm上升到I IOOrpm需要時(shí)間較長(zhǎng)，原生質(zhì)體在離心力的作用下沉降速 度會(huì)減慢，彼此之間受擠壓程度較輕，完整性良好;當(dāng)升降加速度處于最大值9時(shí)，原生質(zhì)體 沉淀在一起，相互擠壓程度嚴(yán)重，在顯微鏡下可觀察到較多破碎的原生質(zhì)體。綜合考慮原生 質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體離心純化時(shí)較適宜的升降加速度為0。
[0030] 本發(fā)明中培養(yǎng)原生質(zhì)體時(shí)激素組合為0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。剛分離出的葉 肉原生質(zhì)體呈球形，邊緣清晰，細(xì)胞質(zhì)較濃，并含有較大的顆粒內(nèi)含物。培養(yǎng)l-2d，多數(shù)原生 質(zhì)體體積增大，其中的一些再生細(xì)胞變?yōu)槁褕A形，這標(biāo)志原生質(zhì)體新的細(xì)胞壁形成。與此同 時(shí)，原生質(zhì)體再生細(xì)胞中含有的顆粒內(nèi)含物漸漸消失。培養(yǎng)3d后，再生細(xì)胞開(kāi)始第一次細(xì)胞 分裂，細(xì)胞分裂有均等分裂和不均等分裂，并伴有原生質(zhì)體之間輕度粘連現(xiàn)象的發(fā)生。再生 細(xì)胞一旦分裂便能持續(xù)分裂。Hd后在顯微鏡下可觀察到小細(xì)胞團(tuán)的形成，培養(yǎng)17d左右，會(huì) 形成肉眼可見(jiàn)的微愈傷組織，顏色為乳黃色。
[0031 ]本發(fā)明中培養(yǎng)密度為0.5~1.0 X IO5個(gè)/ml，原生質(zhì)體均可維持較高的分裂頻率 (20%)。當(dāng)培養(yǎng)密度為0.1 X IO5個(gè)/ml時(shí)，再生細(xì)胞分裂頻率只有8.33%，出現(xiàn)第一次分裂 時(shí)間為4-5d。當(dāng)密度為5 X IO5個(gè)/ml時(shí)，原生質(zhì)體聚集情況較為嚴(yán)重，培養(yǎng)4d后只有外圍聚 集的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞分裂，但分裂頻率大幅下降，IOd后聚集在一起的大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)褐化。
[0032]本發(fā)明以固液培養(yǎng)法培養(yǎng)原生質(zhì)體。與固體培養(yǎng)法相比，固液培養(yǎng)法培養(yǎng)原生質(zhì) 體初次分裂頻率無(wú)顯著差別，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體損害較小。
[0033]本發(fā)明中培養(yǎng)愈傷組織時(shí)激素組合為1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA，可誘導(dǎo)出芽。在 轉(zhuǎn)移第16d分化出綠色芽點(diǎn)，生芽率為20%。
[0034]本發(fā)明具有如下有益效果：
[0035] 1)本發(fā)明利用含2wt %纖維素+0.2wt %果膠酶+0.4wt %離析酶+0.5M甘露醇的酶 液酶解葉片5h，離心法純化原生質(zhì)體;利用固液培養(yǎng)法培養(yǎng)原生質(zhì)體，培養(yǎng)密度為0.5~1.0 XlO5個(gè)/ml，激素組合為0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA，獲得乳黃色微型愈傷組織。
[0036] 2)利用激素組合為0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)微型愈傷組織， 21d后愈傷組織長(zhǎng)至5mm;利用激素組合為I .Omg/1 ZT+0. lmg/1 NAA的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷 組織，16d后誘導(dǎo)出芽，出芽率為20%。
[0037] 3)本發(fā)明中添加0.2wt%的果膠酶可明顯提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量，原生質(zhì)體產(chǎn)量可 高達(dá)2.90X 106個(gè)· g^1;離心法純化原生質(zhì)體時(shí)，將升降加速度都設(shè)為0,可顯著提高原生質(zhì) 體活性，活性可達(dá)到88.1 %，原生質(zhì)體大小一致，邊緣清晰，細(xì)胞質(zhì)較濃;0.1 %的生長(zhǎng)素有 利于愈傷組織的分化，以l.〇mg/l ZT+0.1mg/l NAA的激素組合培養(yǎng)愈傷組織，可誘導(dǎo)出芽。
[0038] 4)用本發(fā)明的方法可分離出高產(chǎn)量和高活性的原生質(zhì)體，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)可獲得愈 傷組織，并誘導(dǎo)出芽，為矮牽牛進(jìn)一步體細(xì)胞融合等研究提供實(shí)驗(yàn)材料，可為矮牽牛種質(zhì)資 源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0039]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0040]圖1為滲透壓對(duì)分離原生質(zhì)體效果的影響結(jié)果；
[0041 ]圖2為酶解時(shí)間對(duì)分離原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
[0042] 圖3為果膠酶濃度對(duì)分離原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
[0043] 圖4為離析酶濃度對(duì)分離原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
[0044] 圖5為纖維素酶濃度對(duì)分離原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
[0045] 圖6為離心的升降加速度對(duì)分離原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
[0046]圖7為實(shí)施例分離的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的圖片;其中，圖7-A為.酶解2_3h正在解 離的組織，X 800;圖7-B為酶解3h正解離細(xì)胞壁的細(xì)胞，X 800;圖7-C為酶解5h具活性的原 生質(zhì)體，X 400;圖7-D為顯微鏡下的原生質(zhì)體產(chǎn)量檢測(cè)，X 100;圖7-E為FDA檢測(cè)有活性的原 生質(zhì)體，X 100。
[0047] 圖8為實(shí)施例培養(yǎng)的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的圖片;其中，圖8-1為具活性原生質(zhì)體， X 400;圖8-2為培養(yǎng)2d的原生質(zhì)體，X 400;圖8-3為培養(yǎng)4d再生細(xì)胞第一次分裂，X 400;圖 8-4為培養(yǎng)5-6d再生細(xì)胞第二次分裂，X 400 ;圖8-5為培養(yǎng)5-6d再生細(xì)胞第三次分裂，X 400 ;圖8-6為培養(yǎng)12d形成的微細(xì)胞團(tuán)，X 200;圖8-7為第17d固液培養(yǎng)法形成的微愈傷組 織；圖8-8為6-BA0 · 5mg/l+NAA0 · 5mg/微愈傷增殖情況；圖8-9和8-10為第16d在ZT 1 · Omg/1+ NAAO. lmg/1的激素組合中愈傷組織分化出的芽。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員 進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0049] 本發(fā)明涉及一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0050] A、稱(chēng)量0.5g矮牽牛幼嫩葉片，肥皂水浸泡20min，流水沖洗1.5h。于無(wú)菌操作臺(tái)中， 75 %酒精浸泡20s，立即轉(zhuǎn)入1 %雙氧水消毒2min，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌濾紙吸干水分，切成 〇.5mm寬彼此相連的細(xì)絲；
[00511 B、用5ml酶液酶解步驟A處理后的葉片;所述酶解液的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為如下 終濃度的物質(zhì)：2wt %纖維素酶、0.4wt %離析酶、0.2wt %果膠酶、0.5M甘露醇、0.1 Iwt % CaCl2、0.1 Owt %牛血清白蛋白、20mM MES;所述酶解液的PH為5.6~5.7;
[0052] C、向步驟B酶解后的溶液中加入IOml CPW洗液，搖晃30s，經(jīng)300目細(xì)胞篩過(guò)濾后 1100r/min離心2min，升降加速度均設(shè)為0，吸去上清液;所述CPW洗液的溶劑為CPW鹽溶液， 溶質(zhì)為終濃度〇. 5M的甘露醇；
[0053] D、向步驟C中加入15ml CPW洗液洗滌，1100r/min離心2min，升降加速度均設(shè)為0， 吸去上清液，收集沉淀，向沉淀中加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液，獲得純化后的原生質(zhì)體;所述原生 質(zhì)體培養(yǎng)液的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的0.375的％疆 8?、2011^1^3、0.15的％1((：1、 2wt %鹿糖、9wt %葡萄糖、0 · 5mg/1 6-BA、2 · Omg/1 NAA;所述原生質(zhì)體培養(yǎng)液的pH為5 · 6~ 5.7；
[0054] E、將步驟D中的原生質(zhì)體密度調(diào)整為0.5~1.0 X IO5個(gè)/ml，24 °C黑暗環(huán)境固液培 養(yǎng)法培養(yǎng)，培養(yǎng)15d添加新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基，此后每隔7d添加一次；
[0055] F、培養(yǎng)30d后，將步驟E中形成的微愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基;21d微愈傷組織長(zhǎng) 至5mm，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基;所述增殖培養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的0.44wt % MS、 2wt %蔗糖、0.7wt %瓊脂、0.5mg/l 6-BA、0.5mg/l NAA;所述分化培養(yǎng)基的溶劑為水溶液， 溶質(zhì)為終濃度的〇.44wt%MS、2wt%鹿糖、0.7wt%瓊脂、1.0mg/l ZT、0.1mg/l NAA。
[0056] (I)針對(duì)步驟B中的甘露醇濃度，本發(fā)明設(shè)置5個(gè)濃度梯度:0.2、0.3、0.4、0.5和 0.6M。結(jié)果表明，綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，0.5M為分離矮牽牛葉肉原生質(zhì)體較適宜的 甘露醇濃度。具體如下：
[0057] 將供試材料分別放入甘露醇濃度為0.2、0.3、0.4、0.5和0.6M的酶液組合中進(jìn)行酶 解，測(cè)定各處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適的甘露醇濃度。
[0058]甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響：
[0059]從圖1可以看出，甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性有明顯影響。當(dāng)濃度為0.2M 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性分別為1.05 X IO6個(gè)· 和41.6%，原生質(zhì)體破裂情況嚴(yán)重，細(xì)胞 碎片較多，0.3M甘露醇條件下，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高值，之后隨滲透壓升高而小幅度下 降；原生質(zhì)體活性先升高后降低，在0.5M濃度時(shí)產(chǎn)量為2.45 X IO6個(gè)· ，活性達(dá)到最高值 82.4 %，并且獲得的原生質(zhì)體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內(nèi)含物多，碎片少。綜合考慮 原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離較適宜的滲透壓為〇. 5M。
[0060] (2)針對(duì)步驟B中的酶解時(shí)間，本發(fā)明設(shè)置3、4、5、6和7h共5個(gè)酶解時(shí)間。結(jié)果表明， 綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，5h為分離矮牽牛葉肉原生質(zhì)體較適宜的時(shí)間。具體如下： [0061 ]將供試材料分別酶解3、4、5、6和7h，測(cè)定各處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適 的酶解時(shí)間。
[0062]酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響：
[0063]結(jié)果如圖2所示，酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性都有明顯的影響。不同酶解時(shí) 間下，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性存在差異，且二者達(dá)到峰值的時(shí)間同步。酶解一段時(shí)間后，組織 被解離成單細(xì)胞（圖7-A)，隨后細(xì)胞壁被解離（圖7-B)，形成單個(gè)原生質(zhì)體（圖7-C);隨著酶 解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性都增加，在酶解5h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性分別為2.91 X IO6個(gè)· g-1和86.9%，均達(dá)到最高值（圖7-D和7-E)。超過(guò)5h后，活性隨酶解時(shí)間的增加而 大幅下降，而原生質(zhì)體活性的降低與細(xì)胞碎片的增多對(duì)原生質(zhì)體的純化和培養(yǎng)均不利，因 此最佳酶解時(shí)間為5h。
[0064] (3)針對(duì)步驟B中的果膠酶濃度，本發(fā)明設(shè)置Owt %、0 · 2wt %、0 · 4wt %、0 · 6wt %共4 個(gè)濃度。結(jié)果表明，綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，〇.2wt%為分離矮牽牛葉肉原生質(zhì)體較 適宜的果膠酶濃度。具體如下：
[0065] 在最適宜的甘露醇濃度和酶解時(shí)間下，酶混合液添加2 %纖維素酶和0.6 %離析酶 外，另分別添加 Owt%、0.2wt%、0.4wt%、0.6wt%果膠酶共4個(gè)濃度梯度，分離原生質(zhì)體。測(cè) 定各處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適的果膠酶濃度。
[0066] 果膠酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響：
[0067] 從圖3可看出，在原生質(zhì)體分離過(guò)程中，果膠酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性都有較大影 響。在同一纖維素酶和離析酶濃度下，隨果膠酶濃度提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低，而 活性逐漸降低。綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離較適宜的果膠酶 濃度為〇.2wt%。
[0068] (4)針對(duì)步驟B中的離析酶濃度，本發(fā)明設(shè)置0 · 2wt %、0 · 4wt %、0 · 6wt %、0 · 8wt % 共4個(gè)濃度梯度。結(jié)果表明，綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，0.4wt%為分離矮牽牛葉肉原生 質(zhì)體較適宜的離析酶濃度。具體如下：
[0069] 在最適宜的甘露醇濃度和酶解時(shí)間下，酶混合液成分為2wt%纖維素酶和適宜的 果膠酶濃度，另分別添加〇.2wt%、0.4wt%、0.6wt%、0.8wt%離析酶4個(gè)濃度梯度，分離原 生質(zhì)體。測(cè)定各處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適的離析酶濃度。
[0070] 離析酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響：
[0071]試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，離析酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量有較大影響，對(duì)原生質(zhì)體的活性沒(méi)有 顯著影響。當(dāng)離析酶濃度為〇. 4wt %時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性都達(dá)到最高值，分別為2.90 X IO6個(gè)· g^1和88.1 %，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谶@個(gè)濃度時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性都有不同程度下降， 當(dāng)離析酶濃度為0.8wt%，原生質(zhì)體產(chǎn)量大大降低，僅1.90X 106個(gè)· g^1。綜合考慮原生質(zhì)體 產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離較適宜的離析酶濃度為〇. 4wt %。
[0072] ( 5)針對(duì)步驟B中的纖維素酶濃度，本發(fā)明設(shè)置I . Owt %、I . 5wt %、2 . Owt %、 2.5wt %共4個(gè)濃度。結(jié)果表明，綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，2. Owt %為分離矮牽牛葉肉 原生質(zhì)體較適宜的纖維素酶濃度。具體如下：
[0073] 在最適宜的甘露醇濃度和酶解時(shí)間下，酶混合液添加0.2%果膠酶和適宜的離析 酶濃度外，另設(shè)置I 、1.5wt%、2.0wt%、2.5wt%共4個(gè)濃度梯度，分離原生質(zhì)體。測(cè)定 各處理下原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適的纖維素酶濃度。
[0074] 纖維素酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響：
[0075] 由圖5可看出，纖維素酶顯著影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活性。在一定濃度范圍內(nèi)，隨 著纖維素濃度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性同步增加，且當(dāng)濃度為2.Owt%時(shí)，產(chǎn)量及活性 均達(dá)到峰值，分別為2.87 X IO6個(gè)· 和87.5 %。當(dāng)濃度為1.0 %時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量較低，形 狀不規(guī)則，大小不一，部分原生質(zhì)體觀察不到清晰的邊緣，說(shuō)明此時(shí)有的細(xì)胞壁還沒(méi)有完全 被游離。當(dāng)濃度為2.5wt %時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性都開(kāi)始下降，原生質(zhì)體破裂程度開(kāi)始嚴(yán) 重。綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離較適宜的纖維素酶濃度為 2.Owt% 〇
[0076] (6)針對(duì)步驟C中升降加速度，本發(fā)明設(shè)置0、5、9共3個(gè)升降加速度。結(jié)果表明，綜合 原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性來(lái)看，當(dāng)升價(jià)加速度為〇時(shí)，純化原生質(zhì)體效果最好。具體如下：
[0077] 適宜的條件下獲得原生質(zhì)體，分別設(shè)置0、5和9共3個(gè)升降加速度純化原生質(zhì)體。測(cè) 定各處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定最適的升降加速度。
[0078] 離心時(shí)升降加速度對(duì)原生質(zhì)體純化的影響
[0079] 由圖6可看出，純化原生質(zhì)體時(shí)，升降加速度影響原生質(zhì)體活性，對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量 無(wú)顯著影響。當(dāng)升降加速度處于0時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速Orpm上升到IlOOrpm需要時(shí)間較長(zhǎng)，原生質(zhì) 體在離心力的作用下沉降速度減慢，彼此之間受擠壓程度較輕，完整性良好;當(dāng)升降加速度 處于最大值9時(shí)，原生質(zhì)體沉淀在一起，相互擠壓程度嚴(yán)重，在顯微鏡下觀察到破碎的原生 質(zhì)體較多，活性為66.7 %。綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性，矮牽牛葉肉原生質(zhì)體離心純化時(shí) 較適宜的升降加速度為0。
[0080] (7)針對(duì)步驟E原生質(zhì)體培養(yǎng)液中的激素組合，本發(fā)明設(shè)置7個(gè)激素組合。結(jié)果表 明，由原生質(zhì)體啟動(dòng)分裂時(shí)間和分裂頻率考慮，以〇.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA的激素組合 培養(yǎng)原生質(zhì)體最好。具體如下：
[0081] 按照上述游離方法獲得矮牽牛葉肉原生質(zhì)體，以KM8P為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)密度為 I.OX IO5個(gè)/ml，進(jìn)行固液培養(yǎng)，激素濃度比例見(jiàn)下表1。每天觀察原生質(zhì)體生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄 再生細(xì)胞啟動(dòng)分裂時(shí)間，統(tǒng)計(jì)分裂頻率。
[0082]表1原生質(zhì)體初期培養(yǎng)基(KM8P)
[0084]激素比例對(duì)矮牽牛原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響：
[0085]結(jié)果如表2所示，所用7種激素組合均可以促進(jìn)葉肉原生質(zhì)體分裂，以0.5mg/l 6-BA+2. Omg/1 NAA的組合(組合3)最好，葉肉原生質(zhì)體在培養(yǎng)第3d出現(xiàn)第一次分裂，且在第5-6d達(dá)到分裂高峰期，分裂頻率達(dá)到27.33 %。在此基礎(chǔ)上，增加6-BA濃度(組合5和7)，原生質(zhì) 體一次分裂頻率下降，所以6-BA濃度不宜超過(guò)0.5mg/l。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，增加2.4-D的濃 度可刺激再生細(xì)胞的分裂。在組合3中，剛分離出的葉肉原生質(zhì)體呈球形（圖8-1)，邊緣清 晰，細(xì)胞質(zhì)較濃，并含有較大的顆粒內(nèi)含物。培養(yǎng)l-2d，多數(shù)原生質(zhì)體體積增大，其中的一些 再生細(xì)胞變?yōu)槁褕A形，這標(biāo)志原生質(zhì)體新的細(xì)胞壁形成（圖8-2)。與此同時(shí)，原生質(zhì)體再生 細(xì)胞中含有的顆粒內(nèi)含物漸漸消失。培養(yǎng)3d后，再生細(xì)胞開(kāi)始第一次細(xì)胞分裂（圖8-3 )，細(xì) 胞分裂有均等分裂和不均等分裂，并伴有原生質(zhì)體之間輕度粘連現(xiàn)象的發(fā)生。再生細(xì)胞一 旦分裂便能持續(xù)分裂（圖8-4和8-5)。14(1后在顯微鏡下可觀察到小細(xì)胞團(tuán)的形成（圖8-6)， 培養(yǎng)17d左右，會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的微愈傷組織，顏色為乳黃色（圖8-7)。
[0086]表2激素比例對(duì)原生質(zhì)體初期培養(yǎng)的影響
[0088] 注：同一列字母不同者差異顯著(P〈0.05)，字母相同者差異不顯著(P>0.05)
[0089] (8)針對(duì)步驟E原生質(zhì)體培養(yǎng)密度，本發(fā)明設(shè)置0 · I X IO5個(gè)/ml、0· 5 X IO5個(gè)/ml、1 · 0 X IO5個(gè)/ml、5.OX IO5個(gè)/ml共4個(gè)培養(yǎng)密度。結(jié)果表明，由原生質(zhì)體啟動(dòng)分裂時(shí)間和分裂頻 率考慮，適宜的培養(yǎng)密度為0.5~1.0 X IO5個(gè)/ml。具體如下：
[0090] 按照上述游離方法獲得矮牽牛葉肉原生質(zhì)體，以KM8P為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素組合選 擇上述最優(yōu)組合，設(shè)置〇. I X IO5個(gè)/ml、0.5 X IO5個(gè)/ml、1.0 X IO5個(gè)/ml、5.0 X IO5個(gè)/ml共4 個(gè)培養(yǎng)密度。每天觀察原生質(zhì)體生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄再生細(xì)胞啟動(dòng)分裂時(shí)間，統(tǒng)計(jì)分裂頻率。 [0091 ]培養(yǎng)密度對(duì)矮牽牛原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響：
[0092] 結(jié)果如表3所示，當(dāng)培養(yǎng)密度0.1 X IO5個(gè)/ml時(shí)，再生細(xì)胞分裂頻率只有8.33%，出 現(xiàn)第一次分裂時(shí)間為4-5d。隨著培養(yǎng)密度增加，原生質(zhì)體第一次分裂頻率隨之增加，當(dāng)培養(yǎng) 密度為〇. 5 X IO5~1.0 X IO5個(gè)/ml時(shí)，原生質(zhì)體均可維持較高的分裂頻率(20% )，培養(yǎng)3d后 會(huì)有少數(shù)再生細(xì)胞聚集。當(dāng)密度為5 X IO5個(gè)/ml時(shí)，原生質(zhì)體聚集情況較為嚴(yán)重，培養(yǎng)4d后 只有外圍聚集的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞分裂，但分裂頻率大幅下降，IOd后聚集在一起的大多數(shù)細(xì)胞 出現(xiàn)褐化。
[0093] 衷3掊兼密庠對(duì)原牛質(zhì)休初期掊兼的影晌
[0095] 注：同一列字母不同者差異顯著(P〈0.05)，字母相同者差異不顯著(P>0.05)
[0096] (9)針對(duì)步驟E原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法，本發(fā)明設(shè)置固液培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種方法。 結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)方法效果無(wú)差異，從操作簡(jiǎn)便考慮，宜采用固液培養(yǎng)法。具體如下： [0097]按照上述游離方法獲得矮牽牛葉肉原生質(zhì)體，以KM8P為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇優(yōu)化后 的激素濃度和培養(yǎng)密度，分別利用固液培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法培養(yǎng)原生質(zhì)體。每天觀察原生 質(zhì)體生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄再生細(xì)胞啟動(dòng)分裂時(shí)間，統(tǒng)計(jì)分裂頻率。
[0098] 培養(yǎng)方式對(duì)矮牽牛原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響：
[0099] 結(jié)果如表4所示，固體培養(yǎng)時(shí)再生細(xì)胞第3d開(kāi)始第一次分裂，僅比固液培養(yǎng)提前 ld，分裂頻率為26%，且原生質(zhì)體再生細(xì)胞中含有的顆粒內(nèi)含物消失時(shí)間快于固液培養(yǎng)，在 5-8d出現(xiàn)細(xì)胞分裂高峰，此時(shí)再生細(xì)胞持續(xù)分裂并形成小細(xì)胞團(tuán)，約15d后即發(fā)育成肉眼可 見(jiàn)的微型愈傷組織，至30d后，有部分小愈傷組織直徑可達(dá)2_，質(zhì)地疏松，顏色為淺黃色。
[0100] 而采用固液培養(yǎng)，第一次分裂時(shí)間與固體培養(yǎng)差不多，分裂頻率也僅略低于固體 培養(yǎng)，但是固液培養(yǎng)操作相對(duì)固體培養(yǎng)更為簡(jiǎn)便，且對(duì)原生質(zhì)體損害更小。因此，本發(fā)明選 擇固液培養(yǎng)。
[0101] 表4培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響
[0103] 注：同一列字母不同者差異顯著(P〈〇.05)，字母相同者差異不顯著(P>0.05)
[0104] (10)針對(duì)步驟？中增殖培養(yǎng)基，本發(fā)明設(shè)置3個(gè)激素組合，分別為0.511^/16-8八+ 0.5mg/l NAA、0.5mg/l 6-BA+1.0mg/l NAA和0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。結(jié)果表明，由愈 傷組織增殖狀態(tài)考慮，適宜的激素組合為〇.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA。具體如下：
[0105] 當(dāng)原生質(zhì)體再生細(xì)胞發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的愈傷組織長(zhǎng)到l-2mm時(shí)，需要轉(zhuǎn)移至增殖 培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)激素組合，分別為0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA、0.5mg/16-BA + 1.0mg/l NAA和0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA。定期觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄生長(zhǎng)情況。 培養(yǎng)溫度(24±1)°C，光照14h · d-S光照強(qiáng)度30001UX。
[0106] 增殖培養(yǎng)基中激素組合對(duì)愈傷組織增殖的影響：
[0107] 結(jié)果如表5所示，編號(hào)3培養(yǎng)基(0.5mg/l 6-BA+2.0mg/l NAA)中，愈傷組織增殖速 度緩慢，顏色呈米黃色，阻礙愈傷組織的進(jìn)一步分化。編號(hào)1培養(yǎng)基中愈傷組織增殖速率最 快，狀態(tài)良好，顏色由剛接種時(shí)的乳黃色變?yōu)榫G色或鮮綠色，致密程度較好，適于分化培養(yǎng) (圖8-8)，增殖效果稍好于編號(hào)2。因此編號(hào)l(0.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA)為最佳微愈傷組 織增殖培養(yǎng)基。
[0108] 表5激素比例對(duì)微愈傷組織增殖的影響
[0110] (11)針對(duì)步驟F中分化培養(yǎng)基，本發(fā)明設(shè)置4個(gè)激素組合，分別為0.5mg/l ZT+ 0.1mg/l NAA、1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA和2.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA、40mg/l ZT+0.1mg/l NAA。結(jié)果表明，由愈傷組織分化情況考慮，適宜的激素組合為I.Omg/1 6-BA+O. lmg/1 NAA。 具體如下：
[0111] 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織，轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，分化培養(yǎng)基設(shè)置4個(gè)激素組 合，分別為〇.5mg/l ZT+0.1mg/l NAA、1.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA和2.0mg/l ZT+0.1mg/l NAA、40mg/l ZT+0. lmg/1 NAA。定期觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)溫度（24 土 1)°C，光照 14h · d-S光照強(qiáng)度30001ux。
[0112] ZT對(duì)矮牽牛愈傷組織分化的影響：
[0113] 結(jié)果如表6所示，ZT有利于促進(jìn)愈傷組織芽的分化，其中以1.0 mg/1 ZT+0 . lmg/1 NAA的激素組合為最佳，愈傷組織第16d分化出芽，出芽率為20%，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，顏色 鮮綠，結(jié)構(gòu)致密，直徑約1.2-1.5cm;在激素組合4中，雖然愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，與組合2類(lèi)似， 但沒(méi)有分化出芽（圖8-9和8-10)?？梢?jiàn)適宜濃度的ZT對(duì)矮牽牛原生質(zhì)體再生愈傷組織的芽 的分化有促進(jìn)作用。
[0114] 表6ZT對(duì)愈傷組織分化的影響
[0116] 實(shí)施例
[0117] 本實(shí)施例涉及矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的方法，矮牽牛品種為錦浪系列 (Petunia hybrida'Shock Wave'）白色花品種，種子來(lái)源于泛美種子公司。具體包括如下步 驟：
[0118] 1、準(zhǔn)備材料:取矮牽牛頂芽下第3~5片幼嫩葉片，稱(chēng)量0.5g。肥皂水浸泡20min，流 水沖洗1.5h。于無(wú)菌操作臺(tái)中，75 %酒精浸泡20s，立即轉(zhuǎn)入1 %雙氧水消毒2min，無(wú)菌水沖 洗3遍，無(wú)菌濾紙吸干水分，切成0.5_寬彼此相連的細(xì)絲；
[0119] 2、酶解：向6cm小培養(yǎng)皿中加入5ml的酶解液中，把經(jīng)過(guò)消毒的葉片平鋪在酶液中， 使之相互不重疊。26°C黑暗條件靜置酶解，每隔Ih輕晃培養(yǎng)皿，以使兩相充分接觸。酶解液 的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為如下終濃度的物質(zhì)：2wt %纖維素酶、0.4wt %離析酶、0.2wt %果膠 酶、0.5M甘露醇、0.1 Iwt %無(wú)水氯化鈣、0.1 Owt %牛血清白蛋白、20mM MES;所述酶解液的PH 為5.6~5.7;
[0120] 3、純化:酶解結(jié)束后，向酶混合液中加入IOml洗液，搖晃30s，移液槍吸取溶液到 300目不銹鋼細(xì)胞篩上，經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞團(tuán)和組織，把濾液轉(zhuǎn)移到50ml大試管中， Centrifuge 5810R離心機(jī)1100r/min室溫離心2min，升降加速度設(shè)為0。吸去上清液，向沉淀 中加入15ml洗液，以相同的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間重復(fù)洗滌2次。吸取純化后的上清液，收集底部 的原生質(zhì)體。CPW洗液中溶劑為CPW鹽溶液，溶質(zhì)為終濃度0.5M的甘露醇，pH為5.6~5.7 (0.5M NaOH溶液微調(diào)即可）。
[0121] 4、懸浮原生質(zhì)體:加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液，獲得純化后的原生質(zhì)體;所述原生質(zhì)體培 養(yǎng)液溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的〇. 375wt %KM8P、20mM MES、0.15wt %KC1、2wt %蔗糖、 9界1:%葡萄糖、0.511^/16-1^、2.〇11^/1熟4;所述原生質(zhì)體培養(yǎng)液的。!1為5.6~5.7;
[0122] 5、統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量。每個(gè)樣品重復(fù)6次，取平均值，最后計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。
[0123] 計(jì)算公式:細(xì)胞數(shù)/ml = 100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100 X 400 X 10000 X稀釋倍數(shù)
[0124] 原生質(zhì)體產(chǎn)量(個(gè)/g) =[原生質(zhì)體數(shù)(個(gè)/ml) X稀釋后的體積(ml)]/葉片總質(zhì)量 (g)
[0125] 6、檢測(cè)原生質(zhì)體活性:將5mg雙醋酸乙酸酯溶于Iml丙酮作為雙醋酸乙酸酯母液(0 °C保存），然后向Iml懸浮的原生質(zhì)體中加25ul雙醋酸乙酸酯母液，室溫3min反應(yīng)后，取少量 溶液置于載玻片用熒光顯微鏡觀察。原生質(zhì)體活性以一個(gè)視野中有活性的原生質(zhì)體占該視 野中原生質(zhì)體總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，選取10個(gè)有代表性的視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0126] 7、培養(yǎng)原生質(zhì)體：向沉淀中加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液，將密度調(diào)整為0.5~I .OX IO5 個(gè)/ml，于24°C黑暗環(huán)境中，固液培養(yǎng)法培養(yǎng)，培養(yǎng)15d添加新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基，此后每隔 7d添加一次；所述原生質(zhì)體培養(yǎng)液溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的0.375wt%KM 8P、20mM MES、0 · 15wt % KCl、2wt % 鹿糖、9wt % 葡萄糖、0 · 5mg/1 6-BA、2 · Omg/1 NAA;所述原生質(zhì)體培 養(yǎng)液的pH為5.6~5.7;新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的滲透壓依次遞減，葡萄糖濃度從9%降至6%， 再降至3 %。
[0127] 8、對(duì)愈傷組織增殖及誘導(dǎo)：培養(yǎng)30d后，將步驟E中形成的微愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖 培養(yǎng)基;2 Id微愈傷組織長(zhǎng)至5mm，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基;所述增殖培養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶 質(zhì)為終濃度的0 · 44wt %MS培養(yǎng)基、2wt % 蔗糖、0 · 7wt % 瓊脂、0 · 5mg/1 6-BA、0 · 5mg/1 NAA; 所述分化培養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的〇. 44wt %MS培養(yǎng)基、2wt %蔗糖、0.7wt % 瓊脂、l.〇mg/l ZT、0.1mg/l NAA。
[0128] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： A、 稱(chēng)量矮牽牛幼嫩葉片，依次經(jīng)肥皂水浸泡、流水沖洗、75wt %酒精浸泡、Iwt %雙氧水 消毒、無(wú)菌水沖洗后，吸干水分，切成細(xì)絲； B、 用酶解液酶解步驟A處理后的葉片;所述酶解液的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為如下終濃度 的物質(zhì)：2wt %纖維素酶、O · 4wt %離析酶、O · 2wt %果膠酶、O · 5M甘露醇、O · I Iwt %CaCl2、 O. IOwt %牛血清白蛋白、20mM MES;所述酶解液的PH為5.6~5.7; C、 向步驟B酶解后的溶液中加入CPW洗液，經(jīng)300目細(xì)胞篩過(guò)濾后I lOOr/min離心2min， 吸去上清液;所述CPW洗液的溶劑為CPW鹽溶液，溶質(zhì)為終濃度0.5M的甘露醇； D、 再次加入CPW洗液洗滌，1100r/min離心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得純化后的 原生質(zhì)體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，步驟A中，所述幼 嫩葉片為頂芽下端第3~5片幼嫩葉片。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，步驟B中，所述纖 維素酶為纖維素酶R-IO，離心酶為離析酶R-IO，果膠酶為果膠酶Y-23。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，步驟B中，所述酶 解溫度為25~27°C，酶解時(shí)間為5h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，步驟C中，所述 CPW鹽溶液是由每升水中加入27.2mg KH2C〇3、101.0mg KN03、1480mg CaCO3 ·2Η20、246·0π^ 1%504,7出0、0.1611^1(1、0.0251^(：11504.5!120制備而得 ;所述0?1鹽溶液的口!1為5.6~5.7。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，所述矮牽牛為矮 牽牛錦浪系列Petunia hybrida'Shock Wave'白色花品種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體分離方法，其特征在于，所述離心采用的 離心機(jī)型號(hào)為Centrifuge 5810R離心機(jī)。8. -種矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 步驟一、將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制備的原生質(zhì)體加入原生質(zhì)體培養(yǎng)液中，24 °C黑暗環(huán)境中固液培養(yǎng)法培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)15d、2 2d、29d時(shí)添加一次新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基； 所述原生質(zhì)體在原生質(zhì)體培養(yǎng)液中的密度為0.5~1.0 X IO5個(gè)/ml;所述原生質(zhì)體培養(yǎng)液的 溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的〇·375wt%KMsP、20mM MES、0· 15wt%KC1、2wt%蔗糖、9wt% 葡萄糖、〇.511^/16-1^、2.〇11^/1熟4;原生質(zhì)體培養(yǎng)液的口!1為5.6~5.7 ; 步驟二、培養(yǎng)30d后，將經(jīng)步驟一中培養(yǎng)形成的微型愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基;培養(yǎng) 21 d后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基;培養(yǎng)即可;所述增殖培養(yǎng)基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的 0.44?七％]\^培養(yǎng)基、2￥丨％蔗糖、0.7￥丨％瓊脂、0.511^/16-84、0.511^/1祖4;所述分化培養(yǎng) 基的溶劑為水溶液，溶質(zhì)為終濃度的〇. 44wt %MS培養(yǎng)基、2wt %蔗糖、0.7wt %瓊脂、1.0 mg/1 ZT、0.1mg/l NAA09. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中，所述 固液培養(yǎng)法為先將含〇. 8 %瓊脂糖的固體培養(yǎng)基平鋪在培養(yǎng)皿底部，待其凝固后，再加入原 生質(zhì)體培養(yǎng)液和原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中，所述 分別在培養(yǎng)15d、22d、29d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的滲透壓依次遞減，即培養(yǎng)15d時(shí)添 加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為9wt %，培養(yǎng)22d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的 葡萄糖濃度為6wt%，培養(yǎng)22d時(shí)添加的新鮮原生質(zhì)體培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為3wt%。11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中，所述 原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中，待形成肉眼可見(jiàn)的乳黃色微型愈傷組織后，置于散射光下培養(yǎng)。12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的矮牽牛葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟二中，將微 型愈傷組織轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基后，培養(yǎng)條件為:溫度（24±1)°C，光照Hh · cf1，光照強(qiáng)度3 OOOIux0
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105941148SQ201610316552
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】曾麗, 王鵬, 劉曉叢, 彭勇政, 王夢(mèng)茹, 周元飛, 劉國(guó)鋒, 陶懿偉, 趙子剛, 李水仙
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)